DK141082B - Process for the preparation of liposomes containing biologically active substance dispersed in an aqueous medium. - Google Patents
Process for the preparation of liposomes containing biologically active substance dispersed in an aqueous medium. Download PDFInfo
- Publication number
- DK141082B DK141082B DK12076A DK12076A DK141082B DK 141082 B DK141082 B DK 141082B DK 12076 A DK12076 A DK 12076A DK 12076 A DK12076 A DK 12076A DK 141082 B DK141082 B DK 141082B
- Authority
- DK
- Denmark
- Prior art keywords
- aqueous
- liposomes
- solution
- liquid
- compound
- Prior art date
Links
Description
i 4 i υ o i 2 mindst ét biologisk aktivt stof, og har i regelen form af en kol-loid dispersion i et vandigt flydende medium, såsom en saltopløsning, især en 0,9 vægtpct. natriumchloridopløsning (fysiologisk saltopløsning).at least one biologically active substance, and generally takes the form of a colloidal dispersion in an aqueous liquid medium such as a saline solution, in particular a 0.9% by weight. sodium chloride solution (physiological saline solution).
Fremstilling af liposomer udgør en meget praktisk og meget effektiv måde til indkapsling af et vandigt medium og er særligt nyttig med henblik på indgivelse af biologisk aktive stoffer i levende organismer, især indgivelse af lægemidler, idet man undgår nedbrydning af de aktive stoffer i organismen (f.eks. under indvirkning af mave- eller tarmsaft), før stofferne når det organ, hvor de skal udøve deres virkning.Preparation of liposomes is a very practical and very effective way of encapsulating an aqueous medium and is particularly useful for the administration of biologically active substances in living organisms, especially administration of drugs, avoiding degradation of the active substances in the organism (e.g. for example, under the influence of gastric or intestinal juices) before the substances reach the body where they are to exert their effect.
Ved et passende valg af forbindelsen med formlen X-Y, der anvendes til dannelse af liposomernes væg, er det faktisk muligt at fremstille liposomer, hvis vægge modstår indvirkning af visse af organismens medier og kun angribes i nærværelse af de medier, der eksisterer i de organer, hvor det biologisk aktive stof skal frigives .Indeed, by an appropriate choice of the compound of formula XY used to form the wall of the liposomes, it is possible to produce liposomes whose walls resist the action of some of the organism's media and are attacked only in the presence of the media existing in the organs. where the biologically active substance is to be released.
Man kender flere fremgangsmåder til fremstilling af liposomer.Several methods for the preparation of liposomes are known.
En af disse fremgangsmåder består i at bringe et lipid i nærværelse af det vandige medium, som man ønsker at indkapsle, og at opvarme den således opnåede heterogene blanding til en temperatur, der er lidt over omgivelsestemperaturen, og derpå sætte blandingen ud for en kraftig omrøring efterfulgt af en vibrationsbehandling ved ultralydfrekvens.One of these methods consists in bringing a lipid in the presence of the aqueous medium which it is desired to encapsulate and heating the thus obtained heterogeneous mixture to a temperature slightly above ambient temperature and then subjecting the mixture to vigorous stirring. followed by a vibration treatment at ultrasonic frequency.
En anden fremgangsmåde består i at opløse en forbindelse med formlen X-Y, hvor X og Y har den ovenfor angivne betydning, f.eks. et lipid, i et flygtigt opløsningsmiddel, danne en film af denne forbindelse på væggene af en beholder og afdampe opløsningsmidlet fra den således opnåede opløsning, og i den samme beholder at indføre den væske, som man ønsker at indkapsle i liposomerne og endelig i beholderen underkaste væsken en vibrationsbehandling ved ultralydfrekvens.Another method consists of dissolving a compound of formula X-Y wherein X and Y have the meaning given above, e.g. a lipid, in a volatile solvent, forms a film of this compound on the walls of a container and evaporates the solvent from the solution thus obtained, and in the same container introduces the liquid which it is desired to encapsulate into the liposomes and finally subject to the container. the fluid a vibration treatment at ultrasonic frequency.
I tysk offentliggørelsesskrift nr. 2 249 552 beskrives en fremgangsmåde til fremstilling af liposomer, hvor der under indvirkning <4 I if dέ - 3 af en vibration med ultralydfrekvens dispergeres en vandig opløsning af det produkt, der ønskes indkapslet, i nærværelse af et stof med den almene formel X-Y, hvor X betegner en hydrophil polær gruppe og Y betegner en hydrophob ikke-polær gruppe, til dannelse af en kolloid dispersion af kugler af den vandige væske, som derved indkapsles i stoffet X-Y i form af liposomer. De dannede liposomer kan separeres fra den vandige væske, hvori de befinder sig, ved centrifugering. Ved denne fremgangsmåde opnår man imidlertid ikke direkte en liposomopløsning i den ønskede vandige fase, men er nødsaget til efter centrifugeringen at re-dispergere bundfaldet i en ny vandig fase og eventuelt gentage rensningen. En anden væsentlig ulempe er, at man opnår et udbytte på maksimalt 20%, idet de 80% ikke-indkapslet væske tjener som dispersionsmedium. Herved bliver det ikke muligt at indkapsle meget små mængder vandig opløsning.German Publication No. 2,249,552 discloses a process for the preparation of liposomes wherein, under the action <4 I if dέ - 3 of an ultrasonic vibration, an aqueous solution of the desired product is dispersed in the presence of a substance having the general formula XY, wherein X represents a hydrophilic polar group and Y represents a hydrophobic nonpolar group, to form a colloidal dispersion of spheres of the aqueous liquid, which is thereby encapsulated in the substance XY in the form of liposomes. The formed liposomes can be separated from the aqueous liquid in which they are located by centrifugation. However, this method does not directly obtain a liposome solution in the desired aqueous phase, but is forced to re-disperse the precipitate into a new aqueous phase and optionally repeat the purification after centrifugation. Another major disadvantage is that a maximum yield of 20% is obtained, with the 80% non-encapsulated liquid serving as dispersion medium. In this way, it will not be possible to encapsulate very small amounts of aqueous solution.
