JPS607933A - リポソ−ムの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はリポソームの製造法に関する。

脂質の閉鎖小胞であるリポソームは、広く生体膜のモデ
ルとしてその物理化学的諸性質の研究に利用されてきた
。またリポソームはその内部に種々の薬剤を保持するこ
とが可能であるために、マイクロカプセルの一種として
硅経口吸収性薬剤の吸収促進、制癌剤等の細網内皮系組
織へのターゲツティング、免疫賦活剤等の活性増強等の
応用研究が数多くなされている。リポソームがこれらの
研究に盛んに用いられている主な理由は、リポソームの
膜構成成分自体が生体由来の脂質であるために毒性が少
ないこと。

生体の種々の膜との親和性が高いことなどが挙げられる
。一方これらリポソームの製法としては大部分膜成分物
質である脂質の溶解剤としてクロロホルム、エーテル、
ベンゼン、エタノール、ヘキサン等を用いており、また
脂質の可溶化剤としてコール酸、トライトンＸ−１００
及びその他の界面活性剤を用いている。従って前者の場
合には有機溶媒を減圧、加温、不活性ガスのバブリング
等により除去せねばならないし。

最終製品中の残留溶媒が問題となる。また、これら調製
方法をそのまま工業的生産に結びつけるには保安上及び
安全作業上の問題の他、操作技術上の困難さ等がある。

更に後者の場合には最終製品から透析またはゲル濾過に
よって用いた界面活性剤を分離除去する必要がある。

有機溶媒あるいは界面活性剤等を用いずにリポソームを
調製するものとしては、アニーリング法、凍結融解法の
他、特開昭５７−８２８１０号及び同５７−８２８１１
号に示される凍結乾燥法などがある。アニーリング法で
は、リン脂質−水分散液をリン脂質の相転移温度（Ｔｃ
）以下にて超音波照射し、構造欠損（５ｔｒｕ、ｃｔｕ
ｒａｌｄｅｆｅｃｔ　）を起こした５ｔｙｖ（小さな一
枚膜リポソーム）をいったん製し、その後にＴｃ、以上
でインキュベーションして融合させＬＵＶ（大きな一枚
膜リポソーム）を調製する手法をとっている。

凍結融解法では、大豆リン脂質に緩衝液を加え２０〜３
５℃で２０分間起音波照射してＳＵＶをいったん製し１
次にドライアイス−エタノールですばやく凍結し更に室
温に戻して融解させ８０℃で軽く超音波照射して融合さ
せることによりＬＵＶを調製する手法をとっている。ま
た凍結乾燥法ではリン脂質を水性溶媒中に分散させた後
凍結乾燥し、これを水性溶媒中に再分散させることによ
りリポソームを製するものである。本来リン脂質は水和
されて初めてラメラ−構造を持ったリポソームになるわ
けであるが。

単なるＴｃ　以上ではリン脂質はながなが水性溶液によ
って水和されず、リポソームもできにくい。従ってＴｃ
付近で適用しても能率、効率の面で決して優れていると
は言い難く、又一部の膜成分物質即ちジセチルホスフェ
ートの如き単独で液晶相を持たない膜成分物質が膜の中
に入りにくいなどの欠点がある。

本発明者らはこれらの状況に優み、従来その有用性につ
いてはあまり顧みられながった有機溶媒を全く使用せず
にリポソームを調製する方法、即ちただ単に脂質を水性
溶媒中に分散させる方法に注目し、その改良について鋭
意検討した結果、リポソームを構成する通常の膜成分物
質と水性溶液とを混ぜて膨潤させ攪拌する際。

従来言われていた脂質が水和したラメラ−相（２分子膜
）での相転移温度（Ｔｃ　）ではなく。

粉末結晶としての相転移温度（Ｔｃ）以上にて行うこと
により（Ｔｃ＞Ｔｃ）均一なリポソームを効率良くしか
も大量に製することができることを見出１本発明を完成
するに至った。一般に中性脂質であるホス７アチジルコ
リン、スフィンゴミエリン、ホスファチジルエタノール
アミンの場合、その脂肪酸鎖長や不飽和度によらず固体
としての融点は高く各々２８０，２０５゜１９６℃であ
ることが知られている。しかしながら実際にはこれら固
体としての融点よりはるかに低い温度にて、これらの脂
質は吸熱的な相変化をし、脂肪酸鎖の部分が溶けて液体
状態になる。即ち液晶へと相変化することが知られてい
る。例えばジパルミトイルホスファチジルコリンの場合
には、ラメラ−相（２分子膜）の状態では４１℃に相転
移温度がある。この温度がよくいわれる脂質の相転移温
度（Ｔｃ）であるが。

