NO180363B - Beskyttelsesmiddelblandinger for stabilisering av liposomer under törking - Google Patents

Description

Den foreliggende oppfinnelse vedrører beskyttelsesmiddelblandinger for stabilisering av liposomer under tørking.

Disse og andre trekk fremgår av de etterfølgende patentkrav.

Denne oppfinnelse muliggjør generelt fremstilling av liposomer som er stabile under tørking og som kan inneholde medikamenter eller andre terapeutiske midler, diagnostiske midler eller andre materialer av biologisk eller farmakologisk interesse. Liposomene kan fremstilles i nærvær av en kombinasjon av minst et sukker og minst et protein, polypeptid og/eller oligopeptid, hvoretter etter rekonstitusjon av det tørkede stabili-serte liposom, liposombilaget opprettholdes, aggregasjon eller fusjon unngås, og graden av medikamentinnkapsling som kan oppnås ved rekonstitusjon forbedres sterkt.

Liposomer beskrives ganske omfattende i litteraturen og deres struktur er velkjent. Liposomer er unilamellære eller multilamellære lipidvesikler som inneslutter et eller flere fluidrom. Veggene av liposomene dannes av et bilag av en eller flere lipidkomponenter med polare hoder og ikke-polare haler. I en vandig (eller polar) oppløsning orienteres de polare hoder av et lag utover for å strekke seg inn i det omgivende medium, og de ikke-polare haledeler av lipidene assosierer med hverandre, slik at det tilveiebringes en polar overflate og en ikke-polar kjerne i veggen av liposomet. Unilamellære liposomer har ett slikt bilag, mens multilamellære liposomer generelt har et flertall av hovedsakelig konsentriske bilag.

En rekke forskjellige metoder for fremstilling av liposomer er kjent, hvorav mange er blitt beskrevet av Szoka og Papahadjo-poulos, Ann. Rev. Biophysics Bioeng. 9: 467-508 (1980) og i Liposome Technology, Preparation of Liposomes, Vol I, Gregoriadis (Utgiver), CRC Press, Inc. (1984). Flere liposom-innkapslingsmetoder er også kjent fra patentlitteraturen, særlig i US patentskrift nr. 4.235.871 utstedt til Papahadjo-poulos et al., den 25. november 1980 og i US patentskrift nr. 4.016.100 til Suzuki et al., 5. april 1977.

Liposomer er kjent å være nyttige for innkapsling av medikamenter og andre terapeutiske midler og for å føre disse midler til selekterte in vivo seter. Medikamenttilførsel via liposomer kan resultere i redusert giftighet, endret vevsfordel-ing, økt medikamentetfektivitet og en forbedret terapeutisk indeks. Se generelt M.J. Poznansky og R.L. Juliano, Biologi-cal Approaches to the Controlled Delivery of Drugs: A Critical Review in Pharmacological Review, 36, 296-305 (1984); B.E. Ryman og D.A. Tyrrell, Liposomes -- Bags of Potential in Biochemistry, 21, 49-98 (1980).

Liposomer har også vært anvendt med hell for innføring av forskjellige kjemiske substanser, biokjemiske substanser, genetisk material og lignende inn i levedyktige celler in vitro, og som bærere for diagnostiske midler. Se generelt M.J. Poznansky og R.L. Juliano, supra; B.E. Ryman og

D.A. Tyrrell, supra.

Nylig er unilamellære liposomer blitt viktige innen flere forskningsområder som arbeider med membranmedierte prosesser som membranfusjon, interfacial katalyse, energikonduksjon og -konversjon, medikamenttilførsel og målsøking. Denne type forskning har allerede ført til industrielle anvendelser av unilamellære og multilamellære liposomer for medikamenttil-førsel og diagnostisk avbilding.

Selv om innkapsling av terapeutiske midler og diagnostiske midler i liposomer har vesentlig kommersielt potensial, er en vesentlig vanskelighet som man støter på ved kommersiell fremstilling av liposominnkapslede produkter mangelen på langtidsstabilitet av selve liposomet og/eller det eller de innkapslede midler.

Liposomal stabilitet ved lagring defineres generelt som den grad hvormed et gitt preparat bibeholder både sin opprinnelige struktur, kjemiske sammensetning og størrelsesfordeling og når dette er aktuelt, dets innhold av innlemmet middel, uansett om dette er av terapeutisk eller diagnostisk art. Ustabilitet kan f.eks. forekomme når liposomstørrelsen øker spontant ved henstand som et resultat av fusjon av sammenstøtende liposomer. Noen små unilamellære liposomer (SUV) fremstilt av zwitterioniske fosfatidylcholiner har tendens til å aggregere og/eller fusjonere til store multilamellære lipidpartikler ved romtemperatur. De større liposomer vil fremvise drastisk forskjellige farmakokinetiske egenskaper in vivo på grunn av at deres størrelse bestemmer deres utskillingstakter og vevs-fordeling. F.eks. blir store liposomer fjernet fra sirkulasjonen hurtigere enn mindre. I tillegg kan liposomer i en vandig liposomdispersjon aggregere og utfelle som et sediment. Selv om slike sedimenter vanligvis kan redispergeres kan strukturen og størrelsesfordelingen av den opprinnelige dispersjon endres. Endelig er en ytterligere viktig faktor med hensyn til ustabilitet at innlemmede substanser med lav molekylvekt vil ha tendens til å lekke ut fra lagrede liposomer. Se generelt G. Gregoriadis, Liposomes for Drugs and Vaccines i Trends in Biotechnology, 3, 235-241 (1985). Slik lekkasje kan representere en vesentlig andel av det totale innhold av midlet i liposomene.

