JPH02503558A - リポソーム/ドキソルビシン組成物および方法 - Google Patents
リポソーム/ドキソルビシン組成物および方法Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、新規なリポソーム/ドキソルビシン組成物および方法に関し、詳しく
は、凍結乾燥された形態で長期間貯蔵可能で、リポソームが選択された粒径を有
しかつリポソームに封入されたドキソルビシンが85〜95%である注射用懸濁
液に再構成し得る組成物に関する。
2、参照文献
Aubel−Sadron、 G、ら、 Biochemie、 66巻、33
3頁、 1984年;Forssen、 E、A、ら、 Proc、 N
at Acad、 Sci、 USA 78(3)巻。
1873頁、 1981年;
Gabizon、 A、ら、 Cancer Res、 42巻、 4734頁
、 1982年;Gabizon、 A、ら、 Cancer Res、 43
巻、 4730頁、 1983年;Goormaghtigh、 E、ら、
Biochen Biophys Acta、 779巻。
271頁、 1984年;
Gutteridge、 J、M、C1,Biochea+ Pharm、 3
300巻、 1725頁。
1984年a;
Juliano R9L、ら、 Biocheo+ Pharmacol、 2
7巻、21頁、 1978年:Poznansky、 M、L、ら、 Pha
rm Revs、 36(4)巻、277頁、 1984年;Sunamot
o、 J、ら、 Bioches Biophys Acta、 833巻、1
44頁。
1985年:
5zoka、 P、ら、 Proc、 Nat Acad、 Sci (USA
’s 75巻、 4194頁。
1978年:
5zoka、 F、ら、 Ann Rev Biophys Bioeng、
9巻、467頁、 1980年;Young、 RoClら、 N Eng
J Med、 305巻、139頁、 1981年。
3、発明の背景
ドキソルビシン(DXR>は、広スペクトルの新生物に対して効果的な効力の高
い化学療法剤である(Aubel−3adronらおよびYoung )。しか
し、この薬剤を遊離の形態で臨床に使うことは、倦怠感、吐気、嘔吐、骨髄抑制
および重篤の脱毛症を含む重篤な副作用と急性毒性のために制限されている。さ
らに2反復投与すると、累積的で回復不能の心臓の損傷が起こり、そのため、治
療が置引いた場合には、この薬剤の使用は著しく制限される(Young)。
インビボでのDIRの毒性に対して用いられてきた方法は。
この薬剤を、リポソーム封入形で投与する方法である。動物実験、そして最近の
臨床試験により、リポソーム結合形のDIRが、その動物腫瘍に対する治療効力
を保持し、死亡率の低下および心臓毒性作用の減少からみて著しく毒性が少なく
なっていることが示される(Forssen、 Gabizon、 1985年
)。リポソームの薬剤保護効果は、少なくとも一部は9組織の性質と。
注射された薬剤の薬剤放出速度が著しく変化することによる(Gabizon
、 1982年; Gabizon、 1983年; Juliano)。
最近の動物モデル実験によってDXR/17ポソームの治療作用が増大し毒性が
減少するのに重要な3つの要因が指摘されている。その1つはリポソームの粒径
である。リポソームの機能として、静脈投与後のDXR/リポソームの生体内分
布および薬剤のクリアランスの測定を目的とする研究が行われている(Gabi
zon 、 1982年、 1983年および1985年12月6日出願の米国
特許出願第806.084号“リポソーム/アントラキノン薬剤組成物および方
法”)。その結果を要約すると次のとおりである:平均粒径が約0.1〜0.2
のDIR/リポソームによって、遊離の薬剤の場合と比較して、肝臓および膵臓
内の薬剤濃度が増大し、そして心臓、肺、腸、腎臓および骨格筋における薬剤濃
度が減少することが認められた。したがって、上記粒径のリポソームは、肝臓と
膵臓とに局在する腫瘍の治療と、非標的組織、特に心臓の薬剤濃度に関連する毒
性を減少させるのに特に有利である。上記粒径のリポソームはまた。
肝臓および膵臓組織の薬剤クリアランスが遅いことを示す。
小さな単層小胞(約0.03〜0.08のサイズ範囲)の生体内分布および薬剤
クリアランス率は、大きなリポソームと遊離の薬剤とのそれの中間であった。
種々の理由から、リポソームの最適サイズの上限は、約0.5ミクロンで好まし
くは約0.2〜0.3ミクロンである。第1に。
肝臓の洞様毛細血管と実質組織、膵臓および骨髄のような所望の標的組織の領域
は、約0.2〜0.3ミクロンより小さいリポソームにとっては接近しやすい領
域である。第2に、0.2〜0.3ミクロンのサイズの範囲のリポソームは、深
層フィルターによる濾過によって容易に滅菌することができる。この粒径の小胞
はまた。貯蔵中凝集する傾向を殆ど示さないので9組成物を非経口投与する場合
に起りつる厳しい問題が少ない。最後に、1ミクロンより小さい(サブミクロン
の)範囲の粒径にしたリポソームは、より均一な生体内分布と薬剤クリアランス
の特性とを示す。その理由は、このリポソームはより均一な粒径を有するからで
ある。
治療効力に対して重要なりXR/Uボソームの第2の特性は。
貯蔵中に起こりうる場合がある。脂質および薬剤成分の化学的分解の程度である
。リン脂質の分解は、脂肪族アシル鎖基の加水分解による放出および脂質の(特
に脂質のアシル鎮部分における不飽和結合領域の)過酸化による損傷の形態を取
ることがある(Gutterage 、 1984年; Sunamoto)
、さらに。
DIRのようなアントラキノン形の薬剤は、それ自体が酸化反応を開始できるし
く Goormaghtigh 、 1984年; にutteridge。
1984年a)、脂質の存在下で、フリーラジカル反応/酸化反応に寄与してい
るようであり、そしてまた、上記米国特許出願“リポソーム/アントラキノン薬
剤組成物および方法”に報告されているように、貯蔵中に、リポソーム内に、急
速な化学変化を受ける。
上記特許出願を支持するために行われた研究において、α−トコフェロールのよ
うな脂質溶解性の遊離ラジカル失活剤と、デスフェラルのような水溶性のトリヒ
ドロキサム酸のキレート剤との共存によって、脂質および薬剤成分の過酸化によ
る損傷が、上記のどちらかの保護剤だけで与えられる個々の保護作用の合計より
はるかに大きく減少することが見い出された。この保護効果の主な特性には、容
易には過酸化反応を触媒しないような形に3価の鉄をキレート化する作用が。