これは脂質が水の中で完全に水和され（レシチン１分子
に対し１０分子の水が水和し、それ以上の水は自由水と
なる）でラメラ−相（２分子膜）を形成しているときの
相転移温度を意味している。ジパルミトイルホスファチ
ジルコリンの場合、水和した状態即ちラメラ−相（２分
子膜）の状態では相転移温度は４１℃にあるが。

粉末結晶状態では６５℃（ｌ水和物結晶）あるいは９３
℃（無水物結晶）に相転移温度が存在する。そしてただ
単にリン脂質を水性溶媒中に分散させ温度を単にＴｃ　
以上にしても、水界面と接したリン脂質は水和されてこ
の温度で流動性を持ってはいるが、粉末結晶内部のリン
脂質は水和されず固体状態にあるといえる。ここで攪拌
等の機械的振動を与えると水界面と接し水和されたリン
脂質だけが水性溶媒中にリポソームとして分散していく
ことになる。

このように単なるＴｃ　以上で行う従来の方法は、粉末
結晶状態のリン脂質−水界面で徐々にラメラ−構造（２
分子膜）を生成させ小胞化させていくという方法である
がために、能率、効率の面で優れた方法とは言いがたい
。これに対し本発明によれば、リン脂質の粉末結晶状態
即ち無水物結晶あるいは１水和物結晶としての相転移温
度（Ｔｃ）に注目して行うために能率、効率の面で上述
の方法よりはるかに優れている。

即ちＴｃ以上では相溶媒中に粉末結晶状態で分散してい
るリン脂質は、水界面のリン脂質ばかりでなく内部のリ
ン脂質も液体状態にあるために非常に水和されやすい状
態にある。ここで攪拌等の機械的振動を与えてやれば内
部のリン脂質も瞬時に水和されながらリポソーム化して
水性溶媒中に分散していくことになる。かかる新知見に
基いてなされたのが本発明である。

本発明において使用される膜成分物質としては９例えば
ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミ
ン、ホスファチジルセリン。

ホスファチジルイノシトール、リゾホスファチジルコリ
ン、スフィンゴミエリン、卵黄レシチン、大豆レシチン
等に代表されるリン脂質の他。

糖脂質、ジアルキル型合成界面活性剤等の一種又は二種
以上の混合物が主体となる。なお、これに膜安定化剤と
してコレスタン、コレステロール等のステロール類を、
荷電物質としてジセチルホスフェート、ホスファチジン
酸、ガングリオシド、ステアリルアミン等を、更に酸化
防止剤としてα−トコフェロール等を加えて膜成分物質
を形成させてもよい。

これらリポソーム製剤の膜成分物質の比率は何ら限定さ
れるべきものではないが、好ましくは脂質１重量部に対
しステロール類を０〜２重量部程度、荷電物質をｏ、１
重量部程度加えるのが適している。

また膜成分物質を分散させる水性溶媒としては、水、生
理食塩水、緩衝液、糖類の水溶液及びこれらの混合液等
が好ましく使用される。

膜成分物質との使用比率は膜成分物質１重量部に対し、
１０〜１０００重賃部程度が適当である。

本発明のリポソームに保持させる薬剤としては、特に制
限はないがサイトシンアラビノシド。

メトトレキセートに代表される制癌剤、ペニシリンＧに
代表される抗生物質、インシュリン。

インターフェロン、グルコアミラーゼに代表されるたん
ばく質、デキストランに代表される多糖類、ＤＮＡ、几
ＮＡの如き核酸類、ビタミンＡに代表されるビタミン類
などの他、サリチル酸ナトリウムのような一般薬剤が用
いられ、一般にはこれ等は水性溶媒に溶解して用いる。

