JPH02503558A - リポソーム／ドキソルビシン組成物および方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、新規なリポソーム／ドキソルビシン組成物および方法に関し、詳しく は、凍結乾燥された形態で長期間貯蔵可能で、リポソームが選択された粒径を有 しかつリポソームに封入されたドキソルビシンが８５〜９５％である注射用懸濁 液に再構成し得る組成物に関する。

２、参照文献 Ａｕｂｅｌ−Ｓａｄｒｏｎ、　Ｇ、ら、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｅ、　６６巻、３３ ３頁、　１９８４年；Ｆｏｒｓｓｅｎ、　　Ｅ、Ａ、ら、　　Ｐｒｏｃ、　　Ｎ ａｔ　Ａｃａｄ、　　Ｓｃｉ、　　ＵＳＡ　７８（３）巻。

１８７３頁、　１９８１年； Ｇａｂｉｚｏｎ、　Ａ、ら、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、　４２巻、　４７３４頁 、　１９８２年；Ｇａｂｉｚｏｎ、　Ａ、ら、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、　４３ 巻、　４７３０頁、　　１９８３年；Ｇｏｏｒｍａｇｈｔｉｇｈ、　　Ｅ、ら、 　　Ｂｉｏｃｈｅｎ　Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ａｃｔａ、　　７７９巻。

２７１頁、　１９８４年； Ｇｕｔｔｅｒｉｄｇｅ、　Ｊ、Ｍ、Ｃ１，Ｂｉｏｃｈｅａ＋　Ｐｈａｒｍ、　３ ３００巻、　１７２５頁。

１９８４年ａ； Ｊｕｌｉａｎｏ　Ｒ９Ｌ、ら、　Ｂｉｏｃｈｅｏ＋　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、　２ ７巻、２１頁、　　１９７８年：Ｐｏｚｎａｎｓｋｙ、　Ｍ、Ｌ、ら、　Ｐｈａ ｒｍ　Ｒｅｖｓ、　３６（４）巻、２７７頁、　　１９８４年；Ｓｕｎａｍｏｔ ｏ、　Ｊ、ら、　Ｂｉｏｃｈｅｓ　Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ａｃｔａ、　８３３巻、１ ４４頁。

１９８５年： ５ｚｏｋａ、　Ｐ、ら、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ　（ＵＳＡ ’ｓ　７５巻、　４１９４頁。

１９７８年： ５ｚｏｋａ、　Ｆ、ら、　Ａｎｎ　Ｒｅｖ　Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ｂｉｏｅｎｇ、　 ９巻、４６７頁、　　１９８０年；Ｙｏｕｎｇ、　ＲｏＣｌら、　Ｎ　Ｅｎｇ　 Ｊ　Ｍｅｄ、　３０５巻、１３９頁、　１９８１年。

３、発明の背景 ドキソルビシン（ＤＸＲ＞は、広スペクトルの新生物に対して効果的な効力の高 い化学療法剤である（Ａｕｂｅｌ−３ａｄｒｏｎらおよびＹｏｕｎｇ　）。しか し、この薬剤を遊離の形態で臨床に使うことは、倦怠感、吐気、嘔吐、骨髄抑制 および重篤の脱毛症を含む重篤な副作用と急性毒性のために制限されている。さ らに２反復投与すると、累積的で回復不能の心臓の損傷が起こり、そのため、治 療が置引いた場合には、この薬剤の使用は著しく制限される（Ｙｏｕｎｇ）。

インビボでのＤＩＲの毒性に対して用いられてきた方法は。

この薬剤を、リポソーム封入形で投与する方法である。動物実験、そして最近の 臨床試験により、リポソーム結合形のＤＩＲが、その動物腫瘍に対する治療効力 を保持し、死亡率の低下および心臓毒性作用の減少からみて著しく毒性が少なく なっていることが示される（Ｆｏｒｓｓｅｎ、　Ｇａｂｉｚｏｎ、　１９８５年 ）。リポソームの薬剤保護効果は、少なくとも一部は９組織の性質と。

注射された薬剤の薬剤放出速度が著しく変化することによる（Ｇａｂｉｚｏｎ　 、　１９８２年；　Ｇａｂｉｚｏｎ、　１９８３年；　Ｊｕｌｉａｎｏ）。

最近の動物モデル実験によってＤＸＲ／１７ポソームの治療作用が増大し毒性が 減少するのに重要な３つの要因が指摘されている。その１つはリポソームの粒径 である。リポソームの機能として、静脈投与後のＤＸＲ／リポソームの生体内分 布および薬剤のクリアランスの測定を目的とする研究が行われている（Ｇａｂｉ ｚｏｎ　、　１９８２年、　１９８３年および１９８５年１２月６日出願の米国 特許出願第８０６．０８４号“リポソーム／アントラキノン薬剤組成物および方 法”）。その結果を要約すると次のとおりである：平均粒径が約０．１〜０．２ のＤＩＲ／リポソームによって、遊離の薬剤の場合と比較して、肝臓および膵臓 内の薬剤濃度が増大し、そして心臓、肺、腸、腎臓および骨格筋における薬剤濃 度が減少することが認められた。したがって、上記粒径のリポソームは、肝臓と 膵臓とに局在する腫瘍の治療と、非標的組織、特に心臓の薬剤濃度に関連する毒 性を減少させるのに特に有利である。上記粒径のリポソームはまた。

肝臓および膵臓組織の薬剤クリアランスが遅いことを示す。

小さな単層小胞（約０．０３〜０．０８のサイズ範囲）の生体内分布および薬剤 クリアランス率は、大きなリポソームと遊離の薬剤とのそれの中間であった。

種々の理由から、リポソームの最適サイズの上限は、約０．５ミクロンで好まし くは約０．２〜０．３ミクロンである。第１に。

肝臓の洞様毛細血管と実質組織、膵臓および骨髄のような所望の標的組織の領域 は、約０．２〜０．３ミクロンより小さいリポソームにとっては接近しやすい領 域である。第２に、０．２〜０．３ミクロンのサイズの範囲のリポソームは、深 層フィルターによる濾過によって容易に滅菌することができる。この粒径の小胞 はまた。貯蔵中凝集する傾向を殆ど示さないので９組成物を非経口投与する場合 に起りつる厳しい問題が少ない。最後に、１ミクロンより小さい（サブミクロン の）範囲の粒径にしたリポソームは、より均一な生体内分布と薬剤クリアランス の特性とを示す。その理由は、このリポソームはより均一な粒径を有するからで ある。

治療効力に対して重要なりＸＲ／Ｕボソームの第２の特性は。

貯蔵中に起こりうる場合がある。脂質および薬剤成分の化学的分解の程度である 。リン脂質の分解は、脂肪族アシル鎖基の加水分解による放出および脂質の（特 に脂質のアシル鎮部分における不飽和結合領域の）過酸化による損傷の形態を取 ることがある（Ｇｕｔｔｅｒａｇｅ　、　１９８４年；　Ｓｕｎａｍｏｔｏ）　 、さらに。

ＤＩＲのようなアントラキノン形の薬剤は、それ自体が酸化反応を開始できるし く　Ｇｏｏｒｍａｇｈｔｉｇｈ　、　１９８４年；　にｕｔｔｅｒｉｄｇｅ。

１９８４年ａ）、脂質の存在下で、フリーラジカル反応／酸化反応に寄与してい るようであり、そしてまた、上記米国特許出願“リポソーム／アントラキノン薬 剤組成物および方法”に報告されているように、貯蔵中に、リポソーム内に、急 速な化学変化を受ける。

上記特許出願を支持するために行われた研究において、α−トコフェロールのよ うな脂質溶解性の遊離ラジカル失活剤と、デスフェラルのような水溶性のトリヒ ドロキサム酸のキレート剤との共存によって、脂質および薬剤成分の過酸化によ る損傷が、上記のどちらかの保護剤だけで与えられる個々の保護作用の合計より はるかに大きく減少することが見い出された。この保護効果の主な特性には、容 易には過酸化反応を触媒しないような形に３価の鉄をキレート化する作用が。

