CN102818889B - 检测结核杆菌脂阿拉伯甘露聚糖特异性抗体的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种检测结核杆菌脂阿拉伯甘露聚糖特异性抗体的方法。本发明提供了经乳胶微粒预处理的脂阿拉伯甘露聚糖(LAM)抗原、含所述预处理抗原的检测试剂和试剂盒。本发明的试剂盒和检测方法具有快速、高灵敏度、高特异性等优点。
Description
技术领域
本发明涉及一种免疫层析方法检测血清中结核抗体的方法，具体地说涉及使用结核杆菌脂阿拉伯甘露聚糖(LAM)抗原，采用双抗原夹心的方法制备检测血清中结核抗体的方法。
背景技术
目前，世界上有1/3的人口感染了分支杆菌，在所有可以避免的死亡人口当中，结核超过25％，是单一细菌感染最常见的死亡原因。世界卫生组织(WHO)将结核称为“全球性急症状态”。
目前，普遍认为宿主对结核杆菌的抵抗是依靠细胞免疫机制，因而大部分在研制的针对结核杆菌的疫苗是通过刺激细胞介导的免疫反应来控制结核杆菌的生长从而使机体获得保护。抗体介导的针对结核杆菌感染的保护作用目前仍然存在争议。
结核病的细菌学检查目前是结核病实验室诊断的金标准。由于痰涂片阳性率较低，镜检需要经验，难以区分环境分枝杆菌造成的假阳性；痰培养需时太长，因此细菌学检查对结核病的诊断价值有限。
随着分子生物学技术的迅速发展，用高度敏感的方法检测结核菌及其特异性DNA片段，如PCR、生物探针和基因芯片等，需要相应的检测设备和检测费用高未能广泛推广。血清学诊断技术有其固有的优势，如操作简便、快速、便于推广、无需特殊精密仪器，已有多种纯化的特异性抗原可采用，可以发展成自动化检测，尤其是对痰培养阴性和肺外结核病有较为重要的辅助诊断价值，受到广泛的重视。
结核杆菌的38kDa蛋白是一定位在质膜上的磷酸盐转运蛋白，只在分枝杆菌复合体中表达。38kDa蛋白为一分泌蛋白，可刺激T细胞和B细胞免疫反应，广泛应用于结核病的血清学试验。英国公司生产的OMEGA结核抗体定量检测Myco G、A、M试剂盒联合应用38kDa和脂多糖(LPS)抗原，而TB Complex Plus试剂盒选用的是38kDa和16kDa抗原。然而，38kDa对活动性肺结核的诊断非常有效，但和大肠埃希菌同源蛋白有30％以上的交叉，所以对不同人群的灵敏度波动较大，尤其对涂片阴性和合并HIV感染的结核病患者效果较差。
脂阿拉伯甘露聚糖(LAM)抗原指结核杆菌的脂阿拉伯甘露聚糖(LAM)。LAM是分枝杆菌细胞壁的重要组成部分，是属特异性抗原，具有较强的免疫原性和免疫调节功能，可刺激机体产生相应的抗体，比如抑制T细胞的增殖，干扰伽马干扰素介导的巨噬细胞的激活，清除毒性的氧自由基，抑制蛋白激酶的活性和抑制IL-2，IL-5，人T细胞GM-CSF的mRNA的合成，诱导巨噬细胞即时基因表达，增加单核细胞产生肿瘤坏死因子和介导补体的激活。因此，LAM是结核病的血清学诊断应用较广的抗原，有一些应用LAM抗原进行检测的报道。检测LAM抗体被认为是结核病一项有效的辅助诊断方法。例如，Antunes等人研发了结明(MycoDot TM)试剂盒，用于检测活动性肺结核病人。
现有的利用LAM抗原来检测结核抗体的试剂盒大部分是采用间接斑点法(也称为渗滤法)。该方法包括：用纯化的LAM抗原包被在硝酸纤维膜上，封闭干燥；将血清样本滴在硝酸纤维膜上，洗涤后加胶体金标记的抗人IgG、IgM二抗，如果血清中含有抗LAM抗体，二抗或Protein A将与之结合呈现红色的斑点，为阳性。反之则为阴性。虽然斑点法已经应用于临床检测，但是斑点法检测存在以下缺点：1)由于使用LAM包被间接法检测容易导致假阳性结果出现。2)渗滤法检测步骤有加样、洗涤、加标记的二抗或Protein A、洗涤等步骤。必须配备洗涤液、胶体金标记的二抗或Protein A等试剂，步骤繁琐，而且试剂容易失去活性。
