ES2275443A1

ES2275443A1 - Procedimiento de preparacion de liposomas.

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Publication number: ES2275443A1
Application number: ES200502954A
Authority: ES
Inventors: Jaime Moscoso Del Prado; Lydia Echevarria Zamacona
Original assignee: Italfarmaco SA
Current assignee: Italfarmaco SA
Priority date: 2005-11-30
Filing date: 2005-11-30
Publication date: 2007-06-01
Anticipated expiration: 2025-11-30
Also published as: EP2380559A1; WO2007063156A1; US20080274172A1; EP2380559A4; ES2275443B1

Abstract

Procedimiento para preparar liposomas con al menos dos fosfolípidos homogéneamente distribuidos sin utilizar solventes orgánicos.

Description

Procedimiento de preparación de liposomas.

La invención se refiere a un procedimiento para preparar liposomas que contengan al menos dos fosfolípidos distribuidos de forma homogénea en las membranas sin utilizar solventes orgánicos.

Antecedentes de la invención

Los liposomas son vesículas microscópicas que poseen una cavidad central acuosa rodeada por una membrana lipídica formada por bicapa(s) concéntrica(s) (lamelas) y tienen capacidad de incorporar sustancias hidrofílicas (en el interior acuoso) o hidrofóbicas (en la membrana lipídica). Pueden ser unilamelares (es decir tener una única bicapa lipídica), oligolamelares o multilamelares. Las vesículas multilamelares (MLVs) tienen un tamaño que va desde 0,2 \mum a 10 \mum mientras que las unilamelares pueden ser grandes (LUVs) o pequeñas (SUVs) con un tamaño entre 0,02 y 0,2 \mum.

Los componentes estructurales más importantes de los liposomas son los fosfolípidos (PLs). Las propiedades de las vesículas liposomales van a depender, entre otros factores, de la naturaleza de los fosfolípidos constituyentes. Es así que, si se pretende obtener liposomas con determinadas características se debe tener en cuenta la carga de su grupo polar y/o la longitud y el grado de saturación de las cadenas de sus ácidos grasos.

Un importante parámetro a considerar en lo concerniente a la formación de liposomas es la rigidez de la bicapa lipídica. El PL hidratado que forma parte de la bicapa puede estar en estado líquido-cristalino (fluido) o gel. Incrementando la temperatura, el estado gel se convierte en líquido-cristalino. Esto ocurre a una temperatura conocida como temperatura de transición (Tc), específica para cada PL. La Tc es directamente proporcional al largo de cadena e inversamente proporcional al grado de insaturación de los ácidos grasos y depende de la naturaleza del grupo
polar.

Si se desea modificar las propiedades de los liposomas se puede, por ejemplo, incorporar colesterol (COL) u otros lípidos a la membrana, modificar el número de bicapas lipídicas o unir covalentemente moléculas naturales (por ejemplo proteínas, polisacáridos, glicolípidos, anticuerpos, enzimas) o sintéticas (por ejemplo polietilenglicol) a su superficie.

Las vesículas liposomales tienen aplicación en distintos campos, por ejemplo son útiles como vehículos para la administración de fármacos, productos cosméticos, agentes diagnósticos y material genético.

Existen numerosas opciones para combinar fosfolípidos con una fase acuosa y obtener liposomas. Dependiendo del método de preparación y los lípidos utilizados es posible obtener vesículas de diferente tamaño, estructura y propiedades.

El paso común de los métodos para preparar liposomas consiste en evaporar el solvente orgánico en el cual los lípidos están disueltos y posteriormente dispersar los lípidos en una solución acuosa tamponada. Los procedimientos de preparación difieren en la forma en la que los lípidos son dispersados y pueden ser clasificados en:

a) Hidratación directa de una capa lipídica delgada. Es el método original de Bangham et al.. A partir de la solución orgánica de los lípidos constituyentes de la bicapa se prepara un film lipídico por remoción del solvente orgánico, que se puede llevar a cabo por evaporación (a presión reducida en un rotavapor) o liofilización. El film lipídico seco depositado sobre la pared del matraz se hidrata por adición de una solución tampón y agitación a temperaturas por encima de la Tc.

