JPH0333657A - 分子集合体で被覆された免疫測定用磁性体標識体 - Google Patents
分子集合体で被覆された免疫測定用磁性体標識体Info
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- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
「産業上の利用分野」
本発明は、抗原抗体反応を利用して、きわめて微量の検
体から特定の抗体または抗原を、定量的に検出すること
ができるレーザ磁気免疫センザに用いる磁性体標識体の
製造方法に関するものである。
体から特定の抗体または抗原を、定量的に検出すること
ができるレーザ磁気免疫センザに用いる磁性体標識体の
製造方法に関するものである。
「従来の技術」
後天性免疫不全症候群、成人T細胞白血病等のような新
型ウィルス性疾病、あるいは各種ガンの早期検査法とし
て、抗原抗体反応を利用した免疫測定法の開発が、現在
、世界的規模で推進されている。このような免疫測定法
の一つとして、抗原抗体反応の有無の検出にレーザ光を
利用し、標識飼料として磁性体微粒子を用いたレーザ磁
気免疫測定方法がある。
型ウィルス性疾病、あるいは各種ガンの早期検査法とし
て、抗原抗体反応を利用した免疫測定法の開発が、現在
、世界的規模で推進されている。このような免疫測定法
の一つとして、抗原抗体反応の有無の検出にレーザ光を
利用し、標識飼料として磁性体微粒子を用いたレーザ磁
気免疫測定方法がある。
上記標識材料に用いる磁性体微粒子としては、■市販さ
れている磁性体を分散させたポリマビーズ。
れている磁性体を分散させたポリマビーズ。
■米国特許第4452773号(Molday)、米国
特許第4454234号(Czerlinski)、米
国特許4582622号(Ikeda)、特開昭63−
5019号(角田氏)等において開示された磁性体微粒
子をポリマコートしたもの。
特許第4454234号(Czerlinski)、米
国特許4582622号(Ikeda)、特開昭63−
5019号(角田氏)等において開示された磁性体微粒
子をポリマコートしたもの。
等が挙げられる。
「発明が解決しようとする課題」
ところが、現在市販されている」二足■のボリマヒーズ
は、磁性体の含有率が高くても20%程度であり、磁場
に対する吸引力が小さいという欠点を有する。さらに、
粒径か0.1μm以下の微小な磁性体分散ポリマビーズ
はまだ市販されていないという問題がある。
は、磁性体の含有率が高くても20%程度であり、磁場
に対する吸引力が小さいという欠点を有する。さらに、
粒径か0.1μm以下の微小な磁性体分散ポリマビーズ
はまだ市販されていないという問題がある。
また、」二足■の特許で開示されている磁性体微粒子に
ポリマコートする方法は、コートするポリマがゼラチン
、デキストラン等の天然高分子の場合、水溶夜中で分子
鎖がほどけ、粒子同志が会合、凝集する欠点がある。さ
らに微粒子の表面にイオン性がないため、いわゆる電気
二重層を形成できずに粒子が帯電しないので、静電的な
反発力が期待できない。この点からも、粒子同志の会合
、凝集が起こりやすくなる欠点を有する。
ポリマコートする方法は、コートするポリマがゼラチン
、デキストラン等の天然高分子の場合、水溶夜中で分子
鎖がほどけ、粒子同志が会合、凝集する欠点がある。さ
らに微粒子の表面にイオン性がないため、いわゆる電気
二重層を形成できずに粒子が帯電しないので、静電的な
反発力が期待できない。この点からも、粒子同志の会合
、凝集が起こりやすくなる欠点を有する。
また、これまでの磁性体微粒子は磁性を用いた分離用で
あり、粒子の粒径に対しては何等注意は払われていない
。実際、市販の磁性体を含むポリマビーズでは粒径分布
は幅広く、本レーザ磁気免疫測定には適用できないとい
う問題がある。
あり、粒子の粒径に対しては何等注意は払われていない
。実際、市販の磁性体を含むポリマビーズでは粒径分布
は幅広く、本レーザ磁気免疫測定には適用できないとい
う問題がある。
さらに、特定の抗体または抗原あるいは中間物質を選択
的に結合するために磁性体微粒子表面の化学的特性基を
磁性体微粒子作製時に付与する方法はない。このため、
後処理に上って、特性基を付与しているのが現状である
。
的に結合するために磁性体微粒子表面の化学的特性基を
磁性体微粒子作製時に付与する方法はない。このため、
後処理に上って、特性基を付与しているのが現状である
。
本発明は、」二足事情に鑑みてなされたもので、■微粒
子同志の融合、会合がなく、 ■イオン性基をその表面にもち、電気的反発を有し、 ■化学的特性基をその表面に有し、 ■磁性体標識体の粒径分布が小さい、 免疫測定用磁性体標識体を提供することを目的とするも
のである。
子同志の融合、会合がなく、 ■イオン性基をその表面にもち、電気的反発を有し、 ■化学的特性基をその表面に有し、 ■磁性体標識体の粒径分布が小さい、 免疫測定用磁性体標識体を提供することを目的とするも
のである。
「課題を解決するための手段」
本発明においては、分子集合体で作られたマイクロカプ
セル中に超常磁性体あるいは強磁性体を収容し、この分
子集合体マイクロカプセルに抗体あるい(」抗原を結合
さU゛た分子集合体で被覆された免疫測定用磁性体標識
体、好ましくは、上記分子集合体が、グリセロリン脂質
