JP2008520577A - 肺表面活性物質配合物を凍結乾燥により生成する方法並びにその配合物及び利用 - Google Patents

Abstract

肺表面活性配合物を、溶媒溶解及び凍結乾燥により製造する方法並びにそれにより得られる表面活性配合物を記載する。呼吸機能障害を治療する方法も又、提供される。

Description

この出願は、３５ＵＳＣ§１１９(ｅ)に基づき、２００４年１１月１５日出願の米国特許出願第６０／６２８，３６５号の優先権を主張するものであり、該出願の開示をそっくりそのまま本明細書中に援用する。

この発明は、肺の表面活性物質の配合物を、溶媒溶解及び凍結乾燥によって生成する方法に向けられている。この発明は又、それに由来する表面活性物質の配合物及び呼吸機能不全を治療する方法にも向けられている。

肺の表面活性物質(「肺表面活性物質」とも呼ばれる)は、肺胞の空気−水界面での単層の形成を促進し、表面張力を低減させることにより呼息中に肺胞がつぶれるのを防止する脂質とタンパク質の複雑な混合物である。天然の肺表面活性物質は、肺の気液界面で表面張力を下げるように相互作用するリン脂質とアポタンパク質の両方を含むので、「リポタンパク質複合体」として記載されている。４種類のタンパク質(即ち、ＳＰ−Ａ、ＳＰ−Ｂ、ＳＰ−Ｃ及びＳＰ−Ｄ)が、肺表面活性物質と関連することが見出されている。特に、ＳＰ−Ｂは、肺表面活性物質の生物物理的作用に必須であるようである。肺表面活性物質を患者の肺に投与することは、様々な呼吸障害を処置するために受け入れられた治療である。

薬理学的観点から、この処置で用いるための最適の外因性肺表面活性物質は、完全に実験室で合成されよう。この点において、有用であることが見出されているＳＰ−Ｂの模倣物は、２１アミノ酸のカチオン性ポリペプチドであるＫＬ４である。

医療用に商業規模で肺表面活性物質を製造する一つの方法は、薄膜蒸発(ＴＦＥ)ユニット操作を利用する工程によるものである。この工程は、ＫＬ４肺表面活性物質の製造に適用する場合は、次の工程よりなる：１）４つの主要配合物成分のジパルミトイルホスファチジルコリン(ＤＰＰＣ)、パルミトイルオレオイルホスファチジルグリセロール(ＰＯＰＧ)及びパルミチン酸(ＰＡ)及びＫＬ４をエタノールに溶解させ；２）エタノールをＴＦＥを用いて除去し；そして３）最終的分散液を瓶詰めする。このＴＦＥユニット操作は、それ自体複雑であり且つ規模に限界がある。特に、１ｆｔ²のＴＦＥは、４０リットルのバッチを生成し、最大の匹敵する利用可能なユニットは、１０ｆｔ²ＴＦＥである。これは、バッチサイズを制限し、それは、常に増大する量の表面活性物質を必要する更なる兆しがＫＬ４表面活性物質について認められるので望ましくない。その上、この工程は、無菌条件下で行われ、これは、有意に、製品のコスト、計画の柔軟性、及び複雑さに寄与する。

ＴＦＥを利用するコスト及び複雑さに加えて、この組成物が液体状態で保存されるために、更なる紛糾が存在する。この組成物のポリペプチド及び脂質成分は分解の対象であるので、溶液は、如何なる分解をも遅らせて長期間の安定性を達成するように冷却して維持しなければならない。

水溶液中で比較的不安定な製品例えば注射用医薬を凍結乾燥することが、一層安定で、それ故一層棚持ちが良い固相生成物を生じることは、当分野で周知である。凍結乾燥される医薬の例には、アルプロスタジル、アルプリジン、ベータ−インターフェロン、アモキシシリンナトリウム、硫酸トブラマイシン、硫酸ゲンタマイシン、強心性ホスホジエステラーゼインヒビター、シクロヘキサン−１，２−ジアミンＰｔ(ＩＩ)錯塩、アナマイシン、フルクトース−１，６−二リン酸などが含まれる。

