WO2015163131A1 - 両親媒性ブロックポリマー分子集合体の作製法 - Google Patents

両親媒性ブロックポリマー分子集合体の作製法 Download PDF

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WO2015163131A1
WO2015163131A1 PCT/JP2015/060761 JP2015060761W WO2015163131A1 WO 2015163131 A1 WO2015163131 A1 WO 2015163131A1 JP 2015060761 W JP2015060761 W JP 2015060761W WO 2015163131 A1 WO2015163131 A1 WO 2015163131A1
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WO
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molecular assembly
producing
block polymer
assembly according
container
Prior art date
Application number
PCT/JP2015/060761
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English (en)
French (fr)
Inventor
恵利 松谷
英一 小関
Original Assignee
株式会社 島津製作所
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    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J13/00—Colloid chemistry, e.g. the production of colloidal materials or their solutions, not otherwise provided for; Making microcapsules or microballoons
    • B01J13/02—Making microcapsules or microballoons
    • B01J13/04—Making microcapsules or microballoons by physical processes, e.g. drying, spraying
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08J—WORKING-UP; GENERAL PROCESSES OF COMPOUNDING; AFTER-TREATMENT NOT COVERED BY SUBCLASSES C08B, C08C, C08F, C08G or C08H
    • C08J3/00—Processes of treating or compounding macromolecular substances
    • C08J3/02—Making solutions, dispersions, lattices or gels by other methods than by solution, emulsion or suspension polymerisation techniques
    • C08J3/03—Making solutions, dispersions, lattices or gels by other methods than by solution, emulsion or suspension polymerisation techniques in aqueous media
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08J—WORKING-UP; GENERAL PROCESSES OF COMPOUNDING; AFTER-TREATMENT NOT COVERED BY SUBCLASSES C08B, C08C, C08F, C08G or C08H
    • C08J3/00—Processes of treating or compounding macromolecular substances
    • C08J3/12—Powdering or granulating

Definitions

  • the present invention relates to a novel method for producing fine particles (molecular aggregates) having a nano-level (several tens of nanometers) particle diameter used in the fields of pharmaceuticals, agricultural chemicals, foods, battery materials and the like. More specifically, the present invention relates to a so-called film method in which a solvent in which an amphiphilic block polymer is dissolved is distilled off in a container to form a film, and then a molecular assembly is prepared by adding water or the like.
  • Fine particles or molecular aggregates with nano-level particle diameter are applied in various fields.
  • the focus is on the dynamics of nanoparticles in vivo.
  • molecular imaging technology, molecular probes, and drug delivery system (DDS) technology for efficiently delivering drugs to affected areas such as tumor tissues Particles are applied.
  • DDS drug delivery system
  • attempts have been made to make a molecular probe by encapsulating a fluorescent agent such as indocyanine green (ICG) or a polymer obtained by adding a radioisotope such as 18F in such fine particles.
  • ICG indocyanine green
  • 18F radioisotope
  • the fine particles (molecular aggregates).
  • Hydrophobic polypeptide chain comprising a hydrophilic polypeptide chain having 10 or more sarcosine units, a unit selected from the group consisting of an amino acid unit and a hydroxyl acid unit as an essential constituent unit, and having 5 or more of the essential constituent units
  • a molecular assembly comprising an amphiphilic block polymer having a molecular chain (see Patent Document 1).
  • an amphiphilic block polymer having a hydrophilic block chain having 20 or more sarcosine units, a hydrophobic block chain having 10 or more lactic acid units, and 10 or more lactic acid units and a labeling group A molecular assembly comprising at least a labeled polymer (see Patent Document 2).
  • a molecular assembly having a branched amphiphilic block polymer having a branched hydrophilic block containing sarcosine and a hydrophobic block having polylactic acid see Patent Document 3).
  • At least the amphiphilic block polymers according to the above (2) and (3) can be self-assembled relatively easily to form polymer micelles having a particle size of about 30 nm, that is, molecular assembly.
  • lactosomes also called “Lactosomes” (registered trademark, hereinafter omitted) because of its excellent characteristics.
  • methods for producing molecular aggregates such as lactosomes include an injection method, a film method, an ultrasonic method, and an extruder method.
  • the injection method is a method in which an amphiphilic block polymer is dissolved in an organic solvent such as trifluoroethanol, and the resulting solution is dispersed in an aqueous solvent such as water for injection and purified by gel filtration chromatography or the like. And then removing the organic solvent.
  • an amphiphilic block polymer is dissolved in an organic solvent such as chloroform, and the organic solvent is distilled off to form a film in the container. In this method, the solvent is added and heated.
  • JP 2008-24816 A International Publication No. 2009/148121 International Publication No. 2012/176885
  • the film method a nano-level molecular assembly can be easily produced.
  • the film method is relatively easy to study conditions, and is suitable for the production of a molecular assembly of a small amount (for example, 10 mg / mL or less).
  • a molecular assembly having a uniform particle size that is, a narrow particle size distribution.
  • the amount of molecular assemblies that can be produced in one lot is not sufficient.
  • the main object of the present invention is to provide a novel production method capable of producing a molecular assembly having a more uniform particle size and a narrow particle size distribution.
  • Another object of the present invention is to provide a production method capable of increasing the amount of molecular assemblies that can be produced in one lot in the film method.
  • the inventors have formed a film by distilling off the solvent in a state where the granular material is immersed in the solution in the container, and then adding water or an aqueous solution to make the particle diameter uniform. As a result, the inventors have found that a large number of nano-level molecular assemblies can be produced, and have completed the present invention.
  • a film having the block polymer is formed by distilling off the solvent from the solution containing the linear or branched amphiphilic block polymer in the container, and then water or an aqueous solution in the container.
  • a method for producing a molecular assembly by adding a solvent to form a film by immersing one or more granular bodies in a solution in the container.
  • a method for producing a molecular assembly containing a permeable block polymer hereinafter, also referred to as “the method for producing the present invention”).
  • amphiphilic block polymer includes a hydrophilic block chain having a sarcosine unit and a hydrophobic block chain having a lactic acid unit. How to make a body.
  • a nano-level molecular assembly having a uniform particle size and a narrow particle size distribution can be produced in a large amount (high concentration) in one lot. Therefore, it is advantageous from the viewpoint of practical use and quality control of pharmaceuticals.
  • grains obtained in Example 1 is represented.
  • the vertical axis represents scattered light intensity (%)
  • the horizontal axis represents particle diameter (nm).
  • the solid line shows the particle size distribution curve after particle formation, and the broken line shows the particle size distribution curve after 200 nm filter treatment.
  • grains obtained in Example 2 is represented.
  • the vertical axis represents scattered light intensity (%)
  • the horizontal axis represents particle diameter (nm).
  • the solid line shows the particle size distribution curve after particle formation, and the broken line shows the particle size distribution curve after 200 nm filter treatment.
  • grains obtained in Example 3 is represented.
  • the vertical axis represents scattered light intensity (%), and the horizontal axis represents particle diameter (nm).
  • the solid line shows the particle size distribution curve after particle formation, and the broken line shows the particle size distribution curve after 200 nm filter treatment.
  • grains obtained in Example 4 is represented.
  • the vertical axis represents scattered light intensity (%), and the horizontal axis represents particle diameter (nm).
  • the solid line shows the particle size distribution curve after particle formation, and the broken line shows the particle size distribution curve after 200 nm filter treatment.
  • grains obtained by the comparative example 1 is represented.
  • the vertical axis represents scattered light intensity (%)
  • the horizontal axis represents particle diameter (nm).
  • the solid line shows the particle size distribution curve after particle formation
  • the rough broken line (-) shows the particle size distribution curve after the 200 nm filter treatment
  • the fine broken line (---) shows the particle size distribution curve after the 100 nm filter treatment.
  • the production method of the present invention is to form a film having the block polymer by distilling off the solvent from the solution containing the linear or branched amphiphilic block polymer in the container, and then into the container.
  • the gist of the method of the present invention is to distill off the solvent in a state where one or more granules are immersed in the solution in the container.
  • the granular body includes a step of forming a film having the block polymer by distilling off the solvent from the solution containing the linear or branched amphiphilic block polymer in the container, and water in the container.
  • a step of forming a film having the block polymer by distilling off the solvent from the solution containing the linear or branched amphiphilic block polymer in the container, and water in the container there is no particular limitation as long as the step of preparing a molecular assembly by adding an aqueous solution smoothly proceeds, and examples thereof include a sphere, an ellipsoid, a cylinder, and a polyhedron. Among them, a sphere is preferable because a film having a uniform thickness can be formed, and thereby a molecular assembly having a more uniform particle diameter can be formed.
  • the material of the granular material is inactive in the step of forming a film having an amphiphilic block polymer and the step of preparing a molecular assembly in the container, and the polymer film can be formed on the surface of the granular material.
