FR2475047A1 - Procedes d'obtention de relaxine humaine a partir de membranes foetales et relaxine ainsi obtenue - Google Patents

Abstract

L'INVENTION SE RAPPORTE AUX HORMONES. ELLE CONCERNE UN PROCEDE D'OBTENTION DE RELAXINE HUMAINE TIREE D'UNE SOURCE HUMAINE, CARACTERISE EN CE QUE L'ON UTILISE COMME SOURCE DES MEMBRANES FOETALES. UTILISATION PAR L'INDUSTRIE PHARMACEUTIQUE.

Description

La relaxine est une hormone du type poly-

peptide qui facilite la relaxation du ligament pel-

vien des mammifères. Hisaw (Proc. Soc. Exp. Biol. 23, 661, 1926) a observé le premier l'existence de la relaxine en 1926. Malgré les nombreuses années qui se sont écoulées depuis la première découverte de cette hormone, on dispose de peu d'information sur

celle-ci, spécialement dans l'espèce humaine.

Chez les animaux, on a trouvé de la rela-

xine dans divers tissus de mammifères et de non-mam-

mifères. Jusqu'ici, la seule source riche et abon-

dante de relaxine est l'ovaire de la truie gravide, dont on tire la relaxine pour l'usage commercial et expérimental. Dans l'espèce humaine, on sait très peu de

chose de l'origine, du r8le physiologique ou patholo-

gique et de la structure de la relaxine.

Il semble que l'ovaire gravide, chez la femme aussi, soit riche en activité similaire à celle de la relaxine. Toutefois, la possibilité de tirer de la relaxine humaine de cette source est très faible,

puisqu'il est,en pratique, impossible d'avoir des quan-

tités suffisantes d'ovaires humains gravides pour le processus d'extraction0 L'invention est basée sur la découverte qu'une source nouvelle et facilement accessible de

relaxine humaine est le complexe de membranes foeta-

les que l'on obtient facilement lors de l'accouche-

ment en même temps que le placenta.

Plus précisément, on a trouvé que la mem-

brane caduque est particulièrement riche en relaxine.

Les "membranes foetales' sont un complexe

des trois couches: amnios, chorion et caduque.

L'amnios est facile à séparer, par décolle-

ment, des membranes associées, chorion et caduque. Au contraire, le chorion et la caduque sont difficiles à séparer complètement l'un de l'autre, L'objet principal de l'invention est un

procédé d'obtention de relaxine utilisant les mem-

branes foetales comme source. De préférence, on uti-

lise comme source le chorion et la caduque associée ou, de préférence encore, la caduque elle-m9me.

On peut tirer directement la relaxine hu-

maine de la ou des sources ci-dessus, par extraction, ou indirectement du milieu d'incubation de cultures

in vitro des tissus ou cellules en question.

Le titrage biologique de préparations con-

tenant de la relaxine est généralement basé sur les méthodes suivantes:

1) l'inhibition de la contraction spontanée de l'uté-

rus, aussi bien in vivo qu'in vitro; et 2) la relaxation de la symphyse pubienne que l'on peut déterminer: a) par palpation de la symphyse pubienne

du cobaye,.

b) aux rayons X sur la symphyse pubienne de la souris, ou

c) par mesure directe de la symphyse pu-

bienne de la souris.

On a mesuré par la méthode 2c ci-dessus l'activité biologique des compositions contenant de la relaxine, obtenues selon l'invention et elle est exprimée en U1.C. (unités cobaye) en agrément avec la préparation de relaxine porcine utilisée comme étalon

(NIH).

On a trouvé aussi que les compositions de l'invention sont actives dans l'essai d'inhibition

de la contraction utérine (voir 1 plus haut).

On peut utiliser la relaxine en thérapeu-

tique dans divers états pathologiques gravidiques (accouchement prématuré, menace de fausse couche) et

des tissus conjonctifs (sclérodermie et ulcère tro-

phique). En outre, la relaxine humaine a une impor-

tance extrême pour la préparation d'un nécessaire de

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dosage radioimmunologique homologue permettant de doser la relaxine dans les humeurs et tissus humains*

Les exemples non limitatifs ci-après illus-

trent l'invention.

Exemple 1

- Relaxine humaine tirée d'un homogénéisat tissu-

laire

On recueille lors de l'accouchement le pla-

centa humain et les membranes foetales associées et on les lave dans de la solution de Hank ou du soluté

physiologique tamponné, pH 7,4. On conserve la ma-

tière à -3000 jusqu'au traitement (on peut séparer le placenta des membranes foetales associées, avant

ou après le stockage).