親油性失活剤による脂質相の遊離ラジカルの失活と組合わされて含まれるようで ある。

ＤＸＲ／　リポソーム処方物の毒性は、該処方物中の遊離の薬剤濃度（％）に影 響されやすい。臨床試験の測定値は、中程度のレベルの遊離薬剤（約３５％）を 含有するＤＸＲ／ＩＪボソームは、５０■／　ｍ’の投与量で、低い遊離薬剤濃 度（１０〜１５％）のＤＸＲ／Ｕボソームを７０■／ｍ″の投与量で投与した場 合よりもかなり大きな毒性を生じることを示している。ＤＸＲ／リポソーム処方 物から遊離のＤＸＲを除去するのに利用し得る方法には次のような種々の方法が 含まれる。つまり、遠心分離。

透析濾過９分子ふるいクロマトグラフィーによる濾過、および米国特許第４．４ ６０．５７７号に開示されているようなイオン交換樹脂による濾過が含まれる。

これらの方法は、新たに調製したＤＸＲ／　！Ｊボソーム処方物中の遊離薬剤の レベルを、全ＤＸＲの１０％またはそれを下まわる値に減少させるのに有効であ る。

しかし、溶液中に貯蔵すると、脂質および薬剤の酸化による損傷が起こるにつれ て、遊離の薬剤が徐々に放出される。ＤＸＲ／リポソームを乾燥状態で貯蔵する 通常の凍結乾燥および再構成法では、再構成する際に遊離薬剤がかなり放出され る。

本発明を支持するために行った実験によれば、従来の凍結乾燥および再構成法で は、リポソームと結合したＤＸＲがかなり放出され、典型的には、再構成された リポソーム懸濁液中には２０〜３０％の遊離薬剤が存在する。

４、発明の要約 したがって１本発明の一般的な目的は９選択されたリポソームサイズ特性を有し 、長期間貯蔵しても安定で、かつリポソームと結合した形態で少なくとも約８５ 〜９５％のＤＸＲを含有するＤＸＲ／リポソーム処方物を提供することにある。

本発明に関連した目的は、そのような処方物を調製するのに用いられる凍結乾燥 リポソーム組成物およびリポソーム濃縮物を提供することである。

本発明の他の目的は、長期間貯蔵した後にも、あらかじめ選択されたサイズを有 し遊離ＤＸＲが比較的少量で、酸化による損傷が最小である。　　ＤＸＲ／＋７ ボソームを調製する方法を提供することにある。

本発明には、１つの態様としては９次のような凍結乾燥されたドキソルビシン／ リポソーム組成物が含まれる。

この凍結乾燥されたドキソルビシン／リポソーム組成物は。

所定容量の水性媒体で再構成された場合にリポソーム濃縮物を与える組成物であ って。

ａ、リポソームの濃度が約１００ｍＭリポソーム脂質より大きく。

ｂ、リポソームサイズが主として約０．１〜０．５μの選択されたサイズ範囲内 にあり。

ｃ、ｌＪボソームで封入されたＤＸＲが、約２〜１０モル％の脂質濃度において 、全ＤＸＲの約８５％〜９５％であり、そして。

ｄ、凍結防止剤が約１％と１０％との間で含有されている。

ことにより特徴づけられる。

好ましい態様においては、上記の組成物は、低い浸透圧モル濃度の媒体もしくは 蒸留水が再構成されて、生理的浸透圧モル濃度に近い濃縮物を与える。好ましい 凍結剤防止剤はトレハロースもしくはラクトースであり、濃度は約５％が好まし い。

他の態様においては１本発明には、上記組成物を再構成することによって形成さ れるロＸＲ／リポソーム濃縮物が含まれる。その濃縮物は、生理的浸透圧モル濃 度のものが好ましく。

さらに親油性の遊離ラジカル失活剤と、水溶性の鉄枠異的キレート化剤とを含む ように処方し、遊離ラジカルと、酸化による損傷（最初にリポソームを製造して 貯蔵したときに、そして再構成した後に起こり得る）と、を最少にする。

本発明はさらに、癌の化学治療中に静脈投与するのを目的とする。リポソームと 結合した形態であり８５〜９５％のＤＸＲを含有するＤＸＲ／リポソームを製造 する方法を包含する。この方法は、まず次の事柄によって特徴づけられるリポソ ーム分散液を調製することを包含する： ａ、リポソームサイズが主として約０．１〜０．５μの選択されたサイズ範囲内 にあり。

ｂ、リポソームで封入されたＤＸＲが、約２〜１０モル％のリポソーム脂質濃度 において、リポソーム結合ＤＸＲの約９０％を越える割合であり、そして。

Ｃ９凍結防止剤が約１％〜１−％で含有されている。

上記の分散液は、生理的浸透圧モル濃度で１００ｍＭより大きい脂質濃度に調製 するのが好ましい。この分散液は、凍結乾燥して貯蔵し１次いで水性媒体および 好ましくは蒸留水を添加して再構成することによって、少なくとも約１００ｍＭ の脂質濃度を有する再構成濃縮物が得られる。この濃縮物中の遊離薬剤の濃度（ ％）は、典型的には、もとの分散液のそれよりも約５％高い。再構成されたＤＸ Ｒ／ＩＪポソームは、生理食塩水のような注射用媒体で希釈され、静脈注射用に 適したＤＸＲ／リポソーム懸濁液が形成される。得られた希釈懸濁液中の遊離Ｄ ＸＲの割合（％）は、再構成されたものとほぼ同様である。

本発明の上記およびその他の目的と特徴は９本発明の以下の詳細な説明からより 一層明らかになるであろう。

本発明のＤＸＲ／ＩＪポソームの濃縮物および懸濁液は、濃縮され、あらかじめ 凍結乾燥されたリポソーム分散液から調製される。その調製法はこの章で述べる 。懸濁液は種々の方法で調製され得るが、２つの方法が強調される。その方法は 。

（１）薄膜水和を行い９次いでサイズ分類を行ない、遊離薬剤を除いて懸濁液を 濃縮する処理を行う方法と：（２）高濃度の分散液を生成する新規な方法による 溶媒噴射法である。

Ａ、リポソーム分散液の成分 分散液のＤＸＲ／ＩＪボソームは、標準的な小胞形成脂質で形成される。これら 脂質としては一般に以下の物質が包含される：ホスファチジルコリン（ＰＣ）の ような中性のリン脂質；ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、ホスファチジル セリン（ＰＳ）。

ホスファチジルイノシトール（Ｐｌ）およびホスファチジン酸（ＰＡ）のような 負の電荷を有するリン脂質；硫酸コレステロールおよびコレステロールヘミスク シナートのような負の電荷を有するステロール類；およびコレステロールのよう なステロール類。脂質の選択は、（ａ）血清中での薬剤放出率、（ｂ）薬剤封入 効率、（Ｃ）ＩＪボソームの毒性、および（ｄ）生体内分布性および標的性を考 慮することによって行われる。インビボでの薬剤放出率、薬剤封入効率およびリ ポソーム毒性に対するリン脂質およびコレステロール成分の影響を、前記特許願 “リポソーム／アントラキノン薬剤組成物とその製造法”を支持するために実施 した研究において調べた。これらの研究の結果を要約すると次のとおりである。

１、ＰＧ、　ＰＳおよびＰＩのような負の電荷を有するリン脂質は。

５０％血漿へのＤＸＲ放出量により測定・評価すると、薬剤リポソームの安定性 を高める作用がある。負の電荷を有する脂質の最適濃度は約１０〜３０モル％で ある。

２、コレステロールは、血漿へのＤＩＲ放出量で測定した場合には、約２０〜５ ０モル％の濃度が、ＰＣ！Ｊボソーム内へのＤＸＲの保持率を２〜３倍増大させ るが、負の電荷を有するリン脂質が存在する場合には、安定化効果が小さい。