Disse fremgangsmåder nødvendiggør således at man disponerer over et totalvolumen af den væske, som man ønsker at indkapsle, der er væsentligt større end voluminet af den væske, som til sidst indeholdes i de opnåede liposomer. Ved disse fremgangsmåder dannes liposomerne faktisk i form af en kolloid dispersion af kugler i en væskefase, der består af den fraktion af væske, der skal indkapsles, som ikke tilbageholdes i liposomernes indre. Forholdet mellem voluminet af den indkapslede væske inden i liposomerne og det totale volumen af væsken er i reglen af størrelsesordenen 1-10%.Thus, these methods necessitate disposing of a total volume of the liquid which it is desired to encapsulate that is substantially greater than the volume of the liquid which is eventually contained in the obtained liposomes. In these methods, the liposomes are actually formed in the form of a colloidal dispersion of spheres in a liquid phase consisting of the fraction of liquid to be encapsulated which is not retained in the interior of the liposomes. The ratio of the volume of the encapsulated fluid within the liposomes to the total volume of the fluid is usually of the order of 1-10%.
Hvis derfor den væske, der skal indkapsles, er af stor værdi, hvilket i reglen er tilfældet, når væsken er en opløsning af et biologisk aktivt stof, er det nødvendigt at genvinde den væskefraktion, der ikke er indkapslet, for at anvende den til andre operationer til dannelse af liposomer. Denne udvinding indebærer en separering af liposomerne fra væsken og derpå en rensning af væsken, og i reglen en genindstilling af koncentrationen af aktivt stof. (Faktisk medfører de ovennævnte separerings- og rensningsoperationer anvendelsen af større eller mindre rumfang opløsningsmiddel, og følgelig en modificering af koncentrationen af den væske , der indeholder det aktive stof).Therefore, if the liquid to be encapsulated is of great value, as is usually the case when the liquid is a solution of a biologically active substance, it is necessary to recover the non-encapsulated liquid fraction to use it for others. liposome formation operations. This recovery involves a separation of the liposomes from the liquid and then a purification of the liquid, and usually a reset of the concentration of active substance. (In fact, the above separation and purification operations involve the use of larger or smaller volumes of solvent, and consequently a modification of the concentration of the liquid containing the active substance).
\ί*\ΟϋΔ 4 Nødvendigheden af at foretage sådanne rensnings- og genindstillingsoperationer af koncentrationen af den væske, der indeholder det aktive stof, gør de ovenfor beskrevne fremgangsmåder til fremstilling af liposomer vanskelige at udøve i industriel skala.The need to perform such purification and resetting operations on the concentration of the liquid containing the active substance makes the above-described processes for the preparation of liposomes difficult to practice on an industrial scale.
Formålet med den foreliggende opfindelse er at råde bod på denne ulempe ved at muliggøre en fremstilling af liposomer, hvor man ved hver liposom-fremstilling anvender den totale mængde væske, der skal indkapsles, og dette opnås ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, der er ejendommelig ved det i kravets kendetegnende del anførte.The object of the present invention is to remedy this disadvantage by enabling the preparation of liposomes, whereby in each liposome preparation the total amount of liquid to be encapsulated is utilized, and this is achieved by the method according to the invention characterized by the invention. in the characterizing part of the claim.
Den omhandlede fremgangsmåde består således af to trin. Under det første trin danner man under indvirkning af ultralydvibrationen en dispersion af kugler af den væske, der skal indkapsles, idet disse kugler har kolloide dimensioner, d.v.s. en diameter af størrelsesordenen 200 - 1 000 Å, i en organisk væske, der er uopløselig i vand. Disse kugler er afgrænset af en monomolekylær hinde af forbindelsen X-Y, hvor de hydrophile grupper X vender ind mod kuglernes indre, der er optaget af den vandige væske, og de hydrophobe grupper Y modsætningsvis vender mod kuglens ydre, der består af en ikke-vandig fase. Disse kugler kan, selv om de ikke udgør liposomer i ordets egentlige betydning, eftersom de ikke er begrænset af et bimolekylært lag af forbindelsen X-Y, men kun af en monomolekylær hinde af forbindelsen, ikke desto mindre betragtes som et liposomt forstadium, idet hver af disse kugler indeholder det samme rumfang væske, der skal indkapsles, som de endelige liposomer. I den følgende beskrivelse vil disse kugler blive benævnt "liposomprækursorer".Thus, the present process consists of two steps. During the first step, under the influence of the ultrasonic vibration, a dispersion of balls of the liquid to be encapsulated is formed, these balls having colloidal dimensions, i.e. a diameter of the order of 200-1000 Å, in an organic liquid insoluble in water. These spheres are bounded by a monomolecular membrane of the compound XY, wherein the hydrophilic groups X face the interior of the spheres occupied by the aqueous liquid and the hydrophobic groups Y oppositely face the sphere which consists of a non-aqueous phase. . These spheres, although not constituting liposomes in the true sense of the word, since they are not limited by a bimolecular layer of the compound XY, but only by a monomolecular membrane of the compound, are nonetheless considered a liposome precursor, each of these spheres contain the same volume of liquid to be encapsulated as the final liposomes. In the following description, these spheres will be referred to as "liposome precursors".
