NO153121B - Fremgansmaate for fremstilling av en liposomforloeper - Google Patents

Description

Liposomer er ganske bredt beskrevet i litteraturen, og

deres struktur er velkjent. De har vanligvis en løk-lignende multilamellær struktur som omfatter en flerhet av fosfolipide bi-sj ikt som er skilt fra hverandre med vandig materiale. En annen liposom-type som er kjent, består av et enkelt fosfolipid bisjikt som inneslutter vandig materiale, og disse unilamellære former blir noen ganger referert til som "blærer". I de senere år har det vært økende interesse for anvendelse av liposomer som bærere for forbindelser som er av interesse på grunn av en eller annen biologisk egenskap, for eksempel medisiner, proteiner, enzymer, hormoner, vitaminer og merke-forbindelser, etc. Det skal forstås at denne brede gruppe av biologisk interessante forbindelser, som innbefatter medisiner (for mennesker og dyr), men ikke er begrenset til disse , vil bli referert til i denne beskrivelse som "biologisk aktive forbindelser".

Innkapslingen av en biologisk aktiv forbindelse i lipo-

somer kan oppnås ved en rekke forskjellige fremgangsmåter. Den mest vanlig anvendte fremgangsmåte medfører støping av en film av fosfolipid (med eller uten et ladet lipid) ved inndampning fra en løsning i et organisk løsningsmiddel, f.eks. kloroform, og så dispergering av filmen i et egnet vandig medium. Når det dreier seg om lipid-løselige biologisk aktive forbindelser, det vil si slike som forenes med lipid-sjiktet fremfor med den vandige fase av liposomene, blir forbindelsen vanligvis støpt som en film sammen med et fosfolipid, ved anvendelse av et vanlig organisk løsningsmiddel. Når det dreier seg om vann-løselige biologisk aktive forbindelser, blir forbindelsen vanligvis innkapslet i liposomer ved å dispergere en støpt fosfolipid-film med en vandig løsning av forbindelsen. Den innkapslede forbindelse blir så separert fra den frie forbindelse ved sentrifugering, kromato-grafering eller ved en annen egnet fremgangsmåte. Når det dreier seg om biologisk aktive forbindelser som forenes med den lipide fase av liposomer, forutsatt at de er til stede i en mengde under deres maksimale lipid-løselighet eller under den maksimale mengde som kan bindes med lipidet, inneholder liposomer fremstilt ved den ovenfor angitte fremgangsmåte vanligvis mesteparten av forbindelsen bundet i de lipide bisjikt, og separeringen av den frie forbindelse er ikke så kritisk som når det dreier seg om vann-løselige biologisk aktive forbindelser som ikke bindes til lipidet.

Den ovenfor nevnte fremgangsmåte egner seg ikke til å

benyttes i stor målestokk. I tillegg har vandige liposome dispersjoner bare begrenset stabilitet, og deres lagringstid er derfor begrenset. Dessuten kan liposomene aggregere og utfelles som et sediment. Selv om slike sedimenter vanligvis kan re-dispergeres, så kan strukturen og størrelsesfordelingen til den opprinnelige dispersjon bli forandret. Aggregering og sediment-ering kan reduseres ved inkorporering av ladede lipider i liposomene, men det er ikke dermed garantert noen tilfreds-stillende lagringstid. Tapet av den biologisk aktive forbindelse fra liposomene og inn i det ytre vandige medium er en annen faktor som begrenser potensialet av disse preparater som prak-

tiske doseformer. Dette er spesielt tungtveiende for lav-molekylære, vann-løselige forbindelser, men lipid-løselige forbindelser kan også fordeles inn i det ytre vandige medium inntil likevekt er nådd. Dersom innholdet av forbindelse er lite,

og/eller volumet av det ytre vandige medium er stort, kan dette tap representere en betydelig andel av det totale innhold av den biologisk aktive forbindelse i liposomene.

Alle disse faktorer begrenser anvendelsen av liposomer

som praktiske bærere for biologisk aktive forbindelser, spesielt ved medisinsk terapi. En løsning kan være å fremstille og lagre filmen av den lipid/biologisk aktive forbindelse, og så disper-

gere filmen for å danne liposomer efter behov like før anvendelse. Disse enhetsdose-filmpreparater og lagringen medfører imidler-

tid alvorlige praktiske vanskeligheter, og denne idé tilveiebringer derfor ikke noen praktisk løsning på de problemer som er omtalt ovenfor. Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte som tilveiebringer en praktisk løsning. Kort sagt omfatter fremgangsmåten å fremstille en vandig liposom-blanding på kjent måte og så frysetørke blandingen, hvorefter den resulterende fryse-tørkede blanding blir lagret og, når ønskes, dispergert i et egnet vandig medium for å danne et vandig liposom-preparat.