本発明にもとづいてリポソーム製剤を製するには以下の
如き手順によれば良い。

まず用いる膜成分物質自体の粉末結晶としての相転移温
度（Ｔｃ）をめるが、一般に示差相差熱分析（ＤＳ（り
による熱的分析が速くて簡便である。

ここで用いる膜成分物質自体とは、無水物結晶状態であ
れｌ水和物結晶状態であれ限定はされないが、一般には
無水のリン脂質は吸湿性が強く容易に１水和物を形成し
てしまうことが知られている。ここでいう粉末結晶とし
ての相転移温度（Ｔｃ）は、卵黄レシチン、スフィンゴ
ミエリンに代表される単独で液晶相をもつ脂質の場合に
は脂肪酸鎖の部分が液体状態になる。即ち、液晶へ相変
化する温度を意味し、固体としての融点（ｍｐ）を意味
しているのではない（Ｔｃ＜Ｔｃ＜＜ｍｐ　）。また、
ステアリルアミン。

ジセチルホスフェート、コレスタンに代表される単独で
は液晶相をもたない脂質の場合には。

いわゆる固体としての融点（ｍｐ）を意味している。Ｄ
ＳＯの測定における昇温速度は２〜ｂ の補性開始温度を相転移温度（Ｔｃ）とすれば良い。

次に所定量の薬剤を含有する水性溶媒をとり。

あらかじめ膜成分物質の粉末結晶としての相転移温度（
Ｔｃ）以上に加温しておく。ここで膜成分物質として何
種類かを混合して用いる場合には、用いる膜成分物質の
中で最も粉末結晶としての相転移温度（Ｔｃ）が高いも
のに合わせることが望ましい。

従来のただ単に脂質のＴｃ以上に加温する方法では、こ
のステアリルアミン、ジセチルホスフェートの如き単独
で液晶相を持たない膜成分物質が無視されており、従っ
て、ジセチルホスフェートのような高い融点（７０℃）
の物質が。

例えばジパルミトイルホスファチジルコリン（Ｔｃ−４
１℃）と共に処方された場合、リポソームの膜の中に入
りにくかった理由がここにあると考えられる。

次にこの水性溶媒中に所定量の膜成分物質を加えると、
膜成分物質はすぐに水性溶媒中に膨潤し始める。この時
攪拌操作を行うことにより。

薬剤を保持した均一のリポソームが再現性良く得られる
ことになる。この膨潤、攪拌操作もＴｃ以上で行うが、
この水性溶媒と膜成分物質の混合においては、添加順序
は任意である。

この攪拌においては攪拌機の選択によりできるリポソー
ムの粒径は影響を受けやすい。即ちプロペラミキサーの
如く比較的紛和な攪拌機を用いた場合には大きな粒径の
リポソームができやすいし、ホモミキサーの如く比較的
せん断力の強い攪拌機を用いた場合には、小さな粒径の
リポソームができやすい。また更に小さな粒径のリポソ
ームを製するには超音波乳化機、高圧乳化機等を用いる
のも良いし、径を均一にするため限外濾過膜法１例えば
ポリカーボネート製メンプラン・フィルターによって粒
径分布をコントロールすることも可能である。

なお、同−処方内で薬剤のリポソームへの保持率を高め
るには保持させる薬剤を少量の水性溶媒に溶かしこみ、
これをまず膜成分物質との混合に用いて、最後に残りの
水性溶媒を加えて希釈した方がよい。

このようにして薬剤を保持した均一粒径のリポソーム製
剤が再現性良く、シかも大量に得ることもできるが、こ
のリポソーム製剤はこのまま使用しても良く、また透析
、ゲル濾過、遠心分離等の手段によりリポソームに保持
されなかった薬剤を分離除去して使用しても良い。

既知のリポソーム調製法に比して本発明法が優れている
ところは次の点である。

１）有機溶媒をいっさい使わずにリポソームの調製が可
能である。従って、保安上、安全作業上、及び生物学的
安全性上問題ない。

２）製造は非常に簡便で、特別な装置や操作技術は必要
としない。

調製時の温度制御に留意するのみで良い。

３）薬剤の保持率の高いリポソーム製剤が得られる。

４）スケールアップが容易であり、リポソーム製剤の工
業的生産が可能である。

５）膜成分物質の中で一部使いにくいものもあるが（例
えばコレステ四−ルは融点が１４８℃と高く、温度制御
だけで膜の構成成分の一部として入れるには無理がある
。この場合、コレスタンなどの融点の低いステロール類
によって代用が可能である。）、はとんどの脂質で調製
可能である。従来のＴｃ　以上でただ単にリン脂質粉末
結晶を大量の水性溶媒中で攪拌する方法では、ジセチル
ホスフェートの如き単独で液晶相を持たない膜成分物質
が膜の中に入りにくいという欠点があったが１本発明に
よれば容易に膜中に入れることができる。