Forskning rettet på forlengelse av den liposomale stabilitet ved lagring har inkludert liposomkonservering i form av frysetørking. Frysetørking refererer til den prosess hvorved en substans fremstilles i tørr form ved frysing og dehydratisering. Et liposom kan frysetørkes med eller uten innhold av terapeutiske midler, diagnostiske midler eller andre midler av biologisk interesse. Hvis de frysetørkes uten slike midler kan slike midler deretter innføres etter rekonstitusjon av liposomene ved hjelp av metoder som er vel kjent på området. Andre tørkemetoder enn frysetørking kan anvendes i oppfin-nelsens sammenheng, f.eks. tørking ved forstøvning, tørking i skåler og tromler, såvel som den tørkeprosess som er omhandlet i US patentsøknad med løpenr. USSN 018.190 som innlemmes heri som referanse.

Det er vanlig at liposomene går i stykker under tørking når kryobeskyttende midler ikke anvendes. Dette bevirker lekkasje eller frigivelse av det innkapslede innhold. I tillegg blir prosessen med fusjon og aggregasjon av unilamellære vesikler sterkt aksellerert når de underkastes fryse-tining eller dehydratisering. Det er vist at små unilamellære vesikler av egg-fosfatidylcholin vender tilbake til store multilamellære strukturer ved frysing og tining. Det vises til G. Strauss og H. Hauser, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 83, 2422 (1986).

Kryobeskyttende midler kan anvendes for å beskytte det dehydratiserte produkt og holde det i en tilstand egnet for fremtidig bruk. Det dehydratiserte produkt kan så rekonsti-tueres ved tilsetning av destillert vann eller passende oppløsning. Hydrofile substanser som dekstran, mannitol, laktose og polyvinylpyrrolidon er velkjent på området som kryobeskyttende midler for celler og vev (MacKenzie, A.P.

(1976) Develop. Biol. Standard 36, 51-67) såvel som volum-givende midler for biologiske og farmasøytiske midler som frysetørkes. MacKenzie, A.P. (19 66) Bull. Parenteral Drug Association 20, 101-129.

Sukrose ble anvendt for å beskytte soyabønnefosfolipid-vesikler (liposomer) med membran-assosiert cytokromoksydase mot skade under frysetørking. Det vises til Racker, E. (1972) J. Membrane Biol. 10, 221-235. Målet på intaktheten av fosfolipid-vesiklene var forholdet mellom opptak av oksygen med og uten tilsetning av en respirasjons-utløser. Dette forhold benevnes respirasjonskontroll (RC). Etter frysetørking og rekonstitusjon med vann var respirasjonskontrollen fullstendig opphevet (RC=1,0). Tilsetning av sukrose til vesikkel-suspensjonen før frysetørkingen beskyttet imidlertid mot skade. Økende konsentrasjoner av sukrose opp til 0, 4M økte progressivt respirasjonskontrollen etter frysetørking til et maksimum på omtrent RC=2,25. Forfatteren konkluderte at sukrose beskytter den strukturelle organisering av fosfolipidene under frysetørking.

Andre forsøk innbefattende liposomer fremstilt av eggfos-fatidylcholin eller 90 % palmitoyloleylfosfatidylcholin/ 10 % fosfatidylserin er foretatt hvor et disakkarid som trehalose, sukrose eller maltose var tilstede både på innsiden og utsiden av liposombilaget. Det vises til Madden, T.D. et al (1985) Biochim. Biophys. Acta 817, 67-74; og Crowe, L.M. et al. (1985) Arch. Biochem. Biophys. 242, 240-247. Disse lipider benevnes "fluide" på grunn av at de foreligger i en flytende krystallinsk fase når de er hydratisert ved romtemperatur. Forsøk foretatt av Dr. John og Dr. Lois Crowe ved University of California i Davis indikerer at disse disakkarider alene virker som kryobeskyttende midler under frysetørk-ing av store unilamellære liposomer sammensatt av flytende fosfolipider, og undersøkelsene konkluderer med at 100 % retensjon oppnås når et disakkarid er lokalisert både på innsiden og på utsiden av liposomet. Crowe fant også ut at forholdet mellom sukker og fosfolipid er nøkkelparameteren til heldig frysetørking snarere enn den absolutte konsentrasjon av sukker i oppløsning. Å anordne kombinasjonen av minst ett sukker og minst ett protein, polypeptid og/eller oligopeptid både innenfor og utenfor liposombilaget, som representerer en utførelsesform av den foreliggende oppfinnelse, gir stort sett de samme resultater. Ekteparet Crowe fant imidlertid ut at bare 42 % av den aktive bestanddel ble holdt tilbake hvis disakkaridet bare ble tilsatt til utsiden. Det vises til L.M. Crowe et al., Biophysical Journal, 47, 248a (1985).

Liposomer nyttige for stabil innkapsling av farmasøytiske forbindelser som skal føres til in vivo steder krever ofte fosfolipider av en mindre flytende natur som f.eks. dipalmi-toylfosfatidylcholin (DPPC) eller distearoylfosfatidylcholin (DSPC) og inkluderer vanligvis kolesterol for å styrke membranbilaget. Kolesterol i liposombilag kan imidlertid føre til mer lekkasje og mer fusjon ved frysetørking og rehydratisering enn for den samme liposomsammensetning uten kolesterol. Det vises til Crommelin, D.J.A. og vanBommel, E.M.G. (1984) Pharmaceutical Research 3, 159-163.