３、コレステロールは殆んど効果がないが、負の電荷を有するリン脂質は、薬剤 封入効率を高めるようである。

４、飽和脂質は、酸化による損傷を受けてその結果貯蔵中に毒性が増大すること が少ないが、飽和アシル鎮部分を有するリン脂質で主として構成されているリポ ソームは、対応する不飽和アシル鎮成分で構成されているリポソームより毒性が 高い。

好ましいリポソーム組成物は、約３０〜７０モル％のＰＣ，２０〜５０モル％の コレステロールおよび１０〜１５モル％の負の電荷を有するリン脂質もしくはス テロールを含有している。

リポソーム内での脂質およびＤＸＲ成分間の相互作用、およびＤＸＲ／Ｕボソー ム内の遊離ラジカルの反応と脂質の過酸化反応とを阻止する保護剤の効果も、前 記の特許出願に報告されているように、広く研究されている。これらの研究によ って、　　ＤＸＲが、リポソーム内の酸化反応を促進し、それ自体が遊離ラジカ ルの反応と過酸化反応とで分解することがわかった。これらの研究の重要な発見 によって、α−トコフェロールのような脂質溶解性の遊離ラジカル失活剤と、デ スフエラルのような水溶性の３価の鉄のキレート化剤との両者を共存させること によって、脂質および薬剤成分の酸化による損傷が、各成分単独で生じる阻止の 程度から予想される以上に。

有意に大きく阻止される。これらの結果により９分散液中の水性相と親油性相の 両方での遊離ラジカルの作用および／または過酸化作用を阻止することが、　　 ＤＸＲ／ＩＪポソームの酸化による損傷を効果的に阻止するために重要であるこ とが示唆される。

本発明の組成物に用いられる親油性の遊離ラジカル捕そく剤として好ましいのは 、α−トコフェロール、またはα−トコフェロールスクシナートのような薬理学 的に許容される同族体もしくはそのエステルである。他の適切な遊離ラジカル捕 捉剤には、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＩＴ）　、プロピルガラードおよび その薬理学的に許容される塩と同族体が含まれる。遊離ラジカル失活剤は、従来 の方法でリポソームを調製する際に使われる脂質成分に、一般に包含される。保 護化合物の好ましい濃度は、リポソームを構成する全脂質成分の約０．２〜２モ ル％である。

水溶性の保護剤は、天然および合成のトリヒドロキサム酸の類から選択された鉄 枠異的キレート化剤である。これは。

３価の鉄に対する結合定数が非常に高＜　（１０３０のオーダー）。

カルシウムおよびマグネシウムのような２価のカチオンに対する結合定数が比較 的低いという特徴を有する。天然起源の種々のトリヒドロキサム酸類としては次 のようなものが報告されている：フェリクロム、フェリクロムＡｊ、；よびアル ボマイシンのようなフェリクロム系の化合物；フェリオキサミン類およびフェリ マイシン類を含むフェリオキサミン系の化合物：およびフザラミン系の化合物で ある。これらの化合物の構造と鉄との配位特性が検討されている。

好ましいキレート化剤は、フェリオキサミンＢであり、またフェリオキサミンと してはデフエロキサミン、デスフェリオキサミンＢおよびデスフェラルのような 種々のものが知られている。この化合物は、並はずれた鉄との結合親和性を示し 、鉄蓄積症および鉄中前症を治療するためにヒトに非経口で用いるのに安全であ ることが証明されている。

（以下余白） Ｂ、薄膜水和法 上記のように、　　ＤＸＲ／ＩＪボソーム分散液は、様々な周知のリポソーム調 製法によって調製することができる（例えば。

５ｚｏｋａ　１９８０年を参照されたい）。ＤＸＲのリポソーム内への最初の封 入が比較的高くなる（約９５％まで）ある好ましい方法は、実施例１に示す薄膜 水和法である。この方法では、小胞形成脂質を、適切な有機溶媒もしくは有機溶 媒系に溶解し。

次いで減圧下もしくは不活性ガスの雰囲気下で乾燥して脂質膜が得られる。この 脂質膜には親油性の遊離ラジカル失活剤を含有させてもよい。好ましい組成（実 施例１による）は。

卵ＰＣ二卵Ｐ６：コレステロール：α−トコフェロールスフシネ−）　（７：　 ３　：４　：０．２）テあル。コノ脂質１１ｊｆ！；！、　ＤＸＲ（７）水性懸 濁液で水和して、薬剤ニリン脂質の最終モル比を約１：５０〜約１＝１０にする 。この処理によって、遊離ＤＸＲを除去した後におけるＤＸＨの濃度が約２〜１ ０モル％の小胞が生成する。

好ましいＤＸＲ：脂質のモル比は約１：１５である。

乾燥した脂質膜を水和するのに用いる水性媒体は、ラクトースもしくはトレハロ ースのような凍結防止剤を約１〜１０％含有する発熱原性物質を含有しない水性 媒体である。この媒体としては、生理学的モル浸透圧濃度に近い濃度（約３００ ｍ０）を生ずるのに充分なり　ＮａＣ］のような生理学的塩と、　ＤＸＲとを含 有するものが好ましい。水溶性の鉄キレート化剤が存在していてもよい。実施例 １で用いられる好ましい媒体は、５％のラクトース、０．４５％のＮａＣ１，５ ０ｍＭのデスフェラルｐＨ５〜６゜および１０モル％（脂質に対する百分率）の ＤＸＲを含有している。水性媒体を上記フィルムに加えて、高速条件下で（振盪 して）もしくは低速条件下で（振盪せずに）水和させる。脂質は水和して、多重 ラメラ小胞（ＭＬＶ”）の懸濁液を形成する。

そのサイズは、典型的には約０．０５μ〜１０μまたはそれ以上の範囲内にある 。一般に、上記の方法におけるＭＬＶのサイズ分布は、振盪してより高速で脂質 膜を水和することによって。

より小さなサイズにすることができる。リポソームは、バルク水性相の濃度にほ ぼ等しい濃度の封入されたキレート化剤を含有している。典型的には９分散液中 のリポソームの濃度は約７０ｍＭの脂質濃度である。

リポソーム分散液は、上記のような、約０．１μと０．５μとの間の好ましいサ イズ範囲の選択的なサイズ分布が得られるようにサイジングされる。このサイジ ングは、大きなリポソームを除いて、最適の薬物速度論的特性を有する所定のサ イズ範囲を生成するのに役立つ。リポソームサイズの所望のサイズ分布を得るた めのある好ましい方法は、細孔を有するポリカーボネート膜にリポソームを通過 させて押し出す方法である。この膜の９例えば０．１．　０．２．　もしくは０ ．４μのような選択された細孔のサイズは、膜を１回またはそれ以上通過させた 後のリポソームのサイズ分布にほぼ相当している。典型的には、リポソームは、 サイズ分布が安定するまで数回膜に通過させて押し出される。このサイジングの 方法は、　５ｚｏｋａら、　１９７８年によって一般的に述べられている。

あるいは、　１９８６年２月２８日付で出願された共有の米国特許出願第８２９ ．７１０号「リポソーム押し出し法」に記載されているように、約０．２μと１ ．０μとの間の孔サイズを有するセラミックフィルターにリポソーム通過させて 押し出してもよい。

リポソームのサイジングに続いて、さらに、遊離のＤＸＲ。

すなわちリポソームと密に会合していないＤＸＲを除去する処理が分散液に対し て行われる。この薬剤除去の目的は、遊離の薬剤の量を１分散液中の全ＤＸＨの 約１０％未満のレベル、好ましくは約３％と７％との間に減少させることである 。懸濁液は、希釈後、高速遠心分離によってペレット化され、上澄液中には遊離 の薬剤と非常に小さなリポソームとが残留する。

この方法の長所は、遊離薬剤の除去と、最終的な分散液を調製するのに有用な濃 縮工程とを組み合わせたことである。他の方法では２分子ふるいクロマトグラフ ィーによるゲル濾過法を用いてリポソームを遊離のＤＸＲ分子から分離する。あ るいは、リポソームを選択的に残して遊離薬剤を通過させるように孔サイズを設 定した透析または透析濾過／限外濾過膜に。