、スフィンゴリン脂質、グリセロ糖脂質、スフィンゴ糖
脂質、コレステロールの膜形成脂質から選ばれた単一ま
たは複数の分子種より形成された分子集合体である免疫
測定用磁性体標識体を用いることにより」二足問題を解
決するようにした。
セル中に超常磁性体あるいは強磁性体を収容し、この分
子集合体マイクロカプセルに抗体あるい(」抗原を結合
さU゛た分子集合体で被覆された免疫測定用磁性体標識
体、好ましくは、上記分子集合体が、グリセロリン脂質
、スフィンゴリン脂質、グリセロ糖脂質、スフィンゴ糖
脂質、コレステロールの膜形成脂質から選ばれた単一ま
たは複数の分子種より形成された分子集合体である免疫
測定用磁性体標識体を用いることにより」二足問題を解
決するようにした。
以下、本発明の免疫測定用磁性体標識体について詳しく
説明する。
説明する。
上記分子集合体マイクロカプセルの膜を形成する膜形成
能を有する低分子化合物としては、グリセロリン脂質、
スフィンゴリン脂質、グリセロ糖脂質、スフィンゴ糖脂
質、コレステロール等の生体膜に含まれる膜形成脂質が
挙げられる。第1表に、」二足膜形成能を有する低分子
化合物の具体例を挙げる。
能を有する低分子化合物としては、グリセロリン脂質、
スフィンゴリン脂質、グリセロ糖脂質、スフィンゴ糖脂
質、コレステロール等の生体膜に含まれる膜形成脂質が
挙げられる。第1表に、」二足膜形成能を有する低分子
化合物の具体例を挙げる。
(以下、余白)
本発明の磁性体標識体は、このような生体膜に含まれる
膜形成能を有する化合物と、膜形成能を有しない生体高
分子、水溶性高分子、合成低分子、該低分子の生体高分
子との結合体より選ばれた分子種との混合膜により、磁
性体微粒子をコートシたものであってもよい。上記生体
高分子としては、例えば、グルコース、ポリペプチド等
が挙げられ、水溶性高分子としては、例えば、ポリアク
リルアミド、ポリビニルアルコール等が挙げられ、合成
低分子としては、例えば、エヂレングリコール、グリセ
リン等が挙げられる。
膜形成能を有する化合物と、膜形成能を有しない生体高
分子、水溶性高分子、合成低分子、該低分子の生体高分
子との結合体より選ばれた分子種との混合膜により、磁
性体微粒子をコートシたものであってもよい。上記生体
高分子としては、例えば、グルコース、ポリペプチド等
が挙げられ、水溶性高分子としては、例えば、ポリアク
リルアミド、ポリビニルアルコール等が挙げられ、合成
低分子としては、例えば、エヂレングリコール、グリセ
リン等が挙げられる。
また、上記生体膜に含まれる膜形成脂質以外の合戚膜形
成能合物としては、分子集合体(化学総説νo1.40
、日本化学会編、学会出版センタ)、人工細胞へのアプ
ローチ(化学増刊No、98、国武他編、化学同人)等
に示されている一本から三本の長鎖アルキルを有するア
ンモニウム塩誘導体、グリセロール誘導体や一本鎖中に
ビフェニル基、ノフェニルアゾメヂン基をもつアンモニ
ウム塩などがある。
成能合物としては、分子集合体(化学総説νo1.40
、日本化学会編、学会出版センタ)、人工細胞へのアプ
ローチ(化学増刊No、98、国武他編、化学同人)等
に示されている一本から三本の長鎖アルキルを有するア
ンモニウム塩誘導体、グリセロール誘導体や一本鎖中に
ビフェニル基、ノフェニルアゾメヂン基をもつアンモニ
ウム塩などがある。
これらの膜形成能を有する化合物の中から単数または複
数種を選択し、これを磁性体微粒子を分散した水溶液中
に混合し、超音波分散処理を施すことにより、マイクロ
カプセル状の分子集合体(以下、分子集合体マイクロカ
プセルとする。)が得られる。分子集合体マイクロカプ
セルの内部は複数の磁性体微粒子が含まれており、あた
かも磁性体微粒子が膜形成能を有する化合物の分子(以
下、膜形成分子とする。)によりコートされた状態とな
る。このときの分子集合体マイクロカプセルの粒径は用
いる膜形成分子、超音波分散の強度等によりことなるが
、−膜内にIOnmから1μm程度であり、この範囲は
、本免疫測定法において最も有用な範囲である。
数種を選択し、これを磁性体微粒子を分散した水溶液中
に混合し、超音波分散処理を施すことにより、マイクロ
カプセル状の分子集合体(以下、分子集合体マイクロカ
プセルとする。)が得られる。分子集合体マイクロカプ
セルの内部は複数の磁性体微粒子が含まれており、あた
かも磁性体微粒子が膜形成能を有する化合物の分子(以
下、膜形成分子とする。)によりコートされた状態とな
る。このときの分子集合体マイクロカプセルの粒径は用
いる膜形成分子、超音波分散の強度等によりことなるが
、−膜内にIOnmから1μm程度であり、この範囲は
、本免疫測定法において最も有用な範囲である。
この分子集合体マイクロカプセルは非常に安定であり、
従来の高分子物質によりコーティングされた磁性体微粒
子にみられるような粒子同志の会合、凝集は極めて起こ
りにくい。
従来の高分子物質によりコーティングされた磁性体微粒
子にみられるような粒子同志の会合、凝集は極めて起こ
りにくい。
このように会合、凝集が起こりにくいのは、上記膜形成
分子の分子末端(特に親水基側)にアンモニウム基、リ
ン酸基、スルホン酸基があり、これらの膜形成分子によ
り得られる分子集合体マイクロカプセルの表面がイオニ
ックになり、電気二重層を形成することにより、電気的
反発の効果がもたらされることがその要因の一つとして