Aggregasjonen av unilamellære liposomer sammensatt av disse mindre fluide fosfolipider med kolesterol som er nyttige ved den foreliggende oppfinnelse ble ikke forhindret ved å ha et disakkarid lokalisert innenfor såvel som utenfor liposomet som foretatt av ekteparet Crowe. Mer enn 9 0 % retensjon og nesten ingen aggregasjon vises imidlertid ved den foreliggende oppfinnelse hvis en kombinasjon av minst et sukker og minst et protein, polypeptid og/eller oligopeptid tilsettes til den vandige oppløsning av fosfolipider av en mindre fluid natur pluss kolesterol før dannelse av liposomene, slik at oppløs-ningen av det kryobeskyttende middel fordeles både innenfor og utenfor liposombilaget.

Med blandingen i samsvar med foreliggende oppfinnelse kan det vellykket fremstilles liposomer inkluderende dem som inneholder ikke-fluide fosfolipider og kolesterol, slik at opptil 100 % av innholdet holdes tilbake og fusjon og aggregasjon inhiberes i sterk grad. Blandingen anvender ved en ut-førelsesform en kombinasjon av minst et sukker og minst et protein, polypeptid og/eller oligopeptid i den vandige oppløsning anvendt for fremstilling av liposomene.

Det ville derfor være fordelaktig å tilveiebringe en kommersielt gjennomførbar fremgangsmåte for fremstilling av liposomer med eller uten medikamenter eller andre terapeutiske midler, diagnostiske midler, eller andre materialer av biologisk interesse med forbedret stabilitet, dvs. større retensjon, liten eller ingen fusjon og aggregasjon ved rekonstitusjon. Videre, hvis de kryobeskyttende midler kunne tilsettes til eller inkluderes i det vandige medium anvendt for fremstilling av liposomene, snarere enn senere tilsetning til allerede dannede liposomer som beskrevet i Schneider et al., Process for Dehydration of a Colloidal Dispersion of Liposomes, US Patentskrift nr. 4.229.360 (21. oktober 1980), ville dette forenkle fremstillingen av det tørkede liposomprodukt. Videre, ved at oppløsningen av det kryobeskyttende middel var fordelt både innenfor og utenfor liposombilaget ville dette beskytte liposomer fremstilt av et bredere utvalg av fosfolipider enn det som kunne vises av ekteparet Crowe.

Den foreliggende oppfinnelse vedrører således beskyttelsesmiddelblandinger for stabilisering av liposomer under tørking, som er kjennetegnet ved at de omfatter liposomer inkluderende fosfolipidmolekyler, inkluderende et internt vandig medium og dispergert i et eksternt vandig medium når liposomene underkastes tørking, idet det eksterne vandige medium inneholder kombinasjonen av minst ett sukker og minst ett protein, polypeptid og/eller oligopeptid, og det interne vandige medium av liposomene inneholder eventuelt minst ett sukker og/eller eventuelt minst ett protein, polypeptid og/eller oligopeptid, idet sukkeret velges fra gruppen bestående av sukrose, trehalose, laktose, maltose og glukose i et vektforhold til fosfolipid på fra 0,5:1 til 10:1, og proteinet, polypeptidet og/eller oligopeptidet velges fra gruppen bestående av gelatin og kasein i et vektforhold til fosfolipid på fra 1:100 til 2:1.

Den foreliggende oppfinnelse muliggjør kommersielt gjennom-førbar fremstilling av liposomer som eventuelt inneholder steroler eller andre stabiliserende molekyler, særlig kolesterol, under anvendelse av kombinasjonen av minst et sukker, foretrukket et disakkarid, og minst et protein, polypeptid og/eller oligopeptid som kryobeskyttende midler i det vandige medium hvori fosfolipidet eller fosfolipidene og eventuell stabiliseringsmiddelblanding hydratiseres før liposomdannelsen. Etter frysetørking av liposomer fremstilt på denne måte oppnås mer enn 90 % intakte liposomer ved rekonstitusjon, og de rekonstituerte liposomer opptrer normalt ved in vivo anvendelser og har essensielt den samme struktur og størrelse som ved deres tilstand før frystetørking, dvs. liten eller ingen fusjon eller aggregasjon har foregått. Liposomblandinger som er stabile ved tørking oppnås på denne måte.

Kort beskrivelse av tegningene

Figur la er et elektronmikrografi tatt ved fryse-fraktur-elektronmikroskopi, forstørrelse 41.000 x, og viser rehydratiserte liposomer i PBS frystørket uten kryobeskyttelse. Figur lb er et elektronmikrografi tatt ved fryse-fraktur-elektronmikroskopi, forstørrelse 21.000 x, og viser rehydratiserte liposomer frysetørket med 9 % vekt/volum sukrose bare på utsiden. Figur lc er et elektronmikrografi tatt ved frysefraktur-elektronmikroskopi, forstørrelse 54.000 x, og viser rehydratiserte liposomer frysetørket med 9 % vekt/volum sukrose og 1,0 mg/ml gelatin bare på utsiden.

Det er iakttatt at den frysebeskyttende virkning sett i figur lc er ekvivalent med den som sees med kryobeskyttende middel både på innsiden og utsiden.

"Miceller" refererer til vannoppløselige partikler som resulterer fra spontan aggregasjon av amfifile molekyler. Amfifile molekyler inneholder hydrofobe og hydrofile deler. I den foreliggende oppfinnelses sammenheng er foretrukne amfi-filer biologiske lipider. Slik miceller kan være i form av små kuler, ellipsoider eller lange sylindre, og kan også bestå av bilag med to parallelle lag av amfifile molekyler. Slike bilagsmiceller tar vanligvis form av unilamellære eller multilamellære kuleformede skall med en indre vandig avdeling og er også kjent som "liposomer".

