JPH04500803A - 乾燥時に改善された安定性を示すリポソームの調製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 乾燥時に改善された安定性を示すリポソームの調製方法発明の分野 本発明は、一般に、乾燥時に安定である、薬物または他の治療物質、診断物質、 または他の重要な生物学的もしくは薬理学的物質を含有することもあるリポソー ムの調製方法に関する。好ましい態様では、少なくとも１つの糖と少なくとも１ つのタンパク質、ポリペプチドおよび／またはオリゴペプチドとを存在させてリ ポソームを調製するので、それにより、乾燥した安定化リポソームを再構成する 際、リポソーム二重層が維持され、凝集または融合を回避でき、そして再構成時 に達成される薬物の包嚢の程度が顕著に高められる。

発明の背景 リポソームは文献に広（記載されており、その構造は周知である。

リポソームは、１つの液間隙または複数の液間隙を包含する単一ラメラまたは多 重ラメラの脂質小胞である。リポソームにおける壁は、極性ヘッドと非極性テイ ルを有する１つまたはそれ以上の脂質成分の二重層から形成されている。水（す なわち極性）溶液中では、１つの層の極性ヘッドが外側に配向して周囲の媒質中 へ延び、その脂質の非極性テイル部分は相互に会合することにより、リポソーム の壁に極性表面と非極性のコアとが提供される。単一ラメラリポソームはこのよ うな二重層を１つ有しており、他方、多重ラメラリポソームは一般に、だいたい 同一中心の多（の二重層を有している。

リポソームを調製する方法は多数知られており、多くは、スゾカ（Ｓｚｏｋａ） およびパパハジ１ブロス（Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ）のＡｎｎ、　Ｒｅ ｖ、　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｒ＋　Ｂｉｏｅｎｇ４＋４６７−５０８（１９８０） 、およびＬｉｐｏｓｏｓｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙのリポソームの調製法、第１ 巻、グレゴリアゾイス（Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ）編、ＣＲＣブレス、　Ｉｎｃ 、　（１９８４）に記載されている。また、リポソームの包嚢方法の幾つかは、 パパハジゴブロスらに対して１９８０年１１月２５日に発行された米国特許第４ ．２３５．８７１号、およびスズキ（Ｓｕｚｕｋｉ）らに対して１９７７年４月 ５日に発行された米国特許第４．０１６．１００号の特許文献に開示されている 。

リポソームは、薬物および他の治療物質を包嚢し、そしてそれらの物質を選択し た生体内部位に運搬するのに有用である、と認識されている。リポソームにより 薬物を投与すると、毒性が減少され、組織分布が改変され、薬物の効能が増大さ れ、そして治療指数が改善され得る。一般的には、ポッナンスキー（ｋｌ、　Ｊ 、　Ｐｏｚｎａｎｓｋｙ）およびジーリアー／　（Ｒ，Ｌ、　Ｊｕｌｉａｎｏ） のフ１−マコロジカル・レイｓ　−（Ｐｈａｒ　・ａａｃｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｒ ｅｖｉｅｗ）、　３６．２９６−３０５（１９８４）の評論、薬物の制御供給へ の生物学的アプローチ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ　ｔｏ　 ｔｈｅ　ＣｏｎｔｒｏｌｌｅｄＤｅｌｉｖｅｒｙ　ｏｒ　Ｄｒｕｇｓ）、ならび （こレイマン（Ｂ、　Ｅ、　Ｒｙｌａｎ）およびチレル（Ｄ、＾、Ｔｙｒｒｅｌ 　ＩンのＢｉｏｃｈｅｓｉｓｔｒｙ＋　２１＋　４９−９８（１９８０）におノ するソボンームー可能性あるバッグ（Ｂａｇｓ　ｏｆ　Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）を 参照のこと。

リポソームはさらに、種々の化学物質、生化学物質、遺伝子物質などをインビト ロで生細胞に導入するため、および診断剤の担体として使用されており、成功を 収めている。一般的には、ポツナンスキーおよびジュリアーノの上掲文献、なら びにレイマンおよびチレルの上掲文献を参照のこと。

最近、膜融合、界面触媒、エネルギー伝導および転換、ドラッグデリバリ−（薬 物供給）およびターゲツティングなどの膜介在性反応を取り扱う幾つかの研究分 野において、単一ラメラのリポソームが重要になってきた。この種の研究により 、薬物供給用および診断イメージングのための単一ラメラおよび多重ラメラのリ ポソームが既に産業上利用されている。

治療物質および診断物質をリポソーム中に包嚢することは、商業的に意義がある という可能性を有するが、リポソーム包嚢体を商業的に生産する上で直面する困 難性として、主としてリポソーム自身および／または包嚢された物質（群）が長 期にわたる安定性を有していないことが挙げられる。

保存時におけるリポソームの安定性を規定するものは一般に、ある調製物がその 元の構造、化学的組成およびサイズ分布、ならびに物質が取り込まれている場合 には、その物質（治療物質であるか、診断物質であるかに関係無く）の充填量、 のすべてを保持する程度である。たとえば、放置した際、コロイド化リポソーム の融合の結果として自然にリポソームのサイズが大きくなった場合は、不安定に なり得る。双性イオン性のホスファチジルコリンから構成される小さな単一ラメ ラリポソーム（ＳＵＶ）の中には、室温で、凝集し、モして／または大きな多重 ラメラ脂質粒子と融合する傾向を示すものがある。それよりも大きなリポソーム は、そのサイズにより消失速度および組織分布が決定されるので、たとえば、大 きなリポソームが小さなリポソームよりも速く循環系から除去されるなど、生体 内で極めて種々の薬物動態を示すであろう。さらに、リポソームの水性懸濁液中 にあるリポソームは凝集し、そして堆積物として沈殿することがある。このよう な堆積物は通常、再分散させることができるが、この場合、最初の分散液の構造 とサイズ分布が変わり得る。

最後に、不安定性に関連するもう１つの重要な因子は、取り込まれている低分子 量活性物質が保存リポソームから漏出し易い、ということである。一般的には、 グレゴリアゾイス（Ｇ、　Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ）のＴｒｅチンとしてのリポ ソーム（Ｌｉｐｏｓｏａｅｓ　ｆｏｒ　Ｄｒｕｇｓ　ａｎｄ　Ｖａｃｃｉｎｅｓ ）Ｊを参照のこと。このような漏出は、リポソーム中における活性物質の全含有 量にとって重要な割合となり得る。

保存時におけるリポソームの安定性を長期化させることを目的とした研究は、凍 結乾燥の形態でリポソームを保存することを包含していた。凍結乾燥とは、凍結 および脱水によって乾燥状態の物質を調製する工程を意味する。リポソームは、 導入される治療物質、診断物質または生物学的に重要な他の活性物質と共に、ま たはその不存在下に凍結乾燥することができる。このような活性物質を伴わずに 凍結乾燥した場合はその後、当業界周知の方法によってリポソームを再構成した 後に、上記の活性物質を導入することができる。本発明では、噴霧乾燥、トレ・ イ乾燥、およびドラム乾燥、ならびに同時継続中の第０１８．１９０号（引用に よって本発明に包含させる）に開示された乾燥方法など、凍結乾燥以外の乾燥方 法を使用することができる。

凍結保護剤（ｃｒｙｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ）を使用しなかった場合には、乾燥 時にリポソームの破損が生じるのが普通である。これは、包嚢されていた内容物 の漏出または放出の原因となる。さらに、単一ラメラ小胞を凍結−解凍または脱 水に供した場合、その融合および凝集反応は顕著に促進される。卵ホスファチジ ルコリンの小さな単一ラメラ小胞は、凍結および解凍の際に大きな多重ラメラ構 造に逆戻りすることが示されている。ここに、ストラース（Ｇ、　５ｔｒａｕｓ ｓ）およびホーサー（Ｈ，Ｈａｕｓｅｒ）のＰｒｏｃ、　Ｍａｔｅ、　Ａｃａｄ 、　Ｓｃｉ、　、　Ｌｌ、　Ｓ、＾、　８３．２４２２＜１９８６）を引用して 本明細書の開示とする。