次に実施例により本発明を例示するが、これらの実施例
は何ら本発明を限定するものではない。

実施例１ 市販のＬ−α−シミリストイルホス７アチジルコリン（
Ｌ−α−１）ＭＰ　Ｃ！　、純度９８％。

Ｔｃ　−２８℃）を粉末結晶状態のまま熱的分析（ＤＳ
Ｏ）にかけＴｃをめたところ４５℃（昇温速度４℃／　
ｍｉｎ　）であった。

次にリポソームに保持させるモデル薬物としてグルコー
スをｉヒ、　ｏ。２８Ｍグルコース水溶液５０ｍ１を水
浴上５５℃（＞Ｔｃ）に加温した。ここに上記り一α−
ＤＭＰＯＯ，７９を加え攪拌し均一に膨潤せしめた後、
５０〜５５℃（＞’ｌ’α）にてホモミキサーにより２
分間攪拌し室温に戻したところ、グルコースを保持した
乳白色のリポソーム懸濁液が得られた。

このリポソーム懸濁液０．５−をとりセファデックスＧ
−５０を用いてゲル濾過（ＩＣｒｎφｘ１８ｃｍ、生理
食塩水５℃）シ、リポソームに保持されなかったグルコ
ースを分陰除去した。次いでリポソーム画分のグルコー
スを常法に従って、油／水　分配により水層中に抽出し
定量したところ、保持率は９．３％であった。

またゲル濾過して得たリポソーム画分を光学顕微鏡（日
本光学、広視野顕微鏡）により観察したところ９粒径１
μｍ前後の均一な球状を呈していた。更に遠心分離を行
い、得られた沈殿物につきＤＳＯによる熱測定を行った
ところ。

２３℃（−Ｔｃ）付近にピークが認められ島比較例１ 実施例１と同一の処方で行い、グルコース水溶液の加温
は３０℃（＞Ｔｃかつ〈Ｔｃ）、攪拌は２５〜３０℃（
＞Ｔｃかつ〈Ｔｃ）で行った。

ホモミキサーによる攪拌２分間では試料は均一に分散せ
ず、攪拌を中断すると沈殿物及び浮遊物が認められたこ
とから、リポソームが完全にはできていないものと判断
された。攪拌１時間後、均一な乳白色のリポソーム懸濁
液が得られ。

この液を室温に戻した後その０．５−をとり実施例１と
同様にゲル濾過を行ったところ、その保持率は５．１％
であった。

実施例２ 市販のＬ−α−ジパルミトイルホス７アチジルコリン（
Ｌ−α−ＤＰＰＯ，シグマ、純度９８％、Ｔｃ−４１”
０）の粉末結晶状態でのＴｃをＤＳＯによりめたところ
５４℃（昇温速度４℃／　ｍｉｎ　）であった。

このＬ−α−ＤＰＰＯ１，０９に、あらかじめ６５℃（
＞Ｔｃ）に保温した０、２８Ｍグルコース水溶液５０−
を加えた後、６０〜６５℃（＞’Ｉ’α）にてホモミキ
サーにより２分間攪拌し室温に戻したところ、グルコー
スを保持した乳白色のリポソーム懸濁液が得られた。

このリポソーム懸濁液種５−をとり実施例１と同様にゲ
ル濾過（ただし室温）を行ったところ、その保持率は１
４．６％であった。

またゲル濾過して得たリポソーム画分を広視野光学顕微
鏡により観察したところ１粒径１μｍ前後の均一な球状
を呈していた。更に遠心分離を行い、得られた沈殿物に
つきＤＳＣによる熱測定を行ったところ、４１℃（−Ｔ
ｃ）伺近にピークが認められた。