Metoder for fremstilling av disse liposomer er nå vel kjent på området. Typisk fremstilles de fra fosfolipider, f.eks. fosfatidylcholin, ved dispergering i vandig oppløsning og eventuell ultralydbehandling eller andre kavitasjonsmetoder og kan inkludere andre materialer som nøytrale lipider, f.eks. kolesterol, og også overflatemodifiserende midler som positivt eller negativt ladede forbindelser, sakkarider, antistoffer og andre funksjonelle liganger som har grupper som kan forankre molekylet i bilaget av liposomet.

Liposomer som er nyttige for tilførsel in vivo av farma-søytiske midler er ikke begrenset til sammensetninger som inneholder bare fosfatidylcholin eller andre nøytrale fosfolipider og stabiliserende molekyler som kolesterol. Eksempler er blandinger med fosfatidylserin, fosfatidylglyserol, fosfatidyletanolamin, kardiolipin og lignende med eller uten steroler.

Det er funnet at ved å innlemme visse fosfolipidmolekyler, oppnås et liposom som er meget stabilt in vivo. Det er kjent at faseomvandlingspunkter er en funksjon av hydrokarbonkjede-lengden, se C. Tanford, The Hydrofobic Effeet, 2. utgave

(1980). Visse fosfolipidmolekyler, f.eks. dem med hydrokar-bonkj eder med minst 16 karbonatomer og ingen dobbeltbindinger er mindre fluide og fremviser faseomvandlinger ved forholdsvis høye temperaturer (mer enn 3 7°C) og det er funnet at bruken av disse fosfolipider tilveiebringer liposomer med forbedret stabilitet in vivo. I noen tilfeller, på grunn av tilgjenge-lighet og omkostningsfaktorer, kan det være ønskelig å anvende fosfolipider med kortere hydrokarbonkjeder, som kan tilsettes til liposomblandingene i små mengder slik at en hoveddel av tilstedeværende fosfolipider utgjøres av molekylene med mettede hydrokarbonkjeder med minst 16 karbonatomer for å konservere stabiliteten av liposomene i serum.

Stabiliteten av fosfolipidliposomene kan ytterligere økes ved å innlemme steroler, særlig kolesterol, eller andre stabiliserende molekyler. Et stabilt lipsom kan oppnås ved å innlemme 25 til 50 mol% kolesterol i liposomene. I liposomer fremstilt av distearoylfosfatidylcholin er kolesterol og distearoylfosfatidylcholinet i et molart forhold på fra 1:1 til 3:1, foretrukket 2:1.

Egnet for bruk som et kryobeskyttende middel ved den foreliggende oppfinnelse er en kombinasjon av minst ett sukker og minst ett protein, polypeptid og/eller oligopeptid. Liposomer i den foreliggende oppfinnelses sammenheng som er stabile under tørking kan fremstilles ved å tilsette kombinasjonen av minst ett sukker og minst ett protein, polypeptid og/eller oligopeptid til det vandige medium anvendt for å hydratisere fosfolipidet eller fosfolipidene og eventuelt foretrukket kolesterolblandingen før liposomdannelsen. Alternativt kan kombinasjonen tilsettes nettopp til det vandige medium utenfor liposomene og det interne vandige medium som eventuelt inneholder minst ett sukker eller eventuelt minst ett protein, polypeptid og/eller oligopeptid. Sukkeret kan være sukrose, laktose, trehalose, maltose og glukose. Vektforholdet mellom sukker og fosfolipid er fra 0,5:1 til 10:1. I tilfellet av laktose og sukrose er vektforholdet mellom sukker og fosfolipid eller lipider omtrent 4:1. Konsentrasjonen av sukker er fra 2,5 % til 15 % (vekt/volum). Proteinet kan f.eks. være albumin og polypeptidet kan være gelatin eller kasein. Vektforholdet mellom fosfolipid og proteinet, polypeptidet og/eller oligopeptidet er fra 1:100 til 2:1. I tilfellet av proteinet albumin er vektforholdet mellom albumin og fosfolipid omtrent 1:1. Vektforholdet mellom kasein og gelatin til fosfolipid er omtrent 1:10. Det antas at virkningen av gelatin, kasein og serumalbumin som kryobeskyttende midler i det minste vedrører deres polymere natur. Dette sees i tabell IV hvor aminosyrer, hovedbestanddelen av polypeptider, ikke tilveiebringer kryobeskyttelse for liposomer. Den kryobeskyttende virkning av polypeptider og proteiner kan skrive seg fra deres evne til å belegge overflaten av liposomer. Ved at de gjør dette kunne de tilveiebringe et middel for å motstå den nære sammenstilling av liposomoverflater som kan forekomme under frysing og tørking og således forhindre aggregasjon og fusjon. F.eks. er kasein kjent å belegge andre overflater som det kommer i kontakt med. Arealet dekket med ett lag er 1,2 7 m<2> pr. mg kasein. Det vises til Encyclopedia of Polymer Science and Technology, bind 2 (19 65) Interscience Publishers, side 861. En beregning av eksterne overflatearealer av en oppløsning av DSPC:kolesterol 2:1 liposomer med 60 nm i gjennomsnittlig diameter og 25 mg/ml i lipidkonsentrasjon gir omtrent 5 m<2>. En oppløsning av 2,5 mg/ml kappa-kasein er tilstrekkelig for god kryobeskyttelse. Hvis alt protein tildannet et lag på liposomene ville proteinmolekylene dekke 63,5 % av overflatearealet, sannsynligvis tilstrekkelig til å forhindre skadelig virkning av frysetørking. Andre mekanismer kan også virke. Det forstås av den fagkyndige at forskjellige kombinasjoner av sukkere og proteiner, polypeptider og oligo-peptider kan anvendes.