親油性失活剤による脂質相の遊離ラジカルの失活と組合わされて含まれるようで
ある。
DXR/ リポソーム処方物の毒性は、該処方物中の遊離の薬剤濃度(%)に影
響されやすい。臨床試験の測定値は、中程度のレベルの遊離薬剤(約35%)を
含有するDXR/IJボソームは、50■/ m’の投与量で、低い遊離薬剤濃
度(10〜15%)のDXR/Uボソームを70■/m″の投与量で投与した場
合よりもかなり大きな毒性を生じることを示している。DXR/リポソーム処方
物から遊離のDXRを除去するのに利用し得る方法には次のような種々の方法が
含まれる。つまり、遠心分離。
透析濾過9分子ふるいクロマトグラフィーによる濾過、および米国特許第4.4
60.577号に開示されているようなイオン交換樹脂による濾過が含まれる。
これらの方法は、新たに調製したDXR/ !Jボソーム処方物中の遊離薬剤の
レベルを、全DXRの10%またはそれを下まわる値に減少させるのに有効であ
る。
しかし、溶液中に貯蔵すると、脂質および薬剤の酸化による損傷が起こるにつれ
て、遊離の薬剤が徐々に放出される。DXR/リポソームを乾燥状態で貯蔵する
通常の凍結乾燥および再構成法では、再構成する際に遊離薬剤がかなり放出され
る。
本発明を支持するために行った実験によれば、従来の凍結乾燥および再構成法で
は、リポソームと結合したDXRがかなり放出され、典型的には、再構成された
リポソーム懸濁液中には20〜30%の遊離薬剤が存在する。
4、発明の要約
したがって1本発明の一般的な目的は9選択されたリポソームサイズ特性を有し
、長期間貯蔵しても安定で、かつリポソームと結合した形態で少なくとも約85
〜95%のDXRを含有するDXR/リポソーム処方物を提供することにある。
本発明に関連した目的は、そのような処方物を調製するのに用いられる凍結乾燥
リポソーム組成物およびリポソーム濃縮物を提供することである。
本発明の他の目的は、長期間貯蔵した後にも、あらかじめ選択されたサイズを有
し遊離DXRが比較的少量で、酸化による損傷が最小である。 DXR/+7
ボソームを調製する方法を提供することにある。
本発明には、1つの態様としては9次のような凍結乾燥されたドキソルビシン/
リポソーム組成物が含まれる。
この凍結乾燥されたドキソルビシン/リポソーム組成物は。
所定容量の水性媒体で再構成された場合にリポソーム濃縮物を与える組成物であ
って。
a、リポソームの濃度が約100mMリポソーム脂質より大きく。
b、リポソームサイズが主として約0.1〜0.5μの選択されたサイズ範囲内
にあり。
c、lJボソームで封入されたDXRが、約2〜10モル%の脂質濃度において
、全DXRの約85%〜95%であり、そして。
d、凍結防止剤が約1%と10%との間で含有されている。
ことにより特徴づけられる。
好ましい態様においては、上記の組成物は、低い浸透圧モル濃度の媒体もしくは
蒸留水が再構成されて、生理的浸透圧モル濃度に近い濃縮物を与える。好ましい
凍結剤防止剤はトレハロースもしくはラクトースであり、濃度は約5%が好まし
い。
他の態様においては1本発明には、上記組成物を再構成することによって形成さ
れるロXR/リポソーム濃縮物が含まれる。その濃縮物は、生理的浸透圧モル濃
度のものが好ましく。
さらに親油性の遊離ラジカル失活剤と、水溶性の鉄枠異的キレート化剤とを含む
ように処方し、遊離ラジカルと、酸化による損傷(最初にリポソームを製造して
貯蔵したときに、そして再構成した後に起こり得る)と、を最少にする。
本発明はさらに、癌の化学治療中に静脈投与するのを目的とする。リポソームと
結合した形態であり85〜95%のDXRを含有するDXR/リポソームを製造
する方法を包含する。この方法は、まず次の事柄によって特徴づけられるリポソ
ーム分散液を調製することを包含する:
a、リポソームサイズが主として約0.1〜0.5μの選択されたサイズ範囲内
にあり。
b、リポソームで封入されたDXRが、約2〜10モル%のリポソーム脂質濃度
において、リポソーム結合DXRの約90%を越える割合であり、そして。
C9凍結防止剤が約1%〜1−%で含有されている。
上記の分散液は、生理的浸透圧モル濃度で100mMより大きい脂質濃度に調製
するのが好ましい。この分散液は、凍結乾燥して貯蔵し1次いで水性媒体および
好ましくは蒸留水を添加して再構成することによって、少なくとも約100mM
の脂質濃度を有する再構成濃縮物が得られる。この濃縮物中の遊離薬剤の濃度(
%)は、典型的には、もとの分散液のそれよりも約5%高い。再構成されたDX
R/IJポソームは、生理食塩水のような注射用媒体で希釈され、静脈注射用に
適したDXR/リポソーム懸濁液が形成される。得られた希釈懸濁液中の遊離D
XRの割合(%)は、再構成されたものとほぼ同様である。
本発明の上記およびその他の目的と特徴は9本発明の以下の詳細な説明からより
一層明らかになるであろう。
本発明のDXR/IJポソームの濃縮物および懸濁液は、濃縮され、あらかじめ
凍結乾燥されたリポソーム分散液から調製される。その調製法はこの章で述べる
。懸濁液は種々の方法で調製され得るが、2つの方法が強調される。その方法は
。
(1)薄膜水和を行い9次いでサイズ分類を行ない、遊離薬剤を除いて懸濁液を
濃縮する処理を行う方法と:(2)高濃度の分散液を生成する新規な方法による
溶媒噴射法である。
A、リポソーム分散液の成分
分散液のDXR/IJボソームは、標準的な小胞形成脂質で形成される。これら
脂質としては一般に以下の物質が包含される:ホスファチジルコリン(PC)の
ような中性のリン脂質;ホスファチジルグリセロール(PG)、ホスファチジル
セリン(PS)。
ホスファチジルイノシトール(Pl)およびホスファチジン酸(PA)のような
負の電荷を有するリン脂質;硫酸コレステロールおよびコレステロールヘミスク
シナートのような負の電荷を有するステロール類;およびコレステロールのよう
なステロール類。脂質の選択は、(a)血清中での薬剤放出率、(b)薬剤封入
効率、(C)IJボソームの毒性、および(d)生体内分布性および標的性を考
慮することによって行われる。インビボでの薬剤放出率、薬剤封入効率およびリ
ポソーム毒性に対するリン脂質およびコレステロール成分の影響を、前記特許願
“リポソーム/アントラキノン薬剤組成物とその製造法”を支持するために実施
した研究において調べた。これらの研究の結果を要約すると次のとおりである。
1、PG、 PSおよびPIのような負の電荷を有するリン脂質は。
50%血漿へのDXR放出量により測定・評価すると、薬剤リポソームの安定性
を高める作用がある。負の電荷を有する脂質の最適濃度は約10〜30モル%で
ある。
2、コレステロールは、血漿へのDIR放出量で測定した場合には、約20〜5