改善された室温での安定性を有する肺表面活性物質ＫＬ４を与えるために、該表面活性物質を凍結乾燥する試みが、米国特許第５，９５２，３０３号に記載されたようになされてきた。しかしながら、肺表面活性組成物を生成する改良された方法及び改良された肺表面活性物質に対する要求がある。本発明は、これ及び他の重要な目的に向けられている。

発明の概要
本願発明者は、表面活性組成物を有機溶媒からの凍結乾燥によって製造することができることを発見した。如何なる理論にも制限はされないが、有機溶媒が肺表面活性物質の成分と相互作用して、それらを一層徹底的に可溶化し、それにより一層完全な混合物を与えるものと考えられる。ある具体例において、凍結乾燥された表面活性組成物は、再構成又は再水和された際に、凍結乾燥前の状態と比較して減少した粘性及び表面張力を有する。ある具体例において、凍結乾燥した表面活性組成物は、室温で保存された場合に、凍結乾燥前の状態と比較して改善された安定性を有し、該凍結乾燥した表面活性物質は、水性緩衝液又は媒質を加えると容易に良く分散されたコロイド状態を再構成する。加えて、本発明のある面において、ここに記載した方法は、これらの界面活性組成物は有意に低いコストで商業規模で製造することができるので、有利である。本発明のある面において、この製造工程のコストは、肺表面活性組成物が薄膜蒸発器及び／又は無菌環境を利用せずに製造されるので低下される。

従って、この発明は、部分的に、肺表面活性組成物を生成するための簡素化された製造工程、改善された粘度及び表面張力特性を有する肺表面活性組成物、並びに該肺表面活性組成物を用いて呼吸障害を治療する方法に向けられている。これらの改善された肺表面活性組成物は、ここに記載したように、この発明のある方法によって得ることができる。

本発明のある具体例において、肺表面活性組成物を生成する方法は、肺表面活性ポリペプチドと一種以上の脂質を有機溶媒系を用いて結合させて実質的に均質な液体混合物を形成し、その液体混合物を凍結乾燥させて凍結乾燥された肺表面活性ポリペプチド組成物を得る工程を含む。この有機溶媒系は、肺表面活性ポリペプチドと一種以上の脂質を可溶化して実質的に均質な液体混合物を形成するのに十分な量の有機溶媒を含む。本発明のある面において、実質的に均質な液体混合物は、凍結乾燥前に濾過される。ある面において、この実質的に均質な液体混合物は、凍結乾燥前に、フィルター殺菌される。幾つかの他の面において、この肺表面活性ポリペプチド組成物は、凍結乾燥後に殺菌される。

本発明は又、ここに記載した方法によって生成される乾燥肺表面活性組成物をも提供する。

ある具体例において、本発明の方法は、ここに記載したある方法によって生成された凍結乾燥された肺表面活性物質を得て、該凍結乾燥された肺表面活性物質を十分量の製薬上許容しうる分散剤を用いて再構成して液体の肺表面活性組成物を生成する工程を含む。

ある具体例において、本発明の方法は、ここに記載した方法により生成した凍結乾燥した肺表面活性組成物を患者に投与することを含む、患者において呼吸障害を処置するステップを含む。
図面の簡単な説明
図１は、この発明の典型的組成物中に存在する脂質の測定された濃度を、無菌濾過のフィルター通過数と比較して示している。
図２は、この発明の典型的組成物中に存在するＫＬ４ポリペプチドの測定された濃度を、無菌濾過のフィルター通過数と比較して示している。これは、ＫＬ４の、脂質からの抽出後の測定値である。
図３は、典型的な再構成された凍結乾燥ＫＬ４配合物の、塩を伴うか又は伴わない表面活性データを示している。ＴＢＡは、ｔ−ブタノールである。
図４は、塩を伴うか又は伴わない、典型的な凍結乾燥ＫＬ４配合物についての残留水分データを示している。ＴＢＡは、ｔ−ブタノールである。

詳細な説明
Ａ．序論
本発明は、とりわけ、液体の肺表面活性組成物を提供する。この発明は又、とりわけ、肺表面活性物質の製造方法及び利用方法をも提供する。本願発明者によって、肺表面活性物質を有効量の有機溶媒系に分散させてその後凍結乾燥すれば、所望の肺表面活性物質が形成されることが発見されている。