  • Any material can be used without particular limitation, and examples thereof include glass, resin, metal, rubber, and ceramic. ⁇ ⁇ Specific examples of the granular material include glass beads, metal beads, and ceramic beads.
  • one or more granular materials may be used, and the number is not particularly limited, but usually a plurality is used.
  • the number of granules used depends on the size and shape of the granules, the capacity and shape of the container, and the like. ⁇
  • the total surface area of the one or more granules is not particularly limited, but is preferably 10 times or more, more preferably 20 times or more the surface area of the inner wall of the container in contact with the solution.
  • the surface area on which a film having an amphiphilic block polymer is formed can be increased, and a uniform thin film can be formed.
  • the polymer solution becomes more uniform.
  • the granular material on which the film is formed is physically rubbed with the inner wall of the container or between the granular materials, thereby forming particles. The effect of being performed smoothly can also be obtained.
  • the size of the granular material may be appropriately adjusted depending on the capacity of the container, the size of the mouth, etc.
  • the diameter is usually 1 to 20 mm, preferably 2 to 10 mm. is there.
  • an operation for collecting the granular material from the container can be easily performed.
  • a linear or branched amphiphilic block polymer (hereinafter also referred to simply as “amphiphilic block polymer”) is used.
  • the containing solution will be described in detail.
  • the amphiphilic block polymer is not particularly limited as long as it can form a molecular assembly by a film method.
  • it includes a hydrophilic block chain having a sarcosine unit and a hydrophobic block chain having a lactic acid unit. Is preferred.
  • the sarcosine unit of the hydrophilic block chain differs depending on whether it is linear or branched, and whether it has a constituent unit other than the sarcosine unit, etc., but the entire block chain (copolymer molecule) is hydrophilic and such a copolymer.
  • the molecule is hydrophilic to such an extent that it can self-assemble in a solvent to form a molecular assembly, and is usually in the range of 2 to 500, and 20 if it is linear.
  • the range of about ⁇ 500 is appropriate, preferably about 40 to 300, and more preferably about 50 to 100.
  • the total number of sarcosine units contained in all branches is suitably in the range of about 2 to 600, preferably about 10 to 400, and more preferably about 50 to 300.
  • the hydrophilic block chain is preferably a polypeptide chain having a sarcosine unit.
  • the sarcosine units may be continuous or discontinuous.
  • the hydrophilic block chain may have a structural unit other than the sarcosine unit.
  • the structural unit other than the sarcosine unit include natural amino acids, unnatural amino acids, and derivatives thereof. More specifically, examples include serine, threonine, lysine, aspartic acid, and glutamic acid.
  • the lactic acid unit of the hydrophobic block chain differs depending on whether it is linear or branched, or whether it has a structural unit other than the lactic acid unit, etc., but the entire block chain (copolymer molecule) is hydrophobic, and such a copolymer There is no particular limitation as long as the molecule is hydrophobic enough to self-assemble in a solvent to form a molecular assembly, and is usually in the range of 5 to 100, preferably about 10 to 80. More preferably, the number is about 20 to 60.
  • the lactic acid unit may be composed of only the L-lactic acid unit, may be composed of only the D-lactic acid unit, or may be composed of both the L-lactic acid unit and the D-lactic acid unit.
  • the polymerization order of the L-lactic acid unit and the D-lactic acid unit is not particularly limited. May be alternately polymerized one by one or two at a time, may be polymerized randomly, or may be block polymerized.
  • the lactic acid unit is composed of both an L-lactic acid unit and a D-lactic acid unit, the content of each lactic acid unit is not particularly limited.
  • the hydrophobic block chain may have a structural unit other than the lactic acid unit.
  • the structural unit other than lactic acid include hydroxyl acids and amino acids other than lactic acid, and more specifically, hydroxyl acids such as glycolic acid and hydroxyisobutyric acid; glycine, alanine, valine, leucine, and isoleucine.
  • natural amino acids such as proline, methionine, tyrosine, and tryptophan; non-natural amino acids such as glutamic acid methyl ester, glutamic acid benzyl ester, aspartic acid methyl ester, aspartic acid ethyl ester, and aspartic acid benzyl ester.
  • amphiphilic block polymer is a branched amphiphilic block polymer
  • only the hydrophilic block chain may have a branched structure, or only the hydrophobic block chain may have a branched structure, Both the hydrophilic block chain and the hydrophobic block chain may have a branched structure.
  • amphiphilic block polymer may be a linear amphiphilic block polymer alone or a branched amphiphilic block polymer alone. Mixtures of block polymers may be used.
  • the amphiphilic block polymer may have other groups.
  • Other groups may be appropriately selected by those skilled in the art according to the use of the molecular assembly produced by the production method of the present invention. Examples of such other groups include functional groups such as organic groups (described later).
  • the solvent for dissolving the amphiphilic block polymer is not particularly limited as long as it is inert to form an amphiphilic block polymer film, but the boiling point at 1 atm is 100 ° C. or less, preferably 90 ° C.
  • the following low-boiling solvents are preferably used. Examples of such solvents include chloroform, diethyl ether, acetonitrile, methanol, ethanol, propanol, butanol acetone, dichloromethane, tetrahydrofuran, hexane and the like.
  • the concentration of the amphiphilic block polymer in the solution varies depending on the type of the solvent and the amphiphilic block polymer, and is not particularly limited as long as it is appropriately adjusted depending on the type, shape, size, number, etc. of the particles and granules. Thus, it is possible to obtain a high density which is difficult with the conventional film method. Examples of such concentrations include 10 mg / mL to saturated dissolution concentration or less, 50 mg / mL to saturation dissolution concentration or less, and 100 mg / mL to saturation dissolution concentration or less. Thereby, compared with the conventional film method, a molecular assembly can be produced in large quantities.
  • the solution in which the amphiphilic block polymer is dissolved may contain optional components such as a functional substance (described later) and additives.
  • soot additives examples include polylactic acid for particle size control, additives for improving stability, and antioxidants.
  • the polylactic acid is not particularly limited as long as the particle diameter can be controlled, and a D-form, an L-form having a mean molecular weight of 1000 to 50000, preferably 2000 to 10000, or a mixture thereof is appropriately used according to the purpose.
  • Commercially available polylactic acid can be used as it is.
  • the addition amount of the polylactic acid may be appropriately adjusted depending on the type of amphiphilic block polymer, the target particle size, and the like, but is usually 0.1 mol% to 1000 mol% with respect to the amphiphilic polymer, preferably Is from 10 mol% to 200 mol%.
  • the additive for improving the wrinkle stability examples include a hydrophobic additive. Of these, aliphatic esters are preferred.
  • the addition amount of the additive may be appropriately adjusted depending on the type of amphiphilic block polymer, the type of additive, and the like. However, in order not to affect the particle diameter, the amount is usually 10 mol% with respect to the amphiphilic polymer. Hereinafter, it is preferably 5 mol% or less. There is no limit if the effect on particle size is not considered.
  • antioxidants examples include tocopherol, its ester, ascorbic acid, butylhydroxytoluene, butylhydroxyanisole, propyl gallate and the like. Of these, tocopherol is preferred.
  • the addition amount of the antioxidant may be appropriately adjusted depending on the type of the amphiphilic block polymer, the type of the antioxidant, etc. Usually, in order not to affect the particle size, It is 10 mol% or less, preferably 5 mol% or less. There is no limit if the effect on particle size is not considered.
  • Step of forming a film having an amphiphilic block polymer Subsequently, the film having the block polymer is formed in the container by removing the solvent from the solution containing the amphiphilic block polymer in the container. The process will be described in detail.
  • a person skilled in the art may appropriately select the type of amphiphilic block polymer and solvent, the type and shape of granules, the size, the number, the method of distilling off the solvent, and the like.
  • Glass containers are suitable, and specific examples include glass eggplant-shaped flasks, round bottom flasks, cylindrical containers and the like.
  • the size of the container can be appropriately selected by those skilled in the art depending on the amount of the amphiphilic block polymer and the solvent, the type, shape, size, number and the like of the granular material.
  • the method for distilling off the solvent may be appropriately selected by those skilled in the art depending on the type of amphiphilic block polymer and the solvent, etc., and may be removed under reduced pressure.
  • the solvent may be removed by natural drying or heated. Removal may be performed. Among these, when removing the solvent under reduced pressure, it is preferable to use an evaporator because the operation is simple and the solvent can be removed in a short time.
  • a film having an amphiphilic block polymer is formed on the surface of the granular body in addition to the inner wall surface of the container.
  • the reduced pressure condition may be appropriately adjusted depending on the size of the container, the kind of the solvent, etc., but usually in a hot water bath at 25 ° C. to 60 ° C. for 5 minutes to 60 minutes. Just a minute. ⁇ Vacuum drying may be performed as necessary.