0モル%の濃度が、PC!Jボソーム内へのDXRの保持率を2〜3倍増大させ
るが、負の電荷を有するリン脂質が存在する場合には、安定化効果が小さい。
3、コレステロールは殆んど効果がないが、負の電荷を有するリン脂質は、薬剤
封入効率を高めるようである。
4、飽和脂質は、酸化による損傷を受けてその結果貯蔵中に毒性が増大すること
が少ないが、飽和アシル鎮部分を有するリン脂質で主として構成されているリポ
ソームは、対応する不飽和アシル鎮成分で構成されているリポソームより毒性が
高い。
好ましいリポソーム組成物は、約30〜70モル%のPC,20〜50モル%の
コレステロールおよび10〜15モル%の負の電荷を有するリン脂質もしくはス
テロールを含有している。
リポソーム内での脂質およびDXR成分間の相互作用、およびDXR/Uボソー
ム内の遊離ラジカルの反応と脂質の過酸化反応とを阻止する保護剤の効果も、前
記の特許出願に報告されているように、広く研究されている。これらの研究によ
って、 DXRが、リポソーム内の酸化反応を促進し、それ自体が遊離ラジカ
ルの反応と過酸化反応とで分解することがわかった。これらの研究の重要な発見
によって、α−トコフェロールのような脂質溶解性の遊離ラジカル失活剤と、デ
スフエラルのような水溶性の3価の鉄のキレート化剤との両者を共存させること
によって、脂質および薬剤成分の酸化による損傷が、各成分単独で生じる阻止の
程度から予想される以上に。
有意に大きく阻止される。これらの結果により9分散液中の水性相と親油性相の
両方での遊離ラジカルの作用および/または過酸化作用を阻止することが、
DXR/IJポソームの酸化による損傷を効果的に阻止するために重要であるこ
とが示唆される。
本発明の組成物に用いられる親油性の遊離ラジカル捕そく剤として好ましいのは
、α−トコフェロール、またはα−トコフェロールスクシナートのような薬理学
的に許容される同族体もしくはそのエステルである。他の適切な遊離ラジカル捕
捉剤には、ブチル化ヒドロキシトルエン(BIT) 、プロピルガラードおよび
その薬理学的に許容される塩と同族体が含まれる。遊離ラジカル失活剤は、従来
の方法でリポソームを調製する際に使われる脂質成分に、一般に包含される。保
護化合物の好ましい濃度は、リポソームを構成する全脂質成分の約0.2〜2モ
ル%である。
水溶性の保護剤は、天然および合成のトリヒドロキサム酸の類から選択された鉄
枠異的キレート化剤である。これは。
3価の鉄に対する結合定数が非常に高< (1030のオーダー)。
カルシウムおよびマグネシウムのような2価のカチオンに対する結合定数が比較
的低いという特徴を有する。天然起源の種々のトリヒドロキサム酸類としては次
のようなものが報告されている:フェリクロム、フェリクロムAj、;よびアル
ボマイシンのようなフェリクロム系の化合物;フェリオキサミン類およびフェリ
マイシン類を含むフェリオキサミン系の化合物:およびフザラミン系の化合物で
ある。これらの化合物の構造と鉄との配位特性が検討されている。
好ましいキレート化剤は、フェリオキサミンBであり、またフェリオキサミンと
してはデフエロキサミン、デスフェリオキサミンBおよびデスフェラルのような
種々のものが知られている。この化合物は、並はずれた鉄との結合親和性を示し
、鉄蓄積症および鉄中前症を治療するためにヒトに非経口で用いるのに安全であ
ることが証明されている。
(以下余白)
B、薄膜水和法
上記のように、 DXR/IJボソーム分散液は、様々な周知のリポソーム調
製法によって調製することができる(例えば。
5zoka 1980年を参照されたい)。DXRのリポソーム内への最初の封
入が比較的高くなる(約95%まで)ある好ましい方法は、実施例1に示す薄膜
水和法である。この方法では、小胞形成脂質を、適切な有機溶媒もしくは有機溶
媒系に溶解し。
次いで減圧下もしくは不活性ガスの雰囲気下で乾燥して脂質膜が得られる。この
脂質膜には親油性の遊離ラジカル失活剤を含有させてもよい。好ましい組成(実
施例1による)は。
卵PC二卵P6:コレステロール:α−トコフェロールスフシネ−) (7:
3 :4 :0.2)テあル。コノ脂質11jf!;!、 DXR(7)水性懸
濁液で水和して、薬剤ニリン脂質の最終モル比を約1:50〜約1=10にする
。この処理によって、遊離DXRを除去した後におけるDXHの濃度が約2〜1
0モル%の小胞が生成する。
好ましいDXR:脂質のモル比は約1:15である。
乾燥した脂質膜を水和するのに用いる水性媒体は、ラクトースもしくはトレハロ
ースのような凍結防止剤を約1〜10%含有する発熱原性物質を含有しない水性
媒体である。この媒体としては、生理学的モル浸透圧濃度に近い濃度(約300
m0)を生ずるのに充分なり NaC]のような生理学的塩と、 DXRとを含
有するものが好ましい。水溶性の鉄キレート化剤が存在していてもよい。実施例
1で用いられる好ましい媒体は、5%のラクトース、0.45%のNaC1,5
0mMのデスフェラルpH5〜6゜および10モル%(脂質に対する百分率)の
DXRを含有している。水性媒体を上記フィルムに加えて、高速条件下で(振盪
して)もしくは低速条件下で(振盪せずに)水和させる。脂質は水和して、多重
ラメラ小胞(MLV”)の懸濁液を形成する。
そのサイズは、典型的には約0.05μ〜10μまたはそれ以上の範囲内にある
。一般に、上記の方法におけるMLVのサイズ分布は、振盪してより高速で脂質
膜を水和することによって。
より小さなサイズにすることができる。リポソームは、バルク水性相の濃度にほ
ぼ等しい濃度の封入されたキレート化剤を含有している。典型的には9分散液中
のリポソームの濃度は約70mMの脂質濃度である。
リポソーム分散液は、上記のような、約0.1μと0.5μとの間の好ましいサ
イズ範囲の選択的なサイズ分布が得られるようにサイジングされる。このサイジ
ングは、大きなリポソームを除いて、最適の薬物速度論的特性を有する所定のサ
イズ範囲を生成するのに役立つ。リポソームサイズの所望のサイズ分布を得るた
めのある好ましい方法は、細孔を有するポリカーボネート膜にリポソームを通過
させて押し出す方法である。この膜の9例えば0.1. 0.2. もしくは0
.4μのような選択された細孔のサイズは、膜を1回またはそれ以上通過させた
後のリポソームのサイズ分布にほぼ相当している。典型的には、リポソームは、
サイズ分布が安定するまで数回膜に通過させて押し出される。このサイジングの
方法は、 5zokaら、 1978年によって一般的に述べられている。
あるいは、 1986年2月28日付で出願された共有の米国特許出願第829