分散液を接触させてもよい。この膜の遊離薬剤側には、リポソームからの遊離薬 剤の分離を促進するために、遊離のＤＸＲと活性的に結合するイオン交換基もし くは疎水性基が存在していてもよい。透析濾過／限外濾過法は１分散液を同時に 濃縮し得る点で、超遠心分離法と同じ長所を有する。

米国特許第４．４６０．５７７号に記載された他の方法では、薬剤／リポソーム 組成物をイオン交換樹脂もしくは疎水性樹脂層で濾過して、　ＤＸＲのような遊 離薬剤を除去する。あるいは。

分散液を通過させた際に選択的にＤＸＲを結合し得るイオン交換基もしくは疎水 性基が表面に結合している固体担体カートリッジに１分散液を通過させてもちよ い。このようなカートリッジはロミコン（Ｒｏｍｉｃｏｎ）　（ウォバーン、　 ＭＡ）から入手し得る。

遊離薬剤を除去するためのある好ましい方法では、透析濾過膜を通過するＤＸＲ を活性的に除去するように設計された透析濾過装置に１分散液を通過させる。こ の方法は、イオン交換樹脂もしくは疎水性樹脂を、透析濾過膜の濾液側に置くか 。

または膜の濾液側の担体構造にイオン交換基もしくは疎水性基を結合させること によって行われる。被処理液は、最終濃度が約１０〇−脂質より高くなるまで膜 室を通じて循環される。

最終的な調製段階では２分散液は、少なくとも約１０ｈＭの最終脂質濃度にまで 濃縮することが好ましい。分散液を濃縮する目的は、簡単に述べれば、凍結乾燥 して貯蔵した後、凍結乾燥物を、最初に、少なくとも約１００ｍＭの濃度に再構 成するためである。同時に、再構成された濃縮物は最終のモル浸透圧濃度が生理 学的モル浸透圧濃度に近い濃度でなければならない。特に、この条件は、リポソ ーム内外の水性相に適用されなければならない。この条件は、（ａ）分散液を、 生理学的モル浸透圧濃度で約１００ｍＭより高い最終濃度に調製し、この濃縮分 散液を凍結乾燥し１次いで分散液を蒸留水でほぼ同じ容量に再構成することによ って、最も良く満足される。

上記のように、遠心分離法、透析濾過／限外濾過法、および薬剤結合樹脂の存在 下での透析濾過／限外濾過法のような遊離薬剤を除去するいくつかの方法は１分 散液を濃縮するのに役立つ。これらの方法は容易に実施することが可能であり。

少なくとも約１００ｍＭの所望の脂質濃度を得ることができる。

他の遊離薬剤除去工程を用いる場合１分散液は１通常の方法。

すなわち限外濾過法もしくは遠心分離法で濃縮される。

最終的なりＸＲ／分散液は、以下の特性を有する：ａ、リポソームサイズが、主 として約０．１−０．５μの選択されたサイズ範囲内にあり。

ｂ、リポソームに封入されたＤＸＲは、約２〜１０モル％のリポソーム脂質の濃 度において、少なくとも約９０％がリポソームと会合しており；そして Ｃ０約１％と１０％との間の凍結防止剤を含有している。

分散液は、少なくとも１００ｍＭであって、生理学的モル浸透圧濃度に近い脂質 濃度を有することが好ましい。

分散液は、０．２２μもしくは０．４５μの通常の深層フィルターで濾過して滅 菌し、凍結乾燥して貯蔵する。

Ｃ２溶媒噴射法 ここで用いられる溶媒噴射法は、ともに１９８６年９月１８日付で出願された共 有の米国特許出願第９０８．７６５号「高カプセル化リポソーム処理法」および 同第９０９．１２２号「高濃度リポソーム処理法」に記載された新規なリポソー ム調製法に基づいている。これらの方法は以下の発見に基づいたものである：す なわち９選択された溶媒噴射条件を用いることによって。

最終濃度が３００〜５００μｍｏｌ／ｍ１までであり、薬剤封入効率が。

水溶性化合物については６０〜７０％まで、疎水性化合物については９０％まで またはそれ以上のリポソームを、単一バッチ法で製造し得るという発見である。

さらに、このシステムは。

サイジングおよび／または遊離薬剤の除去を行って、所望の濃度と、リポソーム サイズ分布と、遊離薬剤の百分率とを有する最終生成物が得られるように容易に 適応させることができる。

溶媒噴射法によってＤＸＲ／Ｕポソーム分散液を調製する際には９選択された溶 媒系によるリポソーム脂質の溶液が、　ＤＸＲ。

凍結防止剤、塩、緩衝剤、および鉄キレート化剤を含む水性媒体が入っている混 合室内に９選択された速度で噴射される。

脂質の溶媒としては、約Ｏ〜１０℃の沸点を有するものが好ましく、水性媒体は 約１０〜２５℃に保持するのが好ましい。上記混合室は、溶媒噴射の間、一定の 温度および圧力で保持される。水性成分および脂質成分は、注入工程の間、電動 機で駆動される羽根で攪拌される。

混合室内で形成されるリポソーム分散液は、リポソームを押し出すことによって サイジングするように設計されたサイジング装置を通じて循環することによって サイジングされ得る。この装置は、押し出しとサイジングとを行うポリカーボネ ート膜もしくはセラミックフィルターを備えている。循環切り換え器を備えた押 し出し装置は、リポソーム分散液から遊離のＤＸＲを除去する透析ユニットもし くは限外濾過ユニットを備えていてもよい。このユニットは、リポソーム分散液 を流動させて、サイズ選択性の透析膜もしくは透析濾過膜を通じて遊離［ＩＸＲ を拡散させて、＊の外側のイオン交換基もしくは疎水性基によって取込まれるよ うに構成されている。

操作中、脂質／溶媒の溶液は、約１００ｍＭより高い所望の脂質濃度が得られる まで、激しく攪拌しながら混合室内に噴射される。この時１分散液は、所望のサ イズ範囲と遊離薬剤の濃度に達するまで、サイジング／薬剤除去の切り換え器に よって再循環される。

リポソームの調製は滅菌条件下で行うことができる。また。

分散液を、溶媒噴射工程に続いて上記のようにフィルター滅菌することもできる 。次いで９分散液は凍結乾燥して貯蔵さ注射用の凍結乾燥されたＤＸＲ／ＩＪポ ソーム組成物を希釈した形態に調製するために、まず組成物を再構成してリポソ ーム濃縮物を形成する。次いで、この濃縮物を、生理学的食塩水のような注射用 媒体で希釈して、非経口注射に適した希ＤＸＲ／リポソーム懸濁液を形成する。

注射用の凍結乾燥組成物を調製する際に用いられる再構成／希釈工程は、希釈懸 濁液中の遊離薬剤の量を最小にするのに重要であり、以下に示すように９本発明 の重要な部分を構成する。この節では、再構成工程における凍結乾燥ＤＸＲ／リ ポソームの挙動について調べる。

Ａ、サイズ特性 再構成されたＤＩＲ／リポソーム材料中のリポソームサイズを制御するためには 、凍結乾燥および再構成によるリポソームサイズの変化を最小にする必要がある 。本発明を確証するために行った実験によれば、凍結防止剤の非存在下でサイジ ングされたリポソームは、凍結乾燥／再構成サイクル中、サイズがかなり増大す る。

このことは、実施例３で報告された研究から明らかであるが、この実施例では、 　１２５ｍＭのトレハロース（約５％）、５％のラクトースまたは５％のマンニ トールのいずれかを含有するリポソーム濃縮物中のサイズ変化について調べた。

０．２μのポリカーボネートフィルターに通過させて押し出すことによって製造 した元のリポソームサイズは１表１に示すように、平均して約２８０〜３３５ｎ ｇ＋の範囲内にある。これら３つの分散液は各々、制御された凍結室内で徐々に 凍結されるか。