On peut alors traiter les membranes foeta-

les dans leur ensemble ou de préférence on sépare l'amnios de la caduque et du chorion par décollement et on le jette. Si on le désire, on peut séparer la

caduque du chorion par raclage et la traiter séparé-

ment. Toutefois, cette dernière opération n'est pas facile à exécuter et ne semble pas se justifier pour

les opérations d'extraction courantes.

On traite à la fois environ 500 g de ma-

tière membraneuse provenant de 15 à 20 accouchements.

On émince le tissu et on l'homogénéise dans

cm3 d'eau distillée.

On traite alors l'homogénéisat tissulaire obtenu, selon l'un des procédés suivants: a) selon Schwabe et Braddon, Biochea. Biophys. Res. Commun. 68, 1126, 1976: après avoir ajouté 30 cm3

de HO1 concentré, on maintient le mélange à 4 0 pen-

dant 24 heures, puis on ajoute 160 cm3 d'acétone froide et on maintient le mélange pendant une nuit à 4 0. On sépare le précipité par centrifugation à 2000 tours/mn pendant 15 minutes et on le jette. On traite le surnageant limpide par 5 volumes d'acétone froide pendant 24 heures, puis on le centrifuge à 27.000 tours/mn pendant 30 minutes; b) selon Sherwood, Endocrinology 104, 886, 1979: on

commence par extraire le mélange par un tampon phos-

phate puis, par centrifugation à 27 000 tours/mn pen-

dant 30 minutes, on sépare les résidus tissulaires et les organites cellulaires les plus lourds et on

les jette.

Dans les deux cas, on obtient la relaxine

sous forme d'un extrait brut. On peut encore puri-

fier l'extrait brut par ehromatographie en série sur carboxyméthylcellulose, "Sephadex G-50' superfin et *Sephadex G-15" par les méthodes proposées par les auteurs cités, pour obtenir une matière purifiée ayant une activité totale de relaxine de 1500 à 2500 U.CO et une activité spécifique de 150 à 1500

U.O./mg de protéines, selon le nombre d'étapes chro-

matographiques.

Exemple 2

- Relaxine humaine tirée d'une culture in vitro de caduque humaine

On racle la caduque de la surface des mem-

branes associées caduque et chorion et on l'émince.

On place 1 à 2 g du tissu émincé dans des

flacons Erlenmeyer contenant chacun 40 cm3 de solu-

tion de Gey oxygénée modifiée par addition de 20 mil-' limoles d'Hepes, de 50 U/ml de pénicilline et de

% de sérum de veau.

On fait incuber les cultures dans un incu-

bateur métabolique à 37 0 pendant 48 heures. On re-

cueille les milieux, on les traite par 5 volumes d'acétone froide et on maintient à 4 0 pendant 24 heures. On centrifuge alors le mélange à 27 000 tours/mn pendant 30 minutes pour obtenir une boulette

contenant un extrait brut de relaxine qui a une ac-

tivité spécifique de 500 à 2000 U.o./mg de protéines, On peut encore purifier l'extrait brut selon les procédés connus mentionnés à l'exemple. lo

Claims (6)

REVENDICATIONS

1. Procédé d'obtention de relaxine humaine tirée d'une source humaine, caractérisé en ce que

l'on utilise comme source des membranes foetales.

2. Procédé selon la revendication lcarac-

térisé en ce que l'on utilise comme membranes foe-

tales le chorion et la caduque.

3. Procédé selon la revendication 1, ca-

ractérisé en ce que a) on émince et on homogénéise des membranes foetales humaines, b) on précipite

les résidus tissulaires et les organites cellulai-

res les plus lourds et on les jette pour obtenir un

extrait brut de relaxine.

4. Procédé selon la revendication 3, ca-

ractérisé en ce qu'on sépare l'amnios des membranes associées que sont le chorion et la caduque et on le jette; et on utilise le chorion et la caduque

comme source.

5. Procédé selon la revendication 3 ou 4,

caractérisé en ce que l'on sépare la caduque du cho-

rion associé, en la raclant; et on l'utilise comme source.

Procédé selon la revendication 1, ca-

ractérisé en ce qu'on fait incuber du tissu ou des cellules de caduque humaine et on purifie, par des procédés classiques, la relaxine tirée du milieu d'incubation.

7. La relaxine obtenue par un procédé se-

lon l'une quelconque des revendications 1 à 60