DE2014957A1 - Verfahren zur Reinigung von Proteinen des Blutserums oder -plasmas von Acrinol - Google Patents

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RECHTSANWÄLTE

DR. JUR. DIPL-CHEM. WALTER BEIL

ALFRED HOSPPcNER

DR. JUR. DiPL-CHEM. H.-J, WOLFF

DR. JUR. HANS CHR. SEIL

623 FRANKFURT AM MAIN-HOCHST *)ft Mär? 1Q7fl

AOELONSTRASSE58 4Ul 1*1(112 19/U

Unsere Fr. 16 198

The Upjohn Company
Kalamazoo, Mich., V.St.A.

Verfahren zur Reinigung von Proteinen des Blutserums oder -plasmas von Acrinol

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur■Entfernung von Acrinol (Athacridinlactat-Monohydrat) aus Blutproteinen, insbesondere gamma-Globulin, durch Behandlung wässriger Acrinol enthaltender Lösungen dieser Proteine mit
einem Siliciumdioxid enthaltenden Material, das vorzugsweise dos Acrinol adsorbiert. Von Acrinol freies gamma-Globulin aus Serum oder Plasma, insbesondere Immunserum oder -plasma, eignet sich zur Verhinderung der Abstoßung von Gewebe- und Organtransplantaten und zum Austausch
von gymma-Globulin.

Acrinol, oder 6,g-Diamino^-athoxyacridinlactat-Monohydrat ist im Handel erhältlich, z.B. von der Galbiochem, Box
54282, Los Angeles, California 90054; Pierce Chemical Co., Rockford Illinois und den Winthrop Laboratories, 90 Park Avenue, Hew York, Few York 10016. Es wird bei der Blutprotein-Fraktionierung zur Abtrennung der Blutproteine. verwendet, insbesondere wegen seiner Eigenschaft,in der Lösung tatsächlich alle gamma-Globiiline zurückzulassen,

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s. Sagan, Z., Clin. CMm. Acta 21_, 225 (1968); Saifer, A. und Lipkin, L,E., Proc. Soc. Expl. 3iol. Med. 102, 220 (1959). Das Acrinol eignet sich zwar gut für die Trennung der Blutproteine, seine Entfernung, insbesondere aus gamma-Globulin, ist jedoch mit beträchtlichen Schwierigkeiten verbunden. Z.B. beschreiben M. Matthaeus und D. Hatheks in Zentr. Bakteriol. Parpsitentc. , Abt. 1, Orig 188, 6 (1963) mühsame und nicht erfolgreiche Versuche zur Entfernung des restlichen Acrinols durch Fällung ;. it Salzen. Sutton und Karp in Biochimica Biophysica Acta 107, 154 (1965) schlagen die Entfernung des Acrinols durch Adsorption an Aktivkohle vor, siehe hierzu auch die US-Patentschrift 3 383 227 (E.D. und k.J. West), wo ebenfalls die Verwendung von Aktivkohle beschrieben ist. In .Lbs. 2 der angezogenen Literaturstelle v/eisen Sutton und Kerp jedoch auf die Schwierigkeiten dieser Arbeitsweise und ihre nicht erfolgreiche Durchfuhrung hin, denn die Verwendung von Aktivkohle zur Entfernung des Acrinols ist mit einem Verlust an gewünschtem Produkt verbunden. Bei der Reinigung von gamma—globulin aus Placenta mit Bentonit nach der US-Patentschrift 3 449 316 v/ird anscheinend eine Zersetzung vermieden, jedoch ist hier die Entfernung von Acrinol nicht beschrieben.

Es wurde nun gefunden, daß bei der Reinigung von Blutproteinen, einschließlich gamma-G-lobulin und insbesondere anti-lymphoidem gamma-Globulin unter Verwendung von Acrinol zur Trennung der verschiedenen Blutproteine d-s Acrinol aus den v/ässrigen Lösungen der gewünschten Proteine einschließlich gamma-Globulin,insbesondere anti-lymphoiüem Globulin durch Kontakt dieser Lösungen mit einer wirksamen Menge Silikagel oder mineralischem Silikatadsorptionsmittel entfernt werden kann. Aufgrund der charakteristischen gelben Farbe der Acrinol enthaltenden Lösungen kann die Wirksamkeit des Adsorptionsmittels bei der Entfernung

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des Acrinole verhältnismäßig leicht durch das Verschwinden der chrrakteristischen Farbe aus den Proteinlösungen und ihrem Auftreten im Adsorptionsmittel festgestellt werden. G-egebenenfalls kann die Anwesenheit von Acrinol in einem FiItrat oder in einer überstehenden Flüssigkeit nach der Adsorptionsbehendlung durch UV-Absorptipn bei etwa 362 my und 268 mu ermittelt werden. Mit dem erfindungs^emäßen Verfahren werden aus den Proteinlösungen in vorteilhafter Weise gleichzeitig pyrogene Substanzen entfernt. Es ist bekannt, daß pyrogene Substanzen in pharmazeutischen Produkten, insbesondere solchen für die pa- K renterale Verabreichung unerwünschte Verunreinigungen darstellen, und ihre Entfernung manchmal schwierig und unsicher und in einigen fällen tatsächlich nicht durchführbar ist, vgl. die Veröffentlichung der Baxter Laboratories, Inc., Morton Gkrove, 111., ^Bacterial Pyrogens, Particularly Pyrogenic Pol-saccharides of Bacterial Origin, An^ Annotated Bibliognphy".(1952). Die Entfernung jeglicher möglicherweise vorhandenen Hepatitisviren wird von Bednarik et al., ZbI. i\_ Bakt. I^ Prig. 200:1, 1966, beschrieben.