比較例２ 実施例２と同一の処方で行い、グルコース水溶液の加温
は４５℃（）Ｔｃかつ〈Ｔｃ）、攪拌は４０〜４５℃（
＞Ｔｅかつ〈Ｔｃ）で行った。

ホモミキサーによる攪拌２分間では試料は均一に分散せ
ず、室温に戻したところ沈殿物及び浮遊物が認められた
ことから、リポソームが完全にはできていないものと判
断された。攪拌１時間後、均一な乳白色のリポソーム懸
濁液が得られ、この液を室温に戻した後そのＯ０！５ｔ
ｎｔをとり実施例２と同様にゲル濾過を行ったところ、
その保持率は１０．４％であった。

実施例３ 市販のＤＬ−α−ジパルミトイルホス７アチジルコリン
（ＤＬ−α−ＤＰＰＯ，純度９９％。

Ｔｃ−４１℃）の粉末結晶状態でのＴｃ、をＤＳＣによ
りめたところ６２℃（昇温速度４℃／　ｍ１ｎ）であっ
た。同様にステアリルアミン（ＳＡ）についてその融点
（Ｔｃ２）をめたところ４１℃であった。従ってこの系
のＴｃを６２℃（−’Ｉ’α、）とした。

次に０．２８Ｍグルコース水溶液５０ｗｄを１００−ビ
ーカーにとり水浴にて７５℃（＞’Ｉ’α）に加温した
。ここに上記ＤＬ−α−ＤＰＰ（！１．０ｇ及び５Ａ４
０■を加え攪拌し均一に膨潤せしめた後、７０〜７５℃
（＞Ｔｃ）にてホモミキサーにより２分間攪拌し室温に
戻したところ。

ったところ、その保持率は１５．２％であった。

またゲル濾過して得たリポソーム画分を広視野光学顕微
鏡により観察したところ９粒径１μｍ前後の均一な粒状
を呈していた。

比較例８ 実施例３と同一の処方で行い、グルコース水溶液の加温
は４５℃（）Ｔｃ、Ｔｃ、かつ〈Ｔｃ、）。

攪拌は４１〜４５℃（＞Ｔｃ、Ｔｃ、かつ〈Ｔｃｌ）で
行った。ホモミキサーによる攪拌２分間では試料は均一
には分散せず、攪拌を止めると沈殿物及び浮遊物が認め
られたことから、リボソー　ムは完全にはできていない
ものと判断された。

次に攪拌温度を５０〜ｂ かつ〈Ｔｃ１）に上げて更に攪拌を２分間行ったところ
乳白色の懸濁液が得られた。しかしながらこの懸濁液を
室温に戻した後、その０．５−をとり実施例２と同様に
ゲル濾過を行ったところ試料の一部が注入口付近にとど
まっていた。

カラムを通過したリポソーム画分につきグルコースの保
持率をめたところ８．５％であった。

実施例４ 膜成分物質として実施例８と同じＤＬ−α−Ｄ　Ｐ　Ｐ
　Ｃ（Ｔｃ＝４１”０．　Ｔｃ、−６２℃）を用い。

更にジセチルホスフェート（ＤＯＰ）についてＤＳＯに
よりその融点（Ｔｃ、）をめたところ７０℃（昇温速度
４℃／　ｍｉｎ　）であった。従ってこの系のＴｃを７
０℃（−Ｔｃ２）とした。

０．２８Ｍグルコース水溶液５０−を水浴上７５℃（＞
Ｔｃ）に加温した。ここにＤＬ−α−ＤＰＰＯＯ，７ｇ
及びＤＣＰ５５ｍｇを加え攪拌し均一に膨潤せしめた後
、７０〜７５℃（〉Ｔｃ）にてホモミキサーにより２分
間攪拌し室温に戻したところ、グルコースを保持した乳
白色のリポソーム懸濁液が得られた。

このリポソーム懸濁液０．５−をとり実施例２と同様に
ゲル濾過を行ったところ、その保持率は１８．８％であ
った。

比較例４ 実施例４と同一の処方で行い、グルコース水溶液の加温
及び攪拌は６５℃前後（＞　Ｔｃ、　Ｔｃ。

かつ〈Ｔｃ、）で行った。ホモミキサーによる攪拌を３
０分間行ったが、乳白色の懸４Ｕ得られるものの、懸濁
液中にＤＯＰと思われる白色結晶が多く認められ、室温
に戻して放置したところ沈降した。これはこの温度での
条件ではＤＬ−α−ＤＰＰＯは水和されてリポソーム化
するが、荷電物質であるＤＯＰはその融点（Ｔｃ、）が
高いため、膜を構成する膜成分となるに至らなかったた
めであることが示唆された。