Ved på passende måde at indstille de respektive mængder af den vandige væske, der skal indkapsles, den uopløselige organiske væske og forbindelsen med formlen X-Y, i løbet af denne første del af processen, er det muligt at opnå en indkapsling af den totale anvendte mængde væske, der skal indkapsles, i liposomprækur-sorerne.By appropriately adjusting the respective amounts of the aqueous liquid to be encapsulated, the insoluble organic liquid and the compound of formula XY during this first part of the process, it is possible to obtain an encapsulation of the total amount of liquid used. to be encapsulated in the liposome precursors.
Fremgangsmåden ifølge opfindelsen muliggør således, at man undgår de genvindings-, rensnings- og genindstillingsoperationer af væsken, der skal indkapsles, der som angivet ovenfor ér nødvendige under de kendte fremgangsmåder til fremstilling af liposomer.Thus, the process of the invention allows to avoid the recovery, purification and resetting operations of the liquid to be encapsulated, as indicated above, necessary during the known processes for preparing liposomes.
iin
AA
I Μ I ΟΟ Δ 5I Μ I ΟΟ Δ 5
Man vil ligeledes forstå, at fremgangsmåden ifølge opfindelsen muliggør indkapsling af væsker, som man kun disponerer over i meget små mængder, f.eks. af størrelsesordenen 0,05 - 0,1 ml, som ville være utilstrækkelige til gennemførelse af de kendte fremgangsmåder til fremstilling af liposomer.It will also be appreciated that the process of the invention enables encapsulation of liquids which are disposed of only in very small quantities, e.g. of the order of 0.05 - 0.1 ml, which would be insufficient to carry out the known processes for the preparation of liposomes.
Fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan således finde anvendelse indenfor områder, såsom visse arbejder på forsknings- eller analyselaboratorier, hvor de kendte fremgangsmåder til fremstilling af liposomer ville være uanvendelige.Thus, the method of the invention may find application in fields such as certain works in research or analysis laboratories where the known methods of producing liposomes would be useless.
Det andet trin i fremgangsmåden ifølge opfindelsen består i en dannelse af selve liposomerne. Det må formodes, at denne dannelse resulterer af det forhold, at hver liposomprækursor ved passagen gennem den monomolekylære ende af forbindelsen X-Y, der er beliggende i grænsefladen mellem det øvre dispersionsvæskelag og det nedre vandige væskelag medriver en del af denne hinde, der kombineres med den monomolekylære hinde af forbindelse X-Y, der afgrænser prækursoreri under dannelse af en bimolekylær hinde af forbindelser, der er karakteristisk for liposomer. (Dannelsen af den nævnte monomolekylære hinde er på i og for sig kendt måde forårsaget af denne forbindelses egenskaber: De hydrophile grupper X tiltrækkes således af det vandige væskelag, mens de hydrophobe grupper Y forbliver i et ikke-vandigt væskelag).The second step of the process of the invention consists in forming the liposomes themselves. It is believed that this formation results from the fact that each liposome precursor at the passage through the monomolecular end of the compound XY located in the interface between the upper dispersion liquid layer and the lower aqueous liquid layer conveys a portion of this membrane which is combined with the monomolecular membranes of compound XY that define precursor formation to form a bimolecular membrane of compounds characteristic of liposomes. (The formation of said monomolecular membrane is in a manner known per se by the properties of this compound: The hydrophilic groups X are thus attracted by the aqueous liquid layer while the hydrophobic groups Y remain in a non-aqueous liquid layer).
Som forbindelse med formlen X-Y anvendes en forbindelse, hvori den hydrophile gruppe X er en af følgende grupper: phosphato, carboxyl, sulfato, amino, hydroxyl og cholin, mens den hydrophobe gruppe Y er en af følgende grupper: En mættet eller umættet alifatisk carbonhydridgruppe, f.eks. alkyl eller alkylen, eller en alifatisk carbonhydridgruppe, der er substitueret med mindst én aromatisk eller cycloalifatisk gruppe.As a compound of formula XY, a compound is used wherein the hydrophilic group X is one of the following groups: phosphato, carboxyl, sulfato, amino, hydroxyl and choline, while the hydrophobic group Y is one of the following groups: A saturated or unsaturated aliphatic hydrocarbon group, eg. alkyl or alkylene, or an aliphatic hydrocarbon group substituted by at least one aromatic or cycloaliphatic group.