この発明は、呼吸障害の治療に利用することのできる幾つかの方法、試薬及び化合物を提供する。この発明は、特定の方法、試薬、化合物、組成物、又は生物系(当然、変化しうる)に制限されないということは、理解されるべきである。ここで用いられる用語は、特定の具体例を説明することを目的とするだけであって、制限を意図するものではないということも又、理解されるべきである。この明細書及び添付の請求の範囲で用いる場合、内容的に明らかに違う場合を除いて、単数形の用語でも複数形の意味をも包含する。従って、例えば、「表面活性物質」に言及する場合、２以上の表面活性物質の組合せなどを包含する。

「約」は、量、一時的遅延などの測定可能な値に言及する場合には、規定値から±２０％又は±１０％の、一層好ましくは±５％の、尚一層好ましくは±１％の変動を包含する(かかる変動は、開示した方法を実施するのに適している)。

別途規定しないかぎり、ここで用いるすべての技術的及び科学的用語は、当業者に一般に理解されているのと同じ意味を有する。ここに記載したものと類似の又は同等の任意の方法及び材料を、本発明の試験のための実施において用いることができるが、好適な材料及び方法は、ここに記載されている。本発明の説明及び請求の範囲においては、下記の術語を用いる。

ここで同定されたすべての「アミノ酸」残基は、天然のＬ−コンフィギュレーションである。標準的なポリペプチド命名法、J.Biol.Chem. 243:3557-59, 1968と一致して、アミノ酸残基の略号は、下記の表に示した通りである。

すべてのアミノ酸残基の配列は、ここでは、左から右への向きが慣用のアミノ末端からカルボキシ末端への向きである式によって表されているということは注意すべきである。

以下で一層詳細に記載するように、有機溶媒系は、低級オキシ炭化水素、低級ハロ炭化水素、低級ハロオキシ炭化水素、低級スルホキシ炭化水素、低級環状炭化水素、及びこれらの組合せよりなる群から選択する有機溶媒を含む。

「低級オキシ炭化水素」は、ここで言及する場合、ヒドロカルビル基及び酸素原子を有して、１〜８炭素原子及び１〜４酸素原子を有する化合物を意味する。典型的な低級オキシ炭化水素には、低級アルカノール、低級ケトン、低級カルボン酸、低級カルボン酸エステル、低級カルボン酸塩などが含まれるが、これらに限られない。

「低級」は、本明細書中に記載された化学化合物に言及する場合、１〜８炭素原子を有する化合物を指す。

「低級アルカノール」は、飽和Ｃ₁〜Ｃ₈アルキル基を指し、これは、１〜４水酸基を有していて、分枝鎖であっても直鎖であってもよい。一つの水酸基を有する典型的な低級アルカノールには、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソ−プロパノール、ｎ−ブタノール、イソ−ブタノール、２−ブタノール、ｔ−ブタノール、ペンタノール、イソ−ペンタノール、２−ペンタノール、３−ペンタノール、ｔ−ペンタノールなどが含まれるが、これらに限られない。

典型的な「低級ケトン」には、アセトン、メチルエチルケトン、メチルプロピルケトン、メチルイソプロピルケトン、メチルブチルケトン、メチルイソ−ブチルケトン、メチル２−ブチルケトン、メチルｔ−ブチルケトン、ジエチルケトン、エチルプロピルケトン、エチルイソプロピルケトン、エチルブチルケトン、エチルイソ−ブチルケトン、エチルｔ−ブチルケトンなどが含まれるが、これらに限られない。

典型的な「低級カルボン酸」には、蟻酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、イソ酪酸などが含まれるが、これらに限られない。

典型的な「低級カルボン酸エステル」には、メチルアセテート、エチルアセテート、プロピルアセテート、イソプロピルアセテート、ブチルアセテート、イソブチルアセテート、２−ブチルアセテート、ｔ−ブチルアセテートなどが含まれるが、これらに限られない。

典型的な「低級カーボネート」には、ジメチルカーボネート、メチルエチルカーボネート、メチルプロピルカーボネート、メチルイソプロピルカーボネート、メチルブチルカーボネート、メチルイソ−ブチルカーボネート、メチル２−ブチルカーボネート、メチルｔ−ブチルカーボネート、ジエチルカーボネート、エチルプロピルカーボネート、エチルイソプロピルカーボネート、エチルブチルカーボネート、エチルイソ−ブチルカーボネート、エチルｔ−ブチルカーボネートなどが含まれるが、これらに限られない。