凍結保護剤は、脱水化生成物を保護し、それを以後の使用に備えて適当な条件下 で保存するために使用することができる。次いで、脱水化生成物は、蒸留水また は適当な溶液を添加することによって再構成することができる。デキス１ラン、 マンニト−ル、ラクトースおよびポリビニルピロリドンなどの親水性物質は、細 胞および組織のための凍結保護剤として［マツケンジー（ＭａｃＫｅｎｚｉｅ、 　Ａ、　Ｐ、　）のＤｅｖｅｌｏｐ、　Ｂｉｏｌ、５Ｌａｎｄａｒｄ　３６，５ ｌ−６７（１９７６）コ、および凍結乾燥された、生物学的および製剤学的に適 した増容剤（ｂｕｌｋｉｎｇ　ａｇｅｎｔ）として当業界では周知である［マツ ケンジーのＢｕｊｌ、Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ　Ｄｒｕｇ　Ａｓ＠ｏｃｉａｔｉｏ ｎ　２０．１０１−１２９（１９６６月。

膜関連チトクロームオキシダーゼを有する大豆リン脂質小胞（リポソーム）を凍 結乾燥時における障害から保護するため、スクロースが使用されたしラッカー（ Ｒａｃｋｅｒ、　Ｅ、　）、Ｊ、　Ｍｅｍｂｒａｎｅ　Ｂｉｏｌ、　１０＋　２ ２１−２３５（１９７２）］。そのリン脂質小胞が無傷であることの基準は、呼 吸脱共役剤の添加、および非添加時における酸素の取り込み率であった。

この比率は呼吸制御（ＲＣ）と呼ばれる。凍結乾燥し、水で再構成した後に呼吸 制御が完全に破壊された（ＲＣ＝１．０）。しかし、凍結乾燥する前にその小胞 懸濁液にスクロースを添加すれば、障害から保護された。スクロースの濃度を０ ．４Ｍまで徐々に増大させた場合、凍結乾燥後の呼吸制御が最大で約ＲＣ＝２． ２５まで増大した。

この著者は、スクロースは凍結乾燥時におけるリン脂質の構造的機構を保護する 、と結論付けた。

卵ホスファチジルコリンまたは９０％バルミトイルオレオイルホスファチジルコ リン／１０％ホスファチジルセリンから構成されたリポソームであって、そのリ ポソーム二重層の内側および外側の両サイドにトレハロース、スクロースまたは マルトースなどの三糖類（ジサッカライド）が存在するものに関連する他の実験 が行われた［マ］。これらの脂質は、室温で水和したとき、液状の結晶相中に存 在するので、「流動体」と呼ばれる。ディビスにあるカリフォルニア大学のジョ ーンおよびロイス・クロー両博士によって行われた実験では、流動性リン脂質か ら構成された大きな単一ラメラリポソームを凍結乾燥した際、上記の三糖類は単 独で凍結保護剤として機能することが示され、そしてその研究により、ジサッカ ライドをリポソームの内側および外側の両サイドに配置させた場合、１００％維 持される、と結論されている。上記クローらはさらに、凍結乾燥を成功させる重 要なパラメーターは、溶液中における糖の絶対的な濃度ではなく、リン脂質に対 する糖の比率であることを見いだした。本発明の１つの態様として特許請求して いる、少なくとも１つの糖と、少なくとも１つのタンパク質、ポリペプチドおよ び／またはオリゴペプチドとの組合わせ物をリポソーム二重層の内側および外側 の両サイドに配置すると、全く同じ結果が得られる。しかし、上記クローらは、 上記ジサッカライドを外側サイドにのみ添加した場合には活性成分は４２％しか 保持されないことを見いだした［クロー（Ｌ］。

Ｃｒｏｗｓ）らのＢｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ、４７．２４８ａ（ １９８５）コ。

生体内部位に供すべき医薬化合物を安定に包嚢するのに有用であるリポソームに は、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）またはジステアロイルホ スファチジルコリン（ＤＳＰＣ）などの若干流動性を有するリン脂質が必要であ る場合が多く、また通常は、膜二重層を強化するためにコレステロールを含有さ せる。しかし、リポソーム二重層にあるコレステロールは、コレステロールを有 していない同一のリポソーム組成物と比較すると、凍結乾燥時および再水和時に 漏出および融合させ易くする［クロンメリン（ＣｒｏｓｎｅＪｉｎ。

Ｄ、　Ｊ、　Ａ、）およびファンボンメル（ｖａｎＢｏｍｓｅｌ、　Ｅ、　Ｍ、 　Ｇ、　）のＰｈａｒｉｉａｃｅｕｔｉｃａ本発明で有用であるコレステロール を含有する上記の低流動性リン脂質から構成される単一ラメラリポソームの凝集 は、クローらが行ったような、ジサッカライドをリポソームの内側および外側の 両サイドに配置させることでは防げなかった。しかし、リポソームが形成される 前に、少なくとも１つの糖と少なくとも１つのタンパク質、ポリペプチドおよび ／またはオリゴペプチドとの組合わせ物を、コレステロールを含む低流動性のリ ン脂質の水溶液に加え、その凍結保護溶液がリポソーム二重層の内側および外側 に分配されるようにした場合、９０％以上が維持され、凝集が殆ど起こらないこ とが、本発明により判明された。

本発明は、非流動性のリン脂質およびコレステロールを含有スるなどのリポソー ムを、その内容物が１００％まで保持され、融合および凝集が大部分阻害される よう、首尾よく調製された組成物である。この組成物は、１つの具体例として、 リポソームの調製に使用される水溶液中にある、少なくとも１つの糖と少なくと も１つのタンパク質、ポリペプチドおよび／またはオリゴペプチドとの組合わせ 物を使用するものである。

したがって、都合の良いことに、本発明により、薬物、または他の治療物質、診 断物質または生物学的に重要な他の物質を含む、または含まない、安定性が改善 されたリポソーム、すなわち再構成時における維持能が増大され、融合および凝 集することが殆どまたは全（無いリポソームを調製するための商業的に利用でき る方法が提供されるであろう。さらに、シニナイダーらの米国特許第４．２２９ ．３６０号（１９８０年ｌＯ月２１日）のリポソームのコロイド状分散剤の脱水 方法に記載されているような、既に形成されたリポソームに凍結保護剤を後期に 加えるのではなく、リポソームを調製するために使用する水性媒質中に凍結保護 剤を加えておき、または含有させていれば、乾燥リポソーム製品の取り扱いは簡 単になるであろう。さらに、凍結保護剤溶液をリポソーム二重層の内側および外 側に分配するなら、リポソームは、クローらによって示されているよりも広範囲 のリン脂質から調製され得よう。

本発明は、ステロールまたは他の安定化分子、具体的にはコレステロールを含有 することができるリポソームを調製するための、商業的に利用可能な方法であっ て、リン脂質（群）および要すれば安定化剤の混合物を水和させる水性媒質中で 、少なくとも１つの糖、好ましくはジサッカライドと少なくとも１つのタンパク 質、ポリペプチドおよび／またはオリゴペプチドとの組合わせ物を凍結保護剤と してリポソームが形成される前に利用することを特徴とする方法に関する。この ようにして調製されたリポソームを凍結乾燥し、次いで再構成すると９０％を越 えた量の無傷のリポソームが得られ、再構成したリポソームは生体内適用では正 常に挙動し、その構造およびサイズは凍結乾燥する前の状態と実質的に同一であ り、すなわち融合または凝集が殆どまたは全く起こらなかった。ここに、乾燥時 に安定であるリポソーム調製物を特許請求するものである。