あるいは液体窒素中で急速に凍結され１次いで凍結乾燥して完全に乾固される。

得られた調製物を９次に蒸留水で再構成して１元の分散液の容量とし、リポソー ムのサイズ分布を分析した。平均的なサイズは表１の下段に示されている。表か ら明らかなように、凍結乾燥／再構成によってリポソームサイズが変化するのを 防止するのに、トレハロースおよびラクトースは有効であったが、マンニトール は有効ではなかった。

マンニトール処方物で観察された。リポソームサイズの増大は、凍結防止剤の糖 が存在しない場合に認められる増大に匹敵するものであった。

Ｂ、脂質の濃度 本発明の重要な局面によれば、凍結乾燥されたＤＸＲ／　！Ｊボソームからの、 リポソームと結合したＩ）ＸＲの放出の度合が。

比較的高い脂質濃度、すなわち少なくとも約１００μｍｏｌ脂質／−にまず再構 成し９次いで等張の注射媒体で希釈することによって著しく減少させることがで きることが見い出された。

再構成時の［ｌＸＲ薬剤の放出に対する脂質濃度の影響は、実施例４に報告した 研究から明らかである。概略を述べれば、上記のようにして調製し、濃縮して脂 質濃度を４０〜２１１ｍＭに増大させた４種のＤＸＲ／　！Ｊポソーム分散液に ついて、まず遊離ＤＸＨの百分率を測定した。この測定は、実施例４で詳細に説 明するように９分子ふるいクロマトグラフィーによって行った。表２に示すよう に、各処方物は１１％と１３％との間の遊離口ＸＲを含有していた。

凍結乾燥後、乾燥組成物を、２５０μｍ（元の容量の′Ａ）もしくは５００μｌ （元の容量）の蒸留水で再構成し、再構成された処方物を、遊離ＤＸｊｌの百分 率について再度分析し、結果を表２の下２行に示した。表２から明らかなように 、凍結乾燥物を４０ｍＭもしくは５４ｍＭに希釈すると（最初の２欄の第３行） 。

遊離ＤＸＲの量が７〜８％増大したが、高濃度では（８０〜４２２ｍＭ）　。

遊離ＤＸＲの増大はせいぜい４％であることが観察された。

同様の結果が、実施例４に報告した第２の研究で得られた。

この実施例では９表２に示す脂質濃度を有し、かつ凍結乾燥前の遊離薬剤濃度が 約６％であるようなりＸＲ／リポソーム分散液を凍結乾燥し、蒸留水で再構成し て９元の容量とした。

表３の右欄には、再構成後の遊離薬剤の百分率の測定値を示す。上記のように、 再構成後の脂質濃度が約１００ａ＋Ｍより低い場合、遊離薬剤の最終濃度は約８ 〜９％増大した。脂質濃度が高い場合、その増大は約３〜４％であった。

（以下余白） 再構成を行いリポソーム濃縮物を形成した後は、さらに等張媒体で希釈しても得 られた懸濁液中の遊離薬剤の濃度（％）については、殆んど影響がないかまたは 全く影響がないようである。例えば、脂質濃度が約１３０ｍＭで、遊離薬剤の測 定濃度が約１１％の再構成されたリポソーム濃縮物は、４℃で４週間貯蔵した後 にも遊離ＤＸＲ濃度（％）が認知できるほどの変化を起こすことなく９等張媒体 で１＝３０または１：６０に希釈することが可能である。またさきに報告した。

遊離薬剤もしくは結合薬剤の割合（％）は、すべて分子ふるいクロマトグラフィ ーで測定され、この方法自体、試験されるべきＤＸＲ／リポソーム濃縮物もしく は懸濁液の数倍の希釈液をつくりだすこともまた。銘記すべきである。

しかし、上記濃縮物をさらに希釈すると、希釈媒体が低張媒体の場合には、リポ ソームからＤＸＲが放出される場合がある。このことは、実施例５の実験で示し たように、高濃度脂質の場合にもあてはまる。ここでは、５％ラクトースと０． ４５％の生理的食塩水中１３８ｍＭの脂質を含有するＤＸＲ／ＩＪポソーム分散 液を、　　０．５ｍｆずつ凍結乾燥し１次に、蒸留水の量を５０４から５０Ｍ！ にまで増加させて再構成した。再構成に続いて室温で１時間静置した後、濃縮物 を蒸留水で希釈して、はぼ最初の濃度（１３８ｍＭ）とした。したがって９例え ば表４に示す最初の試料は、　５Ｍ！で再構成しくもとの濃度の１０倍）９次に ４５０１１１の蒸留水でさらに希釈し約１倍の濃度とした。一方。

この表に示す最後の試料は、　　５００Ｊｉの蒸留水で直接再構成され、１倍の 最終濃度とした。表４は、得られたＤＸＲ／ＩＪボソームに結合しているＤＸＲ の割合（％）を、各試料について同じ処理をした２つの試料を分子ふるいクロマ トグラフィーで測定した結果を示す。その結果かられかるように、高張性のリポ ソーム膨潤をより大きく引き起こす希釈条件によっても。

リポソームと結合したＤＸＲの損失が一層大きくなる。

再構成またはリポソームの膨潤を起こす条件下でのＤＸＲ／リポソームは、遊離 薬剤の放出量を有意に増大するので、再構成時の低張性の膨潤がＤＩＲの放出を 増大するのか否かを決定することは興味深い問題である。ここでは等偏分散液と して調製したＤＸＲ／ＩＪボソーム（約３００ｍ０）を凍結乾燥し、蒸留水もし くは０．９％ＮａＣ］溶液のいずれかで最終脂質濃度が約１５０１ＩＩＭとなる まで再構成した。蒸留水で再構成した場合には。

バルク相の媒体はリポソームの内部領域と等張であり、他方。

等張食塩水で再構成した場合には、外側のバルク相は、リポソームの内部領域の ほぼ２倍の浸透圧モル濃度を有し、いくらかリポソームの収縮を引き起こすと考 えられる。あらかじめ凍結乾燥された分散液中の遊離薬剤の割合（％）は約４％ である。いずれの再構成媒体の場合も、再構成後の遊離ＤＸＲの割合（％）は約 ６〜７％である。この結果により、再構成時の少なくともゆるやかな収縮は、再 構成媒体中への遊離ＤＸＨの放出が増大しないので、許容され得ることが示され る。

上記データには３つの著しい特徴がある。第１に、凍結乾燥されたリポソームの 再構成は、リポソームと結合したＤＸＲのいくらかの損失を必らず引き起こすと いうことである（リポソーム濃縮物を４℃で数カ月間貯蔵した際に遊離ＤＸＲの 増大を示さないので、凍結乾燥時に観察されるＤＸＲの漏洩は凍結乾燥の工程に 関連していることが分かる）。このことは。

リポソームの再構成時に、　　ＤＸＲがリポソームから放出されるような膜の変 化が短期間の間起こることを示している。この損失は、この発明のひとつの態様 に従い、リポソームを比較的濃縮された溶液に再構成することによって、最小に することができる。この現象について考えられる説明は、薬剤が膜から放出され る短期間の間に、薬剤は、再構成媒体中の脂質相とバルク水性相の相対濃度に比 例して、該媒体中の脂質相とバルク水性相との間に急速に分配されるということ である。

脂質の濃度が高ければ、再構成中のリポソームへの分配が優先する。あるいは、 再構成中の膜の変化の度合と薬剤の放出は、リポソームの濃度が高い場合には少 ないかもしれない。

第２に、　　ＤＸＲ／リポソーム濃縮物は、貯蔵期間を延長しても、遊離薬剤の 大きな放出なしに等張希釈媒体で希釈できる。

この挙動は、リポソームに結合しているＤＸＲが、動的平衡交換によって制御さ れておらず濃度に依存していることを示している。むしろ、　　ＤＸＲのリポソ ームからの放出（そしておそら＜　ＤＸＲのリポソームへの結合）は、再構成中 または浸透圧膨潤の条件下のような膜が摂動する期間にのみ起こることは明らか である。この特徴によって、それ自体遊離薬剤の含量が最小のこの発明のリポソ ーム濃縮物は、遊離薬剤の割合（％）を大きく増大させることなく、注射用に希 釈することができる。