目前，在快速检测中的间接法检测仅限于斑点渗滤法。虽然人们希望并尝试开发利用层析法来快速、简便地对结核杆菌进行血清检测，但是由于种种原因至今未开发出使用令人满意的、有效的、高准确性的血清学检测方法。
综上所述，本领域迫切需要开发新的快速、高效、简便、准确地血清学检测结核杆菌的方法和试剂。
发明内容
本发明的目的就是提供一种快速、高效、简便、准确地血清学检测结核杆菌的方法和试剂。
在本发明的第一方面，提供了一种结核杆菌脂阿拉伯甘露聚糖(LAM)抗原，其中，所述的结核杆菌脂阿拉伯甘露聚糖抗原吸附于或偶联于乳胶微粒。
在另一优选例中，所述的LAM抗原共价偶联于乳胶微粒。
在另一优选例中，所述的LAM抗原通过活化羟基共价偶联于乳胶微粒。
在另一优选例中，所述的结核杆菌脂阿拉伯甘露聚糖抗原与乳胶微粒的重量比为1∶2至1∶20。
所述的结核杆菌脂阿拉伯甘露聚糖抗原与乳胶微粒的重量比为1∶5至15；更佳地1∶6至1∶12，如1∶10。
在另一优选例中，所述的乳胶微粒的直径为150-200nm。
在本发明的第二方面，提供了一种结核杆菌脂阿拉伯甘露聚糖(LAM)抗原的复合物，所述复合物由乳胶颗粒以及吸附于或偶联于乳胶微粒的结核杆菌脂阿拉伯甘露聚糖抗原构成。
在另一优选例中，所述的LAM抗原共价偶联于乳胶微粒。
在另一优选例中，所述的LAM抗原通过活化羟基共价偶联于乳胶微粒。
在另一优选例中，所述的结核杆菌脂阿拉伯甘露聚糖抗原与乳胶微粒的重量比为1∶2至1∶20。
所述的结核杆菌脂阿拉伯甘露聚糖抗原与乳胶微粒的重量比为1∶5至15；更佳地1∶6至1∶12，如1∶10。
在另一优选例中，所述的乳胶微粒的直径为150-200nm。
在本发明的第三方面，提供了一种免疫层析试剂，所述的试剂含有本发明第一方面中所述的结核杆菌脂阿拉伯甘露聚糖(LAM)抗原，或第二方面中所述的LAM抗原的复合物。
在另一优选例中，所述的试剂是侧流片或侧流试纸条。
在另一优选例中，所述的侧流片或侧流试纸条包括以下组件：样品垫，结合物释放垫，检测线，反应膜，对照线，吸收垫，和背衬。
在本发明的第四方面，提供了一种试剂盒，它包括：
(a)本发明第三方面中所述的免疫层析试剂；和
(b)使用说明书。
在另一优选例中，所述的试剂是侧流片或侧流试纸条。
在另一优选例中，所述的试剂被密封于一容器或包装中。
在本发明的第五方面，提供了本发明第一方面所述的抗原或第二方面所述的复合物或第三方面所述的试剂的用途，它们被用于制备血清检测结核杆菌的试剂盒。
在本发明的第六方面，提供了一种血清检测结核杆菌的方法，包括步骤：用本发明第三方面所述的试剂或第四所述的试剂盒进行层析检测。
在本发明的第七方面，提供本发明第三方面所述的试剂或第四所述的试剂盒的用途，它们被用于血清检测结核杆菌。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了本发明一种侧流免疫层析试纸条(板)的结构示意图，其中，各标识如下：1为样品垫，2为结合物释放垫，3为检测线，4为反应膜，5为对照线，6为吸收垫，7为背衬。
图2显示了本发明侧流免疫层析检测原理的示意图。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，首次选用LAM抗原开发出了血清-层析检测结核杆菌的方法。该方法巧妙地利用了LAM抗原的脂多糖化学特征，建立了用乳胶颗粒标记LAM抗原的方法，再用双抗原夹心法，成功地检测出样本中LAM抗原的抗体。与现有的结核杆菌检测方法相比，本发明方法的简便性、快速性、灵敏度和/或特异性均有显著提高。