「低級ハロ炭化水素」は、ここで言及する場合、炭化水素基とハロゲン原子を有して、１〜８炭素原子及び１〜４ハロゲン原子を有する化合物を意味する。好ましくは、これらのハロゲン原子は、塩素、フッ素及び臭素である。最も好ましくは、これらのハロゲン原子は、塩素原子である。典型的な低級ハロ炭化水素には、メチルクロリド、メチレンクロリド、クロロホルム、カーボンテトラクロリドなどが含まれるが、これらに限られない。

「低級ハロキシ炭化水素」は、ここで規定する場合、オキシ炭化水素であって、更に１〜４個のハロゲン原子を有するオキシ炭化水素を意味する。典型的なハロキシ炭化水素には、ヘキサフルオロアセトンが含まれるが、これらに限られない。

「低級スルホキシ炭化水素」は、ここで規定する場合、オキシ炭化水素であって、硫黄原子をも含むオキシ炭化水素を意味する。典型的な低級スルホキシ炭化水素には、ジメチルスルホキシド(ＤＭＳＯ)及びジメチルスルホンが含まれるが、これらに限られない。

「低級環状炭化水素」は、環化された炭化水素基例えば３〜８員の炭化水素環を指す。典型的な環状炭化水素には、シクロヘキサンが含まれるが、これに限られない。

「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」は、ここでは、アミノ酸残基のポリマーを指すために交換可能に用いられる。これらの用語は、一つ以上のアミノ酸残基が、対応する天然のアミノ酸の人工的な化学的模倣物であるアミノ酸ポリマーに適用され、並びに天然のアミノ酸ポリマー及び非天然のアミノ酸ポリマーに適用される。アミノ酸模倣物は、アミノ酸の一般的化学構造と異なる構造を有するが、天然のアミノ酸と類似した様式で機能する化学化合物を指す。非天然残基は、科学文献及び特許文献によく記載されている。天然アミノ酸残基の模倣物として有用な幾つかの典型的組成物及び指針を以下に記載する。芳香族アミノ酸の模倣物は、例えば、Ｄ−又はＬ−ナフィルアラニン；Ｄ−又はＬ−フェニルグリシン；Ｄ−又はＬ−２チエニルアラニン；Ｄ−又はＬ−１，−２，３−，又は４−ピレニルアラニン；Ｄ−又はＬ−３チエニルアラニン；Ｄ−又はＬ−(２−ピリジニル)−アラニン；Ｄ−又はＬ−(３−ピリジニル)−アラニン；Ｄ−又はＬ−(２−ピラジニル)−アラニン；Ｄ−又はＬ−(４−イソプロピル)−フェニルグリシン；Ｄ−(トリフルオロメチル)−フェニルグリシン；Ｄ−(トリフルオロメチル)−フェニルアラニン；Ｄ−ｐ−フルオロ−フェニルアラニン；Ｄ−又はＬ−ｐ−ビフェニルフェニルアラニン；Ｋ−又はＬ−ｐ−メトキシ−ビフェニルフェニルアラニン；Ｄ−又はＬ−２−インドール(アルキル)アラニン；及びＤ−又はＬ−アルキルアラニンを置き換えることにより生成することができ、ここに、アルキルは、置換された又はされてないメチル、エチル、プロピル、ヘキシル、ブチル、ペンチル、イソプロピル、イソブチル、ｓｅｃ−イソチル、イソ−ペンチル、又は非酸性アミノ酸であってよい。非天然アミノ酸の芳香族環には、例えば、チアゾリル、チオフェニル、ピラゾリル、ベンズイミダゾリル、ナフチル、フラニル、ピロリル、及びピリジル芳香族環が含まれる。