Liposomene i den foreliggende oppfinnelses sammenheng inkluderer, men er ikke begrenset til, unilamellære fosfolipidliposomer mindre enn 2 000 Å i diameter fremstilt ved ultralydbehandling som beskrevet av M.R. Mauk og R.C. Gamble, Anal. Bioc. , 94, s. 302-307 (1979) eller ved mikroemulgering under anvendelse av prosdedyrene beskrevet i søknaden til R. Gamble inngitt 31. januar 1985 og som er overdratt til samme patentsøker som i den foreliggende søknad, og som det begge refereres til. Det forståes imidlertid av den fagkyndige at andre typer av liposomer fremstilt ved hjelp av andre midler kan anvendes.

Hvilke som helst av en rekke forskjellige forbindelser kan innesluttes i det indre vandige rom i liposomene. Illustrerende terapeutiske midler inkludere antibiotika, stoffskifteregulatorer, immunmodulatorer, kjemoterapeutiske medikamenter, toksinantidoter, etc. Tilsvarende kan liposomene fylles med et diagnostisk radionuklid og fluorescerende materialer eller andre materialer som kan detekteres ved in vitro og in vivo anvendelse.

Ved en foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen er liposomene foretrukket unilamellære fosfolipidliposomer inneholdende kolesterol som er dannet i nærvær av en kombinasjon av minst ett sukker og minst ett protein, polypeptid og/eller oligopeptid som er blitt tilsatt til det vandige medium anvendt for å hydratisere fosfolipidet eller lipidene og kolesterolblandingen.

En kombinasjon av minst ett sukker og minst ett protein, polypeptid og/eller oligopeptid kan være tilsatt til liposomene etter dannelsen. Liposomenes interne vandige medium kan inneholde minst et sukker eller minst et protein, polypeptid og/eller oligopeptid.

Den foreliggende oppfinnelse er svært fordelaktig ettersom liposomer stabiliseres mot skade under tørkeprosessen og etterfølgende rekonstitusjon. Ved "stabilisering" menes at gjennomsnittlig størrelse og størrelsesfordeling ikke på-virkes, dvs. at liten eller ingen fusjon eller aggregasjon iakttas ved rekonstitusjon, at liposombilagsintegriteten opprettholdes og at der ikke er noen nedsettelse av brukbar-heten av liposomet bevirket ved lekkasje.

Det etterfølgende eksempel illustrerer fremstilling, karakterisering og in vivo anvendelse i en dyremodell av et frystørket liposomprodukt. Resultatene fra et fryse-tine liposomprodukt er vist bare som et middel for sammenligning.

Det etterfølgende eksempel illustrerer oppfinnelsen.

Generell liposomfremstilling

Små unilamellære vesikler (SUV) (liposomer) eventuelt med spormengder av ionofor A2 3187 ble fremstilt fra distearoylfosfatidylcholin (DSPC) og kolesterol (Ch) (2:1 molforhold) i henhold til tidligere metoder. Det vises til Mauk og Gamble, Anal. Bioc, 94, 302-307 (1979). Kort sagt ble en klorofor-moppløsning av 40 til 100 mg lipid (DSPC og Ch) inndampet til tørrhet under nitrogen (N2) og ytterligere tørket under vakuum over natten. Røret ble fylt med et volum av buffer eller kryobeskyttelsesmiddeloppløsning som eventuelt inneholdt ImM nitriltrieddiksyre (NTA) eller lOOmM 6-karboksyfluorescein og ultralydbehandlet under N2 ved 60 til 70°C i 5 til 15 min. med en probesonikator av type MSE utstyrt med en titanmikrospiss. Ultralydbehandling eller mikroemulgering ga de små lamellære liposomer anvendt ved disse forsøk.

Etter ultralydbehandling ble uinnkapslet ytre oppløsning utvekslet med PBS eller kryobeskyttende oppløsning på en Sephadex G-50-80 kolonne med vakuum-eluering. Endelig lipidkonsentrasjon var i området 20-30 mg/ml.

Screening av hjelpestoffer for krvobeskyttelse

Testing av en spesiell forbindelse eller forbindelser som mulige kryobeskyttende midler besto i fire trinn: Mulige kryobeskyttende midler i forskjellige mengder ble tilsatt til et volum av liposompreparatet. Det neste trinn var en kvalitativ visuell kontroll av prøven etter tilsetning av det mulig kryobeskyttende middel for å se om der var noen umiddelbare virkninger. Hvis prøven syntes å være stabil, dvs. ikke syntes å aggregere etter tilsetning av midlene, ble den utsatt for frysing og tining og/eller frysetørking. For frysetining ble prøver frosset ved -18°C og tint ved romtemperatur (21°C). For frysetørking ble prøvene frosset ved -18°C og deretter anbragt under vakuum (Virtis Freeze Dryer Model G) i minst 24 timer.

Rekons t i tus i on

Frysetørkede liposomprøver ble rekonstituert ved å tilsette destillert vann og forsiktig omrøre hetteglasset manuelt.