Wie oben erwähnt fällt Acrinol in wirksamer Weise die Blutproteine aus ihren wässrigen Lösungen, wobei etwas ,

ß-G-lubolin und tatsächlich das gesamte gamma-Globulin ™

gelöst bleiben. Wegen dieser Eigenschaft eignet es sich für die Reinigung von Blutproteinen aus menschlichem und tierischem ulut, z.B. Blut von Pferden, Schafen, Ziegen, Kühen und Kaninchen. Bekanntlich stellen sowohl das nach dem Gerinnen erhaltene Serum als auch das nach der Entfernung geformter Bestandteile erhaltene Plasma Quellen für gereinigtes gamma-Globulin dar. Es ist auch bekannt, daß aus menschlichem oder tierischem Blut, das klinisch erwünschte Antikörper enthält, wertvolle gamma-Globulinfraktionen hergestellt werden können. Z.B. ist .Serum oder Plasma von Kenschen, die an Polyomj'-elitis erkrankt waren,

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oder die mit nicht-virulentem Polio Virus geimpft v/urden, für die Herstellung von menschlichem gamma-Globulin wertvoll, das Anti-Polio Antikörper enthält. Vorteilhaft wird auch Serum oder Pl&sma aus tierischem Blut hergestellt, insbesondere aus dem Blut von Pferden, die zuvor mit lymph ο id em Gewebe, z.B. menschlichem lymphocytischem Gewebe, einschließlich Tlrrnocyten und hilz-Lymphocyten geimpj't vorden sind.

Zur Gewinnung von Lymphocyten, insbesondere Thymocyten P für die Behandlung von Pferden wird zur Trennung der Lymphocyten und 31utplättchen von den Granulocyten und Jirythrocyten zentrifugiert. Dann v/i'-d zur Trennung der Lymphocyten von den Blutplättchen eine Sedimentation angewandt. Auf diese V/eise v/erden die Thymocyt»,en in im wesentlichen reiner Form erhalten und können in der üblichen Vieise für die Injection von Pferden zur Herstellung von Anti-Human-Thymocytenserum oder -plasma verwendet v/erden.

Besonders brauchbare Seren und Plasmen dieser Art sind z.B. Anti-Hu.Tf-n-Lymphoidserum und -plasm? vom Pferd und vom Schaf sov.ie ähnliche Seren und Plasmen. Aus diesen ^ Quellen isoliertes gereinigtes geiama-Globulin enthält ^ antilymphoide Gewebe — Antikörper, die ils Abwehrreaktionen unterdrückende Substanzen besonders wertvoll sind und z.B. die Verträglichkeit gleichartiger Organ- und Hauttraneplentete, z.B. von Nieren, Leber, Herz, Lunge und Haut beim Menschen und von ähnlichen Transplantaten bei Tieren, v.ie Schimpansen und Ratten, erhöhen.

Gewöhnlich besteht cie Lösung, -A cie das Adsorptionsmittel zur Entfernung der Acrinolspuren angewandt wird, eus einer wässrigen Lösung von gereinigtem gaiuna-Globulin aus den zuvor genannten Quellen, die z.B. Natriumchlorid als Elektrolyt enth It, rsbeto: <->r(_; von gereinigtem gamma-

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Globulin aus Anti-Human-Lymphoidserum oder -plasma vom Pferd. Wie oben erwähnt kann die Entfernung des Acrinols aus der wässrigen Lösung aufgrund des Verschwindens der gelben Farbe verfolgt werden, die für das Acrinol charakteristisch ist. Außerdem kann die Gegenwart von Acrinol in wässrigen lösungen von gereinigtem gamma-Globulin, aus denen das Acrinol entfernt wurde, durch UV-Absorptionsmessun^en bei 362 mu (a = 38,4) und 268 mu (a = 138. ) festgestellt werden.' Die im erfindungsgemäßen Verfahren angewandten Silikagel—Adsorptionsmittel sind bekannt und werden im allgemeinen für die Anwendung in der präparati- \ ven und analytischen Chromatographie verkauft. Ein geeignetes Gel ist z.B. das von der Firma E. Merck A«G., Darmstadt, erhältliche. Es besteht im wesentlichen aus Teilchen mit einem Durchmesser von 0,05-0,12 mm (70-325 mesh, American Society of Testing Materials standard). Andere Adsorptionsmittel sind Magnesiumsilikat, Magnesiumtrisilikat, natürliches Calciummagnesiumsilikat, Talkum und ein Zeolith, wie Heulandit, Stilbit, Chabazit, Analcit und Fatrolit (Infra-Inorgs.nic Chemistry, Latimer-Hildebrand, MacMillan, 1940). Das Adosrptionsmittel wird in solcher Menge verwendet, daß die in den wässrigen Lösungen von gereinigtem gamma-Globulin zurückbleibenden Acrinolapu- λ ren wirksam entfernt werden.