図面の簡単な説明 第１ａ図は、凍結保護剤を使用せずに凍結乾燥したリポソームをＰＢＳで再水和 したものを示す、フリーズーフラクチャ−（凍結破断）電子顕微鏡（Ｘ　４１． ０００倍率）で撮影した電子顕微鏡写真である。

第１ｂ図は、外側にのみ９％ｖ／ｖスクロースを用いて凍結乾燥したリポソーム を再水和したものを示す、フリーズーフラクヂャー電子顕微鏡（Ｘ　２１．００ ０倍率）で撮影した電子顕微鏡写真である。

第１Ｃ図は、外側にのみ１．Ｏｘｇ／ｌ１２ゼラチンおよび９％Ｗ／Ｖスクロー スを用いて凍結乾燥したリポソームを再水和したものを示す、フリーズーフラク チャー電子顕微鏡（Ｘ　５４．０００倍率）で撮影した電子顕微鏡写真である。

第１ｃ図で認められる凍結保護作用は、内側および外側に凍結保護剤を含有させ て観察されたものと同等であると認められた。

本発明の詳細な説明 「ミセル」なる用語は、両親媒性分子の自然の凝集の結果として水溶性になった 粒子を意味する。両親媒性分子は疎水性および親水性部分を含有している。本発 明では、好ましい両親媒性物は生体脂質である。このようなミセルは、小さな球 形、楕円形または長方形の形態を取ることができ、また両親媒性分子の２つの平 行した層を有する二重層から構成される場合もある。このような二重層ミセルは 通常、内部に水性のコンパートメントを有する単一または多重ラメラの球面の殻 形態の形を取っており、「リポソーム」としても知られている。

これらリポソームを調製する方法は、現在では、当業界で周知である。＋ｊボソ ームを調製するには通常は、リン脂質、たとえばホスファチジルコリンを水溶液 中に分散させ、要すれば音波処理または他のキャビテーラシン法を施し、そして それには、中性脂質、たとえばコレステロールなどの他の物質、ならびに正また は負に帯電した化合物、サツカライド、抗体、およびリポソームの二重層の分子 をアンカーする（引っ掛ける）ことができる基を有する他の機能的なリガンドを も含有させることができる。

生体内の医薬品供給に有用であるリポソームは、ホスファチジルコソンのみを、 または池の中性リン脂質およびコレステロールなどの安定化分子を含有する製剤 に限定されない。たとえば、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロー ル、ホスファチジルエタノールアミン、カルシオリビン（ｃａｒｄｉｏｌｉｐｉ ｎ）などを、ステロールと共に、またはそれを含まずに含有する製剤が挙げられ る。

本発明者らは、特定のリン脂質分子を組込むことによって、生体内において極め て安定なリポソームが得られることを見いだした。

相転移点は炭化水素鎖の長さの関数であることが知られている［タンフォード（ Ｃ，Ｔａｎｆｏｒｄ）のＴｈｅ　Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ　Ｅｆ４ｅｃｔ、　２ 版（１９ＢＧ）］。たとえば、炭素原子数が少な（とも１６個であり、かつ二重 結合を含まない炭化水素を有する特定のリン脂質分子は流動性が低く、比較的高 い諷度の相転移（３７℃より高い温度）を示すものであり、本発明者らは、これ らのリン脂質を使用すれば、生体内で改善された安定性を示すリポソームが得ら れることを見いだした。ある場合には、人手容易性および費用を勘案して、より 短い炭化水素鎖のリン脂質を使用することが望まれる場合があるが、その場合は 、血清中におけるリポソームの安定性を保持させるため、炭素原子数が少なくと も１６個である飽和炭化水素鎖を有する分子が、存在するリン脂質の大部分を占 めるように、少量だけなら、リポソーム製剤に加えることができる。

リン脂質リポソームの安定性は、ステロール、特にコレステロール、または他の 安定化分子を加えることによってさらに増強することができる。安定なリポソー ムは、リポソームにコレステロール２５−５０モル％を加えることによって得る ことができる。ジステアロイルホスファチジルコリンから調製されたリポソーム では、コレステロールおよびジステアロイルホスファチジルコリンのモル比率は 約１：１から約３；ｌであり、好ましくは２：ｌである。

本発明において凍結保護剤として使用されるのに適したものは、少なくとも１つ の糖と少なくとも１つのタンパク質、ポリペプチドおよび／またはオリゴペプチ ドとの組合わせ物である。乾燥時に安定である本発明のリポソームを調製するに 当たっては、リン脂質（群）および任意であるが好ましくはコレステロールの混 合物を水和するのに使用される水性媒質中に、少なくとも１つの糖と少なくとも １つのタンパク質、ポリペプチドおよび／またはオリゴペプチドとの組合わせ物 をリポソームの生成前に加える。あるいは、この組合わせ物を、リポソームの外 部にある水性媒質、および少なくとも１つの糖または任意であるが少なくとも１ つのタンパク質、ポリペプチドおよび／もしくはオリゴペプチドを含有すること ある内部の水性媒質に加えるだけでよい。この糖はスクロース、ラクトース、ト レハロース、マルトース、およびグルコースであってよい。糖とリン脂質との重 量比は約０．５：１から約１０：１である。ラクトースおよびスクロースの場合 、糖とリン脂質（群）との重量比は約４：１である。糖の濃度は約２，５％から 約１５％（Ｗ／Ｖ）である。タンパク質は、たとえばアルブミン、およびポリペ プチドのゼラチンまたはカゼインとすることができる。これらタンパク質、ポリ ペプチドおよび／またはオリゴペプチドとリン脂質との重量比は約１：１００か ら約２＝１である。タンパク質がアルブミンである場合、アルブミンとリン脂質 との重量比は約１：ｌである。カゼインおよびゼラチンとリン脂質との重量比は 約１：１０である。凍結保護剤としてのゼラチン、カゼインおよび血清アルブミ ンの作用は少な（とも部分的にそれらの重合性（ｐｏｌｙ■ｅｒｉｃ）に関連し ていると考えられる。

このことは第４表から認められ、第４表には、ポリペプチドの主要な構成成分で あるアミノ酸はリポソームに凍結保護特性を付与しないことが示されている。ポ リペプチドおよびタンパク質の凍結保護作用は、リポソームの表面を覆うことの できるそれらの被覆能によって惹起され得る。これらの物質がこのように作用す ることにより、凍結および乾燥時に起こり得る、リポソーム表面が近接して並ぶ ことに抗する手段が提供され、したがって凝集および融合が防御できるのであろ う。たとえば、カゼインは接触するようになった他の表面を被覆することで知ら れている。カゼイン１ｓ＋ｇが単層として被覆できる面積は、１．２７Ｍ”であ る［百科事典ポリマー・サイエンス・アンド・テクノロジー２巻（１９６５）、 インターサイエンス出版社。

８６１頁］。ＤＳＰＣ：コレステロール２：ｌのリポソームの平均直径６０ｎｓ の脂質濃度２５ｘｇ／ｘＱ溶液における外部表面積（ｅｘｔｅｒｎａｌｓｕｒｆ ａｃｅ　ａｒｅａｓ＞を計算すれば、それは約５Ｍ”である。２．５ｍｇ／ｘσ に一カゼインの溶液は、良好な凍結保護作用にとって十分なものである。このす べてのタンパク質がリポソーム上で層を形成した場合、タンパク質分子は表面積 の６３．５％を覆うであろうが、おそらくこれは凍結乾燥時の有害な作用を防ぐ に十分であろう。さらに、他の機序が作用していることも考えられる。当業者な らば、糖とタンパク質、ポリペプチドおよびオリゴペプチドとの組合わせ物は種 々利用でき、それらが本発明の範囲内に属されることは理解されよう。