この懸濁液の上層をＱ、５匍１とり、実施例２と同様に
ゲル濾過を行ったところその保持率は８．９％であった
。

実施例５ 完全水添精製卵黄レシチン（ＩＶ−１，ＩＪン脂質９９
％以上、　Ｔｃ　−４５〜６０℃、Ｔｍａｘ−５２℃）
の粉末結晶状態でのＴｃ、をＤＳＣによりめたところ６
７℃（昇温速度４℃／　ｍｉｎ　）であった。また荷電
物質としてはジセチルホスフェー）（ＤＯＰ、Ｔｃ２−
７０℃）を用いることとし、この糸のＴｃを７０℃（−
Ｔｃ、）とした。

次に上記完全水添精製卵黄レシチン１１．０９及びＤＯ
Ｐ　８２０■をあらかじめ７５℃（＞’Ｉ’α）に保温
した０、２８Ｍグルコース水溶液３０〇−を加えた後、
７０〜７５℃（＞Ｔｃ）にてホモミキサーにより３分間
攪拌し室温に戻したところ。

グルコースを保持した乳白色のリポソーム懸濁液が得ら
れた。

このリポソーム懸濁液Ｑ、５　ｍｌをとり実施例２と同
様にゲル濾過を行ったところ、その保持率は２８．０％
であった。

比較例５ 実施例５と同一の処方で行い、グルコース水溶液の加温
及び攪拌は６０〜６５℃（＞Ｔｃ。

〈ＴαＩＴＴα）で行った。ホモミキサーによる攪拌を
３０分間行ったが、比較例４と同様懸濁液中にＤＯＰと
思われる白色結晶が多く認められ。

室温に戻して放置したところ沈降した。

比較例４と同様、この懸濁液の上層を０．５−とり実施
例２と同様にゲル濾過を行ったところその保持率は１９
．０％であった。

実施例６ 実施例５と同様にして０．２８Ｍグルコース水溶液の代
わりに１％デキストランＴ４０生理食塩水溶液を、ホモ
ミキサーの代わりにプロペラミキサーを用いて調製した
ところ、デキストランＴ４０を保持した乳白色のリポソ
ーム懸濁液が得られた。

このリポソーム懸濁液１−をとりセファローズ０Ｌ−４
Ｂを用いてゲル濾過（２，２ｃｍφ×４２ｃｍ、生理食
塩水）シ、リーボソームに保持されなかったデキストラ
ンＴ４０を分離除去した。

次いでリポソーム画分のデキストランＴ　４．０　全常
法に従って　油／水　分配により水層中に抽出し定量し
たところ、保持率は２１．２％であった。

実施例７ 実施例６と同一処方で行ったが、デキストラン’ｆ’４
０は高濃度生理食塩水溶液で添加し、この段階で攪拌し
てリポソームを調製し、その後残りの生理食塩水を加え
て希釈、攪拌した。即ち実施例６と同様にまず完全水添
精製卵黄レシチン１１゜Ｏｇ及びＤＣ！Ｐ８２０ｍｇを
とり、あらかじめ７５℃（＞Ｔα）に保温した２％デキ
ストランＴ４０生理食塩水溶液１５０ｎ／を加えた後７
０〜７５℃（＞Ｔα）にてプロペラミキー丈−により３
分間攪拌した。この液を室温に戻した後。

更に生理食塩水１５０−を加えて室温にてプロペラミキ
サーにより２分間攪拌したところ、デキストランＴ４０
を保持した乳白色のリポソーム懸濁液が得られた。

このリポソーム懸濁液１ｄをとり実施例６と同様にゲル
濾過を行ったところ、その保持率は２９．７％であった
。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. リポソーム膜成分物質と水性溶液とを、膜成分物質自体
   の相転移温度以上にて、攪拌することを特徴とするリポ
   ソームの製造法。