挙げられる。
分子の分子末端(特に親水基側)にアンモニウム基、リ
ン酸基、スルホン酸基があり、これらの膜形成分子によ
り得られる分子集合体マイクロカプセルの表面がイオニ
ックになり、電気二重層を形成することにより、電気的
反発の効果がもたらされることがその要因の一つとして
挙げられる。
上記分子集合体マイクロカプセルは、この膜形成分子の
非晶質から結晶性への転移温度を常温以上にすることに
より、マイクロカプセルの膜の安定性をコントロールで
きる。すなわち、膜形成分子のアルキル鎖長を長くする
ことにより、転移温度は高温化し、これにより、この膜
形成分子に上る分子集合体は、常温においては極めて安
定な分子集合体になる。例えば、ホスファデジルコリン
のアルキル鎖長が炭素数22の場合、転移温度は77℃
となり、このホスファデジルコリンによる分子集合体マ
イクロカプセルは、常温において極めて安定である。さ
らには、コレステロール等の他の膜形成分子を添加する
ことにより、膜のバッキングを向上させ、膜安定性を高
めることも可能である。
非晶質から結晶性への転移温度を常温以上にすることに
より、マイクロカプセルの膜の安定性をコントロールで
きる。すなわち、膜形成分子のアルキル鎖長を長くする
ことにより、転移温度は高温化し、これにより、この膜
形成分子に上る分子集合体は、常温においては極めて安
定な分子集合体になる。例えば、ホスファデジルコリン
のアルキル鎖長が炭素数22の場合、転移温度は77℃
となり、このホスファデジルコリンによる分子集合体マ
イクロカプセルは、常温において極めて安定である。さ
らには、コレステロール等の他の膜形成分子を添加する
ことにより、膜のバッキングを向上させ、膜安定性を高
めることも可能である。
さらに、」−記膜形成分子として、重合性特性基、例え
ば、ビニル基、アセチレン基をもつ膜形成分子を選択し
、この膜形成分子を用いて分子集合体マイクロカプセル
を形成の後、重合開始剤または紫外線を用いてこの膜形
成分子間に共有結合を作ることにより、この分子集合体
マイクロカプセルの膜強度を飛躍的に向上できる。また
、この分子集合体マイクロカプセル表面の2個のアミノ
基間を低分子化合物により化学的に結合し、マイクロカ
プセル表面を安定化することもできる。
ば、ビニル基、アセチレン基をもつ膜形成分子を選択し
、この膜形成分子を用いて分子集合体マイクロカプセル
を形成の後、重合開始剤または紫外線を用いてこの膜形
成分子間に共有結合を作ることにより、この分子集合体
マイクロカプセルの膜強度を飛躍的に向上できる。また
、この分子集合体マイクロカプセル表面の2個のアミノ
基間を低分子化合物により化学的に結合し、マイクロカ
プセル表面を安定化することもできる。
なお、上記分子集合体マイクロカプセル表面に、プロテ
ィンAを共有結合させることにより、抗体を選択的に吸
着させる効果が生じ、これにより、抗原抗体反応を、高
い効率で行わせることができる。
ィンAを共有結合させることにより、抗体を選択的に吸
着させる効果が生じ、これにより、抗原抗体反応を、高
い効率で行わせることができる。
上記方法にて得られる磁性体微粒子をその中に収容した
分子集合体マイクロカプセルの粒径分布は、他の方法に
より得られる磁性体微粒子に比べて、その粒径分布が狭
いという特徴を有する。通常、実際の測定において、磁
力により磁性体微粒子を集める過程において、磁性体微
粒子への吸弓力、移動における溶液からの抵抗力、ブラ
ウン運動による移動等は、この磁性体微粒子の粒径が大
きく影響する因子である。従って、」二足粒径分布が狭
いという特徴は、測定の定量性の向上等に大きな効果を
有する。
分子集合体マイクロカプセルの粒径分布は、他の方法に
より得られる磁性体微粒子に比べて、その粒径分布が狭
いという特徴を有する。通常、実際の測定において、磁
力により磁性体微粒子を集める過程において、磁性体微
粒子への吸弓力、移動における溶液からの抵抗力、ブラ
ウン運動による移動等は、この磁性体微粒子の粒径が大
きく影響する因子である。従って、」二足粒径分布が狭
いという特徴は、測定の定量性の向上等に大きな効果を
有する。
また、粒径の均一化をさらに図るため、磁性による分画
の手法も可能である。これは、磁性体微粒子を内包した
分子集合体マイクロカプセルに強力な磁場を与え、その
移動度の違いによりふるい分け、粒径の整った単分散の
分子集合体マイクロカプセルを得るというものである。
の手法も可能である。これは、磁性体微粒子を内包した
分子集合体マイクロカプセルに強力な磁場を与え、その
移動度の違いによりふるい分け、粒径の整った単分散の
分子集合体マイクロカプセルを得るというものである。
以上述べたように、分子集合体マイクロカプセルは、膜
形酸分子を自由に選択でき、さらに、他の膜形成能を有
しない分子も導入できるため、免疫測定用磁性体微粒子
として必要な条件、すなわち、 ■粒子同志の会合、凝集がなく、長期保存性がよい。
形酸分子を自由に選択でき、さらに、他の膜形成能を有
しない分子も導入できるため、免疫測定用磁性体微粒子
として必要な条件、すなわち、 ■粒子同志の会合、凝集がなく、長期保存性がよい。
2
■イオン性基を有し、電気的反発により水溶夜中の分散
性がよい。
性がよい。
■化学的特性基を表面に有し、生体分子との結合性がよ
い。
い。
■粒径分布が小さく、定量性が高い