b) Evaporación en fase reversa. Primero se prepara un film lipídico por remoción del solvente orgánico. El sistema se purga con nitrógeno y los lípidos se redisuelven en una segunda fase orgánica, habitualmente constituida por dietiléter y/o isopropiléter. Sobre los lípidos redisueltos se añade la fase acuosa. El sistema se mantiene bajo nitrógeno continuo. El gel se forma por emoción del segundo solvente orgánico.

c) Inyección de solvente. Los lípidos disueltos en un solvente orgánico se inyectan lentamente en una solución acuosa templada.

En el caso de querer incorporar más de un PL, se debe cuidar que éstos queden distribuidos de forma homogénea en las vesículas liposomales. Tradicionalmente, esto se logra disolviendo previamente los PLs en un solvente orgánico y utilizando la solución orgánica resultante para preparar los liposomas.

US 4508703 describe un método para obtener mezclas pulverulentas de al menos un lípido amfifilico y opcionalmente al menos un componente de carácter hidrofóbico o parcialmente hidrofóbico que comprende disolver en al menos un solvente orgánico los componentes de la mezcla y atomizar la solución obtenida en un gas inerte. El método permite preparar mezclas lipídicas que pueden ser fácilmente dispersadas en un medio acuoso pero no evita utilizar solventes orgánicos.

WO 92/10166 - EP 514523 describe un método para preparar liposomas con una elevada capacidad de encapsulación. El método permite emplear mezclas de lípidos, sin embargo dicha mezcla se obtiene mediante previa disolución de los lípidos en un solvente orgánico y su posterior evaporación. Por otra parte, el contacto entre lípido(s) y la solución acuosa de agente activo se realiza a una temperatura por encima de la Tc.

En suma, las técnicas del arte previo para preparar liposomas que contienen más de un PL, utilizan solventes orgánicos para lograr su adecuada distribución en las vesículas liposomales. Sin embargo, los solventes orgánicos, debido a su toxicidad y flamabilidad, son reactivos no deseables desde un punto de vista industrial por sus repercusiones negativas en costes de producción, seguridad e higiene laboral y medioambiente.

Resumen de la invención

Existe por lo tanto la necesidad de disponer de un procedimiento para preparar liposomas que permita incorporar al menos dos PLs de forma homogénea en las membranas liposomales sin tener que hacer una premezcla de los PLs disueltos en solventes orgánicos.

Los inventores de la presente han encontrado que aplicando un incremento de temperatura sobre una suspensión acuosa de al menos dos PLs en estado sólido, desde una temperatura menor a la Tc hasta una superior a la Tc, es posible obtener liposomas estables, en los que los PLs están distribuidos de forma homogénea.

Por otra parte, en caso de que se desee incorporar al menos un agente activo, los inventores han encontrado que, empleando suspensiones acuosas de los PLs en estado sólido, es posible preparar liposomas donde el agente activo permanece eficazmente encapsulado durante el tiempo necesario para su preparación, almacenamiento, distribución y utilización.

De acuerdo con lo anteriormente expuesto, la presente invención se refiere a un método que permite preparar liposomas con al menos dos fosfolípidos sin utilizar solventes orgánicos. Este método comprende las siguientes etapas:

- añadir los fosfolípidos en forma sólida a un medio acuoso;

- dispersar la suspensión resultante por agitación enérgica a una temperatura inferior a la temperatura de transición de la mezcla de fosfólipidos durante el tiempo necesario para obtener una dispersión homogénea;

- aumentar la temperatura hasta alcanzar una temperatura superior a la temperatura de transición de la mezcla de fosfolípidos manteniendo agitación enérgica hasta la completa formación de los liposomas.

Previo a la descripción de las realizaciones particulares, cabe definir algunos términos específicos vinculados a los aspectos principales de la presente invención, con fines aclaratorios, no limitativos.