  • the thickness of the film containing the amphiphilic block polymer formed varies depending on the concentration of the amphiphilic block polymer in the solution, etc., and depends on the capacity of the container and the type, shape, size, number, etc. of the granular materials. The trader may adjust as appropriate, but in order to produce a molecular assembly having a more uniform particle size, water or water is used between the film formed on the inner wall surface of the container and the film formed on the surface of the granular material.
  • the thickness is preferably such that there is a gap enough to contain the aqueous solution.
  • a film having the amphiphilic block polymer is formed on the inner wall surface of the container and the surface of the granular material in the container. .
  • Water or an aqueous solution is added to the container in which this film is formed, and an amphiphilic block polymer or the like is dispersed or self-assembled to produce a molecular assembly.
  • the water or aqueous solution to be added is not particularly limited as long as it is an aqueous medium in which a molecular assembly is formed, and may be appropriately selected depending on the application. Specific examples include purified water, distilled water, and ultrapure water. When preparing a molecular assembly for use in medicine, a person skilled in the art may appropriately select a biochemically and pharmaceutically acceptable one.
  • Such water or aqueous solution may be, for example, water for injection, physiological Examples include saline, buffer solution, and other general infusions.
  • the amount of the water or aqueous solution is not particularly limited, and may be added to the extent that all the amphiphilic block polymers in the container can form a molecular assembly.
  • concentration of the amphiphilic block polymer in the obtained dispersion of the molecular assembly varies depending on the use of the molecular assembly to be obtained. For example, when used as an injection as it is, 1 mg / mL In the case of freeze-drying the composition by freeze-drying to about 10 mg / mL, about 20 mg / mL to 100 mg / mL can be mentioned. According to the production method of the present invention, a molecular assembly having a high concentration can be obtained as compared with the conventional film method.
  • a heating treatment can be performed as necessary.
  • a molecular assembly is formed in the process in which the film having the amphiphilic block polymer is peeled off from the inner wall surface of the container and the surface of the granular material by heating.
  • the heating treatment may be appropriately adjusted according to the thickness of the film having the amphiphilic block polymer, the size of the container, the amount of the granular material, etc., but usually within the range of 60 ° C. to 100 ° C. for 5 minutes to 60 ° C. Can be done for a minute.
  • Ultrasonic treatment or manual or mechanical shaking may be performed at the same time as the heat treatment or after the heat treatment. Moreover, you may perform the filter process for particle diameter and particle size distribution control after a heating process as needed. Filter processing for particle size and particle size distribution control is performed in order to obtain a uniform molecular aggregate with a uniform particle size distribution, excluding unnecessary excessive particles. According to the production method of the present invention, the particle size and particle size distribution are controlled. A molecular assembly with a narrow uniform particle size distribution that does not contain unnecessary excessive particles can be obtained without performing filtering for control or a small number of times.
  • a filter treatment for removing dust or the like in the sterilization or manufacturing process may be performed simultaneously with or after the filter treatment for controlling the particle size or the particle size distribution.
  • Filter processing for removing dust and the like in the sterilization and manufacturing process can be performed by a conventional method, and may be performed by the same method as the filter processing for particle size and particle size distribution control, or by a different method. May be.
  • the obtained dispersion liquid of the molecular assembly can be used as it is without performing the lyophilization treatment described below.
  • the manufacturing method of the present invention may further include a freeze-drying process.
  • the freeze-drying step can be performed by a conventional method. For example, it can be carried out by freezing the obtained dispersion liquid of the molecular assembly with liquid nitrogen or the like and sublimating it under reduced pressure. More specifically, if necessary, after sterilizing the obtained dispersion liquid of the molecular assembly, a predetermined amount is dispensed into an appropriate container such as a vial, and the condition is about ⁇ 40 ° C. to ⁇ 20 ° C. Pre-freezing is performed for about 2 hours, primary drying is performed at about 0 ° C. to 10 ° C. under reduced pressure, and then secondary drying is performed at about 15 ° C. to 25 ° C. under reduced pressure, followed by freeze drying. In general, the inside of a container such as a vial can be replaced with nitrogen gas and stoppered to obtain a lyophilized composition of a molecular assembly produced by the production method of the present invention.
  • the obtained lyophilized composition can be used by re-dissolving generally by adding any appropriate solution (re-dissolving solution).
  • re-dissolving solution examples include water for injection, physiological saline, buffer solution, and other general infusion solutions.
  • the amount of the re-dissolved solution is not particularly limited and varies depending on applications.
  • a micelle-shaped molecular assembly configured such that the inner side (core portion) is a hydrophobic block chain and the outer side (shell portion) is a hydrophilic block chain can be produced.
  • a molecular assembly can be provided with a functional structure having a form or function that is useful when used in a molecular imaging system or a drug delivery system (DDS).
  • DDS drug delivery system
  • the molecular assembly becomes a useful structure as a flow in molecular imaging or as a carrier in a drug delivery system.
  • an amphiphilic block polymer itself having a functional group bonded thereto may be used, and an amphiphilic block polymer before film formation is included.
  • a solution containing a functional substance may be used.
  • Examples of the functional group include a signal group and a ligand group.
  • the soot signal group is a group having a characteristic that enables imaging by detection, and examples thereof include a fluorescent group, a radioactive element-containing group, and a magnetic group.
  • the fluorescent group include groups derived from ICG, Cy7, DY776, DY750, Alexa790, Alexa750, rhodamine, quantum dots, and the like.
  • a group derived from ICG, Cy7, DY776, DY750, Alexa790, and Alexa750 is preferable because it is possible to provide useful information when a measurement target is specified as a small animal or a site close to the body surface.
  • radioactive element-containing groups examples include groups derived from sugars, amino acids, nucleic acids, peptides, synthetic polymers, etc., labeled with radioactive isotopes such as 18F and 111In.
  • diamagnetic group examples include those having a magnetic material such as ferrichrome and ferrocene.
  • a ligand group is a group that controls the directivity of a molecular assembly by binding to a biomolecule expressed in a target cell, thereby increasing the targeting property of the molecular assembly.
  • Peptides and sugar chains can be mentioned.
  • sputum antibodies include those having a specific binding ability to an antigen expressed in cells at the target site.
  • sputum cell adhesion peptides include adhesion factors such as RGD (arginine-glycine-aspartic acid).
  • sucrose chains include stabilizers such as strength ruboxylmethylcellulose and amylose, and those having specific binding ability to proteins expressed in cells at the target site.
  • the bonding position of the functional group is not particularly limited.
  • functional groups can be exposed on the surface (shell part) of the molecular assembly produced by binding to the terminal structural unit of the hydrophilic block chain of the amphiphilic block polymer.
  • the functional group can be included in the core portion of the produced molecular assembly by binding to the terminal structural unit of the hydrophobic block chain.
  • the functional substance is included by being located in the hydrophobic core part of the molecular assembly to be produced.
  • Examples of such a functional substance include a signal agent and a drug.
  • Examples of wrinkle signal agents include compounds having the above-mentioned signal group.
  • near-infrared fluorescent substances such as fluorescein dyes and cyanine dyes
  • radioactive element-containing substances such as sugars, amino acids, nucleic acids, peptides, proteins, and synthetic polymers labeled with radioactive isotopes such as 18F and 111In.
  • those suitable for the target disease are appropriately selected by those skilled in the art.
  • Specific examples include anticancer agents, antibacterial agents, antiviral agents, anti-inflammatory agents, immunosuppressive agents, steroid agents, hormone agents, angiogenesis inhibitors and the like. These drug molecules can be used alone or in combination of two or more kinds.
  • the functional substance may have a polylactic acid group bonded thereto.
  • the polylactic acid group is a group having a lactic acid unit as a main constituent. All of the lactic acid units may be continuous or discontinuous. Basically, the structure, chain length, and optical purity of the polylactic acid group can be determined from the same viewpoint as in the molecular design of the hydrophobic block described above. By doing in this way, in a molecular assembly, the effect that it is excellent in affinity with a functional substance and the hydrophobic block of an amphiphilic block polymer is also acquired.
  • the number of lactic acid units in the polylactic acid group is usually in the range of 15 to 60, preferably about 25 to 45. Within this range, the molecular design is such that the total length of the polylactic acid-binding functional substance does not exceed the length of the above-mentioned amphiphilic block polymer. Preferably, the molecular design is such that it does not exceed twice the length of the hydrophobic block in the amphiphilic block polymer.
  • the number of structural units exceeds the above range, when the molecular assembly is formed, the formed molecular assembly tends to lack stability. When the number of structural units is below the above range, the affinity between the functional substance and the hydrophobic block of the amphiphilic block polymer tends to be weakened.
  • the optical activity of the polylactic acid chain in the polylactic acid-binding functional substance is preferably the same as that of the branched amphiphilic block polymer or linear amphiphilic block polymer that is a constituent element of the molecular assembly.
  • the polylactic acid chain in the polylactic acid-binding functional substance is also composed of L-lactic acid units. It is preferable.
  • the content of the functional substance in the solution containing the amphiphilic block polymer is not particularly limited.