第３に、再構成時のゆるやかな収縮は、遊離薬剤の放出には全く影響がないよう であるが、リポソームの膨潤によって。

再構成された膜からの遊離ＤＸＲの放出はかなり増大する。この特徴によって、 この発明の方法に用いるのに適した希釈媒体の性質にはある種の制限を必要とす る。典型的には、最後の希釈媒体は生理的食塩水であるが、この場合、リポソー ム濃縮物は、リポソームの大きな膨潤を避けるために、生理食塩水の量は約２倍 をこえてはならない。凍結乾燥されたリポソームを少なくとも約０．５の生理的 浸透圧モル濃度（約３００ｍ０）の最終浸透圧モル濃度に再構成することによっ て、低張性の収縮をも避けることが好ましい。この発明の好ましい態様では、リ ポソーム分散液は、生理的浸透圧モル濃度で調製され。

蒸留水でもとの濃縮体積に再構成され９次に生理食塩水で希釈される。希釈され た注射用懸濁液の最終濃度としては、約２〜２０ａ１Ｍの脂質濃度であることが 好ましい。

Ｃ０温度条件 貯蔵温度と再構成時の物質の温度の、遊離薬剤放出に対する影響も試験した。そ の結果を実施例６に示す。簡単に述べると、凍結乾燥した口ＸＲ／リポソームを 、数日間２０℃または４℃で貯蔵し、試料を、貯蔵温度でまたは凍結乾燥物を室 温と平衡化させた後に、室温の蒸留水でもとの体積に再構成した。すべての場合 において、リポソームと結合した口ＸＨの割合（％）は９表５のデータかられか るように約９０〜９２％であった。このように、貯蔵温度または凍結乾燥物の温 度は、再構成時におけるリポソームからの遊離薬剤の放出度には殆ど影響がない か全く影響がない。

ＩＩｌ、　ＤＸＲ／リポソームの投与 この節では、この発明のＤＸＲ／リポソーム処方物の臨床環境（その調製条件お よび貯蔵条件を含む）での、調製および利用、そして、腫瘍の治療における有用 性を調べる。

Ａ、調製および貯蔵 このＤＸＲ／ＩＪボソーム処方物は凍結乾燥組成物として供給される。第■節で 述べたように、その組成物は、予めきめられた量の水性媒体で再構成される場合 、以下の事柄により特徴づけられる： ａ、リポソームの濃度が約１００ｍＭリポソーム脂質より大きく。

ｂ、リポソームサイズが主として約０．１〜０．５μの選択されたサイズ範囲内 にあり。

ｃ、リポソームで封入されたＤＸＲが、約２〜１０モル％の脂質濃度において、 そしてリポソーム結合ＤＸＲの約８５〜９５％であり、そして。

ｄ、凍結防止剤が約１％と１０％との間で含有されている。

この組成物は、蒸留水で、リポソーム分散液のもとの体積に再構成するのが好ま しい。

この凍結乾燥された組成物の利点は、脂質が大きく酸化分解もしくは加水分解す ることなく冷凍庫内もしくは室温下で長期間貯蔵できるということである。同時 に、バルク相の媒体に対してごく僅かなりＸＲが失われるだけで、０．１〜０． ５ミクロンの粒径範囲の所望の選択されたリポソームのサイズ範囲を有する濃縮 物に再構成することができる。

調製に便利なようにまた薬剤の損失を最小にするために。

凍結乾燥物を複数回投与用の量で供給するのが好ましい。これはいくつかの部分 に分かれており、再構成されるときに。

希釈により９個々の量で薬剤投与を行うことができる。例えば、凍結乾燥物は９ 合計的２Ｏｎ＋ｍｏ　１の脂質中１ｇのＤＸＲ（約１．８４ｍｒｎｏｌ）を含有 する量で供給してもよい。この凍結乾燥物は。

次に、約１００ｒｎ１の蒸留水で再構成され、約２００ｍＭの最終脂質濃度にす る。このリポソーム濃縮物は、検討したように、α−トコフェロールとデスフェ ラルで保護される場合、有意に分解することなしに、４℃で数週間貯蔵できる。

一般に、約１００〜１５０ｍ１の静脈点滴合計量巾約２５〜１００■の個々の投 与量が、化学療法の投与に最適である。単一の希釈された投与物は、滅菌食塩水 で簡単に希釈することによって上記濃縮物から容易に調製することができる。例 えば、５０■の投与量を投与するために、濃縮物の５ｄ文を取出して。

約１２０１ｎ１．０滅菌食塩水に加え、そしてこの懸濁液は、従来の手法により 静脈点滴などによって供給される。あるいは、注射器によって注射するためには 、濃縮物は、投与用に、好ましくは２５〜５０ｍｆｆ１のより小さな容積に希釈 されうる。このように、この濃縮物は、約１０〜４０個の個々の投与物を調製す るのに利用することができる。

あるいは、凍結乾燥物は、別個の投与形態９例えば１個々のシールされたコンパ ートメントに、（ａ）所望量の凍結乾燥ＤＸＲ／リポソーム組成物、う）凍結乾 燥組成物と混合した場合に。

ＤＸＲ／リポソーム濃縮物を形成するのに充分な量の再構成用媒体、および（Ｃ ）希釈媒体を入れた複数コンパートメントパッケージで供給してもよい。最初に （ａ）と（ロ）のコンパートメントを混合することによって濃縮物を形成し９次 いで、得られた濃縮物とコンパートメント（Ｃ）を混合することによって最終の 希釈媒体が得られる。

Ｂ、腫瘍治療における治療用途 さきに挙げた特許出願“リポソーム／アントラキノン薬剤組成物とその製法″に 記載された初期の試験により次のことが示されている。つまり小さな、薬剤を保 持するリポソームは、肝臓の洞様毛細管および実質、膵臓および骨髄のような組 織領域（比較的小さなリポソームが近づきやすい）にリポソームと結合した薬剤 を集中させることができるということが示されている。これらの知見は、肝臓の 転位性疾患、原発性肝癌、リンパ球の増殖性疾病および白血病（これらは、その 数および患部の分布の両者から、すべて主要な癌である）の治療に重大な関連が ある。

肝臓の転位性腫瘍を治療するためにＤＸＲ／ＩＪボッ、−ムを用いる臨床試験が 行われている。今までに得られた治療結果は。

胃腸毒性（吐気、嘔吐、下痢および口内炎）が事実上完全に消失し、注射部位の 痛みがないために、リポソームに封入された［ｌＸＲによって全患者の快適さが 著しく改善されたことを示している。この結果はある種の癌をＤＩＲで治療した 際に大きく改善されたことを示している。さらに、治療を受けた患者の脱毛症が 有意に軽減され、治療の効力（このことは、腫瘍の大きさの変化で証明されてい る）は、遊離のＤＸＲ単独の場合と同様に良好か、またはより優れているように 思われる。

種々の割合（％）で遊離のＤＸＲを含有するＤＸＲ／リポソーム懸濁液の臨床試 験は、懸濁液中の遊離ＤＸＨの割合（％）が減少するにつれて、副作用が著しく 減少することを示している。

上記の事柄から１本発明の種々の目的および特徴がいかに合致しているかが理解 され得る。この発明の凍結乾燥組成物は、長期間にわたって（数カ月以上に至る まで）、冷凍庫もしくは室温で、脂質もしくは薬剤成分が分解することなく貯蔵 できる好都合で安定な形態のＤＸＲ／リポソームを提供する。

この凍結乾燥組成物は、所望のリポソームのサイズ分布を有しかつ少なくとも約 ８５％のより典型的には９０〜９５％の、リポソームと結合したＤＸＲを含有す る濃縮物に、容易に再構成することができる。その濃縮物は９次に、リポソーム のサイズもしくはリポソームと結合した薬剤の割合（％）を大きく変化させるこ となく、非経口投与用に希釈することができる。