Se entiende por "fosfolípido" a aquel derivado anfifilico del glicerol en el que uno de sus grupos hidroxilo está esterificado con ácido fosfórico y los otros dos hidroxilos están esterificados con ácidos grasos de cadena larga, que pueden ser iguales o diferentes entre sí y pueden ser saturados o insaturados. Un fosfolípido neutro será generalmente aquel en el que otro hidroxilo del ácido fosfórico está esterificado por un alcohol sustituido con un grupo polar (habitualmente hidroxilo o amino) y cuya carga neta es cero. Un fosfolípido con carga será generalmente aquel en el que otro hidroxilo del ácido fosfórico está esterificado por un alcohol sustituido por un grupo polar y cuya carga neta es positiva o negativa.

Se entiende por "temperatura menor a la Tc" aquella temperatura que sea menor a la Tc del PL de menor Tc, y por "temperatura mayor a la Tc" aquella temperatura que sea mayor a la Tc del PL de mayor Tc.

Se entiende por "medio acuoso" a un medio que no contiene solventes orgánicos. El medio acuoso está constituido por agua y, opcionalmente, solutos tales como agentes reguladores de pH, sustancias reguladoras de osmolaridad y agentes quelantes.

Se entiende por encapsulación al procedimiento de incorporación de un agente activo en las vesículas liposomales. En el contexto de la presente invención, el agente activo encapsulado puede permanecer en el interior acuoso o asociado a membranas.

Figuras

Fig. 1: Fotografía mediante microscopia electrónica de liposomas DSPC:DSPG vacíos

Fig. 2: Análisis granulométrico de liposomas DSPC:DSPG vacíos

Fig. 3: Potencial Z de liposomas DSPC:DSPG vacíos

Fig. 4: Análisis granulométrico de liposomas DSPC:DSPG con 5-FU

Fig. 5: Potencial Z de liposomas DSPC:DSPG con 5-FU

Fig. 6: Análisis granulométrico de liposomas DSPC:DPPG vacíos

Fig. 7: Potencial Z de liposomas DSPC:DPPG vacíos

Fig. 8: Análisis granulométrico de liposomas DSPC:DSPG con dicofenaco sódico

Fig. 9: Potencial Z de liposomas DSPC:DSPG con diclofenaco sódico

Fig. 10: Estabilidad de liposomas DSPC:DSPG vacíos

Fig. 11: Estabilidad de liposomas DSPC:DSPG con diclofenaco sódico

Descripción detallada de la invención

En una realización particular, el medio acuoso utilizado en la etapa inicial del procedimiento de esta invención no contiene un agente activo. De este modo es posible obtener vesículas vacías, que pueden ser utilizadas como tales o en las cuales puede ser encapsulado luego al menos un agente activo (por encapsulación activa). El método de encapsulación activa empleado puede ser cualquiera de los conocidos por un experto en la materia, tales como técnicas mediante gradiente de pH o gradiente de concentración.

En otra realización particular, el medio acuoso empleado en la primera etapa del procedimiento de la presente invención contiene un agente activo. De esta forma es posible preparar, sin etapas adicionales, liposomas con al menos un agente activo (por encapsulación pasiva).

En ambos casos el agente activo a encapsular puede ser añadido en suspensión o solución y una vez encapsulado puede permanecer en el interior acuoso y/o asociado a membranas.

El procedimiento de la presente invención permite encapsular en liposomas agentes activos tales como fármacos, material diagnóstico, cosméticos, sustancias alimenticias, material genético, etc, de manera eficaz y estable. Preferiblemente, este procedimiento es utilizado para incorporar agentes farmacológicamente activos a liposomas. En principio, cualquier fármaco puede ser encapsulado utilizando el procedimiento de la presente invención.

La relación molar sustancia activa/PLs dependerá de las características de la sustancia a encapsular. El límite inferior viene determinado por la menor cantidad de sustancia que resulte práctica para hacer liposomas dado su pretendido uso y puede ser fácilmente determinado por un experto en la materia. El límite superior está condicionado por la estabilidad de los liposomas.