「ペプチド」は、ここで用いる場合、ここで特に例示したペプチドの保存的変異体であるペプチドを包含する。「保存的変異」は、ここで用いる場合、アミノ酸残基の、他の生物学的に類似した残基による置換を指す。保存的変異の例には、一つの疎水性残基例えばイソロイシン、バリン、ロイシン、アラニン、システイン、グリシン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、チロシン、ノルロイシン又はメチオニンによる他の残基の置換、又は一つの極性残基による他の残基の置換、例えばアルギニンによるリジンの置換、グルタミン酸によるアスパラギン酸の置換、又はグルタミンによるアスパラギンの置換などが含まれるが、これらに限られない。他のアミノ酸を置換することのできる中性の親水性アミノ酸には、アスパラギン、グルタミン、セリン及びスレオニンが含まれる。「保存的変異」は又、置換されたポリペプチドに対して高められた抗体が未置換ポリペプチドとも免疫反応する場合の、未置換の親アミノ酸の代わりの置換されたアミノ酸の利用をも包含する。かかる保存的置換は、この発明のペプチドのクラスの定義内にある。「カチオン性」は、ここで用いる場合、ｐＨ７．４で、正味の正電荷を有する任意のペプチドを指す。それらのペプチドの生物学的活性は、当業者に公知で且つ本明細書に記載された標準的方法によって測定することができる。

この発明のペプチドは、当業者に公知の方法によって合成することができる。例えば、ある具体例においては、一般的に用いられる方法例えばアルファ−アミノ基のｔ−ＢＯＣ又はＦＭＯＣ保護を利用することができる。両方法は、ペプチドのＣ末端から開始して、各ステップで単一のアミノ酸を加える段階式合成を含む(Coligan等、Current Protocols in Immunology, Wiley Interscience, 1991, Unit 9 参照)。この発明のペプチドは、例えば、Merrifield, J.Am.Chem.Soc. 85:2149, 1962, 及びStewart及びYoung, 1969, Solid Phase Peptides Synthesis, 27-62頁に記載された公知の固相ペプチド合成法によって、ポリマー１ｇ当たり０．１〜１．０ｍモルアミンを含むコポリ(スチレン−ジビニルベンゼン)を用いて合成することができる。化学合成の完了時に、これらのペプチドを脱保護してポリマーから開裂させることができる(液体ＨＦ−１０％アニソールでの、約１／４〜１時間の、０℃での処理による)。試薬の蒸発後、これらのペプチドをポリマーから、１％酢酸溶液を用いて抽出し、次いで、凍結乾燥することにより粗生成物を生成する。これは、普通、セファデックスＧ−１５上での５％酢酸を溶媒として用いるゲル濾過などの技術によって精製することができる。このカラムの適当な画分の凍結乾燥は、均質なペプチド又はペプチド誘導体を生じ、次いで、それを、アミノ酸分析、薄層クロマトグラフィー、高性能液体クロマトグラフィー、紫外吸収分光法、モル旋光度、溶解度などの標準的技術によって特性決定し、固相エドマン分解法によって定量することができる。

「組換え」は、タンパク質を参照して用いる場合、そのタンパク質が、異質の核酸若しくはタンパク質の導入又はネイティブな核酸若しくはタンパク質の変化により改変されていることを示す。
Ｂ．組成物及び方法

ここに記載の凍結乾燥した肺表面活性ポリペプチド組成物は、典型的には、肺表面活性ポリペプチドと一種以上の脂質を有機溶媒系を用いて合せることにより実質的に均質な液体混合物を形成してから該混合物を凍結乾燥することによって製造される。凍結乾燥前又は後で、この混合物を殺菌することができる。ある具体例においては、この実質的に均質な液体混合物を、凍結乾燥前に殺菌濾過して無菌の液体混合物を得、続いて、その無菌混合物を凍結乾燥する。ある別の具体例においては、この肺表面活性組成物を、例えば凍結乾燥した後で、最後に殺菌する。

天然の肺表面活性物質は、肺で自然に生成されるタンパク質／脂質組成物であって、肺の酸素を吸着する能力に臨界的である。それらは、肺の全肺胞表面及び末端の肺胞へと導く誘導気道を覆っている。表面活性物質は、肺胞内に通常存在する液体の表面張力を継続的に緩和することにより呼吸を容易にする。表面活性物質が存在しないか低下するならば、肺胞は潰れる傾向があり、肺は十分な酸素を吸収しない。末端誘導気道の表面張力を低下させることにより、表面活性物質は、開通性を維持する(即ち、気道を開いた状態に維持する)。開通性の喪失は、気道の開通障害及び危機的肺機能の喪失へと導く。ヒトの表面活性物質は、主として、リン脂質{主なものは、ジパルミトイルホスファチジルコリン(ＤＰＰＣ)}及び４種類の表面活性ポリペプチドＡ、Ｂ、Ｃ及びＤ{表面活性タンパク質Ｂ(ＳＰ−Ｂ)が呼吸機能に必須}である。