Som forbindelse med formel X-Y anvendes fortrinsvis et phospholipid eller en forbindelse, der er beslægtet med phospholipider, især en af følgende forbindelser: lecithin, phosphatidyl-ethanol-amin, lysolecithin, lysophosphatidyl-ethanolamin, phosphatidyl-serin, phosphatidyl-inositol, sphingomyelin, cardiolipin, phos-phatidinsyre og cerebrosider.Preferably, as a compound of formula XY, a phospholipid or a compound related to phospholipids is used, especially one of the following compounds: lecithin, phosphatidyl-ethanolamine, lysolecithin, lysophosphatidyl-ethanolamine, phosphatidyl-serine, phosphatidyl-inositol, sphingomyelin, cardiolipin , phos-phatidic acid and cerebrosides.
i · « ^ *, m, . i *4 i u « «- 6i · «^ *, m ,. i * 4 i u «« - 6
Man kan ligeledes som forbindelse X-Y anvende en blanding af mindst ét phospholipid og mindst ét andet lipoid, der hører til en kategori forskellig fra phospholipider. Til dette formål kan man især anvende en af følgende forbindelser: stearylamin, dice ty lphosphat, cholesterol og topopherol.A compound of at least one phospholipid and at least one other lipoid belonging to a category different from phospholipids can also be used as compound X-Y. In particular, one of the following compounds may be used: stearylamine, diethylphosphate, cholesterol and topopherol.
Som væske, der er uopløselig i vand og har en massefylde, der er lavere end vands, udvælger man fortrinsvis en organisk væske, især valgt blandt: benzen, halogen- eller alkylderivater af benzen, alifatiske etheroxider, alifatiske ketoner, alifatiske aldehyder, alifatiske estere, alifatiske eller cycloalifatiske car-bonhydrider eller en blanding af flere forbindelser, der har en massefylde, der er lavere end vands.As liquid which is insoluble in water and has a density lower than water, an organic liquid is preferably selected, especially selected from: benzene, halogen or alkyl derivatives of benzene, aliphatic ether oxides, aliphatic ketones, aliphatic aldehydes, aliphatic esters , aliphatic or cycloaliphatic hydrocarbons or a mixture of several compounds having a density lower than water.
Valget af den primære vandige væske, d.v.s. den væske, der skal indkapsle s i liposomeme, kan foretages praktisk taget uden begrænsning, bortset fra de, der er dikteret af den påtænkte anvendelse af liposomerne.The choice of the primary aqueous liquid, i.e. the liquid to be encapsulated in the liposomes can be practically done without restriction, except those dictated by the intended use of the liposomes.
Fortrinsvis anvendes som vandig væske en opløsning af mindst ét biologisk aktivt stof, især et enzym, et lægemiddel, såsom et antibiotikum, etc.Preferably, as aqueous liquid, a solution of at least one biologically active substance is used, in particular an enzyme, a drug such as an antibiotic, etc.
Som den sekundære vandige væske kan man anvende rent vand eller en anden passende vandig væske. Fortrinsvis anvendes en væske, der er beregnet til at tjene som det endelige dispersionsmedium for liposomerne under disses anvendelse, f.eks. en vandig natrium-chloridopløsning. Især kan man anvende den vandige natriumchlorid-opløsning, der benævnes fysiologisk saltopløsning, og som har en koncentration på 0,15 mol NaCl pr. 1 (0,9 vægtpct.), med henblik på direkte under den anden fase af fremgangsmåden at opnå en lipo-somdispersion i et medium, der er injicerbart i den menneskelige organisme. Der opnås således en yderligere fordel ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen over for de kendte fremgangsmåder til fremstilling af liposomer, idet den muliggør en direkte opnåelse af en liposomdispersion i et vandigt medium valgt som funktion af den endelige anvendelse af liposomerne.As the secondary aqueous liquid, one can use pure water or another suitable aqueous liquid. Preferably, a liquid is intended to serve as the final dispersion medium for the liposomes during their use, e.g. an aqueous sodium chloride solution. In particular, one can use the aqueous sodium chloride solution, called physiological saline solution, which has a concentration of 0.15 moles of NaCl per liter. 1 (0.9 wt.%), In order to obtain, directly during the second phase of the process, a liposome dispersion in a medium injectable into the human organism. Thus, a further advantage of the method of the invention is obtained over the known processes for the preparation of liposomes, enabling the direct obtaining of a liposome dispersion in an aqueous medium selected as a function of the final use of the liposomes.
Naturligvis er det også muligt at separere liposomerne fra den sekundære vandige væske, f.eks. hvis man ønsker at undgå til- i 7Of course, it is also possible to separate the liposomes from the secondary aqueous fluid, e.g. if you want to avoid 7
A · 4 ^ ^ AA · 4 ^^ A
« *1 i w g «.«* 1 i w g«.
stedeværelsen af ethvert spor af ikke-indkapslet aktivt stof under den endelige anvendelse af liposomeme. Denne separering kan let foretages på enhver i sig selv kendt måde, f.eks. ved gelchromatografi.the location of any trace of non-encapsulated active substance during the final use of the liposomes. This separation can be easily accomplished in any manner known per se, e.g. by gel chromatography.
Opfindelsen illustreres nærmere ved nedenstående eksempler.The invention is further illustrated by the following examples.