Eri'indungsgemäß wird eine wässrige Acrinollösung, die etwa 0,1 bis etwa 5 und vorzugsweise etwa 0,4 Gew.)& Acrinol enthält, langsam unter Rühren zu dem Serum oder Plasma gegeben, um die anderen Blutproteine als gamma-Globulin, insbesondere die α- und ß-Globuline, auszufällen. Das Plasma oder Serum hat dabei seinen normalen pH-'wert von etwa 7 bis etwa 8, obgleich es durch die Zugabe eines geeigneten Reagenzes, wie Natriumhydroxid oder Natriumbicarbonat, auf pH etwa 7,6 eingestellt werden kann. Die Fällung wird gewöhnlich bei etwa 25° C durchgeführt, ob-

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gleich auch niedrigere Tempere.türen möglich sind. Je Volumteil Plasma oder Serum werden 3,5-5, vorzugsweise etwa 4 Volumteile der 0,4 #igen Acrinollösung verwendet. Man läßt die Fällung vollständig vor sich gehen, wobei das Ausfällen und das Absetzen der Fällung bei vorzugsweise etwa 4° C während eines etwa 15 Minuten langen Stehens bis zu einem Stehen über Nacht und länger erfolgt. Die Fällung wird vom löslichen Anteil z.B. durch Filtrieren oder Zentrifugieren abgetrennt. Im löslichen Anteil ist das teilweise gereinigte gamma-Globulin enthalten. Nach

* der Einstellung des pH-Wertes auf etwa 7,2 mit 0,8 molarem Acetatpuffer wird das gamma-Globulin durch Zugabe von Aceton oder einem niederen Alkanol, z.B. Isopftr^anol oder Äthanol, aus dem löslichen Anteil gefällt. Z.B. kann man Isopropanol tropfenweise unter Rühren bei 0-6° C bis au einer Konzentration von etwa 25 # Isopropanol Vol./Vol. zugeben. Hierdurch wird das gamma-Globulin ausgefällt, und nach einer geeigneten Absetzzeit bei etwa 0° C, z.B. von mehreren Stunden oder über Nacht wird es durch Filtrieren oder Zentrifugieren gewonnen. Die Fällung aus teilweise gereinigtem gamma-Globulin, die,wie die gelbe Farbe zeigt, gewöhnlich etwas Acrinol und manchmal pyrogene

fc Substanzen enthält, wird im kleinstmöglichen Volumen eines geeigneten wässrigen Lösungsmittels, z.B. 0,9 #igem NaCl oder 2,25 tigern Glycin, gelöst. Eine wässrige 0,01 oder 0,02 molare Natriumphosphatlösung mit einem pH-Wert von etwa 6,7 ergibt, wie nachstehend beschrieben, eine Lösung, die sich in zufriedenstellender Weise für die Chromatographie eignet. Danach wird die Lösung des gamma-Globulins auf eine kleine Adsorptionsmittelsäule oder eine Adsorptionsmittelschicht auf einer geeigneten Unterlage, z.B. einem rauhen Glastrichter, aufgebracht. Gelegentlich kann eine v/eitere Adsorptionsmittelbehandlung erforderlich sein. Hinsichtlich der geeigneten Verhältnisse von Adsorptionsmittel zu gereinigtem gamma-Globulin wurde festge-

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stellt, daß ein zufriedenstellender Bereich bei 1 g Adsorptionsmittel zu etwa 0,5 bis etwa 5 g "gamma-Globulin liegt und z.B. völlig zufriedenstellende Ergebnisse erzielt werden, wenn man etwa 4 g Silikagel in Form einer Filterschicht i'.ur Entfernung von Acrinol aus etwa 2 g gereinigtem gammaglobulin in etwa 50 ml Wasser verwendet. Die so gewonnene gereinigte gamma-Globulinlösung erwies sich als frei von Acrinol und Pyrogenen. Sie wird gefrierkonserdtffert oder partiell konzentriert, vorzugsweise durch Entfernung von lösungsmittel aus einer gefrorenen Lösung und dann konserviert bis zur "Verwendung als kalte Lösung oder als gefrier- i getrocknetes Produkt.