.710号「リポソーム押し出し法」に記載されているように、約0.2μと1
.0μとの間の孔サイズを有するセラミックフィルターにリポソーム通過させて
押し出してもよい。
リポソームのサイジングに続いて、さらに、遊離のDXR。
すなわちリポソームと密に会合していないDXRを除去する処理が分散液に対し
て行われる。この薬剤除去の目的は、遊離の薬剤の量を1分散液中の全DXHの
約10%未満のレベル、好ましくは約3%と7%との間に減少させることである
。懸濁液は、希釈後、高速遠心分離によってペレット化され、上澄液中には遊離
の薬剤と非常に小さなリポソームとが残留する。
この方法の長所は、遊離薬剤の除去と、最終的な分散液を調製するのに有用な濃
縮工程とを組み合わせたことである。他の方法では2分子ふるいクロマトグラフ
ィーによるゲル濾過法を用いてリポソームを遊離のDXR分子から分離する。あ
るいは、リポソームを選択的に残して遊離薬剤を通過させるように孔サイズを設
定した透析または透析濾過/限外濾過膜に。
分散液を接触させてもよい。この膜の遊離薬剤側には、リポソームからの遊離薬
剤の分離を促進するために、遊離のDXRと活性的に結合するイオン交換基もし
くは疎水性基が存在していてもよい。透析濾過/限外濾過法は1分散液を同時に
濃縮し得る点で、超遠心分離法と同じ長所を有する。
米国特許第4.460.577号に記載された他の方法では、薬剤/リポソーム
組成物をイオン交換樹脂もしくは疎水性樹脂層で濾過して、 DXRのような遊
離薬剤を除去する。あるいは。
分散液を通過させた際に選択的にDXRを結合し得るイオン交換基もしくは疎水
性基が表面に結合している固体担体カートリッジに1分散液を通過させてもちよ
い。このようなカートリッジはロミコン(Romicon) (ウォバーン、
MA)から入手し得る。
遊離薬剤を除去するためのある好ましい方法では、透析濾過膜を通過するDXR
を活性的に除去するように設計された透析濾過装置に1分散液を通過させる。こ
の方法は、イオン交換樹脂もしくは疎水性樹脂を、透析濾過膜の濾液側に置くか
。
または膜の濾液側の担体構造にイオン交換基もしくは疎水性基を結合させること
によって行われる。被処理液は、最終濃度が約10〇−脂質より高くなるまで膜
室を通じて循環される。
最終的な調製段階では2分散液は、少なくとも約10hMの最終脂質濃度にまで
濃縮することが好ましい。分散液を濃縮する目的は、簡単に述べれば、凍結乾燥
して貯蔵した後、凍結乾燥物を、最初に、少なくとも約100mMの濃度に再構
成するためである。同時に、再構成された濃縮物は最終のモル浸透圧濃度が生理
学的モル浸透圧濃度に近い濃度でなければならない。特に、この条件は、リポソ
ーム内外の水性相に適用されなければならない。この条件は、(a)分散液を、
生理学的モル浸透圧濃度で約100mMより高い最終濃度に調製し、この濃縮分
散液を凍結乾燥し1次いで分散液を蒸留水でほぼ同じ容量に再構成することによ
って、最も良く満足される。
上記のように、遠心分離法、透析濾過/限外濾過法、および薬剤結合樹脂の存在
下での透析濾過/限外濾過法のような遊離薬剤を除去するいくつかの方法は1分
散液を濃縮するのに役立つ。これらの方法は容易に実施することが可能であり。
少なくとも約100mMの所望の脂質濃度を得ることができる。
他の遊離薬剤除去工程を用いる場合1分散液は1通常の方法。
すなわち限外濾過法もしくは遠心分離法で濃縮される。
最終的なりXR/分散液は、以下の特性を有する:a、リポソームサイズが、主
として約0.1−0.5μの選択されたサイズ範囲内にあり。
b、リポソームに封入されたDXRは、約2〜10モル%のリポソーム脂質の濃
度において、少なくとも約90%がリポソームと会合しており;そして
C0約1%と10%との間の凍結防止剤を含有している。
分散液は、少なくとも100mMであって、生理学的モル浸透圧濃度に近い脂質
濃度を有することが好ましい。
分散液は、0.22μもしくは0.45μの通常の深層フィルターで濾過して滅
菌し、凍結乾燥して貯蔵する。
C2溶媒噴射法
ここで用いられる溶媒噴射法は、ともに1986年9月18日付で出願された共
有の米国特許出願第908.765号「高カプセル化リポソーム処理法」および
同第909.122号「高濃度リポソーム処理法」に記載された新規なリポソー
ム調製法に基づいている。これらの方法は以下の発見に基づいたものである:す
なわち9選択された溶媒噴射条件を用いることによって。
最終濃度が300〜500μmol/m1までであり、薬剤封入効率が。
水溶性化合物については60〜70%まで、疎水性化合物については90%まで
またはそれ以上のリポソームを、単一バッチ法で製造し得るという発見である。
さらに、このシステムは。
サイジングおよび/または遊離薬剤の除去を行って、所望の濃度と、リポソーム
サイズ分布と、遊離薬剤の百分率とを有する最終生成物が得られるように容易に
適応させることができる。
溶媒噴射法によってDXR/Uポソーム分散液を調製する際には9選択された溶
媒系によるリポソーム脂質の溶液が、 DXR。
凍結防止剤、塩、緩衝剤、および鉄キレート化剤を含む水性媒体が入っている混
合室内に9選択された速度で噴射される。
脂質の溶媒としては、約O〜10℃の沸点を有するものが好ましく、水性媒体は
約10〜25℃に保持するのが好ましい。上記混合室は、溶媒噴射の間、一定の
温度および圧力で保持される。水性成分および脂質成分は、注入工程の間、電動
機で駆動される羽根で攪拌される。
混合室内で形成されるリポソーム分散液は、リポソームを押し出すことによって
サイジングするように設計されたサイジング装置を通じて循環することによって
サイジングされ得る。この装置は、押し出しとサイジングとを行うポリカーボネ
ート膜もしくはセラミックフィルターを備えている。循環切り換え器を備えた押
し出し装置は、リポソーム分散液から遊離のDXRを除去する透析ユニットもし
くは限外濾過ユニットを備えていてもよい。このユニットは、リポソーム分散液
を流動させて、サイズ選択性の透析膜もしくは透析濾過膜を通じて遊離[IXR
を拡散させて、*の外側のイオン交換基もしくは疎水性基によって取込まれるよ
うに構成されている。
操作中、脂質/溶媒の溶液は、約100mMより高い所望の脂質濃度が得られる
まで、激しく攪拌しながら混合室内に噴射される。この時1分散液は、所望のサ
イズ範囲と遊離薬剤の濃度に達するまで、サイジング/薬剤除去の切り換え器に
よって再循環される。
リポソームの調製は滅菌条件下で行うことができる。また。
分散液を、溶媒噴射工程に続いて上記のようにフィルター滅菌することもできる
。次いで9分散液は凍結乾燥して貯蔵さ注射用の凍結乾燥されたDXR/IJポ