本発明のリポソームには、マーク（Ｍ、　Ｒ，Ｍａｕｋ）およびガンベル（Ｒ， Ｃ。

Ｇａ５ｂｌｅ）のＡｎａｌ、　Ｂｉｏｃ、　、　９４．３０２−３０７頁（１９ ７９）に記載されているように音波処理によって１、またはガンベルの同時係属 出願（１９８５年１月３１日出願）であって本出願人に譲渡された出願に記載さ れている操作法を使用するマイクロエマルジゴン化（両文献とも引用によって本 発明に包含される）によって調製される、直径で２０００人よりも小さい単一ラ メラリン脂質リポソームが包含されるが、これに限定されない。しかし、当業者 ならば、他の方法によって調製される別のタイプのリポソームを使用することが 本発明の範囲内で利用可能であることは理解されよう。

リポソームの内部水性コンパートメント内には、種々の化合物を包含させること ができる。代表的な治療物質には、抗生物質、代謝調節剤、免疫変調剤、化学療 法剤、毒物解毒剤、などがある。同様に、リポソームは診断的放射性核種および 蛍光性物質、またはインビトロおよびインビボ（生体内）適用において検出され 得る他の物質を運搬することができる。

本発明における好ましい態様のリポソームは、リン脂質（群）およびコレステロ ール混合物を水和するために使用する水性媒質に添加される、少なくとも１つの 糖と少なくとも１つのタンパク質、ポリペプチドおよび／またはオリゴペプチド との組合わせ物の存在下に生成される、コレステロールを含有する単一ラメラリ ン脂質リポソームのリポソームである。

本発明の別の態様では、少なくとも１つの糖と少なくとも１つのタンパク質、ポ リペプチドおよび／またはオリゴペプチドとの組合わせ物を、生成後のリポソー ムに加える。そのリポソームの内部水性媒質は、少なくとも１つの糖、または少 なくとも１つのタンパク質、ポリペプチドおよび／もしくはオリゴペプチドを含 有することができる。

本発明は、乾燥工程およびその後の再構成時の障害に対してリポソームを安定化 させるものとして最も都合が良い。「安定化」なる用語は、平均サイズおよびサ イズ分布に影響を与えないこと、すなわち再構成時に融合または凝集が殆ど、ま たは全く認められず、リポソーム二重層の完全性が維持され、漏出に起因するリ ポソームの有用性の無駄な損失を招かないこと、を意味する。

以下に記載の実施例は、凍結乾燥したリポソーム製品の調製物、特性化、および 動物モデルへの生体内適用例を説明するものである。

凍結〜Ｍ凍リボソーム製品から得られた結果を示すが、これは単に比較を目的と するのみである。

以下の実施例は、本発明の説明のためのものであり、本発明の範囲の限定を意図 するものでない。

一般的なリポソーム調製物 従来からの方法によって、微量のイオノホア抗生物質Ａ　２３１．８７を含有す る小さな単一ラメラ小胞（ＳＵＶ）（リポソーム）をジステアロイルホスファチ ジルコリン（ＤＳＰＣ）およびコレステロール（ＣｈＸ比率２：１）から製造し た［モーフ（Ｍａｕｋ）およびガンベル（Ｇａｍｂｌｅ）のＡｎａｌ、　Ｂｉｏ ｃ、　、　９４．３０２−１０７（１９７９）を引用して本明細書に包含させる ］。

手短に言えば、脂質（ＤＳＰＣおよびＣｈ）４０−１００ｍｇのクロロホルム溶 液を窒素（Ｎ、）雰囲気下に蒸発乾固し、さらに減圧下に一晩乾燥させた。その 試験管を、ｌ１Ｍニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）もしくは１００ｍＭ６−カルポキシ フルオレスセインを含有することある凍結保護剤の溶液または緩衝液の所定量で 充満させ、そしてチタニウムのマイクロチップを備えたＭＳＥブランドのプロー ブ音波処理器を使用し、窒素雰囲気下、６０−７０℃で５−１５分間音波処理し た。音波処理またはマイクロエマルジ冒ン化によって、ここに記載の実験で使用 される小さい単一ラメラのリポソームを得た。

セファデックスＧ−５０−８０カラムの減圧溶離によって、音波処理後に包嚢さ れていない外部溶液をＰＢＳまたは凍結保護剤溶液と交換した。最終脂質濃度は ２０−３０ｗｇ／ｍＱであった。

凍結保護用添加剤のスクリーニング 凍結保護・剤としての可能性について個々の化合物または化合物群を試験する方 法として、以下の４つの工程を行った：種々の量の凍結保護剤候補物質を所定量 のリポソーム調製物に加えた。次工程として、可能性ある凍結保護剤の添加後に 試料について定量的な視覚チェックを行い、即時性の効果が現れているか否かを 確認した。１試料が安定である、すなわち上記活性物質の添加後に凝集が認めら れない場合は、凍結し解凍し、および／または凍結乾燥してもよいであろう。凍 結−解凍では、−１８℃で試料を凍結し、室温（２１”Ｃ）で解凍した。凍結乾 燥では、−１８℃で凍結した後、少なくとも２４時間真空下に置いた［バーチス ・フリーズ・ドライア−Ｇ型（Ｖｉｒｔｉｓ　Ｆｒｅｅｚｅ　Ｄｒｙｅｒ　Ｍｏ ｄｅｌ　Ｇ）］。

再構成 凍結乾燥したリポソーム試料に蒸留水を加え、バイアルを手で穏やかに撹拌して 該試料を再構成した。

再構成したリポソーム調製物をまず、大きな粒子、凝集体、または不安定性を示 唆し得る溶液の他の変化について視覚的にチェックした。次いで、リポソームを エツペンドルフ５４１４型遠心機で遠心した（１５６００ｇ、３分間）。得られ た遠心管について、その底に大きなベレットが形成されていないか、またさらに 考察する対象から除外すべき所見がないか否かをチェックする。得られた結果を 以下の第１表に示す。

再構成した凍結乾燥リポソームからの包嚢化１００ｍＭ５−カルボキシフルオレ スセインの放出を測定して得られた蛍光性色素放出データを使用し、リポソーム 二重層の完全性を試験した。ＨＰＬＣ蛍光検出器によって試料の蛍光を測定した 。凍結乾燥をしなかった試料の一部を測定し、「バックグランド」蛍光値を得た 。試料の蛍光値からバックグランド蛍光値を引き算し、溶解したリポソーム［０ ，４％のトリトンｘ−ｉｏｏを使用し、リポソームを溶解］のバックグランド蛍 光値を引いた全蛍光値で割り算して放出値％を計算した。

１００％から放出％を引き算し、保持パーセントを計算した。得られた結果を第 ２表に示す。

上述のようにして調製したリポソームを、５ｍＭ　リン酸塩（ｐＨ７，４）中ラ クトース（９０ｍｇ／ｍｅ）に懸濁した。ラクトースはリポソームの外側にのみ 存在した。ＰＢＳはリポソームの内側に存在した。

ＳＵＶの保存溶液を１０１Ｑ容量セプタム（ｓｅｐｔｕｍ）容器に２ｊ１１２容 量づつ分配し、牛乳のにカゼイン、牛乳のカゼイン−〇−グリコペプチド、魚皮 ゼラチンおよび牛皮ゼラチン（６０ブルーム（Ｂｌｏｏｍ））［これらはすべて シグマ・ケミカルＧｏ、から入手］をさらに精製することなく加えた。温度制御 槽を有する凍結乾燥器に試料を入れ、プログラム化した棚温度で３日間真空中で 凍結乾燥した。