Visuell kontroll

De rekonstituerte liposompreparater ble først visuelt kontrollert med hensyn til store partikler, aggregater eller

andre endringer i oppløsningen som kunne indikere ustabilitet. Liposomene ble så sentrifugert i 3 min. i en Eppendorf modell 5414 sentrifuge ved 15600 G. Sentrifugerøret ble kontrollert for å se om store pelleter dannet seg ved bunnen av røret, og et slikt funn ville diskvalifisere en prøve fra ytterligere betraktning. Resultatene er vist i tabell I.

Karakterisering av liposomintegritet

Fluorescerende fargestoff- frigivelse

Liposombilags-integritet ble testet under anvendelse av fluorescerende fargestoff-frigivningsdata oppnådd ved å måle frigivelse av innkapslet 100 mM 6-karboksyfluorescein fra frysetørkede liposomer som var blitt rekonstituert. Prøvens fluorescens ble målt ved hjelp av en HPLC fluorescensdetektor. En porsjon av prøven, holdt tilbake fra frysetørkingen, ble målt for å gi en "bakgrunns"-fluorescensverdi. % frigivnings-verdier ble beregnet ved å trekke bakgrunnsfluorescensen fra prøvefluorescensen og dividere med den totale fluorescens minus bakgrunnsfluorescensen av de lysebehandlede liposomer (Triton X-100, 0,4 % ble anvendt for lysebehandlingen av liposomene). % retensjon ble beregnet som 100 % minus % frigitt. Resultatene er vist i tabell II.

Partikkelstørrelsesmålinger

Laktose og polypeptider

Liposomer som fremstilt tidligere ble suspendert i laktose (90 mg/ml) med 5 mM fosfat ved pH 7,4. Laktose var tilstede bare på utsiden av liposomene. PBS var på innsiden av liposomene.

Porsjonen av SUV-oppløsning ble delt i 2 ml volumer i 10 ml septumflasker og målte andeler av bovint melke-kappakasein, bovint melke-kasein-o-glykopeptid, fiskeskinn-gelatin og bovint skinn-gelatin (60 Bloom), samtlige fra Sigma Chemical Co. og anvendt uten ytterligere rensing, ble tilsatt. Prøvene ble fylt inn i en frysetørker med temperaturstyrte hyller, frosset og tørket ved vakuum over en 3 døgns periode med programmert hylletemperatur.

Etter frysetørking ble prøvene rekonstituert med et volum av destillert vann tilsvarende utgangsvolumet. Midlere vesikkel-diametre ble bestemt ved hjelp av dynamisk lysspredning under anvendelse av et Nicomp modell 270 instrument i den volum-veiede Gauss-metode. Prøvene ble testet både før og etter sentrifugering ved 15.600 G i 10 min. for å fjerne aggregater og utfelt material, tilstede i noen rekonstituerte prøver. Resultater er vist i tabell III.

Aminosyrer

Aminosyrer ble også testet med hensyn til deres kryobeskyttende evne. Innveide prøver på 10 mg/ml aminosyrer (Sigman Chemical Co.) ble tilsatt til liposomene hvori 9 % sukrose var inneholdt i det ytre vandige medium. Prøvene ble frosset og frysetørket under anvendelse av en hylletørker. Etter frysetørking ble prøvene rekonstituert med avionisert vann, forsiktig omrørt og oppvarmet til omtrent 30°C og undersøkt for bunnfall som indikerte irreversibel aggregasjon, fusjon og/eller knusing. Mens mengden av bunnfall varierte blant prøvene var der i alle tilfeller vesentlig uoppløselig material som indikerte svikten til aminosyrene til å beskytte mot frysetørkingsskade. Gjennomsnittlig størrelse og stør-relsesfordeling ble så målt for supernatantene. Resultatene er vist i tabell IV.

Frysefraktur- elektronmikrografi- påvisning av beskyttende virkninger på liposomer etter frysetørking og rehydratisering Prøver av DSPC:kolesterol (2:1) SUV ble fremstilt i fosfatbufret saltløsning (PBS) som beskrevet. Porsjoner ble utvekslet for sukrose (9 % vekt/volum) (90 mg/ml) med 5 mM fosfatbuffer pH 7,4, på utsiden av liposomene, under anvendelse av Sephadex G-50 kolonnekromatografering. Innveide delprøver av 60 Bloom bovint skinn-gelatin (Sigma Chemical CO.) (1,0 mg/ml) ble tilsatt til noen prøver og oppløst. To ml volum av test-liposomoppløsninger ble frosset og fryse-tørket i en frysetørker med hylletemperaturkontroll.

Tørkede prøver ble fremstilt for frysefraktur-elektronmikro-skopering ved å suspendere dem i paraffinolje for å holde det granulære material sammen. Prøvene ble rehydratisert i 50 % glyserol/vann før frysefrakturering. Prøvene ble så hurtig frosset og spaltet med et Balzers BAF 400D fryse-fraktur-apparat med Pt-skygging med en 45° vinkel. Kopier ble undersøkt i et Phillips 410 elektronmikroskop. Resultatene er vist i fig. la-lc.

I nærvær av sukrose og 1,0 mg/ml gelatin er liposomene intakte etter rehydratisering (Fig. lc), ikke fusjonert eller aggre-gert, og har en størrelse lignende størrelsen målt i oppløs-ning før frysetørking. Med sukrose bare utenfor, men ikke noe polypeptid i mediet viser den tørkede prøve etter rehydratisering (Fig. lb) mange store unilamellære strukturer som representerer fusjonerte liposomer (21.000 gangers forstørr-ing) . Bemerk at forstørrelsen av lb er omtrent halvparten av forstørrelsen av lc. Uten tilsetning av noen kryobeskyttende midler faller liposomene fullstendig sammen etter tørking og rehydratisering og danner multilamellære vesikler hvis innhold stort sett tapes og hvis store størrelse forhindrer skikkelig biofordeling (Fig. la).