Hvilken som helst konvensjonell fryse-tørkings-prosess

kan anvendes ved utførelse av fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen. Når en liposom-forløper fremstilt i henhold til denne

oppfinnelse blir redispergert i et egnet vandig medium, blir det uventet dannet liposomer som er lik dem som fremstilles ved den kjente film-dispergeringsmetode. Når det dreier seg om en lipid-løselig eller lipid-bundet biologisk aktiv forbindelse, blir forbindelsen reinkorporert i liposomene i stor utstrekning. De frysetørkede blandinger dispergeres lett når de ristes med et egnet vandig medium, og det viser seg at de fører til liposom-preparater som har en snevrere størrelsesfordeling enn et tilsvarende preparat erholdt ved dispergering av en støpt film. Dette kan være fordelaktig med henblikk på evnen til å reprodu-sere effekten av liposom-preparater.

I henhold til oppfinnelsen er det tilveiebragt en fremgangsmåte for fremstilling av en liposom-forløper som kan dispergeres i et egnet vandig medium for å fremstille et vandig liposom-preparat, som omfatter at det på kjent måte fremstilles en vandig liposom-blanding omfattende

minst ett liposom-dannende amfipatisk lipid, minst én lipidløselig eller lipidbundet biologisk aktiv forbindelse og eventutelt minst ett adjuvans. Fremgangsmåten karakteriseres ved at den vandige liposom-blanding frysetørkes for å danne nevnte liposom-forløper.

Nevnte vandige liposom-blanding kan for eksempel fremstilles ved den ovennevnte filmdispersjonsmetode. Eksempler på egnede amfipatiske lipider er de naturlige lecitiner, f.eks. egg-lecitin eller soyabønne-lecitin, eller syntetiske lecitiner, f.eks. mettede syntetiske lecitiner, f.eks. dimyristoylfosfatidylcholin, dipalmitoyl-fosfatidylcholin eller distearoylfosfatidylcholin, eller umette syntetiske lecitiner, f.eks. dioleylfosfatidyl-cholin eller dilinoleyl-fosfatidylcholin. Det kan anvendes enten et enkelt fosfolipid eller en blanding av fosfolipider.

Som angitt ovenfor kan den biologisk aktive forbindelse

være hvilken som helst lipid-løselig eller lipid-bundet forbindelse som har en egenskap av biologisk interesse. Forbindelsen kan således være et legemiddel, protein, enzym, hormon, vitamin eller en merke-forbindelse. Det skal forstås at fremgangsmåten

i henhold til oppfinnelsen er spesielt nyttig når det dreier seg

om lipid-løselige eller lipid-bundne biologisk aktive forbindelser (som inkluderer noen vannløselige forbindelser, for eksempel proteiner).

Det eventuelle adjuvans består av (1) substanser som er kjent for å tilveiebringe en negativ ladning, f.eks. egg-fosfatidsyre, dipalmitoyl-fosfatidsyre, dicetylfosfat eller oksehjernegangliosid, (2) substanser som er kjent for å tilveiebringe en positiv ladning, f.eks. stearylamin eller stearylamin-acetat og (3) substanser som er kjent for å påvirke de fysikalske egenskaper til lipid-bisjiktene i liposomene på en eller annen ønskelig måte, for eksempel ved å gjøre dem mer fluide eller stivere, efter behov, f.eks. cholesterol.

Oppfinnelsen blir belyst av de følgende eksempler.:

Eksempel 1

Egg-lecitin (16,1 mg), egg-fosfatidsyre (2 mg) og

-j H-cortisol-21-palmitat (herefter kalt ". 3H-CP"; 1,66 mg) ble opp-løst i kloroform (5 ml) og løsningen ble hellet inn i en 250 ml kolbe med rund bunn. Løsningsmidlet ble fjernet ved romtemperatur ved å rotere kolben og blåse en strøm av tørr nitrogen inn i den. Den derved oppnådde lipidfilm ble så dispergert ved romtemperatur i vann (5. ml), og dette ga en liposom-blanding. Duplikat-prøver (50 ul) ble tatt ut for å. foreta gnist-telling. Det gjenværende av liposoia-blandingen ble fortynnet til 25 ml med destillert vann i et ultrasentrifuge-rør, og ble ultrasentrifugert ved 120.000 g i 30 minutter.- Den overflytende væske ble.fjernet fra liposom-proppen, og proppen ble dispergert i destillert vann (5 ml). Det ble tatt duplikat-prøver (50 ul) av denne dispersjon., og steroid-inkorporeringen ble målt ved

gnist-telling. Resten av liposom-dispersjonen ble frosset ved anvendelse av en blanding av metanol og fast karbondioksyd,

og løsningsmidlet ble fjernet ved anvendelse av en kommersiell frysetørker. Det ble således oppnådd en frysetørket, liposom-forløper blanding.