ソーム組成物を希釈した形態に調製するために、まず組成物を再構成してリポソ
ーム濃縮物を形成する。次いで、この濃縮物を、生理学的食塩水のような注射用
媒体で希釈して、非経口注射に適した希DXR/リポソーム懸濁液を形成する。
注射用の凍結乾燥組成物を調製する際に用いられる再構成/希釈工程は、希釈懸
濁液中の遊離薬剤の量を最小にするのに重要であり、以下に示すように9本発明
の重要な部分を構成する。この節では、再構成工程における凍結乾燥DXR/リ
ポソームの挙動について調べる。
A、サイズ特性
再構成されたDIR/リポソーム材料中のリポソームサイズを制御するためには
、凍結乾燥および再構成によるリポソームサイズの変化を最小にする必要がある
。本発明を確証するために行った実験によれば、凍結防止剤の非存在下でサイジ
ングされたリポソームは、凍結乾燥/再構成サイクル中、サイズがかなり増大す
る。
このことは、実施例3で報告された研究から明らかであるが、この実施例では、
125mMのトレハロース(約5%)、5%のラクトースまたは5%のマンニ
トールのいずれかを含有するリポソーム濃縮物中のサイズ変化について調べた。
0.2μのポリカーボネートフィルターに通過させて押し出すことによって製造
した元のリポソームサイズは1表1に示すように、平均して約280〜335n
g+の範囲内にある。これら3つの分散液は各々、制御された凍結室内で徐々に
凍結されるか。
あるいは液体窒素中で急速に凍結され1次いで凍結乾燥して完全に乾固される。
得られた調製物を9次に蒸留水で再構成して1元の分散液の容量とし、リポソー
ムのサイズ分布を分析した。平均的なサイズは表1の下段に示されている。表か
ら明らかなように、凍結乾燥/再構成によってリポソームサイズが変化するのを
防止するのに、トレハロースおよびラクトースは有効であったが、マンニトール
は有効ではなかった。
マンニトール処方物で観察された。リポソームサイズの増大は、凍結防止剤の糖
が存在しない場合に認められる増大に匹敵するものであった。
B、脂質の濃度
本発明の重要な局面によれば、凍結乾燥されたDXR/ !Jボソームからの、
リポソームと結合したI)XRの放出の度合が。
比較的高い脂質濃度、すなわち少なくとも約100μmol脂質/−にまず再構
成し9次いで等張の注射媒体で希釈することによって著しく減少させることがで
きることが見い出された。
再構成時の[lXR薬剤の放出に対する脂質濃度の影響は、実施例4に報告した
研究から明らかである。概略を述べれば、上記のようにして調製し、濃縮して脂
質濃度を40〜211mMに増大させた4種のDXR/ !Jポソーム分散液に
ついて、まず遊離DXHの百分率を測定した。この測定は、実施例4で詳細に説
明するように9分子ふるいクロマトグラフィーによって行った。表2に示すよう
に、各処方物は11%と13%との間の遊離口XRを含有していた。
凍結乾燥後、乾燥組成物を、250μm(元の容量の′A)もしくは500μl
(元の容量)の蒸留水で再構成し、再構成された処方物を、遊離DXjlの百分
率について再度分析し、結果を表2の下2行に示した。表2から明らかなように
、凍結乾燥物を40mMもしくは54mMに希釈すると(最初の2欄の第3行)
。
遊離DXRの量が7〜8%増大したが、高濃度では(80〜422mM) 。
遊離DXRの増大はせいぜい4%であることが観察された。
同様の結果が、実施例4に報告した第2の研究で得られた。
この実施例では9表2に示す脂質濃度を有し、かつ凍結乾燥前の遊離薬剤濃度が
約6%であるようなりXR/リポソーム分散液を凍結乾燥し、蒸留水で再構成し
て9元の容量とした。
表3の右欄には、再構成後の遊離薬剤の百分率の測定値を示す。上記のように、
再構成後の脂質濃度が約100a+Mより低い場合、遊離薬剤の最終濃度は約8
〜9%増大した。脂質濃度が高い場合、その増大は約3〜4%であった。
(以下余白)
再構成を行いリポソーム濃縮物を形成した後は、さらに等張媒体で希釈しても得
られた懸濁液中の遊離薬剤の濃度(%)については、殆んど影響がないかまたは
全く影響がないようである。例えば、脂質濃度が約130mMで、遊離薬剤の測
定濃度が約11%の再構成されたリポソーム濃縮物は、4℃で4週間貯蔵した後
にも遊離DXR濃度(%)が認知できるほどの変化を起こすことなく9等張媒体
で1=30または1:60に希釈することが可能である。またさきに報告した。
遊離薬剤もしくは結合薬剤の割合(%)は、すべて分子ふるいクロマトグラフィ
ーで測定され、この方法自体、試験されるべきDXR/リポソーム濃縮物もしく
は懸濁液の数倍の希釈液をつくりだすこともまた。銘記すべきである。
しかし、上記濃縮物をさらに希釈すると、希釈媒体が低張媒体の場合には、リポ
ソームからDXRが放出される場合がある。このことは、実施例5の実験で示し
たように、高濃度脂質の場合にもあてはまる。ここでは、5%ラクトースと0.
45%の生理的食塩水中138mMの脂質を含有するDXR/IJポソーム分散
液を、 0.5mfずつ凍結乾燥し1次に、蒸留水の量を504から50M!
にまで増加させて再構成した。再構成に続いて室温で1時間静置した後、濃縮物
を蒸留水で希釈して、はぼ最初の濃度(138mM)とした。したがって9例え
ば表4に示す最初の試料は、 5M!で再構成しくもとの濃度の10倍)9次に
450111の蒸留水でさらに希釈し約1倍の濃度とした。一方。
この表に示す最後の試料は、 500Jiの蒸留水で直接再構成され、1倍の
最終濃度とした。表4は、得られたDXR/IJボソームに結合しているDXR
の割合(%)を、各試料について同じ処理をした2つの試料を分子ふるいクロマ
トグラフィーで測定した結果を示す。その結果かられかるように、高張性のリポ
ソーム膨潤をより大きく引き起こす希釈条件によっても。
リポソームと結合したDXRの損失が一層大きくなる。
再構成またはリポソームの膨潤を起こす条件下でのDXR/リポソームは、遊離
薬剤の放出量を有意に増大するので、再構成時の低張性の膨潤がDIRの放出を
増大するのか否かを決定することは興味深い問題である。ここでは等偏分散液と
して調製したDXR/IJボソーム(約300m0)を凍結乾燥し、蒸留水もし
くは0.9%NaC]溶液のいずれかで最終脂質濃度が約1501IIMとなる
まで再構成した。蒸留水で再構成した場合には。
バルク相の媒体はリポソームの内部領域と等張であり、他方。
等張食塩水で再構成した場合には、外側のバルク相は、リポソームの内部領域の
ほぼ2倍の浸透圧モル濃度を有し、いくらかリポソームの収縮を引き起こすと考
えられる。あらかじめ凍結乾燥された分散液中の遊離薬剤の割合(%)は約4%