LAM抗原
在本发明中，术语“LAM抗原”、“脂阿拉伯甘露聚糖”、“脂阿拉伯甘露聚糖抗原”或“本发明抗原”可互换使用，指来源于结核分枝杆菌的、构成细胞壁的聚糖。
本发明的研究表明，LAM抗原是结核杆菌特异性的且经预处理后适合层析法的抗原。
LAM抗原可用常规方法进行制备、分离和纯化。
乳胶微球
可用于本发明的乳胶微球没有特别限制，可以选用市售的或用常规方法准备的乳胶微球。
乳胶微球的直径一般为10-1000nm，较佳地为50-500nm，更佳地为100-250nm，最佳地为150-200nm。
通常，本发明优选的乳胶微粒是表面带活化基团(如活化羧基)的乳胶微粒，可以为聚苯乙烯，聚丙烯或二氧化硅乳胶颗粒。
自从1947年乳胶微粒被开发应用，它已经被广泛用于各个科学领域。在医学诊断领域，从最早的乳胶凝集试验发展到今天复杂的多元化检测。以乳胶微粒作为抗原抗体的标记物，主要是由于乳胶微粒本身的特性，它可以进行多种形式表面功能化修饰，密度改变和特殊属性的改变(比如：颜色改变、荧光或磁性等)，使得乳胶成为检测中的一个重要部分。彩色乳胶微粒可以替代胶体金用于免疫层析检测。此外，结合荧光染料的荧光微粒可以用来替代发射性标记技术。
在本发明中，优选的乳胶微粒是具有某一色彩的乳胶微粒，以便于检测。一种优选的乳胶微粒是彩色乳胶微粒。
预处理的LAM抗原
本发明提供了经乳胶微粒预处理的LAM。经预处理后，LAM抗原被吸附于或偶联于乳胶微粒。当然，也可视为乳胶微粒被吸附或偶联有LAM抗原。
将LAM抗原吸附于或偶联于乳胶微粒可采用吸附法或偶联法。一种优选的方法是将LAM抗原通过乳胶微粒表面活化的羟基而共价偶联于乳胶微粒。
免疫层析侧流片
利用本发明的上述经乳胶微粒预处理的LAM，本发明还提供了免疫层析检测试剂。一种优选的检测试剂是利用侧流原理的免疫层析侧流片或免疫层析试纸条。
本发明的一种免疫层析侧流片(或试纸条)的结构如图1所示，其中包括：1样品垫，2结合物释放垫，3检测线，4反应膜，5对照线，6吸收垫，和7背衬。
在本发明中，所述侧流片的各组成元件(或组件)可选用本领域已有的材料制成。
在本发明中，根据结核病人血清中产生抗结核杆菌特异性的脂阿拉伯甘露聚糖(LAM)抗原的特异性抗体的原理，采用纯化的LAM抗原固相包被，同时用乳胶颗粒标记的LAM抗原，使用三明治双抗原夹心的方法，捕捉样本中的特异性抗体，从而进行血清检测。
为了便于理解本发明，给出本发明免疫层析侧流片的检测原理。应理解，本发明的保护范围并不受该原理的影响或限制。
如图2所示，如果血清中含有抗结核LAM的抗体(IgG或IgM)，抗体将与乳胶标记的LAM抗原结合，一起沿硝酸纤维膜向前流动，到达检测线位置时，被固定在膜上的LAM抗原捕获，形成有色的条带，则为阳性，反之，则为阴性。无论结果如何，乳胶标记的兔IgG将会与对照线上的羊抗兔IgG多抗结合，形成对照线，说明检测系统工作正常。
检测试剂盒和检测方法
本发明还提供了可用于血清检测结核杆菌的检测试剂盒。所述试剂盒包括：一容器以及位于容器内的、本发明上述的带有经乳胶微粒预处理的LAM抗原的免疫层析侧流片。
本发明提供了采用双抗原夹心的层析方法来检测病人血清中的结核抗体的方法。
本发明的试剂盒和检测方法解决了斑点渗滤法的繁琐操作，结果迅速。更重要的是提高了检测的灵敏度和特异性。降低了假阳性率。
本发明的免疫层析检测血清中结核抗体的方法和试剂(或试剂盒)，可用于结核杆菌的临床检测等场合。本发明的主要优点包括：
(a)与斑点法相比，更为简便、增加快速性。
(b)与常规的、目前使用较多的斑点法、或以结核蛋白抗原的双抗原夹心法相比，灵敏度有显著提高；
(c)与常规的斑点法等方法相比，检测特异性有显著提高。