Die Adsorptionsmittelbehandlung kann mit anderen Reinigungsverfahren oder Polgen von Reinigungsverfahren kombiniert werden, z.B. bei lymphoidem Anti-Human-Globulin vom Pferd für die .Behandlung von Menschen zur Unterdrükkung von Abwehrreaktionen, z.B. um der Empfängerreaktion, Organtransplantate abzustoßen, entgegenzuwirken. Z.B. sind nach der Immunisierung von Tieren, z.B. Pferden mit menschlichen Thymocyten im tierischen Serum oder Plasma gewöhnlich Anti-Erythrocyten Antikörper vorhanden. Diese durch Antigene erzeugten Antikörper werden durch Adsorption , an gemischte menschliche rote Blutzellen (A, B, AB, 0 '

und Rh⁺) entfernt. Daher wird cie an gamma-Globulin reiche Lösung, die nach der Acrinolbehandlung zurückbleibt, mit etwa 1/20 bis 1/5, vorzugsweise etwa 1/10 des VoIu- ■ raens an gewaschenen menschlichen Erythrocyten oder Stroma behf-ndelt und die erhaltene Suspension 1-3 Stunden bei 25° C oder einer niedrigeren Temperatur langsam gerührt. Die Ervthrocyten oder das Stigma werden durch geeignete Maßnahmen entfernt, z.B. durch Filtrieren oder Zentrifugieren. Es wird also die an gamma-Globulin reiche Lösung zur Entfernung der Anti-Erythrocyten-Antikörper mit menschlichem Erythrocytenstroma behandelt. Menschliches Erythro-

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cytenstroma, das von Serumproteinen frei ist, wird mit Digitonin hergestellt. Digitonin (0,5 ml einer 5 mg/ml Suspension in 0,9 tigern NaCl) wird zu 10 ml einer gekühlten 10 #igen Suspension roter Zellen gegeben. Es tritt sofort ein Zellabbau ein, und das Stroma ballt sich zusammen. Die Sedimentation wird bei 34 000 g innerhalb 30 Minuten bei etwa 5° C bewirkt. Zur Entfernung von Hämoglobin- und Digitoninspuren wird mit Salzlösung gewaschen. Das Stroma wird als wässrige Dispersion verwendet, z.B. in 0,9 #iger wässriger NaCl-Lösung, gewöhnlich im Verhält- ψ nie Erythrocytenäquivalent von 4-5 ml in 1 ml der endgültigen wässrigen Salzdispersion. Der Anti-Erythrocyten Titer einer überstehenden, Globulin enthaltenden Flüssigkeit wird durch übliche immunologische Agglutinationsmethoden ermittelt,und, falls erforderlich, werden zusätzliche Adsorptionen durchgeführt. Dsnach v/ird die so behandelte Globulinlösung mit Aceton oder dem niederen Alkanol wie oben beschrieben gefällt. Das Globulin wird in wässriger Lösung aufgenommen, die zur Entfernung des Acrinols und der Pyrogene mit dem Siliciumdioxid enthaltenden Adsorptionsmittel behandelt wird. Eine weitere Reinigungsstufe umfaßt die Behandlung der gamma-Globulin- ^ lösung mit einem Anionenaustauscher, z.B. einer Säule W aue dem Diäthylaminoäthyläther der Cellulose, der in der Technik als Diäthylaminoäthylcellulose (DEAE Cellulose) bekannt ist. Die Säule wird zuvor mit dem Lösungsmittel ins Gleichgewicht gebracht, das zur Herstellung der gamma-Globulinlösung verwendet wurde, vorzugsweise mit 0,01 bis 0,02 molarem Natriumphosphat vom pH etwa 6,7. Nach der Aufbringung der gamma-Globulinlösung auf die Säule wird mit dem gleichen Lösungsmittel eluiert,und die EIution wird durch Ermittlung der Proteinabsorption bei 280 ημι verfolgt. Die Dimensionen der Säule sind 5-10 cm Durchmesser und bis zu 80 cm Höhe bei Fließgeschwindigkeiten von etwa 120-480 ml je Stunde. Diejenigen Fraktio-

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nen, die wesentliche Absorptionen zeigen, werden unter Anwendung "bekannter immunologischer oder elektrophoretischer Untersuchungsmethoden auf ihren Gehalt an gamma-Globulin untersucht. Das gamma-Globulin tritt normalerweise als erstes Protein aus der Säule aus, wahrend das Transferrin fester gebunden wird. Das gamma-Globulin wird gewonnen, z.B. durch Fällung mit Aceton, oder einem niederen Alkanol, wie oben angegeben,und die Fällung wird abgetrennt. Die weitere Behandlung umfaßt das Trocknen im Vakuum oder die Gefriertrocknung. Das gamma-Globulin kann aber auch in einem wässrigen Träger für di& parenterale Verabreichung, z.B. 0,3 molarem Glycin, gelöst, durch Filtration sterilisiert und bei 0-4° G aufbewahrt werden.

Die folgenden Beispiele erläutern das erfindungsgemäße Verfahren.