を十分満足するものである。
「実施例」
以下、本発明の免疫測定用磁性体標識体について実施例
を用いて具体的に説明する。
を用いて具体的に説明する。
本発明の磁性体標識体は、
■分子集合体マイクロカプセルに収容される磁性体微粒
子を製造する工程、 ■分子集合体マイクロカプセルを製造すると共にその内
部に■にて製造した磁性体微粒子を収容する工程、 ■磁性体標識体を製造する工程、 の各工程を経て製造されるものである。以下、この工程
順に従い説明する。
子を製造する工程、 ■分子集合体マイクロカプセルを製造すると共にその内
部に■にて製造した磁性体微粒子を収容する工程、 ■磁性体標識体を製造する工程、 の各工程を経て製造されるものである。以下、この工程
順に従い説明する。
(実施例1 )
[磁性体微粒子の製造]
3
本発明に用いる磁性体微粒子は1μm以下、望ましくは
0.1μm以下の粒径を持つものであって、水溶液中に
分散するものであることが望ましい。
0.1μm以下の粒径を持つものであって、水溶液中に
分散するものであることが望ましい。
そこで、従来法であるエルモア(Emore)法により
製造した。すなわち、塩化第一鉄(F eCI2・4
Hzo)4gと塩化第二鉄(PeC1,−6I20)I
O,8gを600ccの蒸留水に溶かし、液温85℃
に保ち、NaOHI Og/ 100cc溶液を滴下し
ながら、よくかき混ぜる。約5分間滴下および攪拌を続
け、マグネタイトPe304微粒子の黒色沈澱が得られ
る。
製造した。すなわち、塩化第一鉄(F eCI2・4
Hzo)4gと塩化第二鉄(PeC1,−6I20)I
O,8gを600ccの蒸留水に溶かし、液温85℃
に保ち、NaOHI Og/ 100cc溶液を滴下し
ながら、よくかき混ぜる。約5分間滴下および攪拌を続
け、マグネタイトPe304微粒子の黒色沈澱が得られ
る。
このマグネタイトFe304微粒子の沈澱が完全に沈降
したら、静かに上澄み液をすて蒸留水を加えよくかき混
ぜ放置し、再び上澄み液を捨てる方法(いわゆる傾斜沈
澱法)10回繰り返す。この方法で得られた沈澱を0.
INのNaC1で分散させ、濾紙を通過したものをビー
力に採取する。このようにして、よく分散した磁性体微
粒子コロイドが得られた。この磁性体微粒子の粒径を光
散乱法で測定した結果、粒径が100人〜130人の磁
性体微粒子が全体の95%以上であった。
したら、静かに上澄み液をすて蒸留水を加えよくかき混
ぜ放置し、再び上澄み液を捨てる方法(いわゆる傾斜沈
澱法)10回繰り返す。この方法で得られた沈澱を0.
INのNaC1で分散させ、濾紙を通過したものをビー
力に採取する。このようにして、よく分散した磁性体微
粒子コロイドが得られた。この磁性体微粒子の粒径を光
散乱法で測定した結果、粒径が100人〜130人の磁
性体微粒子が全体の95%以上であった。
」二足磁性体微粒子は適当な界面活性剤、例えば、ドラ
イウェル(商品名 富士フィルム社製)を添加すること
によって、コロイド状態の安定性を向上することができ
る。
イウェル(商品名 富士フィルム社製)を添加すること
によって、コロイド状態の安定性を向上することができ
る。
[分子集合体マイクロカプセルの製造]このマグネタイ
ト磁性体微粒子10mg/20cc水溶液に、グリセロ
リン脂質の1種であり炭素数16のホスファチジルエタ
ノールアミンであるジパルミトイルホスファチジルエタ
ノールアミン50 mg/ 3 ccクロロホルム溶液
を加えた後、40°Cに昇温し窒素ガスを10分間送り
クロロホルムを除去した。この溶液に5分間の超音波処
理を2回繰り返し、分子集合体マイクロカプセルいわゆ
るリポソームが得られた。得られたリポソームの粒径は
光散乱法の測定した結果、粒径が400〜600人のも
のが全体の80%以上であり、電子顕微鏡による観察に
より、上記分子集合体マイクロカプセルがほぼ球形に近
い形状であることが確認された。この分子集合体マイク
ロカプセル分散水溶液を4℃の条件下で1力月保存後、
分散状態を目視観察した結果、沈降物は認められなかっ
た。。
ト磁性体微粒子10mg/20cc水溶液に、グリセロ
リン脂質の1種であり炭素数16のホスファチジルエタ
ノールアミンであるジパルミトイルホスファチジルエタ
ノールアミン50 mg/ 3 ccクロロホルム溶液
を加えた後、40°Cに昇温し窒素ガスを10分間送り
クロロホルムを除去した。この溶液に5分間の超音波処
理を2回繰り返し、分子集合体マイクロカプセルいわゆ
るリポソームが得られた。得られたリポソームの粒径は
光散乱法の測定した結果、粒径が400〜600人のも
のが全体の80%以上であり、電子顕微鏡による観察に
より、上記分子集合体マイクロカプセルがほぼ球形に近
い形状であることが確認された。この分子集合体マイク
ロカプセル分散水溶液を4℃の条件下で1力月保存後、
分散状態を目視観察した結果、沈降物は認められなかっ
た。。
さらに、光散乱法による粒径測定の結果、その分布状態
は保存前のそれと一致した。
は保存前のそれと一致した。
同様にホスファチジルセリン、ホスファチジルコリン、
ホスファデジルグリセロールを用いてもほぼ同様を特性
を持つリポソームが得られた。
ホスファデジルグリセロールを用いてもほぼ同様を特性
を持つリポソームが得られた。
[磁性体標識体の製造]
上記分子集合体マイクロカプセル分散水溶液2cc(I