(d)进一步降低了假阳性率。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring HarborLaboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
实施例1
LAM抗原的制备：
H37Ra菌株(该菌株的来源，ATCC 25177)培养物破碎后，用常规方法进行纯化，方法如下：用50％乙醇提取，再用苯酚和水提取，水相冻干后用含0.2M NaCl，0.25％deoxycholate，1mM EDTA，0.02％ NaN3的10mM Tris pH 8.0溶解，过Sephacryl S-200柱。获得纯化的LAM抗原。
实施例2
结核杆菌特异性的脂阿拉伯甘露聚糖(LAM)抗原乳胶微粒的预处理
在本实施例中，通过吸附法进行预处理，方法如下：
2.0x109个表面带活化羧基的聚苯乙烯乳胶颗粒直径150-200nm(BangsLaboratories，Inc.，Fishers，IN.USA)，用0.05M pH 9.6的碳酸盐缓冲液洗涤两次，10000rpm离心10分钟。用1m l0.05M pH 9.6的碳酸盐缓冲液重悬，加入50mg纯化的LAM抗原混合，在37℃下孵育2小时。离心后弃上清，用0.01M pH 7.3的磷酸盐缓冲液洗涤两次，加入含5％人血清白蛋白(HAS)的磷酸盐缓冲液，在37℃下孵育2小时。以封闭非特异结合位点。离心后用含0.5％人血清白蛋白(HAS)的磷酸盐缓冲液洗涤，再用含0.5％人血清白蛋白(HAS)的磷酸盐缓冲液重悬，保存于4℃。
经多糖检测，证实LAM抗原被吸附于乳胶微粒上。
实施例3
结核杆菌特异性的脂阿拉伯甘露聚糖(LAM)抗原乳胶微粒的预处理
在本实施例中，通过共价偶联法进行预处理，方法如下：
用0.1M的硼砂盐缓冲液稀释聚苯乙烯乳胶微粒(表面含羧基)到1wt％(乳胶微粒同实施例1)。在13000rpm下离心20分钟。弃去上清液。用0.1M pH 8.5硼砂缓冲液重悬乳胶颗粒。逐滴加入纯化的LAM抗原，总量为1mg/ml，混匀。用纯水配制量是1ml的15mg/ml EDC溶液，取1ul/ml加入到乳胶溶液中。在室温下混合过夜。加入0.1M乙醇胺溶液30ul/ml封闭，室温下旋转混合30分钟。在13000rpm下离心20分钟。弃去上清液。然后加入相同体积的用含5％的人血清白蛋白0.1M pH 8.5硼砂缓冲液重悬乳胶微粒。在室温下混合4个小时。13000rpm下离心20分钟。弃去上清液，再加入相同体积的含0.5％的人血清白蛋白0.1M pH8.5硼砂缓冲液，保存于4℃。
实施例4 免疫层析检测试剂板的制备
(1)乳胶标记的LAM抗原玻璃纤维条的制备
将实施例2或3制备的预处理的乳胶微粒的LAM抗原与含0.5％S9(表面活性剂Tetronic-1037，购自BASF公司)pH为7.4的10mM磷酸盐缓冲溶液，混合，配制成0.5mg/ml浓度的溶液，均匀地涂布在玻璃纤维素纸上，涂布量为50μl/cm2，真空干燥。
(2)乳胶标记的兔IgG玻璃纤维条的制备
将实施例2或3同样方法制备的乳胶标记的兔IgG(购自Sigma公司)与含0.5％S9(表面活性剂Tetronic-1037)pH为7.4的10mM磷酸盐缓冲溶液，混合，配制成0.5mg/ml浓度的溶液，均匀地涂布在玻璃纤维素纸上，涂布量为50μl/cm2，真空干燥。
(3)检测线和质控线
检测线：将1)纯化的LAM抗原与pH为7.4的10mM磷酸盐缓冲溶液混合配制成为浓度为0.5mg/ml的混合溶液，喷在硝酸纤维膜上，涂布量为10μl/cm2；