Beispiel 1

gamma-Globulin aus normalem Pferdeserum

Zu 100 ml"normalem Pferdeserum werden tropfenweise unter Rühren innerhalb von etwa 30 Minuten 400. ml 0,4 #iges wässriges Acrinol gegeben. Man läßt dann das Gemisch bei etwa 4° C etwa 4 Stunden absitzen. Die Filtration ergibt einen unlöslichen Anteil, der verworfen wird, und. einen löslichen Anteil, zu dem tropfernweise 167 ml Isopropanol (Temperatur -20° C) gegeben werden. Die Temperatur des Gemischs bleibt bei etwa 0° 0. Man läßt das Gemisch bei etwa 0° C 4 Stunden absitzen. Nach dieser Periode des Ab-· setzens und Ausflockens wird das Gemisch 10 Minuten bei 2000 U.p.M. zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wird abgegossen und verworfen. Zur lösung des mit 25 ?6 IsopropnÄbl ausgefällten Niederschlags werden 30 ml ■ 2,25 ^iges "wässriges Glycin verwendet. Diese Lösung wird durch eine Schicht aus mit Wasser eingeschlämmtem Silika-

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gel filtriert (Durchmesser 2 cm, Höhe 2,7 cm). Das unlösliche Material wird auf dem Filter mit 5 ml weiterer GlycinlöBung und 10 ml Wasser gewaschen. Dae Filtrat wird gefroren und in gefrorenem Zustand getrocknet. Die Trockenausbeute betrug 2,53 g, von denen etwa 788 mg als Glycin errechnet wurden. Der Rest von 1,74 g bestand aus gamma-Globulin. Dieses gamma-Globulin erwies sich als frei von pyrogenen Substanzen, wenn es nach dem Test der Food and Drug Administration 141A.3. auf Pyrogene untersucht wird.

fc Beispiel 2

Behandlung mit Silikagel

4 000 ml einer Globulinlösung in 0,01 molarem wässrigem Phosphatpuffer vom pH 6,7 werden mit Silikagel behandelt. Zur Herstellung einer 10 cm χ 14 cm Säule werden 500 g Silikagel,aufgeschlämmt in Wasser, verwendet. Die wässrige gamma-Globulinlösung wird durch die Säule geführt,und die Säule wird mit weiterem Puffer gewaschen. Das Filtrat und die Waschlösungen, 6 600 ml, sind frei von Acrinol. Bei dem verwendeten Globulin handelte es sich um Anti-Human-Thymocytenglobulin vom Pferd.

fc Beispiel 3

Behandlung mit Silikagel

2 000 ml einer Lösung von gamma-Globulin in 0,01 molarem wässrigem Phosphatpuffer vom pH 6,7 werden mit 500 g Silikagel behandelt, das als wässrige Aufschlämmung zur Bildung einer 10 cm χ 14 cm Säule verwendet wird. Das Gel wird mit weiterem Puffer gewaschen. Das Filtrat und die Waschlösungen, 2 800 ml, sind frei von Acrinol. Das Globulin war ein Anti-Human-Thymocytenglobulin vom Pferd.

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Beispiel 4

.Behandlung mit Silikagel

Wie- in den Beispielen 2 und 3 werden 3 000 ml wässrige gamma-GlobulinlÖsung mit 600 g Silikagel behandelt. Das Filtrat und die Waschlösungen sind frei von Acrinol.

Beispiel 5

Behandlung mit Diäthylaminoäthylcellulose

Das mit den Waschlösungen vereinigte Filtrat des Beispiels 2, 6 600 ml, wird über eine Säule aus Diäthylaminoäthylcellulose (Naßvolumen 10 550 ml) geführt. Die Fließgeschwindigkeit beträgt 120 ml/Std. Nachdem 3 080 ml Eluat die. Kolonne passiert haben, werden die nächsten 7 870 ml zur Gewinnung von gereinigtem gamma-Globulin durch Fällung bei einer Äthylalkoholkonzentration von 25 Ί» Vol./Vol. gesammelt.

Beispiel 6

Behandlung mit Diäthylaminoäthylcellulose

Die vereinigten Filtrate und Vaechlösungen der Beispiele 3 und 4, 6 610 ml, werden über eine Säule aus Diäthylaminoäthylcellulose (Naßvolumen 14 970 ml) geführt. Die Fließgeschwindigkeit beträgt 120 ml/Std. Nachdem 7 770 ml Eluat die Kolonne passiert haben, werden die nächsten 9 410 ml zur Gewinnung von gereinigtem gamma-Globulin durch Fällung bei einer Xthylalkoholkonzentration von 25 $> Vol./Vol. gesammelt.

Beispiel 7

Gewinnung von gereinigtem gamma-Globulin aus dem Eluat

Die vereinigten gamma-Globulin enthaltenden Eluate der Beispiele 5 und 6 werden bei einer Konzentration von 25 # Äthanol Vol./Vol. durch Zugabe von 6 516 ml 95 tigern Ätha-

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nol gefällt. Die Fällung erfolgt bei etwa O⁰ C. Nach dem Stehen über Nacht bei -5° C wird das Gemisch zur Gewinnung des unlöslichen gereinigten gamma-Globulins zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wird verworfen. Es werden bei dieser Arbeitsweise 167,4 g gereinigtes gamma-Globulin aus Anti-Human-Thymocytenplasma vom Pferd erhalten.