Den frysetørkede blanding ble lagret i fem dager, og så ble den tilsatt 0,9% vekt/volum med saltløsning (5 ml). Liposomer ble dannet ved forsiktig risting av blandingen i kolben ved romtemperatur. Mikroskopisk undersøkelse bekreftet nærværet av liposomer. To dager senere ble liposomene vasket to ganger med 0,9% vekt/volum saltløsning ved den ovenfor beskrevne fremgangsmåte, bortsett fra at det ble brukt saltløsning i stedet for vann. Steroid-innholdet i liposomene ble bestemt ved gnist-telling. Sammenligning av radioaktiviteten til dispersjonene før og efter frysetørking viste at 72% av det steroid som var til stede i det vaskede preparat før frysetørking, var tilbake i de vaskede liposomer dannet efter frysetørking.

Eksempel 2

Dipalmitoyl-fosfatidylcholin (herefter kalt "DPPC", 29,8 mg)

3

og H-CP (3,32 mg) ble oppløst i kloroform (5 ml) og støpt som en tynn film på veggen i en 250 ml kolbe med rund bunn ved inndampning av løsningsmidlet ved romtemperatur ved anvendelse av en strøm av tørt nitrogen. Destillert vann (10 ml) ble så satt til kolben, og blandingen ble oppvarmet til 70°C på et vannbad. Det ble dannet liposomer ved agitering av den varme blanding på

en benk-vibromikser. Det ble tatt duplikatprøver (50 pl) av den resulterende dispersjon for å foreta gnisttelling. Resten av dispersjonen ble vasket to ganger ved fortynning til 25 ml med destillert vann og ultrasentrifugering ved 120.000 g i 30 minutter. Den vaskede liposom-propp ble redispergert i destillert vann

(10 ml), og det ble tatt duplikatprøver (50 pl) for å foreta gnisttelling. Dispersjonen (5 ml) ble frosset i en fryse-blanding bestående av metanol og fast karbondioksyd, og løsnings-midlet ble fjernet under vakuum ved anvendelse av en kommersiell frysetørker. Det ble således oppnådd en liposom-forløper som-

ble lagret inntil det var behov for den.

Destillert vann (5 ml) ble satt til den frysetørkede blanding, og den resulterende blanding ble oppvarmet til 70°C på et vannbad og ristet svakt. Mikroskopisk undersøkelse av den resulterende melkeaktige suspensjon viste at den besto av en suspensjon av liposomer, med en snever størrelses-fordeling.

Denne suspensjon ble ultrasentrifugert ved 120.000 g i 30 minutter, og liposom-proppen ble så redispergert i destillert vann (5 ml).

Det ble tatt duplikat-prøver (50 pl) av den resulterende suspensjon for å vurdere det endelige steroid-innhold i liposomene. Gnisttelling viste at 78% av steroid-inkorporeringen i den opprinnelige vaskede dispersjon var til stede i det endelige vaskede liposom-preparat dannet fra den frysetørkede blanding.

Duplikat-prøver (6 mg) av de tørkede liposom-propper fremstilt fra (a) den opprinnelige film og (b) den frysetørkede blanding ble så veid inn i -beholdere for å foreta differensial-avsøknings-kalorimetri (herefter "DSC"). DSC-spektrene av blandingene mellom 0 og 50°C ble nedskrevet på et Perkin Eimer differensial-avsøknings-kalorimeter. Det ble også dannet sammen-ligningsprøver for DSC ved å blande de samme vektmengder av DPPC

og <3>H-CP som i den opprinnelige blanding, og så blande dem med 50 vekt% vann. Disse tjente som "ikke-liposome" sammenligningsblandinger. DSC-spektrene for disse sammenligningsblandinger ble målt som beskrevet ovenfor.

DSC-spekteret for DPPC alene består av en hoved-overgangs-endoterm ved 41°C og en pre-overgangs-endoterm ved 35°C. "Halv-spiss"-linjebredden av hoved-endotermen er tilnærmet 3°C. For-søkene beskrevet ovenfor viste at for de "ikke-liposome" sammenligningsblandinger ble begge spisser ^observert i DSC-spektrene i blandingene, og linjebredden forble ved ca. 3°C. Dette er antatt å vise at i enkle blandinger (dvs. « ikke-liposomer i) i for-andrer ikke steroidet lipidets DSC-spektrum. Spektrene av duplikat-liposom-preparatene viste bare én overgang (hoved-endotermen), og den gjennomsnittlige linjebredde for disse preparater var 5,8°, en betraktelig øket bredde sammenlignet, med sammenlignings-blandingene. Denne økede bredde kommer av molekylær innvirkning mellom lipidet og steroidet i liposomene fremstilt ved den ovenfor angitte fremgangsmåte. Det kan derfor ikke være noen tvil om at liposomer fremstilt ved fremgangsmåten ovenfor, inneholdt steroidet i liposomene.