凍結乾燥した後、得られた試料を出発容量と同量の蒸留水で再構成した。容量− 加重化ガウス法としてニコン（Ｎｉｃｏｍｐ）　２７０型器を使用した動的光散 乱法（ｄｙｎａｍｉｃ　ｌｉｇｈｔ　ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）によって、小胞の 平均直径を計測した。幾つかの再構成した試料中に存在する凝集および沈澱物質 を除去するためにする１、５．６００ｇ、１０分の遠心の前後で、試料を試験し た。得りれた結果を第３表に示す。

アζ／酸 凍結保護能について、７ミ、ノ酸も試験した。重量測定した１０１ｇ／’ｘｆ２ アミノ酸くシグマ・ケミカルＣｏ、）の試料を、９％スクロースが外部の水性媒 質中にＡ自されているリボ゛だ−・ムに加えた。試料を凍結し、棚乾燥器を使用 １７て乾燥した。凍結乾燥した後、脱イオン水で試料を再構成１２、穏やかに撹 拌１．で約３０°Ｃまで暖め、次いで不可逆性の凝集、融Ｃおよび／オたは崩壊 を示す沈澱の有無につい゛て調査し、た。沈澱物の量は試料毎に異なったが、す べ”Ｃの場合で、アミノ酸が凍結乾燥の障害を防御できないことを示す、実質的 に不溶性の物質が存在した。次いで、上清に関して平均サイズおよび→クイズ分 布を測定１、た。得られた結果を第４表に示す。

凍結乾燥および再水和反応後におけるリポソームの保護効果を示す証拠となるフ リーズーフラクチャー電子顕微鏡写真法ＤＳ　ＰＣ：コレステロール（２：１） のＳＵＶ試料を既述のようにしてリン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ）中で調製した。

セファデックスＧ−５０カラムクロマト・グラフィーによつＣ１そのリポソーム の外側において、５ａＭ　リン酸緩衝液１）Ｈ７，４を有するスクロース（９％ ℃／い（９０ｘｇ／ｚ□と交換しまた。重量測定した量の６０ブルーム牛皮ゼラ チン（シグマ・ケミカル、カンパニー）（１，０ｍｇ／ｘｊ）を幾つかの試料に 加え、溶解した。試験リボソート溶液２ｊ１１７を凍結し、棚温度制御した凍結 乾燥器で凍結乾燥し、た。

乾燥した試料をパラフィンオイルに懸濁し、顆粒物質をまとまらぜる１：とによ って、その試料をフリーズーフラクチイー電子顕微鏡法用に調製した。フリーズ ーフラクチャー（凍結破断）する前に、試料を５０％グリセロール／水で再水和 した。次いで、試料を素早（凍結し、角度４５′″で陰にするＰＬを備えた／＜ ルザース（Ｂａｌｚｅｒｓ）　ＢＡ）・’　４００Ｄフリーズーフラクチヤー装 置を用いて破断させた。フィリップス（Ｐｈｉｌｌｉｐｓ）４１０１４子顕微鏡 でレプリカを調査した。得られた結果を第１ａ−１Ｃ図に示す。

スフ翫パ−スおよび１．Ｏｘｇ／ｚＱゼラチンの存在下では、再水相後、リポソ ームは無傷であり（第１Ｃ図）、融合も凝集も起こらず、そのサイズは凍結乾燥 前に溶液中で測定され仁サイズと同様のサイズである。媒質中、外側スクロース のみを存在させ、ポリペプチドを存在させない場合、再水和後の乾燥試料（第ｉ ｂ図）では、融合したり式ソームを示す大きな単一ラメラ構造体が多数認められ た（×２ｉ、　ｏｏｏ倍率）。第１ｂ図における倍率は第１Ｃ図の約半分である ことに注意されたい。凍結保護剤をなんら加えない場合、乾燥および再水相後、 す、ｆソームは完全に崩壊し、その内容物は多量に喪失し、大きなサイズ故に適 切な生体分布が妨げられた多重ラメラ小胞が形成された（第１ａ図）。

凍結乾燥し、再構成したリポソームの生物学的効能Ｉｎ１ｌｌの導入操作 Ｎ　Ｔ　Ａを含有する前形成させたリポソームにＩｎ−１１１を導入することを 、その脂質二重層にイオノホアＡ２３ｉ８７を存在させることによって容易にし た。６５°Ｃの温度を使用１７、ウシ血清アルブミ；・を含有するリポソームで ある以外は、モーフおよびガンベルのＡｎａｌ、　Ｂｉｏｃ、　、　９４．３０ ２−３０７（１９７９）にＨ己載のよう（こして、８０℃でＩｎ−１１１をリポ ソームに導入した。リン酸緩衝化０．９％塩化すトリウム（ｐＨ７，４０ＰＢＳ ）中、ｌ　ＱｍＭ　ＥＤＴＡｏ、１吋を添加してインキュベート反応を停止させ 、七ファデックスＧ−５０のクロマトグラフィーによ−・て、非包嚢１ｎｉｌｌ を、導入されたリボン“−ムと分離した。この操作によって、加えたＩｎ−１１ １の９０％以上が無傷の前形成リポソームに組み込まれたようである。

ＥＤＴＡを添加する前に、導入されたリポソームの溶液を、シエレブクス（Ｃｈ ｅｌｅｘ）−１００を入れた遠心管に加え、導入効率をチェ、。

りした。管を遠心した後、ガンマカウンターでｌｌｌＩｎに関して上清を計測し 、リポソームに残った放射活性％を測定した。得られた結果を第５表に示す。

脂質濃度１０ｍｇ／ｍｅの…Ｉｎ導入リポソーム試料２００μｅを尾静脈注射し て、生体分布試験を行った。８日令ＥＭＴ６腫瘍を脇腹に移植したＢ　Ａ　Ｌ　 Ｂ　／　ｃ雌性マウス（１９土１ｇ）を使用した。１つの試料に対して５匹のマ ウスに注射した。２４時間後、マウスを安楽死させ、■Ｉｎの組織生体分布試験 を行った。対照動物に、凍結乾燥していないが、本発明における添加剤を加え、 そして／またはＰＢＳのみを含有させたリポソームを注射した。肝、腫瘍、牌、 および血液を採取し、ベックマン５５００ガンマカウンターを使用′して試料を 計数した。得られた結果をこれも第５表に示す。

凍結保護剤を内側にのみ、外側にのみ、または内側と外側の両サイドに有するリ ポソームにおけるサイズの保持、および沈澱の比較砂慧 凍結保護剤を内側にのみ有するリポソーム、または外側にのみ有するリポソーム 、または内側と外側の両サイドに有するリポソームの上記の効果を試験した。９ ％（ｖ／ｖ）ラクトース（Ｌ　ａｃ）、または９％（Ｗ／Ｖ）ラクトース＋２． ５ｍｇ／ｘ（ｌゼラチン（６０ブルーム）（Ｌａｃ−Ｇｅｌ）中で、ＤＳＰＣ／ コレステロールのリポソーム試料を調製した。ＰＢＳを包嚢しているＤＳＰＣ／ コレステロールの別のリポソーム試料も使用した。これらの調製物について、リ ポソームの内側および外側の凍結保護剤または緩衝液のすべての置換を得るため にゲルクロマトグラフィーで必要とされるＰＢＳ％Ｌ　ａｃ、またはＬａｃ−Ｇ 　ｅｌと交換した。

光散乱によって各調製物の試料について平均直径を測定した後、その一部を凍結 して凍結乾燥した。次いで、得られた乾燥試料を蒸留水で再構成した。再構成し た試料すべての一部試料を１５６００６で１０分間遠心し、得られた上清におけ る平均直径を測定した。