である。いずれの再構成媒体の場合も、再構成後の遊離DXRの割合(%)は約
6〜7%である。この結果により、再構成時の少なくともゆるやかな収縮は、再
構成媒体中への遊離DXHの放出が増大しないので、許容され得ることが示され
る。
上記データには3つの著しい特徴がある。第1に、凍結乾燥されたリポソームの
再構成は、リポソームと結合したDXRのいくらかの損失を必らず引き起こすと
いうことである(リポソーム濃縮物を4℃で数カ月間貯蔵した際に遊離DXRの
増大を示さないので、凍結乾燥時に観察されるDXRの漏洩は凍結乾燥の工程に
関連していることが分かる)。このことは。
リポソームの再構成時に、 DXRがリポソームから放出されるような膜の変
化が短期間の間起こることを示している。この損失は、この発明のひとつの態様
に従い、リポソームを比較的濃縮された溶液に再構成することによって、最小に
することができる。この現象について考えられる説明は、薬剤が膜から放出され
る短期間の間に、薬剤は、再構成媒体中の脂質相とバルク水性相の相対濃度に比
例して、該媒体中の脂質相とバルク水性相との間に急速に分配されるということ
である。
脂質の濃度が高ければ、再構成中のリポソームへの分配が優先する。あるいは、
再構成中の膜の変化の度合と薬剤の放出は、リポソームの濃度が高い場合には少
ないかもしれない。
第2に、 DXR/リポソーム濃縮物は、貯蔵期間を延長しても、遊離薬剤の
大きな放出なしに等張希釈媒体で希釈できる。
この挙動は、リポソームに結合しているDXRが、動的平衡交換によって制御さ
れておらず濃度に依存していることを示している。むしろ、 DXRのリポソ
ームからの放出(そしておそら< DXRのリポソームへの結合)は、再構成中
または浸透圧膨潤の条件下のような膜が摂動する期間にのみ起こることは明らか
である。この特徴によって、それ自体遊離薬剤の含量が最小のこの発明のリポソ
ーム濃縮物は、遊離薬剤の割合(%)を大きく増大させることなく、注射用に希
釈することができる。
第3に、再構成時のゆるやかな収縮は、遊離薬剤の放出には全く影響がないよう
であるが、リポソームの膨潤によって。
再構成された膜からの遊離DXRの放出はかなり増大する。この特徴によって、
この発明の方法に用いるのに適した希釈媒体の性質にはある種の制限を必要とす
る。典型的には、最後の希釈媒体は生理的食塩水であるが、この場合、リポソー
ム濃縮物は、リポソームの大きな膨潤を避けるために、生理食塩水の量は約2倍
をこえてはならない。凍結乾燥されたリポソームを少なくとも約0.5の生理的
浸透圧モル濃度(約300m0)の最終浸透圧モル濃度に再構成することによっ
て、低張性の収縮をも避けることが好ましい。この発明の好ましい態様では、リ
ポソーム分散液は、生理的浸透圧モル濃度で調製され。
蒸留水でもとの濃縮体積に再構成され9次に生理食塩水で希釈される。希釈され
た注射用懸濁液の最終濃度としては、約2〜20a1Mの脂質濃度であることが
好ましい。
C0温度条件
貯蔵温度と再構成時の物質の温度の、遊離薬剤放出に対する影響も試験した。そ
の結果を実施例6に示す。簡単に述べると、凍結乾燥した口XR/リポソームを
、数日間20℃または4℃で貯蔵し、試料を、貯蔵温度でまたは凍結乾燥物を室
温と平衡化させた後に、室温の蒸留水でもとの体積に再構成した。すべての場合
において、リポソームと結合した口XHの割合(%)は9表5のデータかられか
るように約90〜92%であった。このように、貯蔵温度または凍結乾燥物の温
度は、再構成時におけるリポソームからの遊離薬剤の放出度には殆ど影響がない
か全く影響がない。
IIl、 DXR/リポソームの投与
この節では、この発明のDXR/リポソーム処方物の臨床環境(その調製条件お
よび貯蔵条件を含む)での、調製および利用、そして、腫瘍の治療における有用
性を調べる。
A、調製および貯蔵
このDXR/IJボソーム処方物は凍結乾燥組成物として供給される。第■節で
述べたように、その組成物は、予めきめられた量の水性媒体で再構成される場合
、以下の事柄により特徴づけられる:
a、リポソームの濃度が約100mMリポソーム脂質より大きく。
b、リポソームサイズが主として約0.1〜0.5μの選択されたサイズ範囲内
にあり。
c、リポソームで封入されたDXRが、約2〜10モル%の脂質濃度において、
そしてリポソーム結合DXRの約85〜95%であり、そして。
d、凍結防止剤が約1%と10%との間で含有されている。
この組成物は、蒸留水で、リポソーム分散液のもとの体積に再構成するのが好ま
しい。
この凍結乾燥された組成物の利点は、脂質が大きく酸化分解もしくは加水分解す
ることなく冷凍庫内もしくは室温下で長期間貯蔵できるということである。同時
に、バルク相の媒体に対してごく僅かなりXRが失われるだけで、0.1〜0.
5ミクロンの粒径範囲の所望の選択されたリポソームのサイズ範囲を有する濃縮
物に再構成することができる。
調製に便利なようにまた薬剤の損失を最小にするために。
凍結乾燥物を複数回投与用の量で供給するのが好ましい。これはいくつかの部分
に分かれており、再構成されるときに。
希釈により9個々の量で薬剤投与を行うことができる。例えば、凍結乾燥物は9
合計的2On+mo 1の脂質中1gのDXR(約1.84mrnol)を含有
する量で供給してもよい。この凍結乾燥物は。
次に、約100rn1の蒸留水で再構成され、約200mMの最終脂質濃度にす
る。このリポソーム濃縮物は、検討したように、α−トコフェロールとデスフェ
ラルで保護される場合、有意に分解することなしに、4℃で数週間貯蔵できる。
一般に、約100〜150m1の静脈点滴合計量巾約25〜100■の個々の投
与量が、化学療法の投与に最適である。単一の希釈された投与物は、滅菌食塩水
で簡単に希釈することによって上記濃縮物から容易に調製することができる。例
えば、50■の投与量を投与するために、濃縮物の5d文を取出して。
約1201n1.0滅菌食塩水に加え、そしてこの懸濁液は、従来の手法により
静脈点滴などによって供給される。あるいは、注射器によって注射するためには
、濃縮物は、投与用に、好ましくは25〜50mff1のより小さな容積に希釈
されうる。このように、この濃縮物は、約10〜40個の個々の投与物を調製す
るのに利用することができる。
あるいは、凍結乾燥物は、別個の投与形態9例えば1個々のシールされたコンパ
ートメントに、(a)所望量の凍結乾燥DXR/リポソーム組成物、う)凍結乾
燥組成物と混合した場合に。
DXR/リポソーム濃縮物を形成するのに充分な量の再構成用媒体、および(C
)希釈媒体を入れた複数コンパートメントパッケージで供給してもよい。最初に