Biologisk effektivitet av fr<y>setørkede og rekonstituerte liposomer

In- 111 tilsetningsprosedyre

Tilsetning av In-111 i forutdannede liposomer inneholdende NTA ble lettet ved nærvær av ionoforen A23187 i lipid-bilaget. In-111 ble innført i liposomer ved 80°C som beskrevet av Mauk og Gamble, Anal. Bioc., 94, 302-307 (1979) med unntagelse av prøvene med bovint serumalbumin hvor en temperatur på 65 °C ble anvendt. Inkubasjoner ble avsluttet ved tilsetning av 0,1 ml 10 mM EDTA i fosfatbufret 0,9 % natriumklorid, pH 7,4 (PBS) og uinnkapslet In-111 ble separert fra de behandlede liposomer ved kromatografering på Sephadex G-50. Over 90 % av det tilsatte In-111 kunne innlemmes i intakte forutdannede liposomer ved hjelp av denne teknikk.

Behandlingseffektiviteter ble kontrollert ved å tilsette en del av behandlet liposomoppløsning til et sentrifugerør inneholdende Chelex-100 før tilsetningen av EDTA. Etter sentrifugering av røret ble supernatanten målt med hensyn til li:LIn i en gamma-teller for å bestemme prosent radioaktivitet tilbake i liposomene. Resultatene er vist i tabell V.

EMT6 Tumormodell

Biofordelingsundersøkelser ble gjennomført ved halevene-injeksjon av 200 10 mg/ml lipidkonsentras j on <111>In-fylte liposomprøver. BALB/c hunnmus (19 ± 1 gm) ble anvendt med åtte dager gamle EMT6 tumorer implantert i siden. Fem mus ble injisert pr. prøve. Etter 24 timer ble musene bedøvet og vevsbiofordeling av <111>In ble undersøkt. Kontrolldyr ble injisert med liposomer som ikke var blitt frysetørket, men som hadde hjelpestoffene tilsatt og/eller som inneholdt bare PBS. Lever, tumor, milt og blod ble samlet og prøver ble talt under anvendelse av en Beckmann 5500 gamma-teller. Resultatene er også vist i tabell V.

Sammenligning av størrelsesretension og utfelling for liposomer med kryobeskyttende midler anbragt bare innvendig, bare utvendig, eller både innvendig og utvendig Virkningene av å plassere kryobeskyttende midler bare inne i liposomer eller bare utenfor eller både innvendig og utvendig ble testet. Prøver av DSPC/kolesterol-liposomer ble fremstilt i 9 % (vekt/volum) laktose (Lac) eller 9 % (vekt/volum) laktose pluss 2,5 mg/ml gelatin (60 Bloom) (Lac-Gel). En separat prøve av DSPC/kolesterol-liposomer med PBS innkapslet ble også anvendt. Disse preparater ble utbyttet for PBS, Lac eller Lac-Gel etter beho.v med gel-kromatografering for å generere alle permutasjoner av kryobeskyttende midler eller buffer innenfor og utenfor liposomene.

Prøver av hvert preparat ble målt for midlere diameter ved lysspredning og deretter ble delprøver frosset og frysetørket. De tørre prøver ble så rekonstituert med destillert vann. Porsjoner av de totale rekonstituerte prøver ble sentrifugert ved 15.600 G i 10 min. og supernatanten ble målt for midlere diameter. En ytterligere delprøve av den totale oppløsning ble tatt for måling av kolesterolkonsentrasjonen ved hjelp av høyytelses-væskekromatografering og en lignende delprøve av supernatanten etter sentrifugering ble også målt for koleste-rolkonsentrasjon. Analyse av disse konsentrasjoner ga % av materialet som ble utfelt etter frystetørking. Resultatene er vist i tabell VI.

Resultater

Oppført i tabell I er resultatene av de kvalitative tester av de undersøkte potensielle kryobeskyttende midler. Pluss indikerer et positivt resultat for den spesielle test. Minus indikerer et utilfredsstillende resultat som skyldes utfelling eller svikt for fullstendig resuspendering. Hvis en prøve mottok et minus ved tilsetning av midlet eller midlene eller under frysing/tining ble ikke ytterligere forsøk gjennomført med dette middel. De eneste kryobeskyttende midler som var i stand til å passere alle tre tester var kombinasjonen av et sukker og et protein, polypeptid og/eller oligopeptid.

Tabell II viser % retensjon av 6-karboksyfluorescein for liposomer i nærvær av forskjellige konsentrasjoner av bovint serumalbumin (BSA), serum og laktose. Lave retensjonsverdier indikerer liposomknusing. Frysetørking bevirker at liposomene går i stykker og lekker (mindre enn 90 % retensjon) med mindre både sukker og et protein, polypeptid og/eller oligopeptid er tilstede.