好適な面において、本発明の肺表面活性ポリペプチドは、動物起源から得ることができ又は合成により得ることのできるカチオン性ペプチドである。ここでの使用のための典型的な肺表面活性ポリペプチドには、天然の及び非天然の肺表面活性ポリペプチド例えば動物由来のＳＰ−Ａ、ＳＰ−Ｂ、ＳＰ−Ｃ又はＳＰ−Ｄポリペプチド；組換えＳＰ−Ａ、ＳＰ−Ｂ、ＳＰ−Ｃ又はＳＰ−Ｄポリペプチド；合成により得られるＳＰ−Ａ、ＳＰ−Ｂ、ＳＰ−Ｃ又はＳＰ−Ｄポリペプチド；ＳＰ−Ａ、ＳＰ−Ｂ、ＳＰ−Ｃ及びＳＰ−Ｄ類似体；ＳＰ−Ａ、ＳＰ−Ｂ、ＳＰ−Ｃ及びＳＰ−Ｄポリペプチド模倣物；活性を保持したそれらの保存的改変変異体；及び活性を保持したこれらの断片が含まれる。肺表面活性物質の模倣物は、ヒトの肺タンパク質の本質的属性を正確に真似るように巧みに処理されたポリペプチドである。ある好適な具体例において、この肺表面活性ペプチドは、少なくとも約１０好ましくは少なくとも１１アミノ酸残基よりなり、且つ約８０アミノ酸残基以下の通常は約３５アミノ酸残基より、好ましくは約２５アミノ酸残基より少ないアミノ酸残基よりなるカチオン性ペプチドである。

ここでの使用のための肺表面活性ポリペプチドの典型的なアミノ酸配列、それらを単離する方法、及びそれらを遺伝子工学的技術によって生成する方法は、当分野で公知である。例えば、米国特許第５，８７４，４０６号；５，８４０，５２７号；４，９１８，１６１号；５，８２７，８２５号；６，６６０，８３３号；５，００６，３４３号；５，４５５，２２７号；５，２２３，４８１号；５，７５３，６２１号；５，８９１，８４４号；４，８６１，７５６号；５，２７２，２５２号；５，０２４，９５号；５，２３８，９２０号；５，３０２，４８１号；６，０２２，９５５号；５，８７４，４０６号；５，８４０，５２７号；５，８２７，８２５号；６，６６０，８３３号；及び国際公開Ｎｏ．ＷＯ８６０３４０８及びＷＯ８９０４３２６を参照されたい(これらの各々の開示を本明細書中にそっくりそのまま参考として援用する)。ここでの使用のための好適な肺表面活性ペプチドは、ＳＰ−Ｂ若しくはＳＰ−Ｃポリペプチド又はポリペプチド模倣物である。

ここでの使用に特に好適な肺表面活性ペプチドは、ＳＰ−Ｂポリペプチド又はポリペプチド模倣物である。ＳＰ−Ｂは、表面張力の低下と酸素交換の促進に最も重要な表面活性タンパク質であることが知られている天然の肺表面活性物質中のタンパク質である。ＳＰ−Ｂポリペプチド模倣物は、約８０アミノ酸の大きさより遥かに小さい疎水性ポリペプチドである。多くのＳＰ−Ｂポリペプチド模倣物は、反復する疎水性のカチオン性モチーフを有する。天然のＳＰ−Ｂポリペプチドと同様に、ＳＰ−Ｂ模倣物は、好ましくは、末端誘導気道の表面張力を低下させて酸素交換を促進する。

本発明における利用に好適なＳＰ−Ｂ模倣物は、ＫＬ４ペプチドであり、これは、反復するリジン及びロイシン残基を含むカチオン性ペプチドである。ＫＬ４は、肺表面活性模倣ペプチドのファミリーの代表的なものであって、例えば、米国特許第５，２６０，２７３号、５，１６４，３６９号、５，４０７，９１４号及び６，６１３，７３４号に記載されている(その各々を、そっくりそのまま、すべての目的のために、本明細書中に参考として援用する)。ＫＬ４ペプチドを製造する方法は、米国特許第５，１６４，３６９号中に見出すことができる。