Beispiel 8

Behandlung mit Acrinol und Stroma

t 5 675 ml Anti-Human-Tymocyt^enplasma vom Pferd v/erden mit 350 ml 0,9 molarem Natriumbicarbonat auf pH 7,6 eingestellt. Das Bicarbonat wird langsam unter Rühren zugesetzt. Dann werden langsam unter Rühren 24 100 ml 0,4 5^ige wässrige Acrinollösung zu dem Plasma gegeben. Das Gemisch wird über Nacht in einem Kühlschrank bei etwa 4° C stehen gelessen. Nach dieser Periode des Stehens ist die Fällung gut ausgeflockt,und das Gemisch läßt sich leicht in einen unlöslichen und einen löslichen Teil trennen. Das Filtrat wird mit 0,8 molarem Acetetpuffer auf pH 7,2 eingestellt. Dann werden 113,5 ml einer wässrigen Stromaaufschlämmung in einer 0,9 ^igen wässrigen Natriumchloridlösung zugegeben und das Ganze wird etwa 3 Stunden bei Raumtemperatur

% gerührt. Das Gemisch läßt man über Nacht in einem Kühlschrank stehen und filtriert es dann. Der Rückstand wird verworfen,und das Filtrat wird nochmals mit 113,5 ml wässriger Stromaaufschlämmung in"0,9 tigern Natriumchlorid behandelt. Es wird wieder filtriert,und der Hämagglutinationstiter an diesem Punkt beträgt 1-2.

Beispiel 9

Nach dem Verfahren des Beispiels 8 werden 1 875 ml Anti-Human- Thymocytenplasma vom Pferd rr.it 87 ml 0,9 molarem Natriurnbicarbonat auf pH 7,6 eingestellt. Danach werden langsam unter Rühren 7 848 ml 0,4 $iger wässriger Acrinol-

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lösung zugegeben, und das Gemisch wird stehen gelassen. Hach vollständiger Ausflockung wird filtriert und der Rückstand verworfen. Das Filtrat wird mit 0,8 molarem Acetatpuffer auf pH 7,2 eingestellt» Pur die erste Adsorp tion unerwünschter Antikörper werden 37,5 ml Stromaaufschlämmung verwendet,und nach dem !Filtrieren wird die Stromabehandlung mit weiteren 37,5 ml Stromaaufschlämmung wiederholt. Zu diesem Zeitpunkt beträgt der Hämagglutinationstiter 1-2.

Beispiel 10

Die vereinigten mit Acrinol und Stroma behandelten Filtrate niederen liters der Beispiele 8 und 9 werden zur Fällung von gereinigtem gamma-Globulin mit 12 666 ml vorgekühltem Isopropanol, Temperatur etwa -20° O, versetzt. Die Temperatur des Fällungsgemisches wird langsam auf -5° C verringert. Die Konzentration des Isopropanols in der Mischung beträgt dann 25 °f> YoI./Vol. Nach dem Stehen über Facht bei -5° C wird durch 10 Minuten langes Zentrifugieren bei 2 000 U.p.M. die gamma-Globulin-Fällung von der überstehenden Flüssigkeit gebgetrennt. Die Flüssigkeit wird verworfen. Die Fällung wird mit dem kleinstmöglichen Volumen an 0,01 molarem Phosphatpuffer vom pH 6,7 ausgezogen,und die Lösung wird etwa 10 Minuten bei^GQQU.p.M. zentrifugiert. Der Rückstand wird verworfen und das FiI-trat für die nachfolgende Behandlung mit Silikagel zur Entfernung von Spuren von Acrinol und Pyrogenen verwendet.

Beispiel 11

Acritiolfällung und Stromabehandlung

4 300 ml Anti-Human-Thymocytenplasma vom Pferd werden mit 128 ml 0,9 molarem iTatriumbicarbonat auf pH 7,6 eingestellt. Unter Rühren v/erden 17 712 ml 0,4 folge wässrige

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Acrinollösung zugegeben,und das Gemisch wird 8 Stunden bei etwa 4° C stehen gelassen. Danach läßt sich durch Filtrieren der Rückstand leicht entfernen. Er wird verworfen. Das Piltrat wird mit 0,8 molarem Acetatpuffer auf pH 7,2 eingestellt. Zur Entfernung von Erythrocyten-Antikörpern werden 86 ml Stroma von roten Blutaellen zugefügt. Nach dem Filtrieren wird die Stromabehandlung mit 108 ml Stromaaufschlämmung wiederholt. Nach der Filtration beträgt der Hämagglutinationstiter 0. Die Lösung wird auf 0° C gekühlt und der pH-Wert mit Acetatpuffer auf 7,2 eingestellt. Wie in den anderen Beispielen werden 7 033 ml Isopropanol zur Fällung von gereinigtem gamma-Grlobulin zugesetzt. Dieses wird für die weitere Behandlung mit Silikagel und Diäthylaminoäthylcellulose in 2 1 OpI molarem Phosphatpuffer vom pH 6,7 gelöst.