Omg/ I cc)に25重量%グルタルアルデヒ
ド水溶液(0,2cc)を加え、23℃で90分間反応
させた。その後、2mgの精製プロティンAを添加し、
23℃で15時間連続撹し、0.05Mのグリシンを加
え反応を停止した。未反応プロティンAをゲルクロマト
グラム(Sephacryl S −300)で除去
した。
Omg/ I cc)に25重量%グルタルアルデヒ
ド水溶液(0,2cc)を加え、23℃で90分間反応
させた。その後、2mgの精製プロティンAを添加し、
23℃で15時間連続撹し、0.05Mのグリシンを加
え反応を停止した。未反応プロティンAをゲルクロマト
グラム(Sephacryl S −300)で除去
した。
このようにして処理されたプロティンA被覆のマイクロ
カプセル6mgに、ウサギ血清から単離したインフルエ
ンザウィルスIgG抗体12mgを添加し、4℃で15
時間反応させた。その後、遠心6 分離により未反応1gGを除き、IgG抗体、プロティ
ンAおよび磁性微粒子を内抱した分子集合体マイクロカ
プセルからなる磁性体標識体が得られた。
カプセル6mgに、ウサギ血清から単離したインフルエ
ンザウィルスIgG抗体12mgを添加し、4℃で15
時間反応させた。その後、遠心6 分離により未反応1gGを除き、IgG抗体、プロティ
ンAおよび磁性微粒子を内抱した分子集合体マイクロカ
プセルからなる磁性体標識体が得られた。
この磁性体標識体を第1図に示す。図中符号1は、膜形
成分子を示す。この膜形成分子1は、磁性体微粒子2を
収容するようにマイクロカプセル状の膜(分子集合体マ
イクロカプセル3)を形成している。この分子集合体マ
イクロカプセル3の外周壁には、プロティンA4が共有
結合により結合しており、このプロティンA4には、抗
体5が結合している。
成分子を示す。この膜形成分子1は、磁性体微粒子2を
収容するようにマイクロカプセル状の膜(分子集合体マ
イクロカプセル3)を形成している。この分子集合体マ
イクロカプセル3の外周壁には、プロティンA4が共有
結合により結合しており、このプロティンA4には、抗
体5が結合している。
この磁性体標識体を分散した溶液(0、I ce)は、
40 HAのインフルエンザウィルスを眼着することか
できた。また、本発明者による特頼昭63−10291
4号の「レーザ磁気免疫測定法及び測定装置並びにレー
ザ磁気免疫測定に用いる超常磁性体標識体及びその製造
方法」に開示されている測定方法を用いると10個程度
のインフルエンザウィルスを測定できた。
40 HAのインフルエンザウィルスを眼着することか
できた。また、本発明者による特頼昭63−10291
4号の「レーザ磁気免疫測定法及び測定装置並びにレー
ザ磁気免疫測定に用いる超常磁性体標識体及びその製造
方法」に開示されている測定方法を用いると10個程度
のインフルエンザウィルスを測定できた。
7
(比較例)
比較のため、モルデイ(Molday)らの文献(Jo
urnal of I+nmunological M
ethods、 52,353(19g2) )に従い
、得られたデキストラン被覆の磁性体微粒子に上記実施
例Iに示す処理と同等の処理を行い、プロティンAおよ
びインフルエンザウィルス抗体を結合した磁性体標識体
を作製した。
urnal of I+nmunological M
ethods、 52,353(19g2) )に従い
、得られたデキストラン被覆の磁性体微粒子に上記実施
例Iに示す処理と同等の処理を行い、プロティンAおよ
びインフルエンザウィルス抗体を結合した磁性体標識体
を作製した。
実施例1および比較例の磁性体標識体に対して、赤血球
凝集抑制試験による抗体価()[価)を測定した。その
結果を第1表に示す。
凝集抑制試験による抗体価()[価)を測定した。その
結果を第1表に示す。
第1表
磁性体に標識しないフリーな抗体では512のHI価の
値が得られており、これに比べ実施例1のものでは17
2程度しか低下しない。これに対して、比較例のもので
は1/lOも低下しており、上記実施例1の磁性体標識
体は抗体価の低下の少ない優れた磁性体標識体であるこ
とがわかる。
値が得られており、これに比べ実施例1のものでは17
2程度しか低下しない。これに対して、比較例のもので
は1/lOも低下しており、上記実施例1の磁性体標識
体は抗体価の低下の少ない優れた磁性体標識体であるこ
とがわかる。
(実施例2 )
[磁性体微粒子の製造]
F e(OC4H[1)3を1重量%含有するブタノー
ル溶戒をエタノールで3倍に希釈した後、この溶液を5
℃に保ちつツ、F e(OC4He)31モルに対して
6モル相当分の蒸留水を、上記溶液中に超音波振動を加
えながら滴下した。さらに、この溶液を50℃から80
℃に保持して、約1時間静置して加水分解反応を進行さ
せ、溶液内に微粒子を生成させた。これに凝集、沈降を
防ぐため、市販の界面活性剤を添加した。
ル溶戒をエタノールで3倍に希釈した後、この溶液を5
℃に保ちつツ、F e(OC4He)31モルに対して
6モル相当分の蒸留水を、上記溶液中に超音波振動を加
えながら滴下した。さらに、この溶液を50℃から80
℃に保持して、約1時間静置して加水分解反応を進行さ
せ、溶液内に微粒子を生成させた。これに凝集、沈降を
防ぐため、市販の界面活性剤を添加した。
[分子集合体マイクロカプセルの製造]この磁性微粒子