Tabellene III og IV viser endringer i partikkelstørrelse med forskjellige konsentrasjoner av protein eller aminosyrer pluss disakkarid etter frysetørking. Økt størrelse etter rekonstitusjon indikerer aggregerte og/eller fusjonerte liposomer. Partikkelstørrelsesdata indikerer at minst 25 mg/ml BSA (bovint serumalbumin)/9 % disakkarid er nødvendig for kryobeskyttelse, mens bare 2,5 mg/ml gelatin/9 % disakkarid virker til å konservere liposomer. Uten frysetørking har en lakto-seoppløsning av SUV en midlere diameter på omtrent 50 nm. Den samme prøve etter frysetørking og rekonstitusjon frembringer et bunnfall med en midlere diameter på 104,9 nm før sentrifugering og 88,3 nm for supernatanten etter sentrifugering. Nærvær av bunnfall og stor endring i gjennomsnittlig størrelse er ikke aksepterbart for et injekserbart liposompreparat.

Ved 2,5 mg/ml frembragte bovint gelatin og bovint melke-kappakasein ikke noe synlig bunnfall, med midlere diameter på 57-58 nm før sentrifugering, og diametre på 53-54 nm etter sentrifugering. Fiskeskinn-gelatin ved 1,0 mg/ml var nesten så effektivt med diametre på 57,5 og 56,2 nm henhv. før og etter sentrifugering. 2,5 mg/ml av fiskeskinn-gelatin frembragte et dårlig resultat med en større midlere diameter etter sentrifugering. Kasein-o-glykopeptid beskyttet ikke liposomene mot utfelling etter frysetørking og rekonstitusjon.

Tabell IV viser at aminosyrer, selv om de representerer hoved-bestanddelene i f.eks. kappa-kasein, ikke tilveiebringer liposom-kryobeskyttelsen ved den samme vektkonsentrasjon eller mindre av polypeptidet.

Tabell V oppfører biofordelingsresultåtene for flere forskjellige prøver. Resultatene ved testene med innhold og biofordeling er kritiske for bedømmelse av liposomlevedyktigheten. Lave verdier (<75 %) i innhold medfører brekkasje av liposomene slik at det tilveiebringes NTA i den ytre oppløsning som konkurrerer med NTA inne i liposomene om <111>In. % injisert dose som gjenvunnet måler vanligvis liposomenes "bestan-dighet" i sirkulasjonen. Lave verdier her sammenlignet med kontrollnivået kan antyde at en prøve var utsatt for delvis skade på liposombilaget. Frysetørket BSA/sukkerliposomer viser lavere % injisert dose-gjenvinninger, mens gelatin/sukker- f rysetørkede liposomer biofordeles like godt som et ufrysetørket liposompreparat.

Forholdet tumor-til-lever av <11:L>In-opptak er en tradisjonell nøkkeltest for liposomyteevne. Verdier over 1,2 finnes for et normalt, ufrysetørket liposompreparat. Frysetørkede liposompreparater inneholdende gelatin og laktose, testet i løpet av noen få timer etter rekonstitusjon, viser gode tumor-til-lever forhold såvel som normale verdier for de andre parametre (tabell V).

Resultatene viser at frysetørking av DSPC:kolesterol-liposomer var mest vellykket når både et sukker og minst ett protein, polypeptid og/eller oligopeptid var tilstede. Laktose og sukrose virket like bra og andre disakkarider, f.eks. trehalose og maltose, vil også tilveiebringe fordelene ved oppfinnelsen. Gelatin og kasein ble funnet å være de beste polypeptider for frysetørking. En 2,5 mg/ml gelatin- eller kasein-konsentrasjon er alt som var nødvendig i kombinasjon med 9 % sukker for å oppnå konservering av liposomene.

Tabell VI viser at mens PBS buffer utenfor liposomene frembringer mer enn 84 % utfelling i alle tilfeller, vil inklusjon av 9 % (vekt/volum) laktose i den utvendige oppløsning forhindre utfelling i to av tre prøver. Laktose bare på utsiden var imidlertid utilstrekkelig for å forhindre aggregasjon som påvist ved en økning på mer enn 50 % i den midlere liposomdiameter etter rekonstitusjon, for alle prøver. Med Lac-Gel på utsiden var det mindre enn 10 % utfelling i alle tilfeller og mindre enn en 23 % økning i midlere diameter. Med Lac-Gel både innenfor og utenfor forble størrelsen av liposomene faktisk den samme etter rekonstitusjon.

Claims (5)

1. Beskyttelsesmiddelblandinger for stabilisering av liposomer under tørking, karakterisert ved at de omfatter liposomer inkluderende fosfolipidmolekyler, inkluderende et internt vandig medium og dispergert i et eksternt vandig medium når liposomene underkastes tørking, idet det eksterne vandige medium inneholder kombinasjonen av minst ett sukker og minst ett protein, polypeptid og/eller oligopeptid, og det interne vandige medium av liposomene inneholder eventuelt minst ett sukker og/eller eventuelt minst ett protein, polypeptid og/eller oligopeptid, idet sukkeret velges fra gruppen bestående av sukrose, trehalose, laktose, maltose og glukose i et vektforhold til fosfolipid på fra 0,5:1 til 10:1, og proteinet, polypeptidet og/eller oligopeptidet velges fra gruppen bestående av gelatin og kasein i et vektforhold til fosfolipid på fra 1:100 til 2:1.

2. Blandinger som angitt i krav 1, karakterisert ved at det interne vandige medium av liposomene inkluderer minst ett sukker.

3. Blandinger som angitt i krav 2, karakterisert ved at det interne vandige medium også inkluderer minst ett protein, polypeptid og/eller oligopeptid.

4. Blandinger som angitt i ett eller flere av kravene 1 til 3, karakterisert ved at proteinet, polypeptidet og/eller oligopeptidet er gelatin.

5. Blandinger som angitt i ett eller flere av kravene 1 til 4, karakterisert ved at liposomene videre inkluderer kolesterol.