  • the amount of the fluorescent dye relative to the total of the amphiphilic block polymer and the fluorescent dye is in the range of 0.5 to 50 mol%.
  • the number average particle diameter of the molecular assembly measured by dynamic light scattering (DLS) is usually 10 nm to 200 nm or 20 nm to 50 nm. When the average particle size is smaller than 10 nm, measurement by DLS may be difficult.
  • a molecular assembly having a narrow particle size distribution can be produced.
  • a molecular assembly having a polydispersity index (PDI: PolyDispersity ⁇ ⁇ ⁇ Index) of 0.2 or less can be produced.
  • Example 1 1 g of PSar66-PLLA31 was dissolved in 10 mL of chloroform (100 mg / mL) in an eggplant flask, and in the presence of 40 g of glass beads (diameter 2.5 to 3.5 mm), using an evaporator, Depressurizingly distilled at 45 degreeC for 45 minutes, and produced the polymer film on the inner wall surface of an eggplant flask and the glass bead surface. Furthermore, after vacuum-drying overnight at room temperature, 20 mL of distilled water was added, and the mixture was heated at 85 ° C. for 30 minutes to form particles (50 mg / mL). After particle formation, the solution was allowed to cool to room temperature, and the particle size was measured. Then, 200 nm filter processing was performed and the particle diameter measurement was performed. The results are shown in Table 1. In addition, a graph of the particle diameter measurement results is shown in FIG.
  • Example 2 Particles were prepared in the same manner as in Example 1 except that 20 g of glass beads (diameter 2.5 to 3.5 mm) were used, and the particle diameter was measured. Then, 200 nm filter processing was performed and the particle diameter measurement was performed. The results are shown in Table 1. Moreover, the graph of the particle diameter measurement result is shown in FIG.
  • Example 3 Particles were prepared in the same manner as in Example 1 except that 40 g of glass beads (diameter: 9.0 to 11.0 mm) were used, and particle formation measurement was performed. Then, 200 nm filter processing was performed and the particle diameter measurement was performed. The results are shown in Table 1. In addition, a graph of the particle diameter measurement results is shown in FIG.
  • Example 4 Particles were prepared in the same manner as in Example 1 except that 40 mL of distilled water was added to form particles (25 mg / mL), and the particle diameter was measured. Then, 200 nm filter processing was performed and the particle diameter measurement was performed. The results are shown in Table 1.
  • FIG. 6 shows a graph of the particle diameter measurement results.
  • Comparative Example 1 A polymer film was prepared and granulated under the same conditions as in Example 1 except that glass beads were not placed in the eggplant flask, and the particle diameter was measured. Then, 200 nm filter processing was performed and the particle diameter measurement was performed. Thereafter, 100 nm filter treatment was performed, and the particle size was measured. The results are shown in Table 1.
  • FIG. 7 shows a graph of the particle diameter measurement results.
  • the present invention provides a molecular imaging system, a drug delivery system (DDS), etc. It is useful in the field of Similarly, it is also useful as a method for producing a substance transport carrier in the fields of cosmetics, food, household goods and the like.
  • DDS drug delivery system

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Abstract

【課題】 フィルム法において、より粒子径が均一な粒度分布の狭い分子集合体を作製することができる新規な作製法を提供すること。また、フィルム法において、１ロットで作製できる分子集合体の量を増やすことができる作製法を提供すること。 【解決手段】 本発明として、例えば、容器内で、直鎖型又は分岐型の両親媒性ブロックポリマーを含む溶液から溶媒を留去することにより、該ブロックポリマーを有するフィルムを形成し、その後、該容器中に水又は水溶液を加えて分子集合体を作製する方法であって、 前記容器内の溶液に１個以上の粒状体を浸した状態で、溶媒を留去し前記フィルムを形成することを特徴とする、前記両親媒性ブロックポリマーを含む分子集合体の作製法を挙げることができる。

Description

両親媒性ブロックポリマー分子集合体の作製法
  本発明は、医薬品、農薬、食品、電池材料等の分野で用いられる、ナノレベル（数十ｎｍ）の粒子径を有する微粒子（分子集合体）の新規な作製法に関するものである。詳しくは、本発明は、容器内において、両親媒性ブロックポリマーが溶解した溶媒を留去しフィルムを形成した後、水等を加えて分子集合体を作製する、いわゆるフィルム法に関するものである。