质控线(也称为对照线)：将羊抗兔IgG多抗(购自购自Sigma公司)与pH为7.4的10mM磷酸盐缓冲溶液混合配制成为浓度为0.8mg/ml混合溶液，喷在硝酸纤维膜上，涂布量为10μl/cm2；
然后在15～35℃干燥。
(4)样品垫的制备
样品垫材质为玻璃纤维纸或聚酯膜，用配制好的样品垫处理液浸泡样品垫，样品处理液的量为100ul/cm2，然后在37℃下晾干，样品垫的组成为：pH为7.4的10mM磷酸盐缓冲溶液，含0.5％S9(表面活性剂Tetronic-1037)，1％PVP，0.2％EDTA和0.5％BSA
(5)测试条组装
用常规方法，将以下各组件按图1所示组装成检测试剂条：
1.样品垫
2.结合物释放垫：包被乳胶标记的LAM抗原和兔IgG的玻璃纤维纸
3.检测线：硝酸纤维素膜上包被纯化的LAM抗原
4.反应膜
5.质控线：硝酸纤维素膜上包被羊抗兔IgG多抗
6.吸收垫：
7.背衬(PVC)。
实施例5 试剂板检测结果：
对检测对象，用本发明方法如下进行检测：
取20ul被测血清，用0.01M磷酸缓冲液180ul稀释，缓慢滴三滴于检测板的加样孔中，等待15分钟后判断检测结果。
如图2所示，如果血清中含有抗结核LAM的抗体(IgG或IgM)，抗体将与乳胶标记的LAM抗原结合，一起沿硝酸纤维膜向前流动，到达检测线位置时，被固定在膜上的LAM抗原捕获，形成有色的条带，则为阳性，反之，则为阴性。无论结果如何，乳胶标记的兔IgG将会与对照线上的羊抗兔IgG多抗结合，形成对照线，说明检测系统工作正常。
此外，对于同一检测对象的样品，还分别用常规的斑点渗滤法和结核蛋白双抗原夹心法进行测试。
三种方法的检测结果汇总于下表：
检测结果表明，本方法对痰阳性的结核病人样本的阳性率高于其它两种结核快速检测方法，同时，在健康成人和接种卡介苗儿童的样本检测中，本方法的假阳性率要低于其它两种方法。
另外，本发明的检测非常迅速，仅耗时10分钟左右。与之相反，斑点渗滤法则需要至少半小时。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (19)
1.一种免疫层析试剂，其特征在于，所述的试剂含有结核杆菌脂阿拉伯甘露聚糖(LAM)抗原：其中所述的结核杆菌脂阿拉伯甘露聚糖抗原吸附于或偶联于乳胶微粒，且所述的乳胶微粒是表面带活化基团的乳胶微粒，所述的结核杆菌脂阿拉伯甘露聚糖抗原与乳胶微粒的重量比为1:2至1:20。
2.如权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述的LAM抗原共价偶联于乳胶微粒。
3.如权利要求2所述的试剂，其特征在于，所述的LAM抗原通过活化羟基共价偶联于乳胶微粒。
4.如权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述的结核杆菌脂阿拉伯甘露聚糖抗原与乳胶微粒的重量比为1:5至15。
5.如权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述的结核杆菌脂阿拉伯甘露聚糖抗原与乳胶微粒的重量比为1:6至1:12。
6.如权利要求5所述的试剂，其特征在于，所述的乳胶微粒的直径为150-200nm。
7.一种免疫层析试剂，其特征在于，所述的试剂含有LAM抗原的复合物，所述复合物由乳胶颗粒以及吸附于或偶联于乳胶微粒的结核杆菌脂阿拉伯甘露聚糖抗原构成，且所述的乳胶微粒是表面带活化基团的乳胶微粒，所述的结核杆菌脂阿拉伯甘露聚糖抗原与乳胶微粒的重量比为1:2至1:20。
8.如权利要求7所述的试剂，其特征在于,所述的LAM抗原共价偶联于乳胶微粒。
9.如权利要求7所述的试剂，其特征在于,所述的LAM抗原通过活化羟基共价偶联于乳胶微粒。