Los liposomas preparados de acuerdo con el procedimiento de la presente invención son habitualmente MLVs grandes, con un diámetro medio entre aproximadamente 1 y 10 \mu. Pero también podrían fabricarse otras clases del liposomas seleccionando otros parámetros operativos.

Opcionalmente, los liposomas obtenidos por este procedimiento se pueden someter luego a distintos procesamientos, utilizando métodos conocidos por un experto en la materia:

- Si se desea reducir u homogeneizar la distribución de tamaños, se les puede aplicar alguna de las técnicas de calibración conocidas tales como filtración bajo presión o extrusión a través de membrana microporosa

- Se pueden someter a un proceso de deshidratación, por ejemplo por liofilización, para su posterior formulación y/o almacenamiento y distribución.

- Se pueden mantener en suspensión en la solución acuosa que contiene o no sustancia activa (en el primer caso, parte del agente activo estará encapsulado y parte en el exterior de los mismos). Las suspensiones pueden ser sometidas a dilución hasta obtener la concentración de sustancia activa deseada.

- Se puede eliminar el agente activo no encapsulado (externo) por un método conocido, tal como diafiltración, centrifugación, filtración en gel.

En principio, cualquier PL natural, modificado, semisintético o sintético, saturado o insaturado, con carga o neutro, puede ser utilizado en el procedimiento de preparación de la presente invención. Por otra parte, cualquier relación entre PLs puede ser utilizada en el procedimiento de esta invención.

Los liposomas preparados de acuerdo al procedimiento de esta invención podrían además contener otros componentes lipídicos tales como esteroles y derivados (por ejemplo colesterol); esfingolípidos (por ejemplo esfingomielina, gangliósidos, cerebrósidos); estearilamina.

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PLs y demás sustancias utilizadas en el procedimiento de la presente invención son conocidos por un experto en la materia y pueden ser obtenidos de fuentes comerciales.

Ejemplos

Las propiedades inesperadas y ventajosas del procedimiento de la presente invención se manifiestan a través los siguientes ejemplos no limitativos.

Ejemplo 1 Preparación de liposomas "vacíos" de composición diestearil-fosfatidilcolina : diestearilfosfatidilglicerol (DSPC: DSPG)

Se utiliza un reactor termostatizado equipado con un sistema de agitación de áncora y un sistema de homogeneización del tipo rotor-stator. Se conecta el reactor y se fija la temperatura a 53ºC. Se añaden al vaso del reactor 360 g de solución de hidratación cuya composición (en % p/V) es:

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	- Na_{2}HPO_{4} 2H_{2}O	0,07%
	- EDTANa_{2}	0,1%
	- NaH_{2}PO_{4} 2H_{2}O	0,082%
	- NaCl	0,719%

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Se ajusta el pH a 6,4 \pm 0,2. Se conecta el sistema de agitación a una velocidad de 75 rpm. Con el sistema de agitación en funcionamiento, se añaden 36 g de DSPC y 4 g de DSPG. Se continúa la agitación durante 10 minutos.

Se conecta el sistema de homogeneización a una velocidad de 6700 rpm hasta que se obtiene una dispersión homogénea (5-10 minutos).

Se desconecta el homogeneizador y se conecta el sistema de agitación a 50 rpm.

Sin parar la agitación, se fija la temperatura del reactor en 60ºC y se continúa el calentamiento hasta que se alcanzan 60ºC para asegurar que se supera la temperatura de transición de los fosfolípidos.

Seguidamente se conecta el sistema de homogeneización a una velocidad de 6700 rpm durante 6 minutos. Se desconecta la termostatización.

Se diluye la suspensión liposomal hasta un peso final total de 1000 g añadiendo aproximadamente 600 g de solución de dilución cuya composición (en % p/V) es:

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Se ajusta el pH a 6,4 \pm 0,2. Finalmente, se conecta el sistema de agitación a 50 rpm durante el tiempo necesario para obtener una suspensión liposomal homogénea. Los liposomas obtenidos se muestran en la Figura 1.

Se determina la distribución de tamaño y el potencial Z de estos liposomas inmediatamente después de preparados (tiempo = 0) y a los 8 meses.