  ナノレベルの粒子径を有する微粒子ないし分子集合体が様々な分野で応用されている。特に医薬分野では、ナノ粒子の生体内における動態に着目し、例えば、分子イメージング技術や分子プローブ、また腫瘍組織等の患部へ薬剤を効率的に搬送するためのドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）技術にナノ粒子が応用されている。具体的には、例えば、かかる微粒子にインドシアニングリーン（ＩＣＧ）のような蛍光剤や１８Ｆのような放射性同位元素を付加したポリマーを内包して、分子プローブとする試みがなされている。また、かかる微粒子に抗癌剤や光増感剤といった薬剤を内包させ、標的とする病巣へ効率的に薬剤を搬送し、治療する試みもなされている。  上記微粒子（分子集合体）として、例えば、次のものが開示されている。（１）１０個以上のサルコシン単位を有する親水性ポリペプチド鎖と、アミノ酸単位及びヒドロキシル酸単位からなる群から選ばれる単位を必須構成単位として含み、且つ前記必須構成単位を５個以上有する疎水性分子鎖とを有する両親媒性ブロックポリマーからなる分子集合体（特許文献１参照）。（２）２０個以上のサルコシン単位を有する親水性ブロック鎖と、１０個以上の乳酸単位を有する疎水性ブロック鎖とを有する両親媒性ブロックポリマー、及び１０個以上の乳酸単位と標識基とを少なくとも有する標識ポリマーからなる分子集合体（特許文献２参照）。（３）サルコシンを含む分岐した親水性ブロックと、ポリ乳酸を有する疎水性ブロックとを有する、分岐型両親媒性ブロックポリマーを有する分子集合体（特許文献３参照）。  少なくとも上記（２）及び（３）に係る両親媒性ブロックポリマーについては、比較的容易に自己組織化し、３０ｎｍ程度の粒子径を有する高分子ミセル、即ち分子集合性を形成することができる。また、その優れた特性等から「ラクトソーム」（登録商標、以下省略）とも称されている。  ラクトソーム等の分子集合体の作製方法としては、例えば、インジェクション法、フィルム法、超音波法、エクストルーダー法が挙げられる。  この中、インジェクション法は、トリフルオロエタノール等の有機溶媒に両親媒性ブロックポリマーを溶解し、得られた溶液を、注射用水等の水系溶媒に分散させ、ゲルろ過クロマトグラフィー等により精製処理を行った後、有機溶媒を除去することによって作製する方法である。  フィルム法は、適当な容器内において、クロロホルム等の有機溶媒に両親媒性ブロックポリマーを溶解し、かかる有機溶媒を留去することにより、該容器内でフィルムを形成させ、それに注射用水等の水系溶媒を加えて加温等することにより作製する方法である。
特開２００８－２４８１６号公報 国際公開２００９／１４８１２１号 国際公開２０１２／１７６８８５号
  上記フィルム法によれば、簡便にナノレベルの分子集合体を作製することができる。また、該フィルム法は、条件検討が比較的容易であり、更には少量（例えば１０ｍｇ／ｍＬ以下）の分子集合体の作製に適している。しかしながら、該フィルム法では、粒子径が均一な、即ち粒度分布の狭い分子集合体の作製が困難な場合がある。また、１ロットで作製できる分子集合体の量が充分でないおそれがある。  以上の現状から、本発明の主な課題は、該フィルム法において、より粒子径が均一な粒度分布の狭い分子集合体を作製することができる新規な作製法を提供することにある。また、該フィルム法において、１ロットで作製できる分子集合体の量を増やすことができる作製法を提供することも本発明の課題とする。
  本発明者らは、鋭意検討を重ねた結果、容器内の溶液に粒状体を浸した状態で、溶媒を留去してフィルムを形成した後、水又は水溶液を加えることにより、粒子径が均一なナノレベルの分子集合体を大量に作製することができることを見出し、本発明の完成に至った。  
  本発明として、例えば、下記を挙げることができる。［１］容器内で、直鎖型又は分岐型の両親媒性ブロックポリマーを含む溶液から溶媒を留去することにより、該ブロックポリマーを有するフィルムを形成し、その後、該容器中に水又は水溶液を加えて分子集合体を作製する方法であって、  前記容器内の溶液に１個以上の粒状体を浸した状態で、溶媒を留去し前記フィルムを形成することを特徴とする、前記両親媒性ブロックポリマーを含む分子集合体の作製法（以下、「本発明作製法」ともいう）。  
［２］粒状体が、球体である、前記［１］に記載の分子集合体の作製法。  
［３］球体がガラスビーズである、前記［２］に記載の分子集合体の作製法。  
［４］粒状体の総表面積が、溶液が接している容器内壁の表面積の１０倍以上である、前記［１］～［３］のいずれか一に記載の分子集合体の作製法。  
［５］両親媒性ブロックポリマーが、サルコシン単位を有する親水性ブロック鎖と、乳酸単位を有する疎水性ブロック鎖とを含むものである、前記［１］～［４］のいずれか一に記載の分子集合体の作製法。  
［６］親水性ブロック鎖のサルコシン単位が２～５００個の範囲内である、前記［５］に記載の分子集合体の作製法。  
［７］疎水性ブロック鎖の乳酸単位が５～１００個の範囲内である、前記［５］に記載の分子集合体の作製法。  
［８］両親媒性ブロックポリマーが、機能性基を有するものである、前記［１］～［７］のいずれか一に記載の分子集合体の作製法。［９］フィルム形成前の両親媒性ブロックポリマーを含む溶液が、機能性物質を含むものである、前記［１］～［８］のいずれか一に記載の分子集合体の作製法。  
［１０］機能性基がシグナル基又はリガンド基である、前記［８］に記載の分子集合体の作製法。  
［１１］機能性物質がシグナル剤又は薬剤である、前記［９］に記載の分子集合体の作製法。  
［１２］粒子径や粒度分布制御のためのフィルター処理工程を含まない、前記［１］～［１１］のいずれか一に記載の分子集合体の作製法。  
［１３］フィルム形成前における両親媒性ブロックポリマーの溶液中の濃度が、１０ｍｇ／ｍＬより多い、前記［１］～［１２］のいずれか一に記載の分子集合体の作製法。 
［１４］さらに凍結乾燥工程を含む、前記［１］～［１３］のいずれか一に記載の分子集合体の作製法。
  本発明作製法によれば、粒子径が均一な粒度分布の狭いナノレベルの分子集合体を、１ロットで大量（高濃度）に作製することができる。そのため、医薬品などの実用化、品質管理の観点から有利である。
従来のフィルム法の一例を説明するための模式図である。 本発明作製法の一例を説明するための模式図である。 実施例１で得られた粒子の粒子径の測定結果を表す。図中、縦軸は散乱光強度（％）を、横軸は粒子径（ｎｍ）を、それぞれ示す。実線は粒子化後の粒度分布曲線を、破線は２００ｎｍフィルター処理後の粒度分布曲線を、それぞれ示す。 実施例２で得られた粒子の粒子径の測定結果を表す。図中、縦軸は散乱光強度（％）を、横軸は粒子径（ｎｍ）を、それぞれ示す。実線は粒子化後の粒度分布曲線を、破線は２００ｎｍフィルター処理後の粒度分布曲線を、それぞれ示す。 実施例３で得られた粒子の粒子径の測定結果を表す。図中、縦軸は散乱光強度（％）を、横軸は粒子径（ｎｍ）を、それぞれ示す。実線は粒子化後の粒度分布曲線を、破線は２００ｎｍフィルター処理後の粒度分布曲線を、それぞれ示す。 実施例４で得られた粒子の粒子径の測定結果を表す。図中、縦軸は散乱光強度（％）を、横軸は粒子径（ｎｍ）を、それぞれ示す。実線は粒子化後の粒度分布曲線を、破線は２００ｎｍフィルター処理後の粒度分布曲線を、それぞれ示す。 比較例１で得られた粒子の粒子径の測定結果を表す。図中、縦軸は散乱光強度（％）を、横軸は粒子径（ｎｍ）を、それぞれ示す。実線は粒子化後の粒度分布曲線を、荒い破線（－－）は２００ｎｍフィルター処理後の粒度分布曲線を、細かい破線（---）は１００ｎｍフィルター処理後の粒度分布曲線を、それぞれ示す。
  以下、本発明作製法について詳述する。
  本発明作製法は、容器内で、直鎖型又は分岐型の両親媒性ブロックポリマーを含む溶液から溶媒を留去することにより、該ブロックポリマーを有するフィルムを形成し、その後、該容器中に水又は水溶液を加えて分子集合体を作製する方法であって、前記容器内の溶液に１個以上の粒状体を浸した状態で、溶媒を留去し前記フィルムを形成することを特徴とする、前記両親媒性ブロックポリマーを含む分子集合体の作製法である。
Ｉ．粒状体について  本発明作製法は、容器内の溶液に１個以上の粒状体を浸した状態で、溶媒を留去することを要旨とする。
  該粒状体としては、容器内で、直鎖型又は分岐型の両親媒性ブロックポリマーを含む溶液から溶媒を留去することにより、該ブロックポリマーを有するフィルムを形成する工程、及び容器中に水又は水溶液を加えて分子集合体を作製する工程が円滑に進む形状のものであれば特に限定されず、例えば、球体、楕円体、円筒体、多面体を挙げることができる。中でも、均一な厚さのフィルムを形成でき、これにより、より均一な粒子径の分子集合体を形成できると考えられることから、球体が好ましい。
  粒状体の材質は、容器内で、両親媒性ブロックポリマーを有するフィルムを形成する工程、及び分子集合体を作製する工程に不活性であり、粒状体の表面に該ポリマーのフィルムを形成しうるものであれば特に限定されず、例えば、ガラス、樹脂、金属、ゴム、セラミック等を挙げることができる。  該粒状体の特に好ましい具体例としては、ガラスビーズ、金属ビーズ、セラミックビーズを挙げることができる。