(a)と(ロ)のコンパートメントを混合することによって濃縮物を形成し9次
いで、得られた濃縮物とコンパートメント(C)を混合することによって最終の
希釈媒体が得られる。
B、腫瘍治療における治療用途
さきに挙げた特許出願“リポソーム/アントラキノン薬剤組成物とその製法″に
記載された初期の試験により次のことが示されている。つまり小さな、薬剤を保
持するリポソームは、肝臓の洞様毛細管および実質、膵臓および骨髄のような組
織領域(比較的小さなリポソームが近づきやすい)にリポソームと結合した薬剤
を集中させることができるということが示されている。これらの知見は、肝臓の
転位性疾患、原発性肝癌、リンパ球の増殖性疾病および白血病(これらは、その
数および患部の分布の両者から、すべて主要な癌である)の治療に重大な関連が
ある。
肝臓の転位性腫瘍を治療するためにDXR/IJボッ、−ムを用いる臨床試験が
行われている。今までに得られた治療結果は。
胃腸毒性(吐気、嘔吐、下痢および口内炎)が事実上完全に消失し、注射部位の
痛みがないために、リポソームに封入された[lXRによって全患者の快適さが
著しく改善されたことを示している。この結果はある種の癌をDIRで治療した
際に大きく改善されたことを示している。さらに、治療を受けた患者の脱毛症が
有意に軽減され、治療の効力(このことは、腫瘍の大きさの変化で証明されてい
る)は、遊離のDXR単独の場合と同様に良好か、またはより優れているように
思われる。
種々の割合(%)で遊離のDXRを含有するDXR/リポソーム懸濁液の臨床試
験は、懸濁液中の遊離DXHの割合(%)が減少するにつれて、副作用が著しく
減少することを示している。
上記の事柄から1本発明の種々の目的および特徴がいかに合致しているかが理解
され得る。この発明の凍結乾燥組成物は、長期間にわたって(数カ月以上に至る
まで)、冷凍庫もしくは室温で、脂質もしくは薬剤成分が分解することなく貯蔵
できる好都合で安定な形態のDXR/リポソームを提供する。
この凍結乾燥組成物は、所望のリポソームのサイズ分布を有しかつ少なくとも約
85%のより典型的には90〜95%の、リポソームと結合したDXRを含有す
る濃縮物に、容易に再構成することができる。その濃縮物は9次に、リポソーム
のサイズもしくはリポソームと結合した薬剤の割合(%)を大きく変化させるこ
となく、非経口投与用に希釈することができる。
希釈された媒体は、リポソームのサイズ分布によって有利な生体分布特性を有し
:そして、リポソームおよびDXR成分が元のままの状態であることと、遊離D
XRの比率が低いということとにより、毒性が低い。
以下の実施例においては1本発明により調製されたDXR/リポソームの濃縮物
および懸濁物の製造法および特性を示す。
しかし、これらの実施例は、この発明の範囲を限定するものではない。
材料
ドキンルビシン塩酸塩(DXR)は、 Laboratoire Roger
Be1lon。
SAから入手し、 EPCおよびEPGはAvanti Po1ar Lip
ids Inc。
(アラバマ州、ハーミンガム)から入手し;コレステロール。
α−トコフエロールスクシナート、ラクトースおよびマンニトールはSigma
Chea+1cal (ミズーリ州、セントルイス)から入手し;デスフェラ
ルはCIBA にュージャージー州、サミット)から入手し;そして脱水トレハ
ロースはp(anstiehllaboratories Inc、 (イリ
ノイ州、ウオーケガン)から入手した。
(以下余白)
実施例1
凍結乾燥DXR/IJボソームの調製
518、6■のEPC,210,4■のEPG、 140.0■のコレステロ
ール、 オヨヒ9.8■のα−トコフェロールスクシネートを含有する脂質のク
ロロホルム溶液を調製した。減圧下にて溶媒をロータリーエバポレータで蒸発さ
せて除去し1次いで50J )Igより低い減圧下に試料を2時間さらして、溶
媒残留物を除去した。2.67mg/+++j!のDXRと、5%ラクトースと
、0.45%NaC1と、50浦デスフエラルとを含有する水溶液20m1を、
乾燥脂質(PC: PG :コレステロール:α−トコフェロールスフシネ−)
: DXRノモ、+t、比=7:3:4: 0.2:1)i:添加した。
さらに、直径6mmのガラスピーズ約20個が、脂質の水和を促進するめに加え
られた。次いで、この混合物を、室温にて、2〜3時間9手で振盪した。このよ
うにして形成されたMLVを。
加圧下にて、50dアミコン(Amicon)限外濾過セルの0.2μポリカー
ボネート膜に通過させて5回押し出した。DXR/リポソームは、調製工程のこ
の段階で、以下の特性を有していた。
(a) IJポソームに取込まれた全DIRは、最初に添加された薬剤の量の8
5〜90%であった(セファデックス(Sephadex)ゲル浸透クロマトグ
ラフィーによって測定):(6)全脂質濃度は、55〜68Amol/mj’で
あった(存在する有機ホスフェートによって測定)。
(C)調製物の平均粒子サイズは、直径300〜400nmであった(動的レー
ザ光散乱法で測定):
(6)最終リポソーム濃度2.5urnol/m&で、1時間、37℃にて。
50%ヒト血漿とともに調製物をインキュベートした後、全DXRの80%が依
然としてリポソームと会合していた。
DXR/リポソーム分散液を、ダウエックス([lowex)イオン交換樹脂(
19■のダウエックス50 X4−400樹脂を、1■のDXNに対して用い
た)を用いて、室温にて10分間処理して、遊fiDXRを約5%より少なくし
た。樹脂材料を除去した後、遠心沈降法で、リポソームの濃度を約15OA+!
+101/−にした。
この濃縮されたリポソーム調製物の試料500dを個々のガラスびんに区分けし
、貯蔵温度を5℃に設定した凍結乾燥器(Virtis Lyophilize
r)内に入れた。試料の温度が5℃で平衡になったとき、貯蔵温度を一5℃に下
げた。試料の温度が一30℃〜−35℃に到達したときに、減圧にした。試料を
、−35℃で48時間、5−8gより低い減圧下で凍結乾燥した。このとき、4
時間で貯蔵温度を25℃にあげた。次いで、試料を減圧下で密閉し、使用するま
で4℃で貯蔵した。
ガラスピーズを脂質水和混合物に添加しないこと以外は実施例1に記載した手順
を用いて、 125mM )レバロース−0,45%NaC1中か、5%ラクト
ース−0,45%NaC1中か、あるいは10mMのトリス−塩酸(pH7,4
)にDXRを含有する5%マンニトール中にリポソームを調製した。ポリカーボ
ネート膜を用いた押し出し工程の後に、上記3つの調製物の各々Grnlずつを
、10mM)リス−塩酸−0,9%NaC1で6倍に希釈し、そして約150.