10.如权利要求7所述的试剂，其特征在于,所述的结核杆菌脂阿拉伯甘露聚糖抗原与乳胶微粒的重量比为1:5至15。
11.如权利要求7所述的试剂，其特征在于,所述的结核杆菌脂阿拉伯甘露聚糖抗原与乳胶微粒的重量比为1:6至1:12。
12.如权利要求1所述的试剂，其特征在于,所述的乳胶微粒的直径为150-200nm。
13.一种侧流片或侧流试纸条，其特征在于，所述的侧流片或侧流试纸条含有如权利要求1或7所述的试剂。
14.如权利要求13所述的侧流片或侧流试纸条，其特征在于，所述的侧流片或侧流试纸条包括以下组件：样品垫，结合物释放垫，检测线，反应膜，对照线，吸收垫，和背衬。
15.一种试剂盒，其特征在于，包括：
(a)权利要求1所述的免疫层析试剂；和
(b)使用说明书。
16.如权利要求15所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括侧流片或侧流试纸条。
17.如权利要求15所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂被密封于一容器或包装中。
18.一种非诊断且非治疗性地血清检测结核杆菌的方法，其特征在于，包括步骤：权利要求1所述的试剂或权利要求15所述的试剂盒进行层析检测。
19.如权利要求1所述的试剂或如权利要求15所述的试剂盒的用途，其特征在于，它们被用于非诊断且非治疗性地血清检测结核杆菌。
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Effective date of registration: 20170629 Address after: 200231, room 317, building 2A, 2715 Wu Long Road, Shanghai, Xuhui District Patentee after: VENTURE BIOTECHNOLOGY CO.,LTD. Address before: 200231, room 2, building 2715, 317 Wu Long Road, Shanghai, Xuhui District Patentee before: Shanghai Yesbio Bio-Tech Co.,Ltd. |
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| TR01 | Transfer of patent right | ||
| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right |
Denomination of invention: A Method for Detecting Specific Antibodies Against Mycobacterium tuberculosis Lipid Aramannan Granted publication date: 20170510 Pledgee: The Bank of Shanghai branch Caohejing Limited by Share Ltd. Pledgor: VENTURE BIOTECHNOLOGY CO.,LTD. Registration number: Y2024980005346 |
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| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right |