EKSEMPEL 1EXAMPLE 1
Man indkapsler en vandig opløsning af amyloglucosidase indeholdende 10 mg amyloglucosidase pr. ml opløsning i en vandig natrium-chloridopløsning indeholdende 0,15 mol/l, idet man går frem på følgende måde:An aqueous solution of amyloglucosidase containing 10 mg of amyloglucosidase per hour is encapsulated. ml of solution in aqueous sodium chloride solution containing 0.15 mol / l, proceeding as follows:
Man tilsætter 54 mg lecithin og 0,1 ml af den vandige amyloglu-cosidase-opløsning til 3 ml dibutylether og underkaster den således opnåede heterogene blanding en ultralydbehandling (frekvens: 17 kHz, udgangseffekt: 70 Wj i to minutter, alt imens man holder temperaturen under 30°C ved hjælp af et kølebad.54 mg of lecithin and 0.1 ml of the aqueous amyloglucosidase solution are added to 3 ml of dibutyl ether and the heterogeneous mixture thus obtained is subjected to ultrasonic treatment (frequency: 17 kHz, output power: 70 Wj for two minutes while maintaining the temperature below 30 ° C using a cooling bath.
Man opnår således en transparent væske med homogent udseende, der udviser blålige reflekser. Man anbringer et lag af denne væske i et centrifugeringsrør på et lag af 1,5 ml af en vandig natrium-chloridopløsning indeholdende 0,15 mol/l. Man opnår således en tofaset blanding sammensat af et nedre lag bestående af en vandig fase (natriumchloridopløsning) og et øvre lag bestående af den organiske fase dannet ved ultralydbehandling af blandingen af dibutylether, lecithin og amyloglucosidaseopløsning.Thus, a transparent liquid with homogeneous appearance, exhibiting bluish reflexes, is obtained. A layer of this liquid is placed in a centrifuge tube on a layer of 1.5 ml of an aqueous sodium chloride solution containing 0.15 mol / l. There is thus obtained a two-phase mixture composed of a lower layer consisting of an aqueous phase (sodium chloride solution) and an upper layer consisting of the organic phase formed by ultrasonic treatment of the mixture of dibutyl ether, lecithin and amyloglucosidase solution.
Denne tofaseblanding underkastes en centrifugering ved 30 000 o/min. i 30 minutter. Herefter udtager man det øvre lag (den organiske fase) og underkaster det nedre lag (den vandige fase) en ny centrifugering ved 30 000 o/min. i 30 minutter. Man opnår således en klar væske, der er svagt blålig og et "bundfald" med et lille rumfang, som består af ikke-dispergeret lipid (lecithin), som man bortkaster. Den klare væske består af en suspension af liposomer med kolloidale dimensioner, indeholdende den vandige amyloglucosidaseopløsning i en vandig 0,15 M natriumchloridopløsning, og væsken indeholder ligeledes en ringe mængde ikke-indkapslet amyloglucosidase.This biphasic mixture is subjected to centrifugation at 30,000 rpm. for 30 minutes. Then, the upper layer (the organic phase) is removed and the lower layer (the aqueous phase) is subjected to a new spin at 30 000 rpm. for 30 minutes. There is thus obtained a clear liquid which is slightly bluish and a "precipitate" with a small volume consisting of non-dispersed lipid (lecithin), which is discarded. The clear liquid consists of a suspension of colloidal dimensions liposomes containing the aqueous amyloglucosidase solution in an aqueous 0.15 M sodium chloride solution, and the liquid also contains a small amount of non-encapsulated amyloglucosidase.
8 4 , 4 Λ ^ Ί8 4, 4 Λ ^ Ί
Alt efter de påtænkte anvendelser kan man anvende denne liposom-suspension direkte eller efter eliminering af ikke-indkapslet amyloglucosidase ved gelchromatografi (f.eks. ved hjælp af en M?\ ?! "Sepharose w -gel).Depending on the intended applications, this liposome suspension can be used directly or after elimination of non-encapsulated amyloglucosidase by gel chromatography (e.g., by means of a M? S? Sepharose w gel).
EKSEMPEL 2EXAMPLE 2
Man går frem på samme måde som i eksempel 1, idet man som indkapslingsopløsning anvender 0,05 ml af en vandig pufferopløsning (10 mM-phosphatpuffer, pH 7,2) indeholdende 100 mg/ml penicil-lamin opløst i en vandig 0,15 M natriumchloridopløsning, og idet man til dannelse af den organiske fase, der udsættes for ultralydbehandling, anvender 27 mg lecithin og en blanding af 2,4 ml dibutylether og 0,6 ml chloroform.Proceed in the same manner as in Example 1 using 0.05 ml of an aqueous buffer solution (10 mM phosphate buffer, pH 7.2) containing 100 mg / ml penicil lamin dissolved in an aqueous 0.15 M sodium chloride solution, and to form the organic phase subjected to ultrasound, use 27 mg of lecithin and a mixture of 2.4 ml of dibutyl ether and 0.6 ml of chloroform.
EKSEMPEL 5EXAMPLE 5
Man går frem som i eksempel 1, idet man dog som indkapslingsvæske anvender 0,1 ml af en 500 mg/ml imipraminopløsning i en 0,15 M vandig natriumchloridopløsning, og idet man til dannelse af den organiske fase, der udsættes for ultralydbehandling, anvender en blanding af 25 mg lecithin, 40 mg cholesterol og 5 ml dibutylether.Proceed as in Example 1, however using 0.1 ml of a 500 mg / ml imipramine solution in a 0.15 M aqueous sodium chloride solution and using the ultrasonic organic phase to form the organic phase. a mixture of 25 mg lecithin, 40 mg cholesterol and 5 ml dibutyl ether.