水溶液(5mg/ I Occ)にジパルミトイルホス
ファチジルエタノールアミンI O’mgおよびコレス
テロール40mgのクロロホルム溶液3ccを加え、4
0℃で10分間窒素ガスを送り、クロロホルムを除去し
た。この溶液に5分間の超音波処理を2回繰り返し、分
子集合体マイクロカプセル、いわゆるリポソームが得ら
れた。このリポソームの粒径を光散乱法で測定した結果
、粒径が300人〜400人のリポソームが、全体の9
0%以上であり、電顕観察上りほぼ球形に近い形状であ
ることが確認された。このマイクロカプセル分散水溶液
を、温度4℃の条件下で2力月間保存後分散状態を目視
観察した結果、沈降物は認められなかった。さらに、光
散乱法による粒径測定の結果、その分布状態は、保存前
のそれと一致した。
水溶液(5mg/ I Occ)にジパルミトイルホス
ファチジルエタノールアミンI O’mgおよびコレス
テロール40mgのクロロホルム溶液3ccを加え、4
0℃で10分間窒素ガスを送り、クロロホルムを除去し
た。この溶液に5分間の超音波処理を2回繰り返し、分
子集合体マイクロカプセル、いわゆるリポソームが得ら
れた。このリポソームの粒径を光散乱法で測定した結果
、粒径が300人〜400人のリポソームが、全体の9
0%以上であり、電顕観察上りほぼ球形に近い形状であ
ることが確認された。このマイクロカプセル分散水溶液
を、温度4℃の条件下で2力月間保存後分散状態を目視
観察した結果、沈降物は認められなかった。さらに、光
散乱法による粒径測定の結果、その分布状態は、保存前
のそれと一致した。
このように複数の膜形成分子を混合し膜形成することも
可能であり、本実施例の場合、コレステロールを混合す
ることにより膜強度の向上を図ることができた。
可能であり、本実施例の場合、コレステロールを混合す
ることにより膜強度の向上を図ることができた。
(実施例3 )
実施例1と同様の方法により得られた磁性体微粒子水溶
肢10mg720ccに、ジアセチレン基をもっホスフ
ァチジルコリフ50mg/クロロホルム3cc溶液を加
え、実施例1と同様の方法で磁性体微粒子を内包した分
子集合体マイクロカプセルを0 得た。
肢10mg720ccに、ジアセチレン基をもっホスフ
ァチジルコリフ50mg/クロロホルム3cc溶液を加
え、実施例1と同様の方法で磁性体微粒子を内包した分
子集合体マイクロカプセルを0 得た。
この分子集合体マイクロカプセルl0mg/水溶液10
ccに高圧水銀灯(500W)から得られる紫外線を1
時間照射し、分子集合体からなる膜を重合させた。重合
は、可視吸収スペクトルの496nm、540nmのピ
ーク強度をモニタすることにより確認した。このように
して得られた重合分子集合体マイクロカプセルは、重合
前に比べ膜安定性が大きく向上する。
ccに高圧水銀灯(500W)から得られる紫外線を1
時間照射し、分子集合体からなる膜を重合させた。重合
は、可視吸収スペクトルの496nm、540nmのピ
ーク強度をモニタすることにより確認した。このように
して得られた重合分子集合体マイクロカプセルは、重合
前に比べ膜安定性が大きく向上する。
この重合したマイクロカプセルに実施例1と同様の処理
を行い、プロティンA及びインフルエンザ抗体を結合さ
せ、免疫測定用磁性体標識体を作製 し ノこ 。
を行い、プロティンA及びインフルエンザ抗体を結合さ
せ、免疫測定用磁性体標識体を作製 し ノこ 。
(実施例4 )
3Qの0.145M NaC1を含む0.05M
Tris−HCI(Pl(7,5)緩衝肢に、過剰のベ
プヂダーゼと300gのブドウ状球菌とを加え、37℃
で1昼夜攪拌した。その後、この溶液をゲル濾過し、最
終成分を分取した。分取された成分は、ブドウ状球菌細
胞壁のベプヂドグルカン部位にお1 けるテトラペプチド鎖が加水分解されて得られた糖タン
パクである3、 この糖タンパクを実施例1により得られた分子集合体マ
イクロカプセルに、グルタルアルデヒドを用いて結合さ
せ、糖タンパクでさらに被覆されたマイクロカプセルを
得た。このマイクロカプセルにプロティンAを結合させ
たところ、はぼ100%の収率で捕捉され、さらにTg
G抗体も高い抗体価を示した。
Tris−HCI(Pl(7,5)緩衝肢に、過剰のベ
プヂダーゼと300gのブドウ状球菌とを加え、37℃
で1昼夜攪拌した。その後、この溶液をゲル濾過し、最
終成分を分取した。分取された成分は、ブドウ状球菌細
胞壁のベプヂドグルカン部位にお1 けるテトラペプチド鎖が加水分解されて得られた糖タン
パクである3、 この糖タンパクを実施例1により得られた分子集合体マ
イクロカプセルに、グルタルアルデヒドを用いて結合さ
せ、糖タンパクでさらに被覆されたマイクロカプセルを
得た。このマイクロカプセルにプロティンAを結合させ
たところ、はぼ100%の収率で捕捉され、さらにTg
G抗体も高い抗体価を示した。
(実施例5 )
実施例1と同様の方法で得られたプロティンA被覆の分
子集合体マイクロカプセル6mgを、1重量%グルタル
アルデヒド溶液に1時間浸し、さらにNaBH,で還元
処理した。その後、005Mのリン酸緩衝液(PBS)
を用いて、4℃で15時間透析し、未反応のグルタルア
ルデヒドおよびNa B I44を除いた。
子集合体マイクロカプセル6mgを、1重量%グルタル
アルデヒド溶液に1時間浸し、さらにNaBH,で還元
処理した。その後、005Mのリン酸緩衝液(PBS)