希釈された媒体は、リポソームのサイズ分布によって有利な生体分布特性を有し ：そして、リポソームおよびＤＸＲ成分が元のままの状態であることと、遊離Ｄ ＸＲの比率が低いということとにより、毒性が低い。

以下の実施例においては１本発明により調製されたＤＸＲ／リポソームの濃縮物 および懸濁物の製造法および特性を示す。

しかし、これらの実施例は、この発明の範囲を限定するものではない。

材料 ドキンルビシン塩酸塩（ＤＸＲ）は、　Ｌａｂｏｒａｔｏｉｒｅ　Ｒｏｇｅｒ　 Ｂｅ１ｌｏｎ。

ＳＡから入手し、　　ＥＰＣおよびＥＰＧはＡｖａｎｔｉ　Ｐｏ１ａｒ　Ｌｉｐ ｉｄｓ　Ｉｎｃ。

（アラバマ州、ハーミンガム）から入手し；コレステロール。

α−トコフエロールスクシナート、ラクトースおよびマンニトールはＳｉｇｍａ 　Ｃｈｅａ＋１ｃａｌ　（ミズーリ州、セントルイス）から入手し；デスフェラ ルはＣＩＢＡ　にュージャージー州、サミット）から入手し；そして脱水トレハ ロースはｐ（ａｎｓｔｉｅｈｌｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　Ｉｎｃ、　　（イリ ノイ州、ウオーケガン）から入手した。

（以下余白） 実施例１ 凍結乾燥ＤＸＲ／ＩＪボソームの調製 ５１８、６■のＥＰＣ，２１０，４■のＥＰＧ、　　１４０．０■のコレステロ ール、　オヨヒ９．８■のα−トコフェロールスクシネートを含有する脂質のク ロロホルム溶液を調製した。減圧下にて溶媒をロータリーエバポレータで蒸発さ せて除去し１次いで５０Ｊ　）Ｉｇより低い減圧下に試料を２時間さらして、溶 媒残留物を除去した。２．６７ｍｇ／＋＋＋ｊ！のＤＸＲと、５％ラクトースと 、０．４５％ＮａＣ１と、５０浦デスフエラルとを含有する水溶液２０ｍ１を、 乾燥脂質（ＰＣ：　ＰＧ　：コレステロール：α−トコフェロールスフシネ−） 　：　　ＤＸＲノモ、＋ｔ、比＝７：３：４：　　０．２：１）ｉ：添加した。

さらに、直径６ｍｍのガラスピーズ約２０個が、脂質の水和を促進するめに加え られた。次いで、この混合物を、室温にて、２〜３時間９手で振盪した。このよ うにして形成されたＭＬＶを。

加圧下にて、５０ｄアミコン（Ａｍｉｃｏｎ）限外濾過セルの０．２μポリカー ボネート膜に通過させて５回押し出した。ＤＸＲ／リポソームは、調製工程のこ の段階で、以下の特性を有していた。

（ａ）　ＩＪポソームに取込まれた全ＤＩＲは、最初に添加された薬剤の量の８ ５〜９０％であった（セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）ゲル浸透クロマトグ ラフィーによって測定）：（６）全脂質濃度は、５５〜６８Ａｍｏｌ／ｍｊ’で あった（存在する有機ホスフェートによって測定）。

（Ｃ）調製物の平均粒子サイズは、直径３００〜４００ｎｍであった（動的レー ザ光散乱法で測定）： （６）最終リポソーム濃度２．５ｕｒｎｏｌ／ｍ＆で、１時間、３７℃にて。

５０％ヒト血漿とともに調製物をインキュベートした後、全ＤＸＲの８０％が依 然としてリポソームと会合していた。

ＤＸＲ／リポソーム分散液を、ダウエックス（［ｌｏｗｅｘ）イオン交換樹脂（ １９■のダウエックス５０　　Ｘ４−４００樹脂を、１■のＤＸＮに対して用い た）を用いて、室温にて１０分間処理して、遊ｆｉＤＸＲを約５％より少なくし た。樹脂材料を除去した後、遠心沈降法で、リポソームの濃度を約１５ＯＡ＋！ ＋１０１／−にした。

この濃縮されたリポソーム調製物の試料５００ｄを個々のガラスびんに区分けし 、貯蔵温度を５℃に設定した凍結乾燥器（Ｖｉｒｔｉｓ　Ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅ ｒ）内に入れた。試料の温度が５℃で平衡になったとき、貯蔵温度を一５℃に下 げた。試料の温度が一３０℃〜−３５℃に到達したときに、減圧にした。試料を 、−３５℃で４８時間、５−８ｇより低い減圧下で凍結乾燥した。このとき、４ 時間で貯蔵温度を２５℃にあげた。次いで、試料を減圧下で密閉し、使用するま で４℃で貯蔵した。

ガラスピーズを脂質水和混合物に添加しないこと以外は実施例１に記載した手順 を用いて、　１２５ｍＭ　）レバロース−０，４５％ＮａＣ１中か、５％ラクト ース−０，４５％ＮａＣ１中か、あるいは１０ｍＭのトリス−塩酸（ｐＨ７，４ ）にＤＸＲを含有する５％マンニトール中にリポソームを調製した。ポリカーボ ネート膜を用いた押し出し工程の後に、上記３つの調製物の各々Ｇｒｎｌずつを 、１０ｍＭ）リス−塩酸−０，９％ＮａＣ１で６倍に希釈し、そして約１５０． ０００×ｇで３０分間ペレット化した。次いで、得られたペレットを。

適切な凍結防止剤を含有する１０ｍ１の緩衝液に懸濁させた。この時点では、全 ＤＸＲの約３０％はリポソームと会合していなかった。５００ＪＪ１の試料を、 液体窒素にさらすか、あるいは制御された冷凍室（クライオメッド、　Ｃｒｙｏ ｍｅｄ　）内に入れることによって凍結した。次の凍結乾燥および再構成の工程 は、実施例１に記載したように行った。粒子サイズの測定は、凍結乾燥前または 凍結乾燥後の（再構成された）試料を、適切な糖の溶液で２００倍に希釈し、動 的レーザ光散乱測定装置（Ｎｉｃｏｎ＋ｐモデル２００．メリーランド）を用い て行った。以下の表１に示す粒子サイズのデータから明らかなように、トレハロ ースおよびラクトースの両方は、凍結乾燥時および再構成時にリポソームサイズ が増大するのを効果的に防止した。

表１ 粒子サイズ　（ｎｍ） １２５ｎＭ　　）レバロース　　　　　５％ラクトース　　　　５％マンニトー ル元の試料　　　２８４　　　　　　３０３　　　　３３５低速冷凍　　　２４ ７　　　　　　２６６　　　　７７９急速冷凍　　　２５７　　　　　　２６９ 　　　　６９６実施例４ リポソームをダウエックス樹脂で処理しないことを除いて。

実施例１の記載と同様にして、リポソームを調製した。ポリカーボネート膜を用 いた押し出しを行った後、調製物の一部を、０．９％ＮａＣ１−５ＯＡ！Ｍデス フエラルで１０倍に希釈し、そしてリポソームを１５０．０ＯＯＸ　ｇで１時間 ペレット化した。次いでこれらのリポソームペレットを、５％ラクトース−０， ４５％ＮａＣ］−５０ＪＪＸデスフェラル中に、各種の脂質濃度（４０，５４， １４３゜２１１　ｍＭ）で再懸濁させた。これらの調製物は、この時点で１１〜 １２％の遊離ＤＸＲを含有していた。これらの各試料の５００４ずつを、実施例 １に記載したようにして凍結乾燥した。２５０Ｉもしくは５０Ｍ！の蒸留水を加 えることによって、凍結乾燥物を再構成した。遊離ＤＸＨの百分率を、試料をセ ファデックスＧ−５０のカラムを通過させ、カラムのボイドボリュームで溶出し たリポソームのピークに対するカラムのベッドボリュームで遊離ＤＸＮとして溶 出したピークからＤＸＮＯ量を分析することによって測定した。５００Ｊ１１の 蒸留水で再構成した試料は。