EKSEMPEL 4EXAMPLE 4
Man går frem som i eksempel 1, idet man som indkapslingsopløsning anvender 0,05 ml af en 150 mg/ml opløsning af betamethason-di-natriumphosphat i en vandig 0,15 M natriumchloridopløsning, og idet man til dannelse af den organiske fase, der udsættes for ultralydbehandling, anvender en blanding af 15 mg lecithin og 12 mg phosphatidyl-ethanolamin og en blanding af 2,5 ml dibutylether og 0,5 ml chloroform.Proceed as in Example 1 using 0.05 ml of a 150 mg / ml solution of betamethasone di-sodium phosphate in an aqueous 0.15 M sodium chloride solution and to form the organic phase which is subjected to ultrasound treatment, using a mixture of 15 mg of lecithin and 12 mg of phosphatidylethanolamine and a mixture of 2.5 ml of dibutyl ether and 0.5 ml of chloroform.
EKSEMPEL 5 I en 10 ml pyrexkolbe anbringes 2 ml dibutylether og 1 ml cyclo-hexan. Derefter tilsættes 0,2 ml af en 10 mg/ml opløsning af insulin i en 0,9 % natriumchloridopløsning med pH 3,0 (indstillet ved hjælp af saltsyre). Der tilsættes 150 mg di-palmitoyl-phosphati- 9 14 \ύάΖ dylcholin (en lipophil-hydrophilforbindelse), hvorefter man ved omgivelsestemperatur underkaster den heterogene blanding en behandling med ultralyd i 1 min. ved hjælp af en Br'anson-gene-rator model B 12 (20 kH , 150 W). Efter denne behandling opnås en transparent opløsning, der indeholder mikroskopiske kugler af insulinopløsningen omgivet af et lag af overfladeaktivt stof, hvori molekylerne er orienteret således, at den hydrophile funktion (phosphatidylcholin) vender indad, medens de hydrophobe grupper vender ud mod den kolloide suspension i den organiske opløsning, der på opløst form indeholder det overskydende overfladeaktive stof.Example 5 Place 2 ml of dibutyl ether and 1 ml of cyclohexane in a 10 ml pyrex flask. Then 0.2 ml of a 10 mg / ml solution of insulin is added in a 0.9% sodium chloride solution of pH 3.0 (adjusted by hydrochloric acid). 150 mg of di-palmitoyl phosphate 9 14 14άΖ dylcholine (a lipophilic-hydrophilic compound) is added, after which, at ambient temperature, the heterogeneous mixture is subjected to ultrasound treatment for 1 min. using a Br'anson generator model B 12 (20 kH, 150 W). After this treatment, a transparent solution containing microscopic spheres of the insulin solution is obtained surrounded by a layer of surfactant in which the molecules are oriented so that the hydrophilic function (phosphatidylcholine) faces inward while the hydrophobic groups face the colloidal suspension in the organic solution containing, in dissolved form, the excess surfactant.
Den organiske opløsning overføres til et reagensglas indeholdende 10 ml 0,9 % vandig natriumchloridopløsning, og reagensglasset underkastes en centrifugering ved 30 000 omdr./min. i 20 minutter. Den øverste fase hældes fra, og ved analyse af den ne-derste fase (2 ml opløsning, "Sephadex G-50, eluent 0,15 MThe organic solution is transferred to a test tube containing 10 ml of 0.9% aqueous sodium chloride solution and the tube is subjected to centrifugation at 30,000 rpm. for 20 minutes. The upper phase is poured off and by analysis of the lower phase (2 ml solution, "Sephadex G-50, eluent 0.15 M
natriumchlorid plus phosphatpuffer, pH 7,5) konstaterer man, at denne vandige fase indeholder 55-60 % af den oprindelige insulinmængde indkapslet i lipidet. Denne opløsning kan anvendes direkte til terapeutiske formål, uden at der normalt kræves særlig rensning.sodium chloride plus phosphate buffer, pH 7.5), it is found that this aqueous phase contains 55-60% of the initial amount of insulin encapsulated in the lipid. This solution can be used directly for therapeutic purposes, with no special purification usually required.
EKSEMPEL 6EXAMPLE 6
En vandig opløsning af amyloglucosidase (10 mg/ml) indkapsles i en vandig opløsning af natriumchlorid (0,15 mol pr. 1) på følgende måde: 74 mg phosphatidylethanolamin og 0,1 ml af den vandige amylogluco-sidaseopløsning blandes med 3 ml diisopropylether, og den heterogene blanding udsættes for en ultralydsbehandling (frekvens: 20 kHz; udgangseffekt: 150 W) i 2 minutter, idet temperaturen holdes på under 30° C ved hjælp af et kølebad. Herved opnås en homogent udseende, transparent væske, der udviser blålige reflekser. Blandingen udhældes i 15 ml vandig natriumchlorid (0,15 mol pr. 1), og der centrifugeres i 45 min. som beskrevet i eksempel 5. Derefter fraskiller man den nederste fase, der er en klar væske. Denne består af en suspension af liposomer med kolloide dimensioner, der indeholder den vandige opløsning af amyloglucosidase. Liposomerne 10 141082 er suspenderet i en vandig opløsning af 0,15 M natriumchlorid, som indeholder en meget ringe mængde (af størrelsesordenen 5 %) ikke-indkapslet amyloglucosidase. Denne suspension af liposomer kan anvendes som den er, eller man kan fjerne den ikke-indkapslede amyloglucosidase ved gelchromatografi (f.eks. ved hjælp af en "Sepharose 09 "-gel).An aqueous solution of amyloglucosidase (10 mg / ml) is encapsulated in an aqueous solution of sodium chloride (0.15 mol per 1) as follows: 74 mg of phosphatidylethanolamine and 0.1 ml of the aqueous amyloglucosidase solution are mixed with 3 ml of diisopropyl ether and the heterogeneous mixture is subjected to an ultrasonic treatment (frequency: 20 kHz; output power: 150 W) for 2 minutes, keeping the temperature below 30 ° C by means of a cooling bath. This results in a homogeneous-looking, transparent liquid exhibiting bluish reflexes. The mixture is poured into 15 ml of aqueous sodium chloride (0.15 mol per 1) and centrifuged for 45 minutes. as described in Example 5. The lower phase, which is a clear liquid, is then separated. This consists of a suspension of colloidal dimensions liposomes containing the aqueous solution of amyloglucosidase. The liposomes 10 141082 are suspended in an aqueous solution of 0.15 M sodium chloride which contains a very small amount (of the order of 5%) of unencapsulated amyloglucosidase. This suspension of liposomes can be used as is, or the non-encapsulated amyloglucosidase can be removed by gel chromatography (for example, by means of a "Sepharose 09" gel).