別にすべての溶液の一部試料を取り、高速液体クロマトグラフィーによってコレ ステロール濃度を測定し、遠心後の上清の類似の試料についてもコレステロール 濃度を測定した。これらの濃度分析によって、凍結乾燥後に沈澱した物質の％を 得た。得られた結果を第６表第１表には、試験した凍結保護剤候補物質について の定量試験結果を示している。プラス（＋）は、個々の試験のポジティブ結果を 示している。マイナス（−）は、沈澱、または完全に再懸濁できなかったことか ら不満足であった結果を示すものである。活性物質（群）の添加の際に、または 凍結／解凍時に試料がマイナスを示した場合は、その活性物質についてはさらに 実験を行わなかった。３つすべての試験を合格することができた凍結保護剤のみ が、本発明の、糖とタンパク質、ポリペプチドおよび／またはオリゴペプチドと の組合わせ物である。

第２表は、ウシ血清アルブミン（Ｂ　Ｓ　Ａ）、血清およびラクトースが種々の 濃度で存在する条件下における、６−カルポキシフルオレスセインのリポソーム に関する保持％を示すものである。低い保持能の値はリポソームが崩壊したこと を示す。糖とタンパク質、ポリペプチドおよび／またはオリゴペプチドとが共に 存在しない場合、凍結乾燥によってリポソームは破壊され、漏出する（９０％保 持より低い）。

第３表および第４表は、凍結乾燥後における、種々の濃度のタンパク質またはア ミノ酸＋ジサッカライドによる粒子サイズの変化を示すものである。再構成後に サイズが増大することは、リポソームが凝集および／または融合したことを意味 する。粒子サイズのデータは、凍結保護作用には少なくとも２５ｚｇ／ａ（ｌの ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）７９％ジサッカライドが必要であるが、他方わず か２．５ｍｇ／ｘ（ｌのゼラチン／９％ジサッカライドがリポソームを保護する ように機能することを示している。凍結乾燥を行らていないＳＵＶのラクトース 溶液は、平均直径約５０ｎ＊を有している。凍結乾燥し、再構成したこの同一の 試料では沈澱を生じ、遠心前の平均直径は１０４．９ｎａであり、遠心後の上清 中におけるそれは８８．３１■である。このような沈澱の存在および平均サイズ の大きな変化は、注射用のリポソーム調製物として許容できるものでない。

２．５ｚｇ／ｗＱ濃度のウシゼラチンおよび牛乳に一カゼインでは検視できる沈 澱を生ぜず、遠心前の平均直径は５７　５８ｎｓであり、遠心後の平均直径は５ ３−５４ｎ−であった。濃度ＬＯｘｇ／ｍｅの魚皮ゼラチンは、直径が遠心前お よび遠心後でそれぞれ５７．５および５６．２％ｍと、殆ど同様に有効であった 。２．５ｘｇ／ｘにｌ濃度の魚皮ゼラチンでは、異常な結果が得られ、遠心後に より大きな平均直径を示した。カゼイン−〇−グリコペプチドは、凍結乾燥およ び再構成後に、リポソームを沈澱から保護することはできなかった。

第４表は、アミノ酸はに一カゼインの主要な構成成分ではあっても、たとえばポ リペプチドと同一の、またはそれより以下の重Ｉ１１度のリポソームの凍結保護 作用を示さないことを示している。

第５表は、妓っかの種々の試料についての生体分布結果を示している。導入およ び生体分布試験を行うことは、リポソームの生存性を評価する」二で重要である 。低い導入値（く７５％）は、Ｉｌｌ　ｌ　、に関し、リポソームの内側のＮＴ Ａに匹敵する外部溶液中のＮ　ＴＡが提供される程のリポソームの崩壊を意味し ている。注射した用量の回収％によって通常、循環系におけるリポソームの１強 度」が測定される。対照レベルに匹敵する低い値は、試料がリポソーム二重層に 部分的に障害を与えたことを示唆し、得るであろう。凍結乾燥したＢＳＡ／糖リ ポソームは、比較的低い注射用量の回収％を示し、他方ゼラチン／糖の凍結乾燥 リポソームは非凍結乾燥リポソーム調製物と同様に良好な生体分布を行う。

Ｉｌｌ　１　ｎ取り込みの腫瘍／肝の比率は、リポソーム挙動の従来からの重要 な試験である。正常の非凍結乾燥リポソーム調製物では約１゜２以上の値である ことが見いだされている。ゼラチンおよびラクトースを含有する凍結乾燥したリ ポソーム調製物を再構成し２て数時間以内に試験すると、良好な腫瘍／肝の比率 、および他のパラメーターについても正常値が得られた（第５表）。

上記の結果は、糖と少、ナクとも１つのタンパク質、ポリペプチドおよび／また はオリゴベゾチドとが共に存在した場合に、ＤＳ　ＰＣ：コレステロールのリポ ソームの凍結乾燥が最も成功したこトラ示している。ラクトースおよびヌクロー スは、同じく良好に機能し、他のジ号ツカライド、たとえばトレハロースおよび マルトースも本発明に有益性を提供するものである。ゼラチンおよびカゼインは 、凍結乾燥のための最も良好な′Ｉテリペブ・チドであることが見いだされた。

リボソー・ムを保存させるために９％糖と組み合わせるに当たっては、要は、ゼ ラチンまたはカゼイン２−５　ｚ　ｇ　／　ｘ（！濃度が必要であるのみである 。

第６表は、ＰＢＳ緩衝液が外側リポソームすべての場合で８４％以上の沈殿が生 じるが、外側溶液中に９％（實／ｖ）ラクトースを含有させると、３つの試料の 内２つで沈澱が抑制された。しかし、すべての試料について、再構成後の平均リ ポソーム直径が５０％以上増大したことから証明されるように、外側のみのラク トースでは、凝集を抑制するのに十分ではなかった。

Ｌ　ａｃ−Ｇ　ｅｌを外側に存在させた場合、すべての場合で沈澱は１０％以下 であり、平均直径は２３％以下の増大であった。Ｌ　ａｃ−Ｇ　ｅｔを内側およ び外側の両サイドに存在させた場合、リポソームのサイズは再構成後も、実質的 に同一であった。

第１表 脂質濃度２５ｘｇ／峠（ＤＳＰＣ：コし・ス引ロール−２：１）の凍結保護剤候 補物質の試験結果 試料　活性物質°）　凍結／　凍結乾燥およ」衆１ム易、亙紛月−、−Ｑｌ癒加 猜−−−二眸逮講−μ■ス戊迷、−５ｍＭリン酸緩衝化食塩水　↓　−ｂ１２５ ｄ　Ｃａ”　４−　− 低ｐｌ（４，０＋　− 高ｐＨ１０，０−＝　− ５−Ｍトリス緩衝化食塩水（０９％）十−５ａＭ　トリス緩衝化デ率ストａ−ス （５％）＋−５１トリスｖｊ術化ラクトース（９％）　十　へ５％デキストロー ス（５ｍｋｌ　Ｐｉ）　＋　−９％ラクトース（５ｄ　Ｐｉ）　＋　＋　−９％ スクロース（５ｄＰｉ）　＋　十−１Ｏ％トメチルピロリドン　−）−− グリセロール（１０肩ｇ、／ｘＱ、）　＋　十−グリセロール（１０ｘｇ＃Ｃ） ／９％９％ラクトース　十　−ＰＥＧ”４００（ｌＯｍｇ／ＲＣ）　＋　−ＰＥ Ｇ１４５０（１０ｉｇ＃＋ｆ２）　−ＰＥ０３３５０（１０ｚｇ／ＩＬＱ）　〜 ＰＥＧ４０００（１０肩ｇ／ｘの　− ＰＥ０８０００（１０Ｉｇ／ｍの　− デキストラン４０．０００（１０ｍｇ／瀧１２）−デキストラン５００．　Ｇｏ ｏ（１０膚ｇ／廣ｅ＞　−ポリビニルピロリドン（ｌＯｓ＋ｇ／ｘの　＋　＋　 −フィコール（Ｆｉｃｏｌｌ）（ｌＯｓ＋ｇ／ｍ１２）　＋　＋　−ヒドロキシ エチルセルロース（１０ｍｇ／＋＋＋＆）　−血清”（２０ｍｇ／ｍ１７）　＋ 　＋　−ウシ血清アルブミン（２５履ｇ／ｉ＋ｉ２）　＋　４−　−ゼラチン” （１０ｍｇ／ｓ＋Ｑ）　＋　＋　−９％ラクトース／２０％血清　＋　＋　＋９ ％ラクトース／アルブミン（２５屓ｇ／１１の　＋　＋　＋９％ラクトース／ゼ ラチン（５，Ｏｍｇ／酎）＋＋＋９％＋９％ラクトース／ゼラチンｘｇ７ｍの　 ＋　＋　＋ａ）＋：元の定量的溶液特性を保持していることを示す。