Beispiel 12

gamma-Globulin aus Anti-Rattenserum der Ziege

Zu 210 ml Anti-Rattenserum von Ziegen werden bei pH 7,65 innerhalb von etwa 30 Minuten tropfenweise 840 ml 0,4 wässrige Acrinollösung gegeben. Das Gemisch läßt man dann bei etwa 4° C etwa 4 Stunden absitzen. Die Zentrifugation ergibt einen unlöslichen Anteil,der verworfen wird, und einen löslichen Anteil, der auf 0° C gekühlt,tropfenweise mit 350 ml Isopropanol von -20° C versetzt wird. Die Temperatur bleibt bei etwa 0- -5° C. Das Gemisch läßt man über Nacht bei etwa 0° C stehen. Nach dieser Periode des Ausflockens wird das Gemisch 10 Minuten bei 2 000 U.p.M. und etwa 5° C zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wird abgegossen und verworfen. Der unlösliche Teil wird mit 0,15 molarer Natriumchloridlösung ausgezogen, um das mit 25 $> Isopropjjfjol ausgefällte Material zu lösen. Diese Losung wird durch eine 12 ml-Schicht aus Silikagel filtriert, die in 0,15 molarer Natriumchloridlösung auf einen

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15 ml rauhen gesinterten Glastriehter geschlämmt worden war. Nach dem Filtrieren der Lösung wird das Silikagel auf dem Trichter mit 5 ml 0,15 molarer Natriumchloridlösung gewaschen. Das Gesamtvolumen an Piltrat und Waschlösungen "beträgt 52,5 ml. Die gamma-Globulinfraktion macht 2,625 g aus, ermittelt durch O.D. bei 280 mm. Sie ist frei von Acrinol.

Beispiel 13

Behandlung mit Hagnesiumsilikat

Nach dem Verfahren des Beispiels 2, jedoch unter Verwendung von 500 g Magnesiumsilikat anstelle von .500 g Silikagel wurde eine ebenso gute Entfernung des Acrinols erreicht

Beispiel H

Behandlung mit Kagnesiumtrisilikat

NpcIi äem Verfahren des Beispiels 3 wurde bei Verwendung von 500 g Magnesiumtrisilikat anstelle von.500 g Silikagel ebenfalls eine gute Entfernung von Acrinol erzielt.

Beispiel 15

Behandlung mit Calciummagnesiumsilikat

Bei Anwendung des Verfahrens nach Beispiel 4, jedoch unter Verwendung von 600 g natürlichem Calciummagnesiumsilikat anstelle von 600 g Silikagel war die Entfernung des Acrinols gleichfalls zufriedenstellend.

Beispiel 16

Behandlung mit Magnesiumsilikat

Ein ebenso gutes Ergebnis erzielte man, wenn man beim Verfahren des Beispiels 12 das Silikagel durch Magnesiumsilikat ersetzte.

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Beispiel 17

Behandlung mit Silikagel

2 000 ml menschliches Plasma (frei von hämophylem Faktor) vom pH 7,3 werden durch Zugabe von 33 ml 0,8 molarem NaHCO, auf pH 7,6 eingestellt. Unter Rühren werden darauf 8 1 0,4 $ige wässrige Acrinollöeung zugegeben. Dann wird das Gemisch über Nacht in einen Kühlschrank gestellt. Die überstehende Flüssigkeit wird abdekantiert. Volumen 9 680 ml; Gesamtfeststoffe 307,8 g, Naßgewicht, fe Sie wird in zwei gleiche Teile von je 4 840 ml geteilt.

Behandlung des Teils I

Der Teil I wird langsam durch eine Schicht aus etwa 200 g Silikagel auf einem Glasfritten-Filter geführt und mit Wasser gewaschen. Gesamtvolumen 5 050 ml. Er ist frei von Acrinol. Dann wird auf 0° C gekühlt, der pH-Wert beträgt 6,9. Er wird mit 0,8 molarer ITaHCO,-Lösung auf 7,2 eingestellt. Anschließend werden 1 802,5 ml 95 ^iges Äthanol zugefügt,und das Gemisch wird über Nacht bei -5° C in einem Kühlschrank gehalten. Die klare überstehende Flüssigkeit wird abgegossen und verworfen. Die zurückblei- ^ bende Suspension v/ird in der Kälte zentrifugiert und die W überstehende Flüssigkeit verworfen. Die Fällung v/ird in 100 ml 0,3 molarem Glycin aufgenommen. Der pH-Wert wird durch Zugabe von 0,1 molarer. Essigsäure auf 6,8 eingestellt, Der Niederschlag löst sich vollständig. Das Gesamtvolumen beträgt 161 ml. Die Lösung wird gefriergetrocknet und ergibt 8,87 g Feststoffe, die aus 6,62 g menschlichem gamma-Globulin und 2,25 g Glycin beetehen.