EKSEMPEL 7EXAMPLE 7
Man går frem som i eksempel 5, idet man dog som indkapslingsvæske anvender 0,05 ml af en vandig pufferopløsning (10 mM phosphatpuffer, pH 7,2) indeholdende 0,5 mg/ml cytosinarabinose opløst i 0,15 M vandig natriumchlorid og til dannelse af den organiske fase, der udsættes for ultralydsbehandling, anvender 47 mg cardiolipin og en blanding af 2,4 ml dibutylether og 0,6 ml chloroform.Proceed as in Example 5, however using 0.05 ml of an aqueous buffer solution (10 mM phosphate buffer, pH 7.2) containing 0.5 mg / ml of cytosine arabinose dissolved in 0.15 M aqueous sodium chloride and to formation of the organic phase subjected to ultrasound treatment uses 47 mg of cardiolipin and a mixture of 2.4 ml of dibutyl ether and 0.6 ml of chloroform.
EKSEMPEL 8EXAMPLE 8
Man går frem som i eksempel 5» idet man dog som indkapslingsvæske anvender 0,1 ml af en 100 mg/ml opløsning af penicillamin i en 0,15 M vandig opløsning af natriumchlorid og til dannelse af den organiske fase, der skal udsættes for ultralydsbehandling, anvender en blanding af 105 mg lecithin, 35 mg cholesterol og 3 ml butylacetat.Proceed as in Example 5, however, using 0.1 ml of a 100 mg / ml solution of penicillamine in a 0.15 M aqueous solution of sodium chloride and to form the organic phase to be subjected to ultrasound as the encapsulation fluid. , uses a mixture of 105 mg of lecithin, 35 mg of cholesterol and 3 ml of butyl acetate.
EKSEMPEL 9EXAMPLE 9
Man går frem som i eksempel 5, idet man dog som indkapslingsvæske anvender 0,05 ml af en 150 mg/ml betamethason-dinatriumphosphat i 0,15 M vandig natriumchlorid og til dannelse af den organiske fase, der udsættes for ultralydsbehandling, anvender en blanding af 85 mg lecithin, 45 mg phosphatidyl-ethanolamin og 3 ml 3-hep-tanon.Proceed as in Example 5, however using 0.05 ml of a 150 mg / ml betamethasone disodium phosphate in 0.15 M aqueous sodium chloride and to form the organic phase subjected to ultrasonic treatment using a mixture of 85 mg of lecithin, 45 mg of phosphatidyl-ethanolamine and 3 ml of 3-hepatonone.
EKSEMPEL 10EXAMPLE 10
Man går frem som i eksempel 5, idet man dog som indkapslingsvæske anvender 0,1 ml af en 1 mg/ml kompleks opløsning af polyinosinsyre og polycytidinsyre i en 0,15 M vandig natriumchloridopløsning og 11 ΐ 4 Mi d λ til dannelse af den organiske fase, der udsættes for ultralydsbehandling, anvender en blanding af 60 mg lecithin, 20 mg stea-rylamin, 15 mg cholesterol og 3 ml af en 1:1 blanding af diiso-propylether og butylacetat.Proceed as in Example 5, however, using 0.1 ml of a 1 mg / ml complex solution of polyinosinic acid and polycytidic acid in a 0.15 M aqueous sodium chloride solution and 11 ΐ 4 Mi d λ to form the organic solution. phase subjected to ultrasound treatment uses a mixture of 60 mg of lecithin, 20 mg of stearylamine, 15 mg of cholesterol and 3 ml of a 1: 1 mixture of diisopropyl ether and butyl acetate.
EKSEMPEL 11EXAMPLE 11
Til 20 ml diisopropylether tilsættes 1,5 g lecithin, 0,4 g phos-phatidylserin og 0,5 g cholesterol efterfulgt af en opløsning af 1,8 mg actinomycin D i 3 ml phosphatpuffer (0,1 M, pH 7)* og blandingen udsættes for vibrationsbehandling som beskrevet i eksempel 5 i omkring 5 minutter. Derefter tilsættes 100 ml phosphatpuffer (0,1 M, pH 7), og de to faser adskilles ved centrifugering som beskrevet i eksempel 5. Ved chromatografering på en "Sephadex'S'”-kolonne finder man, at 88% af den tilsatte actinomycin D er blevet indkapslet.To 20 ml of diisopropyl ether are added 1.5 g of lecithin, 0.4 g of phosphatidylserine and 0.5 g of cholesterol followed by a solution of 1.8 mg of actinomycin D in 3 ml of phosphate buffer (0.1 M, pH 7) * and the mixture is subjected to vibration treatment as described in Example 5 for about 5 minutes. Then, 100 ml of phosphate buffer (0.1 M, pH 7) is added and the two phases are separated by centrifugation as described in Example 5. By chromatography on a "Sephadex'S" column, it is found that 88% of the added actinomycin D is been encapsulated.