ある具体例において、肺表面活性ポリペプチド模倣物は、ゼロ未満の、好ましくは−１以下の、一層好ましくは−２以下の複合疎水性を有するアミノ酸残基配列を有するポリペプチドを指す。ペプチドの複合疎水性値は、ペプチド中の各アミノ酸残基に、Hopp等、Proc.Natl.Acad.Sci., 78:3824-3829, 1981(その開示を参考として参考として本明細書中に援用する)に記載された対応する疎水性値を割り当てることにより決定される。所与のペプチドについて、疎水性値を合計し、その合計が複合疎水性値を表している。

ある具体例において、肺表面活性ポリペプチド模倣物のアミノ酸配列は、ＳＰ１８の疎水性及び親水性残基のパターンを真似ていて、ＳＰ１８の疎水性領域の機能を達成する。ＳＰ１８は、公知の肺表面活性アポタンパク質であり、Glasser等、Proc.Natl.Acad.Sci., 84:4007-4001 1987(参考として、本明細書中に、そっくりそのまま、すべての目的のために援用する)に更に徹底的に記載されている。

ある具体例において、ここで用いるためのＳＰ−Ｂ模倣物には、交互の疎水性及び親水性アミノ酸残基領域を有するポリペプチドが含まれ、該模倣物は、下記式により表される少なくとも１０アミノ酸残基を有するとして特性表示される：
(Ｚ_aＵ_b)_cＺ_d
Ｚ及びＵは、アミノ酸残基であり、各出現につき、Ｚ及びＵは、独立に、選択される。Ｚは、親水性アミノ酸残基であり、好ましくは、Ｒ、Ｄ、Ｅ及びＫよりなる群から選択される。Ｕは、疎水性アミノ酸残基であり、好ましくは、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｃ、Ｙ及びＦよりなる群から選択される。文字「ａ」、「ｂ」、「ｃ」及び「ｄ」は、親水性又は疎水性残基の数を示す数字である。文字「ａ」は、約１〜５の、好ましくは約１〜３の平均値を有する。文字「ｂ」は、約３〜２０の、好ましくは約３〜１２の、一層好ましくは約３〜１０の平均値を有する。文字「ｃ」は、１〜１０、好ましくは２〜１０、最も好ましくは３〜６である。文字「ｄ」は、１〜３、好ましくは１〜２である。

Ｚ及びＵにより表されるアミノ酸残基が独立に選択されるということは、各出現につき、特定された群からの残基が選択されることを意味する。即ち、「ａ」が例えば２であるならば、Ｚにより表される親水性残基の各々は、独立に選択され、そうして、ＲＲ、ＲＤ、ＲＥ、ＲＫ、ＤＲ、ＤＤ、ＤＥ、ＤＫなどを含みうる。「ａ」及び「ｂ」が平均値を有するということは、反復する配列(ＺａＵｂ)内の残基の数がペプチド配列内で幾分変化しえても、「ａ」及び「ｂ」の平均値は、それぞれ、約１〜５及び約３〜２０であることを意味する。

ある具体例において、本発明で用いることのできる典型的なＳＰ−Ｂポリペプチド模倣物には、下記の肺表面活性模倣ペプチドの表に示されたものが含まれるが、これらに限られない。

本発明の好適な方法において、肺表面活性ペプチド及び一種以上の脂質を、有機溶媒系を用いて合わせる。用語「脂質」は、ここで用いる場合、天然の、合成の又は半合成の(即ち、改変した天然の)一般に両親媒性の化合物を指す。これらの脂質は、典型的には、親水性成分及び疎水性成分を含む。典型的脂質には、リン脂質、脂肪酸、脂肪アルコール、中性脂肪、ホスファチド、油、糖脂質、表面活性化剤(表面活性物質)、脂肪族アルコール、ワックス、テルペン及びステロイドが含まれるが、これらに限られない。語句半合成の(即ち、改変された天然の)は、何らかの仕方で化学的に改変された天然の化合物を示す。好ましくは、この発明の脂質は、それらの脂肪酸、アルコール、エステル及びエーテル及び脂肪アミンである。