を用いて、4℃で15時間透析し、未反応のグルタルア
ルデヒドおよびNa B I44を除いた。
このようにして得られたマイクロカプセルは、このマイ
クロカプセル表面の未反応のアミノ基を不活性にし、さ
らにグルタルアルデヒドのアミノ基間の架橋反応によっ
てマイクロカプセル表面を補強できた。
クロカプセル表面の未反応のアミノ基を不活性にし、さ
らにグルタルアルデヒドのアミノ基間の架橋反応によっ
てマイクロカプセル表面を補強できた。
この方法によって処理されたプロティンA被覆の分子集
合体マイクロカプセルに、実施例1と同様にインフルエ
ンザウィルス抗体を結合させ、磁性体標識体を得た。
合体マイクロカプセルに、実施例1と同様にインフルエ
ンザウィルス抗体を結合させ、磁性体標識体を得た。
上記方法によって得られた免疫測定用磁性体標識体は、
凝集安定性に優れ、かつ高い抗体価を示した。
凝集安定性に優れ、かつ高い抗体価を示した。
(実施例6 )
第1表に示すリン脂質、糖脂質、コレステロールを単独
もしくは混合物で用いて、上記方法と同様な処理を行う
ことにより分子集合体マイクロカプセルを得た。この分
子集合体マイクロカプセルも」−記分子集合体マイクロ
カプセルと同様の特性を有するものであった。
もしくは混合物で用いて、上記方法と同様な処理を行う
ことにより分子集合体マイクロカプセルを得た。この分
子集合体マイクロカプセルも」−記分子集合体マイクロ
カプセルと同様の特性を有するものであった。
(実施例7 )
実施例1と同様の方法により得られた磁性体微粒子水溶
液10mg/20ccに、ジアセチレン基をもつホスフ
ァチノルコリン20mg/コレステロール15mg/ク
ロロホルム3cc溶肢を加え、実施例1と同様の方法で
磁性微粒子を内包した分子集合体マイクロカプセルを得
た。
液10mg/20ccに、ジアセチレン基をもつホスフ
ァチノルコリン20mg/コレステロール15mg/ク
ロロホルム3cc溶肢を加え、実施例1と同様の方法で
磁性微粒子を内包した分子集合体マイクロカプセルを得
た。
このマイクロカプセル10mg/水溶液10ccに高圧
水銀灯(500W)から得られる紫外線を1時間順Ω・
1し、分子集合体からなる膜を重合させた。
水銀灯(500W)から得られる紫外線を1時間順Ω・
1し、分子集合体からなる膜を重合させた。
重合は可視吸収スペクトルの496nm、 540nm
のピーク強度をモニタすることにより確認した。
のピーク強度をモニタすることにより確認した。
このようにして得られた重合分子集合体のマイクロカプ
セルは重合前に比べ膜安定性が大きく向」ニする。
セルは重合前に比べ膜安定性が大きく向」ニする。
この重合したマイクロカプセルに実施例1と同様の処理
を行い、プロティンA及びインフルエンザ抗体を結合さ
せ、免疫測定用磁性体標識体を作成した。
を行い、プロティンA及びインフルエンザ抗体を結合さ
せ、免疫測定用磁性体標識体を作成した。
「発明の効果」
本発明は、分子集合体で作られたマイクロカプセル中に
超常磁性体あるいは強磁性体を収容し、この分子集合体
マイクロカプセルに抗体あるいは抗原を結合させたこと
を特徴とする分子集合体で4 被覆された免疫測定用磁性体標識体であるので、高分子
がもつ生体に対する非特異反応性を除失するとともに、
分子集合体の表面電荷による静電的反発でマイクロカプ
セル同志の凝集が抑制される。
超常磁性体あるいは強磁性体を収容し、この分子集合体
マイクロカプセルに抗体あるいは抗原を結合させたこと
を特徴とする分子集合体で4 被覆された免疫測定用磁性体標識体であるので、高分子
がもつ生体に対する非特異反応性を除失するとともに、
分子集合体の表面電荷による静電的反発でマイクロカプ
セル同志の凝集が抑制される。
さらに、分子集合体表面およびプロティンAの極仕基を
化学結合することによってプロティンAの配向制御を可
能とした。この結果、抗体または抗原の結合部位を抗原
抗体反応し易い立体配置をとることができる。さらに、
材料選択性の自由度が大きく多様な標識体を容易に設計
でき、また製造方法も簡易である。
化学結合することによってプロティンAの配向制御を可
能とした。この結果、抗体または抗原の結合部位を抗原
抗体反応し易い立体配置をとることができる。さらに、
材料選択性の自由度が大きく多様な標識体を容易に設計
でき、また製造方法も簡易である。
従って、本発明の磁性体標識体は、レーザ磁気゛免疫測
定法において、特異性が高く、保存性に優れ、高感度で
さらに安価に製造することができるという効果を有する
ものである。
定法において、特異性が高く、保存性に優れ、高感度で
さらに安価に製造することができるという効果を有する
ものである。
第1図は本発明において得られる磁性体標識体の一例を
示す模式図である。 1 ・・ 分子集合体を構成する膜形成分子、5 2 ・・・・磁性体微粒子、 3 ・・・・分子集合体マイクロカプセル、プロティン
A1 抗体。
示す模式図である。 1 ・・ 分子集合体を構成する膜形成分子、5 2 ・・・・磁性体微粒子、 3 ・・・・分子集合体マイクロカプセル、プロティン
A1 抗体。
Claims (5)
- (1)分子集合体で作られたマイクロカプセル中に超常
磁性体あるいは強磁性体を収容し、この分子集合体マイ
クロカプセルに抗体あるいは抗原を結合させたことを特
徴とする分子集合体で被覆された免疫測定用磁性体標識