El análisis granulométrico de las suspensiones liposomales, dispersadas en soluciones acuosas de NaCl 0,9% (p/V), se ha llevado a cabo mediante un método de dispersión de láser. El equipo empleado ha sido el analizador de partículas Mastersizer 2000, módulo Hydro 2000G (Malven Instruments, Worcestershire, Reino Unido).

El potencial zeta de las suspensiones liposomales, dispersadas en un tampón fosfato (10 mM, pH 6,2) hasta una concentración en fosfolípidos aproximada de 0,5 x 10^{-3}% (p/V), se ha realizado utilizando el equipo Zetasizer 3000HS (Malven Instruments, Worcestershire, Reino Unido).

Los resultados se muestran en las Figuras 2, 3 y 10 y permiten concluir que se obtiene una distribución homogénea de los PLs en la membrana liposomal preparando las vesículas de acuerdo con el procedimiento de la presente invención y que esta homogeneidad se mantiene en el tiempo.

Ejemplo 2 Preparación de liposomas de composición DSPC:DSPG, con 5-fluorouracilo (5-FU) encapsulado

Los liposomas se preparan de forma análoga al Ejemplo 1 pero añadiendo 72 g de DSPC y 8 g de DSPG a 320 g de solución de hidratación. En este caso la composición de esta solución es:

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	- Na_{2}HPO_{4} 2H_{2}O	0,07%
	- EDTANa_{2}	0,1%
	- NaH_{2}PO_{4} 2H_{2}O	0,082%
	- 5-Fluorouracilo	3%
	- NaCl	0,139%

\vskip1.000000\baselineskip

Y la composición de la solución de dilución es:

	- Na_{2}HPO_{4} 2H_{2}O	0,07%
	- EDTANa_{2}	0,1%
	- NaH_{2}PO_{4} 2H_{2}O	0,082%
	- NaCl	0,477%

\vskip1.000000\baselineskip

Opcionalmente se puede eliminar el 5-FU de fase externa por procedimientos conocidos. Se determina la distribución de tamaño y el potencial Z de estos liposomas inmediatamente después de preparados empleando las mismas técnicas y equipos mencionados en el Ejemplo 1.

Los resultados se muestran en las Figuras 4 y 5 y nuevamente permiten concluir que se obtiene distribución homogénea de los PLs de membrana preparando los liposomas de acuerdo con el procedimiento de la presente invención.

Se determina por HPLC el porcentaje de encapsulación de 5-FU en los liposomas utilizando las siguientes condiciones cromatográficas:

Equipo: Waters Alliance, columna: Hypersil BDS C18 (5 \mum), flujo: 1 ml/min, volumen de inyección: 20 \mul, fase móvil: 95% de acetato amónico (10 mM, pH 6,8) y 5% acetonitrilo

Para determinar la cantidad de 5-FU total (mg/ml) se toma un volumen determinado de suspensión liposomal y se lisa con metanol hasta una concentración final de fosfolípidos de 400 \mug/ml. Esta solución se diluye con la fase móvil. Se filtra y se inyecta en el cromatógrafo.

Para determinar la cantidad de 5-FU libre se toma un volumen determinado de suspensión liposomal y se diluye con una solución de NaCl 0,9% (p/V) hasta una concentración de PLs de 200 \mug/ml. Se centrífuga la muestra 10 minutos a 13000 rpm, se filtra el sobrenadante y se inyecta en el cromatógrafo.

Los liposomas analizados tienen una encapsulación de 5-FU de 44,5%.

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Ejemplo 3 Preparación de liposomas "vacíos" de composición diestearil-fosfatidilcolina : dipalmitoilfosfatidilglicerol (DSPC: DPPG)

Los liposomas se preparan de acuerdo con el Ejemplo 1 con la salvedad que cuando se conecta el reactor la temperatura se fija en 30ºC.

Se determinan la distribución de tamaño y el potencial Z de estos liposomas inmediatamente después de preparados mediante las técnicas y los equipos descritos en el Ejemplo 1.