EKSEMPEL 12 1 g trypsin opløses i 30 ml phosphatpuffer (0,1 M, pH 7), og opløsningen udhældes i 100 ml dipropylether, der indeholder 30 g phosphatidylinositol. Blandingen udsættes for vibrationsbehandling som beskrevet i de foregående eksempler, hvorefter der tilsættes 460 ml 0,5 % vandig natriumchloridopløsning. Der centrifugeres som beskrevet ovenfor og ved analyse af den vandige fase finder man, at mængden af indkapslet stof er omkring 70 %.Example 12 1 g of trypsin is dissolved in 30 ml of phosphate buffer (0.1 M, pH 7) and the solution is poured into 100 ml of dipropyl ether containing 30 g of phosphatidylinositol. The mixture is subjected to vibration treatment as described in the previous examples, after which 460 ml of 0.5% aqueous sodium chloride solution is added. Centrifuge as described above and by analysis of the aqueous phase it is found that the amount of encapsulated substance is about 70%.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DK12076A DK141082B (en) | 1976-01-13 | 1976-01-13 | Process for the preparation of liposomes containing biologically active substance dispersed in an aqueous medium. |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DK12076A DK141082B (en) | 1976-01-13 | 1976-01-13 | Process for the preparation of liposomes containing biologically active substance dispersed in an aqueous medium. |
| DK12076 | 1976-01-13 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DK12076A DK12076A (en) | 1977-07-14 |
| DK141082B true DK141082B (en) | 1980-01-14 |
| DK141082C DK141082C (en) | 1980-06-30 |
Family
ID=8089969
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DK12076A DK141082B (en) | 1976-01-13 | 1976-01-13 | Process for the preparation of liposomes containing biologically active substance dispersed in an aqueous medium. |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| DK (1) | DK141082B (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DK156765B (en) * | 1977-05-10 | 1989-10-02 | Ici Ltd | PROCEDURE FOR THE PREPARATION OF A LIPOSOM PREPARATION THAT CAN BE DISPERSED IN A SUITABLE MEDIUM FOR THE PREPARATION OF A Aqueous LIPOSOM PREPARATION |
-
1976
- 1976-01-13 DK DK12076A patent/DK141082B/en unknown
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DK156765B (en) * | 1977-05-10 | 1989-10-02 | Ici Ltd | PROCEDURE FOR THE PREPARATION OF A LIPOSOM PREPARATION THAT CAN BE DISPERSED IN A SUITABLE MEDIUM FOR THE PREPARATION OF A Aqueous LIPOSOM PREPARATION |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DK12076A (en) | 1977-07-14 |
| DK141082C (en) | 1980-06-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DK155036B (en) | PROCEDURE FOR THE PREPARATION OF SOLUTIONS OR SUSPENSIONS OF LIPOSOMES IN Aqueous Media. | |
| US20230048266A1 (en) | Multisomes: Encapsulated Droplet Networks | |
| Fröhlich et al. | Parameters influencing the determination of liposome lamellarity by 31P-NMR | |
| EP0102324A2 (en) | Lipids and surfactants in an aqueous medium | |
| US4241046A (en) | Method of encapsulating biologically active materials in lipid vesicles | |
| US4485054A (en) | Method of encapsulating biologically active materials in multilamellar lipid vesicles (MLV) | |
| JPH0825869B2 (en) | Antitumor agent-embedded liposome preparation | |
| CN103494773B (en) | A kind of ZL006 liposome and preparation method thereof | |
| JPS607934A (en) | Preparation of liposome | |
| JPS6176414A (en) | Production of liposome preparation | |
| EP1674081A1 (en) | Preparation of lipid based nano-particles with a dual asymetric centrifuge | |
| JP2015501328A5 (en) | ||
| JP5126874B2 (en) | Method for producing liposome preparation | |
| ES2631454T3 (en) | Capsule manufacturing procedure | |
| Ávila et al. | Thermodynamics of partitioning of benzocaine in some organic solvent/buffer and liposome systems | |
| EP0883624B1 (en) | Tetraether lipids and liposomes containing said lipids, and use of the same | |
| DK141082B (en) | Process for the preparation of liposomes containing biologically active substance dispersed in an aqueous medium. | |
| JPH03127622A (en) | Ph sensitive liposome | |
| WO1980001456A1 (en) | Pharmaceutical composition and process for the preparation thereof | |
| KR800001360B1 (en) | Process for the preparation of liposomes | |
| KR102168204B1 (en) | Preparation method of sustatined release liposomal formulations | |
| JPS5919527B2 (en) | Method for manufacturing liposomes | |
| Papahadjopoulos | Phospholipid membranes as experimental models for biological membranes | |
| JP5904555B2 (en) | Method for producing liposome | |
| IE42396B1 (en) | A process for the preparation of liposomes |