体。 - (2)請求項(1)において、上記分子集合体が、グリ
セロリン脂質、スフィンゴリン脂質、グリセロ糖脂質、
スフィンゴ糖脂質、コレステロールの膜形成脂質から選
ばれた単一または複数の分子種より形成されることを特
徴とする分子集合体で被覆された免疫測定用磁性体標識
体。 - (3)請求項(2)において、上記分子集合体が、分子
鎖中または分子末端にアセチレン基、ビニル基の不飽和
基を有し、重合または二分子反応が可能な分子種で形成
されることを特徴とする分子集合体で被覆された免疫測
定用磁性体標識体。 - (4)請求項(2)において、上記分子集合体が、グリ
セロリン脂質、スフィンゴリン脂質、グリセロ糖脂質、
スフィンゴ糖脂質、コレステロールの天然膜形成脂質と
、膜形成能を有しない生体高分子、水溶性高分子、合成
低分子または該低分子の生体高分子との結合体より選ば
れた分子種との混合膜より形成されることを特徴とする
分子集合体で被覆された免疫測定用磁性体標識体。 - (5)分子集合体で作られたマイクロカプセル中に超常
磁性体あるいは強磁性体を収容し、この分子集合体マイ
クロカプセルの表面に、プロテインAを共有結合させ、
さらに、このプロテインAに抗体あるいは抗原を結合さ
せたことを特徴とする分子集合体で被覆された免疫測定
用磁性体標識体。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP16876789A JPH0333657A (ja) | 1989-06-30 | 1989-06-30 | 分子集合体で被覆された免疫測定用磁性体標識体 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP16876789A JPH0333657A (ja) | 1989-06-30 | 1989-06-30 | 分子集合体で被覆された免疫測定用磁性体標識体 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH0333657A true JPH0333657A (ja) | 1991-02-13 |
Family
ID=15874075
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP16876789A Pending JPH0333657A (ja) | 1989-06-30 | 1989-06-30 | 分子集合体で被覆された免疫測定用磁性体標識体 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH0333657A (ja) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2006234417A (ja) * | 2005-02-22 | 2006-09-07 | Jsr Corp | 磁性粒子分散体および診断薬用粒子 |
JP2011185874A (ja) * | 2010-03-10 | 2011-09-22 | Nippon Telegr & Teleph Corp <Ntt> | 生体分子分析用キット、これを用いた生体分子の分析方法 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS5679255A (en) * | 1979-12-03 | 1981-06-29 | Fuji Photo Film Co Ltd | New method and material for inspecting immunity |
JPS60138464A (ja) * | 1983-12-27 | 1985-07-23 | Denka Seiken Co Ltd | 新規な抗原定量法 |
-
1989
- 1989-06-30 JP JP16876789A patent/JPH0333657A/ja active Pending
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS5679255A (en) * | 1979-12-03 | 1981-06-29 | Fuji Photo Film Co Ltd | New method and material for inspecting immunity |
JPS60138464A (ja) * | 1983-12-27 | 1985-07-23 | Denka Seiken Co Ltd | 新規な抗原定量法 |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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JP2006234417A (ja) * | 2005-02-22 | 2006-09-07 | Jsr Corp | 磁性粒子分散体および診断薬用粒子 |
JP2011185874A (ja) * | 2010-03-10 | 2011-09-22 | Nippon Telegr & Teleph Corp <Ntt> | 生体分子分析用キット、これを用いた生体分子の分析方法 |
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