Behandlung dee ^iIs II

Der Teil II, pH 7,75, wird mit 0,1 molarer Essigsäure auf pH 7,2 eingestellt. Dann v/eräen langsam unter Rühren 1 727,5 ml kaltes Äthanol zugegeben. Das Gemisch wird

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über Nacht "bei -5° G in einem Kühlschrank gehalten. Die klare überstehende Flüssigkeit wird abdekantiert und verworfen. Die zurückbleibende Suspension wird zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit verworfen. Die Fällung wird zur Entfernung restlichen Äthanols unter Vakuum gehalten und dann in 600 ml 0,01 molarem Kaliumphosphatpuffer vom pH 6,8 aufgenommen. Die erhaltene Lösung wird durch eine Schicht von 450 ml Diäthylaminoäthylcellulose und dann durch eine Schicht von etwa 200 g Silikagel geführt. Das Gesamtvolumen, einschließlich der Waschwässer, beträgt 1 500 ml. Es ist frei von Acrinol. Protein (OD₂^₈), 6,375 g,

der pH-Wert beträgt 7,2. Es wird auf 0° 0 gekühlt und mit 535 ml 95 ^igem Äthanol versetzt. Nach dem Stehen über Nacht im Kühlschrank wird das Gemisch zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit verworfen. Die Fällung wird in 100 ml 0,3 molarem Glycin gelöst. Der pH-Wert wird mit 0,1 molarer Essigsäure auf 6,8 eingestellt. Das Gemisch wird zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit gefriergetrocknet. Man erhält 8,27 g Feststoffe, die aus 6,02 g menschlichem gamme-Globulin und 2,25 g Glycin bestehen.

Beispiel 18

Behandlung mit anderen Adsorptionsmitteln

Ebenso gute Ergebnisse bei der Entfernung von Acrinol werden erhalten, wenn man in den obigen Beispielen gleiche Mengen an Talkum oder eines Zeolithe, wie Heulandit, Stilbit, Chabazit, Analeit oder Natrolit verwendet, bei denen es sich um mineralische Silikate^; handelt, die auf S. 305 des Reference Book of Inorganic Chemistry, W.JK.. Lattimer und J.H- Hildebrand, Revised Edition, The MacMi-11an Company, 1940, aufgeführt sind, .

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Claims (8)

1. 20U957

   Patentansprüche

   Verfahren zur Reinigung von Proteinen des Blutserums oder Blutplasmas, wobei Acrinol zur Abtrennung des gamma-Globulins von den anderen Proteinen verwendet wird, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Entfernung des Acrinols aus einer wässrigen gamma-Globulinlösung diese Lösung mit einer für die Adsorption des Acrinols wirksamen Menge Silikagel, Magnesiumsilikat, Magnesiumtrisilikat, natürlichem Calciummagnesiumsilikat, Talkum, Heulandit, Stilbit, Chabazit, Analcit oder Natrolit in Berührung bringt und das Adsorptionsmittel abtrennt.
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man tierisches Blutserum oder -plasma verwendet, das mit menschlichem lymphoiden Gewebe behandelt wurde.
3. 3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Blutserum oder -plasma eines Pferdes verwendet, das mit menschlichen Thymocyten behandelt wurde.
4. 4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Ad^fipptionemittel Silikagel verwendet.
5. 5. Verfahren-nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man menschliches Blutserum oder -plasma verwendet.
6. 6. Verfahren zur Reinigung von gamma-Globulin aus Serum oder Plasma nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man

   (1) Plasma oder Serum bei pH 7-8 mit etwa 3,5 bis etwa 5 Volumteilen 0,4 #iger wässriger Acrinollösung versetzt und den löslichen Anteil vom unlöslichen Anteil trennt,

   0 0 0 ϊ Λ R / 17 9 3

   (2) den löslichen Anteil bei pH etwa 7 bis etwa 8 mit menschlichem Erythrocytenstroma oder Erythrocyten vermischt und den löslichen Anteil gewinnt,

   (3) aus dem löslichen Anteil bei pH etwa 7 bis etwa 8 durch Zugabe von Aceton oder einem niederen Alkanol bis zu einer Konzentration des Acetone oder des niedrigen Alkanols von etwa 20 bis etwa 30 <$> Vol./ Vol. das gamma-Globulin ausfällt und die Fällung gewinnt,

   (4) das ausgefällte gamma-Globulin in Phosphatpuffer ■vom pH etwa 6,5 bis· etwa 7,5 löst, die erhaltene Lösung mit Silikagel behandelt und den löslichen Anteil gewinnt,

   (5) den löslichen Anteil über Diäthylaminoäthylcellulose führt, die mit Phosphatpuffer yq& pH etwa 6,7 ins Gleichgewicht gebracht worden ist und die Diäthylaminoäthylcellulose mit Phosphatpuffer vom pH etwa 6,7 eluiert und

   (6) aus dem Eluat durch Feststellung der Absorption bei 280 πτμ gamma-Globulin gewinnt.
7. 7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man tierisches Blutserum oder -plasma verwendet, das mit menschlichem lymphoidem Gewebe behandelt wurde.
8. 8. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man Blutserum oder -plasma eines Pferdes verwendet, das mit menschlichen Thymocyt^en behandelt wurde. '

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   20H957

   Verfahren nnch Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, ch'ii m&n menschliches Blutserum oder -plasma verwendet,

   Für

   The Upjohn Company Kolamazoo, Mich., V.St.A.

   Rc; chtsanvalt

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