Los resultados se muestran en las Figuras 6 y 7 y nuevamente se puede concluir que se consigue distribución homogénea de los PLs de membrana preparando los liposomas según el procedimiento de la presente invención.

Ejemplo 4 Preparación de liposomas de composición DSPC:DSPG, con diclofenaco sódico encapsulado

Los liposomas se preparan de forma análoga al Ejemplo 1 pero utilizando una solución de hidratación cuya composición es:

	Na_{2}HPO_{4} 2H_{2}O	0,07%
	EDTANa_{2}	0,1%
	NaH_{2}PO_{4} 2H_{2}O	0,082%
	NaCl	0,74%
	Diclofenaco sódico	0,72%

Y una solución de dilución cuya composición es:

	Na_{2}HPO_{4} 2H_{2}O	0,07%
	EDTANa_{2}	0,1%
	NaH_{2}PO_{4} 2H_{2}O	0,082%
	NaCl	0,77%

Se determina la distribución de tamaño y el potencial Z de estos liposomas inmediatamente después de preparados y a los 4 meses, empleando las mismas técnicas y equipos mencionados en el Ejemplo 1.

Los resultados se muestran en las Figuras 8, 9 y 11 y una vez más permiten concluir que se obtiene distribución homogénea de los PLs de membrana preparando los liposomas de acuerdo con el procedimiento de la presente invención y que esta homogeneidad se mantiene en el tiempo.

Se determina por HPLC el porcentaje de encapsulación de diclofenaco sódico utilizando las siguientes condiciones cromatográficas:

Equipo: Waters Alliance, columna: LiChrospher 100 RP-18 (5 \mum), flujo: 0,9 ml/min, volumen de inyección: 20 \mul, fase móvil: 75% de metanol y 25% de ácido acético glacial diluido (0,3p en 2500p).

Para determinar la cantidad de dicofenaco sódico total (mg/ml) se toma un volumen determinado de suspensión liposomal y se lisa con metanol hasta una concentración final de fosfolípidos de 200 \mug/ml. Esta solución se diluye con el ácido acético glacial diluido de la fase móvil. Se filtra y se inyecta en el cromatógrafo.

Para determinar la cantidad de diclofenaco sódico libre se toma un volumen determinado de suspensión liposomal y se diluye con una solución de NaCl 0,9% (p/V) hasta una concentración de PLs de 200 \mug/ml. Se centrífuga la muestra 10 minutos a 13000 rpm, se filtra el sobrenadante y se inyecta en el cromatógrafo.

Los liposomas analizados muestran una encapsulación de diclofenaco sódico de 80,8%. Este porcentaje tan elevado se debería a la asociación del principio activo con los fosfolípidos y por tanto a una interacción del diclofenaco sódico con la membrana de los liposomas.

Claims

1. Procedimiento de preparación de liposomas que comprende:

-: añadir los fosfolípidos en forma sólida a un medio acuoso;

-: dispersar la suspensión resultante por agitación enérgica a una temperatura inferior a la temperatura de transición de la mezcla de fosfólipidos durante el tiempo necesario para obtener una dispersión homogénea;

-: aumentar la temperatura hasta alcanzar una temperatura superior a la temperatura de transición de la mezcla de fosfolípidos manteniendo agitación enérgica hasta la completa formación de los liposomas.

2. Procedimiento de acuerdo a la reivindicación 1 en el que el medio acuoso contiene un agente activo.

3. Procedimiento de acuerdo a la reivindicación 1 en el que el medio acuoso no contiene un agente activo.

4. Procedimiento de acuerdo a la reivindicación 3 que adicionalmente comprende, si se desea, encapsular un agente activo.

5. Procedimiento de acuerdo a las reivindicaciones 2 o 4 en el que el agente activo es un agente farmacológicamente activo.

6. Procedimiento de acuerdo a una cualquiera de las reivindicaciones anteriores que adicionalmente comprende, si se desea, aplicar al menos uno de los siguientes procesos:

-: homogeneización y/o reducción del tamaño de los liposomas;

-: deshidratación de la suspensión liposómica;

-: dilución de la suspensión liposómica;

-: remoción del agente activo no encapsulado.