Eksempel 3

Egg-lecitin (15 mg), cholesterol (2,09 mg) og dicetylfosfat (1,55 mg) ble oppløst i kloroform (5 ml) og støpt som en tynn film på veggen i et test-rør. <125>1-Angiotensin II (0,1 mg) i 3,3 mM fosfat-buffer (pH 7,4, 1 ml) ble satt til røret. Lipidet ble dispergert i det vandige medium med hjelp av en benk-vibromikser for å danne liposomer. Liposom-dispersjonen ble vasket to ganger ved fortynning til 26 ml med 3,3 mM fosfat-buffer (pH 7,4), fulgt av ultrasentrifugering ved 120.000 g i 1 time. Den vaskede liposom-propp ble redispergert i 3,3 mM fosfat-buffer (pH 7,4, 5 ml) og det ble tatt duplikat-prøver (0,25 ml) for gnist-telling. 4 ml av den gjenværende suspensjon ble anbragt i et testrør, ble frosset (metanol og fast karbondioksyd) og frysetørket. Den resulterende liposom-

forløper ble resuspendert i 3,3 mM fosfat-

buffer (pH 7,4, 2 ml) og vasket to ganger som før. Den vaskede liposom-propp ble resuspendert i 3,3 mM fosfatbuffer (pH 7,4, 4 ml). Det ble tatt duplikat-prøver (0,25 [ il) for gnist-telling. 26% av den opprinnelige mengde av angiotensin II var opprettholdt i liposomene efter den første liposom-dannelse og vasking.

28% av disse 26%, det vil si 7% av den opprinnelige mengde av angiotensin II, var opprettholdt i liposomene efter frysetørking og rekonstitusjon.

Fosfat-bufferen på 3,3 mM (pH 7,4), anvendt i dette eksempel og eksempel 4, ble fremstilt ved å oppløse kaliumdihydrogen-fosfat (0,895 g) og dinatriumhydrogenfosfatdihydrat (4,765 g)

i destillert vann, og oppspe løsningen til 1 liter med destillert vann.

Eksempel 4

Egg-lecitin (15 mg), cholesterol (2,09 mg) og dicetylfosfat (1,55 mg) ble oppløst i kloroform (5 ml) og støpt som en tynn film på veggen av et testrør. "^H-inulin (5 mg) i 3,3 mM fosfat-buffer (pH 7,4, 1 ml) ble satt til røret. Lipidet ble dispergert i inulin-løsningen ved hjelp av benk-vibromikser for

å danne liposomer. Liposom-dispersjonen ble vasket to ganger ved fortynning til 26 ml med 3,3 mM fosfat-buffer (pH 7,4), fulgt av ultrasentrifugering ved 120.000 gil time. Den vaskede liposom-propp ble redispergert i 3,3 mM fosfat-buffer (pH 7,4, 2,1 ml)

og det ble tatt duplikat-prøver (1 pl) for gnist-telling. Den gjenværende suspensjon ble frosset (blanding av metanol og fast karbondioksyd) og frysetørket i et testrør. Den resulterende liposom-forløper ble resuspendert i

3,3 mM fosfat-buffer (pH 7,4, 1 ml) for dannelse av liposomer og ble vasket to ganger som før. Den vaskede liposom-propp ble resuspendert i 3,3 mM fosfat-buffer (pH 7,4, 2 ml), og det ble tatt duplikat-prøver (1 pl) for gnist-telling. 21% av den opprinnelige mengde med inulin var opprettholdt i liposomene efter den første liposom-dannelse og vasking. 17% av disse 21%, det vil si 4% av den opprinnelige mengde inulin, var opprettholdt i liposomene efter frysetørking og rekonstitusjon.

Claims (1)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av en liposom-forløper som kan dispergeres i et egnet vandig medium for å fremstille et vandig liposom-preparat, som omfatter at det på kjent måte fremstilles en vandig liposom-blanding omfattende'minst ett liposom-dannende amfipatisk lipid, minst én lipidløselig eller lipid-bundet biologisk aktiv forbindelse og eventuelt minst ett adjuvans, karakterisert ved at den vandige liposom-blanding frysetørres for å danne nevnte liposom-forløper.