０．９％食塩水−５０４デスフエラルで平衡化したカラムで分析した。他方、　 　２５Ｍ！の水で再構成した試料は、１．８％食塩水−５０」デスフェラルで平 衡化したカラムで分析した。分析試料中の遊離ＯＸＲの百分率を表２に示す。結 果については、上で検討したとおりである。

表２ 遊離口ＸＮ　　％ ４０ｍＭ　　　５４ｍＭ　　　１４３ｍＭ　　　２１１ｍＭ元の試料　　　　１ ３％　　１２％　　　１３％　　　１１％２５０ラムダ水　　　１６％　　１３ ％　　　１２％　　　１５％５００ラムダ水　　　２２％　　２０％　　　１６ ％　　　１６％２１５　　　　　　　　　　　９１％ ２番目の試験では、リポソームを実施例１に記載したようにダウエックス樹脂で 処理して、遊離ＯＸＲのレベルを、遠心分離によるペレット化で、リポソームを 濃縮する前の５〜６％にしたことを除いては１表２に記載したようにしてＤＸＲ ／リポソームを調製し、そして凍結乾燥した。凍結乾燥物を５００扉の蒸留水で 再構成し、標準的なセファデックスＧ−２５遠心分離法を用いて、遊離ＤＸＮの 百分率を測定した。リポソーム結合薬剤の百分率を表３に示す。

表３ 脂質濃度　　　　　　　　　ＤＸＮ取込み％（膚ｏ　１　／　ｍｌ　）　　　　 　　　　　　（再構成後）１８１　　　　　　　　　　　　　９０％実施例１に 記載したのと同様にして、リポソームを調製し。

そして凍結乾燥した。凍結乾燥前の試料は６％の遊離［ＩＸＲを含有し、この試 料の脂質濃度は１１０Ａａｏｌ／ｍｆであった。凍結乾燥物を４％または一２０ ℃で２週間貯蔵し９次いで表５に記載の手順にしたがって、　　５００ｍの水で 再構成した。ＤＸＲの百分率％を、前記のセファデックスＧ−２５遠心分離法に よって分析した。表５に示すＤＸＨのリポソーム結合に関するデータから明らか なように、リポソームからの遊離薬剤の放出は、貯蔵および再構成の温度には実 質的に無関係であった。

表５ 再構成条件　　　　　　　　ＤＸＮ取込み％−２０℃で貯蔵し、水を添加（室温 ）　　　　　　　９０％−２０℃で貯蔵し、試料を室温で（２時間）平衡化し、 水を室温で添加　　　　　　　　　　９１％４℃で貯蔵し、水を室温で添加　　 　　　　　　９２％そして凍結乾燥した。凍結乾燥した試料を、凍結乾燥した直 後に再構成した。再構成した試料を４℃で貯蔵し、セファデックスＧ−２５遠心 分離法を用いて、下記の表６の左欄に示す異なる貯蔵時間の時点における遊離Ｄ ＸＨの百分率を測定した。

この表には、指定の貯蔵期間経過後に測定したリポソーム結合ＤＸＲの百分率も 示されている。

０８４％ １４８８％ ３０８９％ ６０９０％ 本発明は、特定の処方物、調製条件、および用途について記載されているが１本 発明から逸脱することなく種々の改変を実施できることは明らかである。

Claims (15)

【特許請求の範囲】
1. １．所定容量の水性媒体で再構成された場合にリポソーム濃縮物を与える，凍結 乾燥されたアドリアマイシン／リポソーム組成物であって， ａ．リポソームの濃度が約１００ｍＭリポソーム脂質より大きく， ｂ．リポソームサイズが主として約０．１〜０．５μの選択されたサイズ範囲内 にあり， ｃ．リポソームで封入されたドキソルビシンが，約２〜１０モル％の脂質濃度に おいて，全ドキソルビシンの約８５〜９５％であり， ｄ．凍結防止剤が約１％と１０％との間で含有されている，ことを特徴とするリ ポソーム組成物。
2. ２．蒸留水で再構成された場合に，実質的に生理学的モル浸透圧濃度であること を特徴とする，請求項１に記載の組成物。
3. ３．リポソームに封入されたα−トコフェロール，あるいはその薬学的に受容可 能な類似体，誘導体，またはエステルをさらに含有する，請求項１に記載の組成 物。
4. ４．水で再構成される場合に，前記濃縮物中に存在する３価の鉄に対して過剰モ ル濃度のトリヒドロキサム酸キレート化剤をさらに含有する，請求項１に記載の 組成物。
5. ５．前記リポソームが，約３０〜７０モル％のホスファチジルコリンと，２０〜 ５０モル％のコレステロールと，約１０〜５０モル％の負に荷電したリン脂質ま たはステロールとを含有する，請求項１に記載の組成物。
6. ６．再構成されたドキソルビシン／リポソーム濃縮物であって， ａ．リポソームの濃度が１００ｍＭより大きく，ｂ．リポソームサイズが主とし て約０．１〜０．５μの選択されたサイズ範囲内にあり， ｃ．リポソームで封入されたドキソルビシンが，約２〜１０モル％のリポソーム 脂質濃度において，全ドキソルビシンの約８５〜９５％であり， ｄ．凍結防止剤が約１％〜１０％で含有されている，ことを特徴とするリポソー ム組成物。
7. ７．実質的に生理学的モル浸透圧濃度であることをさらに特徴とする，請求項６ に記載の組成物。
8. ８．リポソームに封入されたα−トコフェロール，あるいはその薬学的に受容可 能な類似体，誘導体，またはエステルをさらに含有する，請求項６に記載の組成 物。
9. ９．懸濁液中に存在する３価の鉄に対して過剰モル濃度のトリヒドロキサム酸キ レート化剤をさらに含有する，請求項６に記載の組成物。
10. １０．リポソームが，約３０〜７０モル％のホスファチジルコリンと，２０〜５ ０モル％のコレステロールと，約１０〜５０モル％の負に荷電したリン脂質また はステロールとを含有する，請求項１に記載の組成物。
11. １１．癌の化学療法において静脈投与することを目的とした，リポソームに封入 された約８５〜９０％のドキソルビシンを含有するドキソルビシン／リポソーム の製造方法であって，ａ．リポソームサイズが主として約０．１〜０．５μの選 択されたサイズ範囲内にあり， ｂ．リポソームで封入されたドキソルビシンが，約２〜１０モル％のリポソーム 脂質濃度において，全ドキソルビシンの少なくとも約９０％であり， ｃ．凍結防止剤が約１％〜１０％で含有されている，ことを特徴とするリポソー ム分散液を調製すること，この濃縮物を凍結乾燥して，脱水されたドキソルビシ ン／リポソーム組成物を形成すること， 得られた脱水組成物を，水性媒体で再構成して最終リポソーム濃度を約１００ｍ Ｍ脂質より大きくすること，得られた再構成組成物を，生理学的水性媒体で希釈 して，静脈注射に適した最終リポソーム濃度とすること，を包含する製造方法。
12. １２．前記リポソーム濃縮物が，リポソームに封入されたα−トコフェロール， あるいはその薬学的に受容可能な類似体，誘導体をさらに含有する，請求項１１ に記載の方法。
13. １３．前記リポソーム濃縮物が，懸濁液中に存在する３価の鉄に対して過剰モル 濃度のトリヒドロキサム酸キレート化剤をさらに含有する，請求項１１に記載の 組成物。
14. １４．前記リポソームが，約３０〜７０モル％のホスファチジルコリンと，２０ 〜５０モル％のコレステロールと，約１０〜５０モル％の負に荷電したリン脂質 またはステロールとを含有する，請求項１１に記載の組成物。
15. １５．前記リポソーム分散液が，少なくとも約１００ｍＭの脂質濃度と，生理学 的モル浸透圧濃度に近いモル浸透圧濃度とを有し，前記再構成物が該脂質分散液 の脂質濃度に近い量で蒸留水または希釈食塩水を含有する，請求項１１に記載の 方法。