−二種々の分析方法によって測定されるように、リポソームを安定化できないこ とを示す。

ｂ）各試験段階において凍結保護剤がマイナスを示した場合、その凍結保護剤を 使用してはさらに試験を行わなかった。

Ｃ）ポリエチレングリコール。

ｄ）ウシ胎仔血清 ｅ）［ノックス（Ｋｎｏｘ）Ｊゼラチン。

！ｚ表 脂質濃度２５ｓ＋ｇ／ｍＮの９％ラクトース（外側のみ）のリポソームにお６す るカルボキシフルオレスセイン放出によって測定した、凍結乾燥に対するリポソ ームの安定性 ｇｕ　ａ川４１μｍ鼾東截懇粕μ格 対照（９％ラクトースのみ）　７２．５９％ラクトースおよび２０％血清　９８ ．８９％５り）−ス＃ヨヒ２５ｍｇ／ｌｌ２ＢＳＡ　９７．８９％ラクトースお よび１０ｍｇ／酎ＢＳＡ耐　９７．０９％ラクトースおよび５ｊＩｇ／蛙ＢＳＡ 　９５゜８脂質濃度２５ｍｇ／ｍＱのＰＢＳ中リポソーム（ジサ・ツカライド無 し）対照（ＰＢＳのみ）　７９” ２０％血清　８２ ２５屓ｇ／ｘＱＢＳＡ　１８ ２０＋ｇ＃＋１２Ｂ　Ｓ　Ａ　０ １０＊ｇ／ｍＱＢ　Ｓ　Ａ　４４ ５ｍｇ／１ＱＢｓＡ　、　７９ ａ）実験毎に広範囲に変動した。

！Ｊ孝 脂質濃度２５ｚｇ／ｚＱにおいて、蒸留水で再構成した後の凍結乾燥リポソーム にかかるレーザー粒子サイズのデータ未遠心　遠心済み 対照　４８．０　４９．９ （９％ラクトース外側リポソーム、 凍結乾燥せず） ９％ラクトース　１０４．９　８８．３９％ラクトースおよび２，５賓ｇ／酎　 ５８．１　５３．０ゼラチン（６０ブルーム） ９％ラクトースおよび　５７．０　５３．８２．５ｚｇ／ｘＱ　ｋ−カゼイン ９％ラクトースおよび　５８，９ ４９．７ ２　、５　＊ｇ／ｘ＆魚皮ゼラチン ９％ラクトースおよび２．５ｍｇ／、ｙｔＱ　２８４．１　９６．１カゼイン− 〇−グリコペプチド ９％ラクトースおよび１．Ｏｚｇ／ｍＱ　７２．２．　６４．９ゼラチン（６０ ブルーム） ９％ラクトースおよび　６５．４　６７．１１．０寓ｇ／畦に一カゼイン ９％ラクトースおよび　５７．５　５６．２１　、　ＯｘｇｌｘＱ魚皮ゼラチン ９％ラクトースおよび１．Ｏｘｇ／ＩＱ　８６．２　８２．５カゼイン−〇−グ リコペプチド 第４表 プロリン　６　７８．５ グリシン　７−９　１４４ アラニン　３−５　７０．９ グルタミン酸　７−９　５３．３ イソロイシン　８　７３．８ メチオニン　７ バリン　６　７６．１ セリン　７　７４．５ ０イシン　７　５６．９ １）　１５．６００ｙの遠心１０分後における等級Ｏ（ベレット無し）から等級 ９（重いペレット）までを意味する。

２）遠心後の上清を測定した。

第５表 腫瘍／肝　％ＩＤ 実験　試料　導入効率　比率　回収 Ａ、１．対照５／８／８６”　１０９％　１．３８　３５．４２、凍結乾燥した ９％ラクトース７９８％　１．２４　３１．０５肩ｇ／＊（ｌゼラチン ３、凍結乾燥していない９％ラク　１０１％　１．３０　３５．７トース／　５ 　ｘｇ／ｘＱゼラチン Ｂ、１．対照５／１５／８６　９８％　１．４２　３６．２２、凍結乾燥した９ ％ラクトース７９６％　１．３２　３５．８２　、５　ｍｇ／ｘ（ｌゼラチン ３、凍結乾燥していない９％ラク　８９％　１．１８　３５．３ドース／　２　 、５　ｚｇｈ（ｌゼラチンＣ８１，対照３／２７／８６　８２％　！、３９　３ ４．８２、凍結乾燥した９％ラクトース７８６％　１．１２　３０．１５　ｘｇ ｈｔＱ　Ｂ　Ｓ　Ａ ａ）対照試料は、凍結保護剤を添加せずに、凍結乾燥したリポソームである。

凍結乾燥および再構成後におけるリポソームの平均直径および沈澱（リポソーム の内側の糖およびポリペプチドの存在に対する依存性）平均サイズ（ｎａ）”　 沈澱％・ν 試料１　凍乾前　凍乾後 ＰＢＳ内側ＰＢＳ外側　６８　ｄ　９４．５ＰＢＳ内側Ｌａｃ外側　６８　１３ ２　０ＰＢＳ内側Ｌ　ａｃ−Ｇ　ｅｌ外側　６ｆ！ｌ　８３　０Ｌａｃ内側ＰＢ Ｓ外側　５９　ｄ　８９．９Ｌａｃ内側Ｌａｃ外側　５９　１０６　５２．５Ｌ ａｃ内側Ｌ　ａｃ−Ｇ　ｅｌ外側　５９　４８　９．ＩＬ　ａｃ−Ｇ　ｅｌ内側 ＰＢＳ外側　５９　ｄ　８４．ＩＬ　ａｃ−Ｇ　ｅｌｌ内側Ｌａ性外側　５９　 ８９　０Ｌ　ａｃ−Ｇ　ｅｌ内側Ｌ　ａｃ−Ｇ　ｅｌ外側　５９　６０　７．６ ａ）リポソームをモル比率２：１のＤＳ　ＰＣおよびコレステロ−およびコレス テロール５ｘｇ／ｘＱ）であ・ンｔこ。Ｌｉｅは９％（ｖ／ｖ）ラクトースであ り、Ｌ　ａｃ−Ｇ　ｅｌは９％ラクトース（ｖ／ｖ）および２．５ａｇ／ｌＱゼ ラチン（６０ブルーム）である。

ｂ）レーザー光散乱測定法。容量加重がウス平均直径（ｖｏｌｕｍｅ　ｗｅｉｇ ｈｔｅｄ　Ｇａｕ＋＋５ｉａｎ　＠ｅａｎ　ｄｉａｍｅｔｅｒ）を記載している 。

Ｃ）リポソームのコレステロールについて、全試料および１５６００Ｇの遠心１ ０分後の上清を検定することによって、再構成後の沈澱を測定した。沈澱％値は 以下の等式から計算した；負の数はＯに丸める。