000×gで30分間ペレット化した。次いで、得られたペレットを。
適切な凍結防止剤を含有する10m1の緩衝液に懸濁させた。この時点では、全
DXRの約30%はリポソームと会合していなかった。500JJ1の試料を、
液体窒素にさらすか、あるいは制御された冷凍室(クライオメッド、 Cryo
med )内に入れることによって凍結した。次の凍結乾燥および再構成の工程
は、実施例1に記載したように行った。粒子サイズの測定は、凍結乾燥前または
凍結乾燥後の(再構成された)試料を、適切な糖の溶液で200倍に希釈し、動
的レーザ光散乱測定装置(Nicon+pモデル200.メリーランド)を用い
て行った。以下の表1に示す粒子サイズのデータから明らかなように、トレハロ
ースおよびラクトースの両方は、凍結乾燥時および再構成時にリポソームサイズ
が増大するのを効果的に防止した。
表1
粒子サイズ (nm)
125nM )レバロース 5%ラクトース 5%マンニトー
ル元の試料 284 303 335低速冷凍 24
7 266 779急速冷凍 257 269
696実施例4
リポソームをダウエックス樹脂で処理しないことを除いて。
実施例1の記載と同様にして、リポソームを調製した。ポリカーボネート膜を用
いた押し出しを行った後、調製物の一部を、0.9%NaC1−5OA!Mデス
フエラルで10倍に希釈し、そしてリポソームを150.0OOX gで1時間
ペレット化した。次いでこれらのリポソームペレットを、5%ラクトース−0,
45%NaC]−50JJXデスフェラル中に、各種の脂質濃度(40,54,
143゜211 mM)で再懸濁させた。これらの調製物は、この時点で11〜
12%の遊離DXRを含有していた。これらの各試料の5004ずつを、実施例
1に記載したようにして凍結乾燥した。250Iもしくは50M!の蒸留水を加
えることによって、凍結乾燥物を再構成した。遊離DXHの百分率を、試料をセ
ファデックスG−50のカラムを通過させ、カラムのボイドボリュームで溶出し
たリポソームのピークに対するカラムのベッドボリュームで遊離DXNとして溶
出したピークからDXNO量を分析することによって測定した。500J11の
蒸留水で再構成した試料は。
0.9%食塩水−504デスフエラルで平衡化したカラムで分析した。他方、
25M!の水で再構成した試料は、1.8%食塩水−50」デスフェラルで平
衡化したカラムで分析した。分析試料中の遊離OXRの百分率を表2に示す。結
果については、上で検討したとおりである。
表2
遊離口XN %
40mM 54mM 143mM 211mM元の試料 1
3% 12% 13% 11%250ラムダ水 16% 13
% 12% 15%500ラムダ水 22% 20% 16
% 16%215 91%
2番目の試験では、リポソームを実施例1に記載したようにダウエックス樹脂で
処理して、遊離OXRのレベルを、遠心分離によるペレット化で、リポソームを
濃縮する前の5〜6%にしたことを除いては1表2に記載したようにしてDXR
/リポソームを調製し、そして凍結乾燥した。凍結乾燥物を500扉の蒸留水で
再構成し、標準的なセファデックスG−25遠心分離法を用いて、遊離DXNの
百分率を測定した。リポソーム結合薬剤の百分率を表3に示す。
表3
脂質濃度 DXN取込み%(膚o 1 / ml )
(再構成後)181 90%実施例1に
記載したのと同様にして、リポソームを調製し。
そして凍結乾燥した。凍結乾燥前の試料は6%の遊離[IXRを含有し、この試
料の脂質濃度は110Aaol/mfであった。凍結乾燥物を4%または一20
℃で2週間貯蔵し9次いで表5に記載の手順にしたがって、 500mの水で
再構成した。DXRの百分率%を、前記のセファデックスG−25遠心分離法に
よって分析した。表5に示すDXHのリポソーム結合に関するデータから明らか
なように、リポソームからの遊離薬剤の放出は、貯蔵および再構成の温度には実
質的に無関係であった。
表5
再構成条件 DXN取込み%−20℃で貯蔵し、水を添加(室温
) 90%−20℃で貯蔵し、試料を室温で(2時間)平衡化し、
水を室温で添加 91%4℃で貯蔵し、水を室温で添加
92%そして凍結乾燥した。凍結乾燥した試料を、凍結乾燥した直
後に再構成した。再構成した試料を4℃で貯蔵し、セファデックスG−25遠心
分離法を用いて、下記の表6の左欄に示す異なる貯蔵時間の時点における遊離D
XHの百分率を測定した。
この表には、指定の貯蔵期間経過後に測定したリポソーム結合DXRの百分率も
示されている。
084%
1488%
3089%
6090%
本発明は、特定の処方物、調製条件、および用途について記載されているが1本
発明から逸脱することなく種々の改変を実施できることは明らかである。
Claims (15)
- 1.所定容量の水性媒体で再構成された場合にリポソーム濃縮物を与える,凍結 乾燥されたアドリアマイシン/リポソーム組成物であって, a.リポソームの濃度が約100mMリポソーム脂質より大きく, b.リポソームサイズが主として約0.1〜0.5μの選択されたサイズ範囲内 にあり, c.リポソームで封入されたドキソルビシンが,約2〜10モル%の脂質濃度に おいて,全ドキソルビシンの約85〜95%であり, d.凍結防止剤が約1%と10%との間で含有されている,ことを特徴とするリ ポソーム組成物。
- 2.蒸留水で再構成された場合に,実質的に生理学的モル浸透圧濃度であること を特徴とする,請求項1に記載の組成物。
- 3.リポソームに封入されたα−トコフェロール,あるいはその薬学的に受容可 能な類似体,誘導体,またはエステルをさらに含有する,請求項1に記載の組成 物。
- 4.水で再構成される場合に,前記濃縮物中に存在する3価の鉄に対して過剰モ ル濃度のトリヒドロキサム酸キレート化剤をさらに含有する,請求項1に記載の 組成物。
- 5.前記リポソームが,約30〜70モル%のホスファチジルコリンと,20〜 50モル%のコレステロールと,約10〜50モル%の負に荷電したリン脂質ま たはステロールとを含有する,請求項1に記載の組成物。
- 6.再構成されたドキソルビシン/リポソーム濃縮物であって, a.リポソームの濃度が100mMより大きく,b.リポソームサイズが主とし て約0.1〜0.5μの選択されたサイズ範囲内にあり, c.リポソームで封入されたドキソルビシンが,約2〜10モル%のリポソーム 脂質濃度において,全ドキソルビシンの約85〜95%であり, d.凍結防止剤が約1%〜10%で含有されている,ことを特徴とするリポソー ム組成物。
- 7.実質的に生理学的モル浸透圧濃度であることをさらに特徴とする,請求項6 に記載の組成物。
- 8.リポソームに封入されたα−トコフェロール,あるいはその薬学的に受容可 能な類似体,誘導体,またはエステルをさらに含有する,請求項6に記載の組成 物。
- 9.懸濁液中に存在する3価の鉄に対して過剰モル濃度のトリヒドロキサム酸キ レート化剤をさらに含有する,請求項6に記載の組成物。
- 10.リポソームが,約30〜70モル%のホスファチジルコリンと,20〜5 0モル%のコレステロールと,約10〜50モル%の負に荷電したリン脂質また はステロールとを含有する,請求項1に記載の組成物。
- 11.癌の化学療法において静脈投与することを目的とした,リポソームに封入 された約85〜90%のドキソルビシンを含有するドキソルビシン/リポソーム の製造方法であって,a.リポソームサイズが主として約0.1〜0.5μの選 択されたサイズ範囲内にあり, b.リポソームで封入されたドキソルビシンが,約2〜10モル%のリポソーム 脂質濃度において,全ドキソルビシンの少なくとも約90%であり, c.凍結防止剤が約1%〜10%で含有されている,ことを特徴とするリポソー ム分散液を調製すること,この濃縮物を凍結乾燥して,脱水されたドキソルビシ ン/リポソーム組成物を形成すること, 得られた脱水組成物を,水性媒体で再構成して最終リポソーム濃度を約100m M脂質より大きくすること,得られた再構成組成物を,生理学的水性媒体で希釈 して,静脈注射に適した最終リポソーム濃度とすること,を包含する製造方法。
- 12.前記リポソーム濃縮物が,リポソームに封入されたα−トコフェロール, あるいはその薬学的に受容可能な類似体,誘導体をさらに含有する,請求項11 に記載の方法。
- 13.前記リポソーム濃縮物が,懸濁液中に存在する3価の鉄に対して過剰モル 濃度のトリヒドロキサム酸キレート化剤をさらに含有する,請求項11に記載の 組成物。
- 14.前記リポソームが,約30〜70モル%のホスファチジルコリンと,20 〜50モル%のコレステロールと,約10〜50モル%の負に荷電したリン脂質 またはステロールとを含有する,請求項11に記載の組成物。
- 15.前記リポソーム分散液が,少なくとも約100mMの脂質濃度と,生理学 的モル浸透圧濃度に近いモル浸透圧濃度とを有し,前記再構成物が該脂質分散液 の脂質濃度に近い量で蒸留水または希釈食塩水を含有する,請求項11に記載の 方法。
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