  本発明作製法の実施にあたっては、１個以上の粒状体を用いればよく、その個数は特に限定されないが、通常は複数個用いる。用いる粒状体の個数は、粒状体の大きさや形状、容器の容量や形状等によって異なる。  １個以上の粒状体の総表面積は、特に限定されないが、溶液が接している容器内壁の表面積の１０倍以上であることが好ましく、２０倍以上であることがより好ましい。粒状体の総表面積が、溶液が接している容器内壁の表面積の１０倍未満の場合、粒状体を入れない従来のフィルム法と同程度の量の分子集合体しか作製できない可能性がある。
  更に、１個以上の粒状体を用いることにより、両親媒性ブロックポリマーを有するフィルムが形成される表面積が増大し、均一な薄膜フィルムが形成されうるだけでなく、該粒状体が攪拌子と同様の役割を果たし、ポリマー溶液がより均一となる。また、その後容器中に水又は水溶液を加えて分子集合体を作製する際に、フィルムの形成された粒状体が容器内壁と、又は該粒状体同士で物理的にこすれあうことにより、粒子化がスムーズに行われるという効果も得られる。
  粒状体の大きさは、容器の容量や、口の大きさ等により適宜調整すればよいが、例えば、ガラスビーズのような球体の場合、通常、直径１～２０ｍｍ、好ましくは、２～１０ｍｍである。粒状体の大きさが前記範囲の場合、分子集合体作製後、容器内から粒状体を回収する際の操作等を簡便に行うことができる。
ＩＩ．直鎖型又は分岐型の両親媒性ブロックポリマーを含む溶液について  次に、直鎖型又は分岐型の両親媒性ブロックポリマー（以下、これらを併せて単に「両親媒性ブロックポリマー」ともいう）を含む溶液について詳述する。
  両親媒性ブロックポリマーとしては、フィルム法により分子集合体を形成できるものであれば特に限定されないが、例えば、サルコシン単位を有する親水性ブロック鎖と、乳酸単位を有する疎水性ブロック鎖とを含むものが好ましい。
  親水性ブロック鎖のサルコシン単位は、直鎖型か分岐型か、またサルコシン単位以外の構成単位を有するか否か等によって異なるが、ブロック鎖全体（コポリマー分子）として親水性であり、かつかかるコポリマー分子が溶媒中で自己組織化して、分子集合体を形成することができる程度に親水性であれば特に制限はなく、通常、２～５００個の範囲内であり、直鎖型であれば２０～５００個程度の範囲内が適当であり、好ましくは４０～３００個程度、より好ましくは５０～１００個程度である。分岐型であれば、分岐全てに含まれるサルコシン単位の合計として、２～６００個程度の範囲内が適当であり、好ましくは１０～４００個程度、より好ましくは、５０～３００個程度である。
  親水性ブロック鎖は、サルコシン単位を有するポリペプチド鎖であることが好ましい。ポリペプチド鎖中、サルコシン単位は、連続していてもよく、非連続でもよい。
  親水性ブロック鎖は、サルコシン単位以外の構成単位を有していてもよい。かかるサルコシン単位以外の構成単位としては、例えば、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、及びそれらの誘導体が挙げられる。より具体的には、例えば、セリン、スレオニン、リシン、アスパラギン酸、グルタミン酸が挙げられる。
  疎水性ブロック鎖の乳酸単位は、直鎖型か分岐型か、また乳酸単位以外の構成単位を有するか否か等によって異なるが、ブロック鎖全体（コポリマー分子）として疎水性であり、かつかかるコポリマー分子が溶媒中で自己組織化して、分子集合体を形成することができる程度に疎水性であれば特に制限はなく、通常、５～１００個の範囲内であり、好ましくは１０～８０個程度、より好ましくは２０～６０個程度である。
  乳酸単位は、Ｌ－乳酸単位のみで構成されていてもよく、Ｄ－乳酸単位のみで構成されてもよく、Ｌ－乳酸単位とＤ－乳酸単位との両方から構成されてもよい。乳酸単位がＬ－乳酸単位とＤ－乳酸単位との両方から構成される場合、Ｌ－乳酸単位とＤ－乳酸単位との重合順番は特に限定されず、Ｌ－乳酸単位とＤ－乳酸単位とが１個又は２個ずつ交互に重合されていてもよく、ランダムに重合されていてもよく、ブロック重合されていてもよい。乳酸単位がＬ－乳酸単位とＤ－乳酸単位との両方から構成される場合、それぞれの乳酸単位の含有量は特に限定されない。
  疎水性ブロック鎖は、乳酸単位以外の構成単位を有していてもよい。かかる乳酸以外の構成単位としては、例えば、乳酸以外のヒドロキシル酸及びアミノ酸を挙げることができ、より具体的には、グリコール酸、ヒドロキシイソ酪酸等のヒドロキシル酸類；グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、メチオニン、チロシン、トリプトファン等の天然アミノ酸類；グルタミン酸メチルエステル、グルタミン酸ベンジルエステル、アスパラギン酸メチルエステル、アスパラギン酸エチルエステル、アスパラギン酸ベンジルエステル等の非天然アミノ酸類を挙げることができる。
  両親媒性ブロックポリマーが、分岐型の両親媒性ブロックポリマーの場合、親水性ブロック鎖のみが分岐構造を有していてもよく、疎水性ブロック鎖のみが分岐構造を有していてもよく、親水性ブロック鎖と疎水性ブロック鎖の両方が分岐構造を有していてもよい。
  また、両親媒性ブロックポリマーは、直鎖型の両親媒性ブロックポリマーのみを用いてもよく、分岐型の両親媒性ブロックポリマーのみを用いてもよく、直鎖型及び分岐型の両親媒性ブロックポリマーの混合物を用いてもよい。
  両親媒性ブロックポリマーは、その他の基を有していてもよい。その他の基は、本発明作製法で作製される分子集合体の用途等に応じて、当業者が適宜選択すればよい。かかるその他の基としては、例えば、有機基等の機能性基（後述）を挙げることができる。
  両親媒性ブロックポリマーを溶解するための溶媒としては、両親媒性ブロックポリマーのフィルムを形成するのに不活性であれば特に限定されないが、１気圧における沸点が１００℃以下、好ましくは、９０℃以下の低沸点溶媒を用いることが好ましい。かかる溶媒としては、クロロホルム、ジエチルエーテル、アセトニトリル、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノールアセトン、ジクロロメタン、テトラヒドロフラン、ヘキサン等を挙げることができる。
  溶液中の両親媒性ブロックポリマーの濃度は、溶媒及び両親媒性ブロックポリマーの種類等により異なり、またそれらや粒状体の種類や形状、大きさ、個数等により適宜調整すればよく特に限定されないが、従来のフィルム法では困難な高濃度とすることができる。そのような濃度として、例えば、１０ｍｇ／ｍＬ～飽和溶解濃度以下、５０ｍｇ／ｍＬ～飽和溶解濃度以下、１００ｍｇ／ｍＬ～飽和溶解濃度以下を挙げることができる。これにより従来のフィルム法と比べ、分子集合体を大量に作製することができる。
  両親媒性ブロックポリマーが溶解している溶液には、機能性物質（後述）、添加剤等の任意成分を含んでいてもよい。
  添加剤としては、粒子径制御のためのポリ乳酸、安定性向上のための添加物、抗酸化剤等を挙げることができる。
  上記ポリ乳酸としては、粒子径が制御できるものであれば特に限定されず、平均分子量が１０００～５００００、好ましくは２０００～１００００のＤ体、Ｌ体、又はその混合物を目的に応じて適宜使用することができ、市販のポリ乳酸をそのまま使用することができる。該ポリ乳酸の添加量は、両親媒性ブロックポリマーの種類、目的とする粒子径等により適宜調整すればよいが、通常、両親媒性ポリマーに対して０．１ｍｏｌ％～１０００ｍｏｌ％であり、好ましくは、１０ｍｏｌ％～２００ｍｏｌ％である。
  安定性向上のための添加物としては、例えば、疎水性添加物を挙げることができる。中でも、脂肪族エステルが好ましい。添加物の添加量は、両親媒性ブロックポリマーの種類や添加物の種類等により適宜調整すればよいが、粒子径に影響を与えないためには、通常、両親媒性ポリマーに対して１０ｍｏｌ％以下、好ましくは、５ｍｏｌ％以下である。粒子径への影響を考慮しない場合、限度はない。
  抗酸化剤としては、例えば、トコフェロール、そのエステル、アスコルビン酸、ブチルヒドロキシトルエン、ブチルヒドロキシアニソール、没食子酸プロピルなどを挙げることができる。中でも、トコフェロールが好ましい。抗酸化剤の添加量は、両親媒性ブロックポリマーの種類や抗酸化剤の種類等により適宜調整すればよいが、通常、粒子径に影響を与えないためには、両親媒性ポリマーに対して１０ｍｏｌ％以下、好ましくは、５ｍｏｌ％以下である。粒子径への影響を考慮しない場合、限度はない。
ＩＩＩ．両親媒性ブロックポリマーを有するフィルムを形成する工程について  続いて、容器内で、両親媒性ブロックポリマーを含む溶液から溶媒を留去することにより、該容器内に該ブロックポリマーを有するフィルムを形成する工程について詳述する。
  フィルムを形成するための容器としては、両親媒性ブロックポリマー及び溶媒の種類、粒状体の種類や形状、大きさ、個数、溶媒を留去する方法等により、当業者が適宜選択すればよく、ガラス容器が適当であり、具体的には、ガラス製のナス型フラスコ、丸底フラスコ、円筒容器等を挙げることができる。また、容器の大きさも、両親媒性ブロックポリマー及び溶媒の量、粒状体の種類や形状、大きさ、個数等により、当業者が適宜選択することができる。
  溶媒を留去する方法としては、両親媒性ブロックポリマー及び溶媒の種類等により当業者が適宜選択すればよく、減圧下における溶媒除去を行ってもよく、自然乾燥による溶媒除去や加温による溶媒除去を行ってもよい。中でも、減圧下で溶媒除去する場合は、操作が簡便で短時間で溶媒除去ができることから、エバポレーターを用いることが好ましい。このように溶媒を留去することにより、容器の内壁面に加えて、粒状体の表面にも両親媒性ブロックポリマーを有するフィルムが形成される。