ｄ）試料におけるすべてのまたは大きなフラクシツンの沈澱によって、光散乱デ ータが得られなかった。

国際調査報告

Claims (40)

【特許請求の範囲】
1. １．リボソームを乾燥する際に核リボソームの内部および外部に存在し、少なく とも１つの糖ならびに少なくとも１つのタンパク質、ポリペプチドおよび／また はオリゴペプチドとの組合わせ物を含有する水性媒質中のリボソームからなる、 乾燥時にリボソームを安定化させるための保護調製物。
2. ２．リボソームがリン脂質分子から構成される請求項１に記載の調製物。
3. ３．タンパク質がアルブミンである請求項１に記載の調製物。
4. ４．ポリペプチドがゼラチンまたはカゼインである請求項１に記載の調製物。
5. ５．タンパク質、ポリペプチドおよび／またはオリゴペプチドとリン脂質との重 量比が約１：１００から約２：１である請求項２に記載の調製物。
6. ６．タンパク質がアルブミンであり、アルブミンとリン脂質との重量比が約１： １である請求項５に記載の調製物。
7. ７．ポリペプチドがゼラチンであり、ゼラチンどリン脂質との重量比が約１：１ ０である請求項５に記載の調製物。
8. ８．ポリペプチドがカゼインであり、カゼインとリン脂質との着量比が約１：１ ０である請求項５に記載の調製物。
9. ９．糖がスクロース、トレハロース、ラクトース、マルトースおよびグルコース の中から選ばれる請求項１に記載の調製物。
10. １０．糖とリン脂質との重量比が約０．５：１から約１０：１である請求項２に 記載の調製物。
11. １１．糖がラクトースであり、ラクトースとリン脂質との重量比が約４：１であ る請求項１０に記載の調製物。
12. １２．糖がスクロースであり、スクロースとリン脂質との重量比が約４：１であ る請求項１０に記載の調製物。
13. １３．糖濃度が約２．５％から約１５％（ｗ／ｖ）であ請求項１に記載の調製物 。
14. １４．タンパク質がアルブミンであり、２５ｍｇ／ｍｌアルブミンを９％糖と混 合する請求項１に記載の調製物。
15. １５．ポリペプチドがカゼインであり、２．５ｍｇ／ｍｌカゼインを９％（ｗ／ ｖ）糖と混合する請求項１に記載の調製物。
16. １６．ポリペプチドがゼラチンであり、１．０ｍｇ／ｍｌゼラチンを９％（ｗ／ ｖ）糖と混合する請求項１に記載の調製物。
17. １７．ポリペプチドがゼラチンであり、２．５ｍｇ／ｍｌゼラチンを９％（ｗ／ ｖ）糖と混合する請求項１に記載の調製物。
18. １８．リボソームを乾燥する際に該リボソームの内部および外部に存在する水性 媒質であって、該外部水性媒質が少なくとも１つの糖と少なくとも１つのタンパ ク質、ポリペプチドおよび／またはオリゴペプチドとの組合わせ物を含有し、か つ該リポソームの内部水性媒質が少なくとも１つの糖または任意であるが少なく とも１つのタンパク質、ポリペプチドおよび／もしくはオリゴペプチドを含有す ることある核水性媒質中のリボソームからなる、乾燥時にリボソームを安定化さ せるための保護調製物。
19. １９．リボソームがリン脂質分子から構成される請求項１８に記載の調製物。
20. ２０．タンパク質がアルブミンである請求項１８に記載の調製物。
21. ２１．ポリペプチドがゼラチンまたはカゼインである請求項１８に記載の調製物 。
22. ２２．タンパク質、ポリペプチドおよび／またはオリゴペプチドとリン脂質との 重量比が約１：１００から約２：１である請求項１９に記載の調製物。
23. ２３．タンパク質がアルブミンであり、アルブミンとリン脂質との重量比が約１ ：１である請求項２２に記載の調製物。
24. ２４．ポリペプチドがゼラチンであり、ゼラチンとリン脂質との着量比が約１： １０である請求項２２に記載の調製物。
25. ２５．ポリペプチドがカゼインであり、カゼインとリン脂質との重量比が約１： １０である請求項２２に記載の調製物。
26. ２６．糖がスクロース、トレハロース、ラクトース、マルトースおよびグルコー スの中から選ばれる請求項１８に記載の調製物。
27. ２７．糖とリン脂質との重量比が約０．５：１から約１０：１である請求項１９ に記載の調製物。
28. ２８．糖がラクトースであり、ラクトースとリン脂質との重量比が約４：１であ る請求項２７に記載の調製物。
29. ２９．糖がスクロースであり、スクロースとリン脂質との重量比が約４：１であ る請求項２７に記載の調製物。
30. ３０．糖濃度が約２．５％から約１５％（ｗ／ｖ）である請求項１８に記載の調 製物。
31. ３１．タンパク質がアルブミンであり、２５ｍｇ／ｍｌアルブミンを９％糖と混 合する請求項１８に記載の調製物。
32. ３２．ポリペプチドがカゼインであり、２．５ｍｇ／ｍｌカゼインを９％（ｗ／ ｖ）糖と混合する請求項１８に記載の調製物。
33. ３３．ポリペプチドがゼラチンであり、１．０ｍｇ／ｍｌゼラチンを９％（ｗ／ ｖ）糖と混合する請求項１８に記載の調製物。
34. ３４．ａ）少なくとも１つの糖、または少なくとも１つのタンパク質、ポリペプ チドおよび／もしくはオリゴペプチド、または少なくとも１つの糖と少なくとも １つのタンパク質、ポリペプチドおよび／もしくはオリゴペプチドとの組合わせ 物から構成される保護溶液を調製し、 ｂ）該保護溶液を脂質と接触させ、 ｃ）保護溶液を中に包裏したリボソームを生成させ、ｄ）該生成リポソームを、 少なくとも１つの糖と少なくとも１つのタンパク質、ポリペプチドおよび／また はオリゴペプチドとを含有する溶液と接触させ、 ｅ）次いで、得られたリボソームを乾燥することを特徴とする、リボソーム乾燥 時に該リボソームを安定化させるための方法。
35. ３５．リボソームの乾燥方法であって、１）少なくとも１つの糖と少なくとも１ つのタンパク質、ポリペプチドおよび／またはオリゴペプチドとを該リボソーム の外部の水性媒質中に含有し、かつ少なくとも１つの糖、または少なくとも１つ のタンパク質、ポリペプチドおよび／もしくはオリゴペプチドまたは少なくとも １つの糖と少なくとも１つのタンパク質、ポリペプチドおよび／もしくはオリゴ ペプチドとの組合わせ物を該リポソームの内部の水性媒質中に含有するリボソー ムの分散液を調製し、２）次いで、得られたリボソーム分散液を乾燥することを 特徴とする方法。
36. ３６．少なくとも１つの糖と少なくとも１つのダンバク質、ポリペプチドおよび ／またはオリゴペプチドとを含有する水性媒質中でリポソームを乾燥することを 特徴とするリポソームの乾燥方法。
37. ３７．少なくとも１つの糖と少なくとも１つのタンパク質、ポリペプチドおよび ／またはオリゴペプチドとをさらにリポソームの内部水性媒質中に含んでいる請 求項３６に記載の方法。
38. ３８．リボソームが脂質から構成され、糖と脂質との重量比が約０．５：１から 約１０：１である請求項３４、３５、３６または３７に記載の方法。
39. ３９．乾燥が凍結乾燥である請求項１から請求項１８に記載の調製物。
40. ４０．乾燥が凍結乾燥である請求項３４、３５、３６または３７に記載の方法。