  エバポレーターを用いて、減圧下で溶媒除去する場合、減圧条件は、容器の大きさや溶媒の種類等によって適宜調整すればよいが、通常、２５℃～６０℃の湯浴中で、５分間～６０分間行えばよい。  また、必要に応じて、真空乾燥を行ってもよい。
  形成される両親媒性ブロックポリマーを含むフィルムの厚さは、溶液中の両親媒性ブロックポリマーの濃度等により異なり、また容器の容量や、粒状体の種類や形状、大きさ、個数等により当業者が適宜調整すればよいが、粒子径がより均一な分子集合体を作製するためには、容器の内壁面に形成されるフィルムと粒状体の表面に形成されるフィルムとの間に水又は水溶液が入る程度の隙間ができる厚さであることが好ましい。
ＩＶ．容器中に水又は水溶液を加えて分子集合体を作製する工程について  続いて、容器中に水又は水溶液を加えて分子集合体を作製する工程について詳述する。
  上記のとおり、適当な容器内で、両親媒性ブロックポリマーを含む溶液から溶媒を留去すると、容器の内壁面及び容器内の粒状体の表面に両親媒性ブロックポリマーを有するフィルムが形成される。このフィルムが形成された容器内に、水又は水溶液を加え、両親媒性ブロックポリマー等を分散ないし自己組織化させて分子集合体を作製する。
  加える水又は水溶液としては、分子集合体が形成される水性媒体であれば特に限定されず、用途に応じて適宜選択すればよい。具体的には、精製水、蒸留水、超純水等を挙げることができる。医薬に用いる分子集合体を作製する場合には、生化学的、薬学的に許容することができるものを当業者が適宜選択すればよく、そのような水又は水溶液として、例えば、注射用水、生理食塩水、緩衝液、その他一般輸液等を挙げることができる。
  上記水又は水溶液の量は、特に限定されず、容器内の両親媒性ブロックポリマーが全て分子集合体を形成することのできる程度以上に加えればよい。  具体的には、得られる分子集合体の分散液中における両親媒性ブロックポリマーの濃度としては、得られる分子集合体の用途に応じて異なるが、例えば、そのまま注射剤として用いる場合は１ｍｇ／ｍＬ～１０ｍｇ／ｍＬ程度、凍結乾燥を行い、凍結乾燥組成物とする場合は２０ｍｇ／ｍＬ～１００ｍｇ／ｍＬ程度を挙げることができる。本発明作製法によれば、従来のフィルム法と比べ、高濃度の分子集合体とすることができる。
  水又は水溶液を加えた後、必要に応じて、加温処理を行うことができる。加温により、両親媒性ブロックポリマーを有するフィルムが容器の内壁面及び粒状体表面から剥がれる過程で分子集合体が形成される。  加温処理は、両親媒性ブロックポリマーを有するフィルムの厚さや、容器の大きさ、粒状体の量等により適宜調整すればよいが、通常６０℃～１００℃の範囲内で、５分間～６０分間行うことができる。
  加温処理と同時に、又は加温処理後に必要に応じて超音波処理や、手動又は機械的に振とうを行ってもよい。また、必要に応じて、加温処理後に粒子径や粒度分布制御のためのフィルター処理を行ってもよい。粒子径や粒度分布制御のためのフィルター処理は、不要な過大粒子を除き、均一な粒度分布の狭い分子集合体を得るために行うが、本発明作製法によれば、その粒子径や粒度分布制御のためのフィルター処理を行わなくても、又は少ない回数で不要な過大粒子を含まない均一な粒度分布の狭い分子集合体を得ることができる。
  必要に応じて、加温処理後に、粒子径や粒度分布制御のためのフィルター処理と同時又は後に、滅菌や製造工程でのホコリ等の除去のためのフィルター処理を行ってもよい。滅菌や製造工程でのホコリ等の除去のためのフィルター処理は、常法により行うことができ、粒子径や粒度分布制御のためのフィルター処理と同様の方法でも行ってもよく、異なる方法で行ってもよい。
  容器中に水又は水溶液を加えた後、得られた分子集合体の分散液は、次に述べる凍結乾燥処理を行わなくても、そのまま用いることができる。
Ｖ．凍結乾燥工程について  本発明作製法は、更に凍結乾燥工程を含んでいてもよい。
  凍結乾燥工程は、常法により行うことができる。例えば、得られた分子集合体の分散液を液体窒素等によって凍結させ、減圧下で昇華させることによって行うことができる。より具体的には、必要に応じ、得られた分子集合体の分散液を滅菌した後、所定量をバイアル瓶等の適当な容器に分注し、約－４０℃～－２０℃の条件で予備凍結を約２時間程度行い、約０℃～１０℃で減圧下に一次乾燥を行い、次いで、約１５℃～２５℃で減圧下に二次乾燥して凍結乾燥することができる。そして、一般にはバイアル等の容器内部を窒素ガスで置換し、打栓して本発明作製法で作製された分子集合体の凍結乾燥組成物を得ることができる。
  得られた凍結乾燥組成物は、一般には任意の適当な溶液（再溶解液）の添加によって再溶解し使用することができる。このような再溶解液としては、例えば、注射用水、生理食塩水、緩衝液、その他一般輸液を挙げることができる。この再溶解液の液量は、用途等によって異なり特に限定されない。
ＶＩ．本発明作製法により作製される分子集合体について  本発明作製法により作製される分子集合体（以下、単に「分子集合体」ともいう）について詳述する。
  本発明作製法により、内側（コア部）が疎水性ブロック鎖、外側（シェル部）が親水性ブロック鎖となるように構成されたミセル形状の分子集合体を作製することができる。かかる分子集合体は、分子イメージングシステムや薬剤搬送システム（ＤＤＳ）に用いられる場合に有用となる形態や機能等を持った機能性構造を備えることができる。これによって、かかる分子集合体は、分子イメージングにおけるフローブとしてや、薬剤搬送システムにおける担体として有用な構造体となる。  機能性構造を備える分子集合体を作製するためには、例えば、両親媒性ブロックポリマー自体に機能性基を結合させたものを用いればよく、また、フィルム形成前の両親媒性ブロックポリマーを含む溶液に機能性物質を含有させたものを用いればよい。
  上記機能性基としては、例えば、シグナル基、リガンド基等を挙げることができる。
  シグナル基とは、検出によりイメージングを可能にする特性を有する基であり、例えば、蛍光基、放射性元素含有基、磁性基を挙げることができる。蛍光基としては、例えば、ＩＣＧ、Ｃｙ７、ＤＹ７７６、ＤＹ７５０、Ａｌｅａｘａ７９０、Ａｌｅａｘａ７５０、ローダミン、量子ドット等に由来する基を挙げることができる。中でも、測定対象を小動物、体表面に近い部位に特定した場合に、有用な情報を与えることが可能になることから、ＩＣＧ、Ｃｙ７、ＤＹ７７６、ＤＹ７５０、Ａｌｅａｘａ７９０、Ａｌｅａｘａ７５０に由来する基が好ましい。
  放射性元素含有基としては、１８Ｆ、１１１Ｉｎ等の放射性同位体でラベルした、糖、アミノ酸、核酸、ペプチド、合成高分子等に由来する基を挙げることができる。
  磁性基としては、フェリクローム、フェロセン等の磁性体を有するものを挙げることができる。
  リガンド基とは、標的細胞に発現している生体分子に結合することによって、分子集合体の指向性を制御し、これにより分子集合体のターゲティング性を高める基であり、例えば、抗体、細胞接着ペプチド、糖鎖を挙げることができる。
  抗体としては、ターゲッ卜部位の細胞に発現している抗原への特異的結合能を有するもの等を挙げることができる。  細胞接着ペプチドとしては、例えば、ＲＧＤ（アルギニン－グリシン－アスパラギン酸）等の接着因子を挙げることができる。  糖鎖としては、例えば、力ルボキシルメチルセルロース、アミロース等の安定剤や、ターゲッ卜部位の細胞に発現しているタンパク質への特異的結合能を有するものを挙げることができる。
  機能性基の結合位置は、特に限定されない。例えば、両親媒性ブロックポリマーの親水性ブロック鎖の末端構成単位に結合させれば、作製される分子集合体の表面（シェル部）に機能性基を露出させることができ、両親媒性ブロックポリマーの疎水性ブロック鎖の末端構成単位に結合させれば、作製分子集合体のコア部に機能性基を内包させることができる。
  機能性物質は、作製される分子集合体の疎水コア部に位置することによって内包されるものである。かかる機能性物質としては、シグナル剤、薬剤等を挙げることができる。
  シグナル剤としては、例えば、上述のシグナル基を有する化合物を挙げることができる。中でも、フルオレセイン系色素、シアニン系色素等の近赤外蛍光物質や、１８Ｆ、１１１Ｉｎ等の放射性同位体でラベルした、糖、アミノ酸、核酸、ペプチド、タンパク、合成高分子等の放射性元素含有物質が好ましい。  薬剤としては、対象となる疾患に適したものが当業者によって適宜選択される。具体的には、抗がん剤、抗菌剤、抗ウィルス剤、抗炎症剤、免疫抑制剤、ステロイド剤、ホルモン剤、血管新生阻害剤等が挙げられる。これら薬剤分子は、単独で文は複数種の組み合わせで用いることができる。
  機能性物質は、ポリ乳酸基が結合しているものであってもよい。ポリ乳酸基は、乳酸単位を主たる構成成分とする基である。乳酸単位のすべてが連続していてもよいし、非連続であってもかまわない。基本的に、ポリ乳酸基の構造、鎖長及び光学純度は、上述の疎水性ブロックの分子設計における場合と同様の観点で決定することができる。このようにすることによって、分子集合体において、機能性物質と両親媒性ブロックポリマーの疎水性ブロックとの親和性に優れるという効果も得られる。
  上記ポリ乳酸基の乳酸単位数は、通常、１５～６０個の範囲内であり、好ましくは２５～４５個程度である。この範囲内で、ポリ乳酸結合機能性物質全体の長さが上述の両親媒性ブロックポリマーの長さを超えないように分子設計される。好ましくは、両親媒性ブロックポリマーにおける疎水性ブロックの２倍の長さを超えないように分子設計される。構成単位数が上記範囲を上回ると、分子集合体を形成した場合に、形成された分子集合体の安定性を欠く傾向にある。構成単位数が上記範囲を下回ると、機能性物質と両親媒性ブロックポリマーの疎水性ブロックとの親和性が弱くなる傾向にある。
  なお、ポリ乳酸結合機能性物質におけるポリ乳酸鎖の光学活性は、分子集合体の構成要素となる分岐型両親媒性ブロックポリマーや直鎖型両親媒性ブロックポリマーと同様であることが好ましい。例えば、分岐型両親媒性ブロックポリマーや直鎖型両親媒性ブロックポリマーにおけるポリ乳酸鎖がＬ－乳酸単位からなる場合は、ポリ乳酸結合機能性物質におけるポリ乳酸鎖も、Ｌ－乳酸単位からなることが好ましい。
  両親媒性ブロックポリマーを含む溶液中における機能性物質の含有量としては特に限定されるものではないが、例えば、蛍光物質の場合、両親媒性ブロックポリマー及び蛍光色素の合計に対し、蛍光色素の量として０．５～５０ｍｏＬ％の範囲内が適当である。
  動的光散乱法（Ｄｙｎａｍｉｃ  Ｌｉｇｈｔ  Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ：ＤＬＳ）により測定される、分子集合体の個数平均粒子径は、通常、１０ｎｍ～２００ｎｍや、２０ｎｍ～５０ｎｍである。平均粒子径が１０ｎｍより小さいものは、ＤＬＳによる測定が難しい場合がある。
  また、本発明作製法によれば、２００ｎｍないし１００ｎｍのフィルター処理等を行わなくても、又はその処理回数を少なくして（具体的には、１回のみ等）、過大粒子を含まない均一な粒度分布の狭い分子集合体を作製することができる。具体的には、例えば、多分散性指数（ＰＤＩ：ＰｏｌｙＤｉｓｐｅｒｓｉｔｙ  Ｉｎｄｅｘ）として、０．２以下の分子集合体を作製することができる。  ここで、多分散性指数（ＰＤＩ）は、ＰＤＩ＝（Ｄ９０－Ｄ１０）／Ｄ５０〔式中、Ｄ９０、Ｄ５０、Ｄ１０は、それぞれ分布関数Ｇ＝∫ｆ（Ｄ）ｄＤ（Ｇは粒子数、Ｄは粒径）の積分が、全粒子数の０．９（９０個数％）、０．５（５０個数％）及び０．１（１０個数％）に等しい粒径を表す。〕の式より求められる。つまり、上記関係式において、粒度分布が狭いほど、ＰＤＩはゼロに近づき、逆に、粒度分布が広い、つまり多分散性が大きいほど、ＰＤＩは大きくなる。
  以下に実施例を挙げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。
  各物性は、次のとおり測定されたものである。［粒子径］  製造した粒子を蒸留水で１ｍｇ／ｍＬに希釈し、動的光散乱法（ＤＬＳ）による粒子径測定装置（Ｍａｌｖｅｒｎ社製  Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  Ｓ）を用い、個数平均として測定した。［ＰＤＩ］  測定された粒子径を使って、以下の式に基づき算出した。ＰＤＩ＝（Ｄ９０－Ｄ１０）／Ｄ５０（式中、Ｄ９０、Ｄ５０、Ｄ１０は、それぞれ分布関数Ｇ＝∫ｆ（Ｄ）ｄＤ（Ｇは粒子数、Ｄは粒径）の積分が、全粒子数の０．９（９０個数％）、０．５（５０個数％）及び０．１（１０個数％）に等しい粒径を表す。）［単峰性］  粒子分散体が、単峰性であるか否かは、下記のような指標で評価した。○：動的光散乱法（ＤＬＳ）による粒子径測定結果の粒度分布曲線が見掛け上１山と判断される場合×：動的光散乱法（ＤＬＳ）による粒子径測定結果の粒度分布曲線が見掛け上２山以上と判断される場合
  使用した原料は、次のとおりである。［両親媒性ブロックポリマー］  両親媒性ブロックポリマーとして、親水性ブロック鎖のサルコシン単位が６６個（平均値）と、疎水性ブロック鎖の乳酸単位が３１個（平均値）とが結合したポリマー（以下、「ＰＳａｒ６６－ＰＬＬＡ３１」という）を用いた。
実施例１  １ｇのＰＳａｒ６６－ＰＬＬＡ３１をナスフラスコ内で１０ｍＬのクロロホルムに溶解し（１００ｍｇ／ｍＬ）、４０ｇのガラスビーズ（直径２．５～３．５ｍｍ）存在下、エバポレーターを用いて、湯浴４０℃で４５分間減圧留去し、ナスフラスコ内壁面およびガラスビーズ表面にポリマーフィルムを作製した。更に室温で１晩真空乾燥を行った後、蒸留水２０ｍＬを加えて８５℃で３０分間加温処理を行うことにより粒子化を行った（５０ｍｇ／ｍＬ）。粒子化後、溶液が室温になるまで放冷し、粒子径測定を行った。その後、２００ｎｍフィルター処理を行い、粒子径測定を行った。その結果を表１に示す。  また、粒子径測定結果のグラフを図３に示す。
実施例２  ２０ｇのガラスビーズ（直径２．５～３．５ｍｍ）を用いた以外は、実施例１と同様にして粒子を作製し、粒子径測定を行った。その後、２００ｎｍフィルター処理を行い、粒子径測定を行った。その結果を表１に示す。  また、粒子径測定結果のグラフを図４に示す。
実施例３  ４０ｇのガラスビーズ（直径９．０～１１．０ｍｍ）を用いた以外は、実施例１と同様にして粒子を作製し、粒子化測定を行った。その後、２００ｎｍフィルター処理を行い、粒子径測定を行った。その結果を表１に示す。  また、粒子径測定結果のグラフを図５に示す。
実施例４  蒸留水４０ｍＬを加えて粒子化を行った（２５ｍｇ／ｍＬ）以外は、実施例１と同様にして粒子を作製し、粒子径測定を行った。その後、２００ｎｍフィルター処理を行い、粒子径測定を行った。その結果を表１に示す。  また、粒子径測定結果のグラフを図６に示す。
比較例１  ナスフラスコ内にガラスビーズを入れなかった以外は、実施例１と同様の条件でポリマーフィルムの作製及び粒子化を行い、粒子径測定を行った。その後、２００ｎｍフィルター処理を行い、粒子径測定を行った。更にその後、１００ｎｍフィルター処理を行い、粒子径測定を行った。その結果を表１に示す。  また、粒子径測定結果のグラフを図７に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
  実施例１～４及び比較例１の結果から、本発明作製法によれば、フィルター処理無しで、又はフィルター処理の回数を少なくして、従来のフィルム法に比べＰＤＩの小さな分子集合体、単分散性の均一な分子集合体を１ロットで大量に作製できることが明らかである。一方、従来のフィルム法では、フィルター処理しない場合、又は２００ｎｍのフィルター処理のみの場合では、ＰＤＩが０．２以下で単峰性の粒子を得ることができなかった。
  本発明作製法によれば、より粒子径が均一な粒度分布の狭い分子集合体を、１ロットで大量に作製することができることから、本発明は、分子イメージングシステムや薬剤搬送システム（ＤＤＳ）等の分野で有用である。また、同様に、化粧品、食品、家庭用品等の分野における物質搬送キャリアの作製法としても有用である。

Claims (14)

  1. 容器内で、直鎖型又は分岐型の両親媒性ブロックポリマーを含む溶液から溶媒を留去することにより、該ブロックポリマーを有するフィルムを形成し、その後、該容器中に水又は水溶液を加えて分子集合体を作製する方法であって、
      前記容器内の溶液に１個以上の粒状体を浸した状態で、溶媒を留去し前記フィルムを形成することを特徴とする、前記両親媒性ブロックポリマーを含む分子集合体の作製法。
  2. 粒状体が、球体である、請求項１に記載の分子集合体の作製法。
  3. 球体がガラスビーズである、請求項２に記載の分子集合体の作製法。
  4. 粒状体の総表面積が、溶液が接している容器内壁の表面積の１０倍以上である、請求項１～３のいずれか一項に記載の分子集合体の作製法。
  5. 両親媒性ブロックポリマーが、サルコシン単位を有する親水性ブロック鎖と、乳酸単位を有する疎水性ブロック鎖とを含むものである、請求項１～４のいずれか一項に記載の分子集合体の作製法。
  6. 親水性ブロック鎖のサルコシン単位が２～５００個の範囲内である、請求項５に記載の分子集合体の作製法。
  7. 疎水性ブロック鎖の乳酸単位が５～１００個の範囲内である、請求項５に記載の分子集合体の作製法。
  8. 両親媒性ブロックポリマーが、機能性基を有するものである、請求項１～７のいずれか一項に記載の分子集合体の作製法。
  9. フィルム形成前の両親媒性ブロックポリマーを含む溶液が、機能性物質を含むものである、請求項１～８のいずれか一項に記載の分子集合体の作製法。
  10. 機能性基がシグナル基又はリガンド基である、請求項８に記載の分子集合体の作製法。
  11. 機能性物質がシグナル剤又は薬剤である、請求項９に記載の分子集合体の作製法。
  12. 粒子径や粒度分布制御のためのフィルター処理工程を含まない、請求項１～１１のいずれか一項に記載の分子集合体の作製法。
  13. フィルム形成前における両親媒性ブロックポリマーの溶液中の濃度が、１０ｍｇ／ｍＬ以上である、請求項１～１２のいずれか一項に記載の分子集合体の作製法。
  14. さらに凍結乾燥工程を含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載の分子集合体の作製法。
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