この発明により送達される組成物において有用なリン脂質の例には、ネイティブな及び／又は合成のリン脂質が含まれる。用いることのできるリン脂質には、ホスファチジルコリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチド酸、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴ脂質、ジアシルグリセリド、カージオリピン、セラミド、セレブロシドなどが含まれるが、これらに限られない。典型的なリン脂質には、ジパルミトイルホスファチジルコリン(ＤＰＰＣ)、ジラウリルホスファチジルコリン(ＤＬＰＣ)(Ｃ１２：０)、ジミリストイルホスファチジルコリン(ＤＭＰＣ)(Ｃ１４：０)、ジステアロイルホスファチジルコリン(ＤＳＰＣ)、ジフィタノイルホスファチジルコリン、ノナデカノイルホスファチジルコリン、アラキドイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン(ＤＯＰＣ)(Ｃ１８：１)、ジパルミトオレオイルホスファチジルコリン(Ｃ１６：１)、リノレオイルホスファチジルコリン(Ｃ１８：２)、ミリストイルパルミトイルホスファチジルコリン(ＭＰＰＣ)、ステロイルミリストイルホスファチジルコリン(ＳＭＰＣ)、ステロイルパルミトイルホスファチジルコリン(ＳＰＰＣ)、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン(ＰＯＰＣ)、パルミトイルパルミトオレオイルホスファチジルコリン(ＰＰｏＰＣ)、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン(ＤＰＰＥ)、パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン(ＰＯＰＥ)、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(ＤＯＰＥ)、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン(ＤＭＰＥ)、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン(ＤＳＰＥ)、ジオレオイルホスファチジルグリセロール(ＤＯＰＧ)、パルミトイルオレオイルホスファチジルグリセロール(ＰＯＰＧ)、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール(ＤＰＰＧ)、ジミリストイルホスファチジルグリセロール(ＤＭＰＧ)、ジステアロイルホスファチジルグリセロール(ＤＳＰＧ)、ジミリストイルホスファチジルセリン(ＤＭＰＳ)、ジステアロイルホスファチジルセリン(ＤＳＰＳ)、パルミトイルオレオイルホスファチジルセリン(ＰＯＰＳ)、大豆レシチン、卵黄レシチン、スフィンゴミエリン、ホスファチジルイノシトール、ジホスファチジルグリセロール、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジン酸、及び卵ホスファチジルコリン(ＥＰＣ)が含まれるが、これらに限られない。

これらの混合物において有用な脂肪酸及び脂肪アルコールの例には、ステロール、パルミチン酸、セチルアルコール、ラウリン酸、ミリスチン酸、ステアリン酸、フィタン酸、ジパルミチン酸などが含まれるが、これらに限られない。好ましくは、脂肪酸は、パルミチン酸であり、好ましくは、脂肪アルコールは、セチルアルコールである。

これらの混合物において有用な脂肪酸エステルの例には、メチルパルミテート、エチルパルミテート、イソプロピルパルミテート、コレステリルパルミテート、パルミチルパルミテートナトリウムパルミテート、カリウムパルミテート、トリパルミチンなどが含まれるが、これらに限られない。

半合成の即ち改変された天然脂質の例は、化学的に改変された上に記載した脂質の何れかである。この化学的改変は、幾つかの改変を包含することができるが、好適な改変は、脂質の所望の部位へ少なくとも一つのポリエチレングリコール(ＰＥＧ)を結合することである。ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)は、生体適合性で、非毒性で、非免疫原性で且つ水溶性ポリマーであるので、生体材料、生体工学及び医薬において広く利用されてきている。Zhao及びHarris, ACS Symposium Series 680:458-72, 1997。薬物送達の領域において、ＰＥＧ誘導体は、免疫原性、タンパク質分解及び腎臓クリアランスを減じ、溶解度を増すためのタンパク質への共有結合物(即ち「ＰＥＧ化」)として広く用いられてきた。Zalipsky, Adv.Drug.Del.Rev. 16:157-82, 1995。

ＰＥＧと結合した脂質は、ここでは、「ＰＥＧ−脂質」と呼ぶ。好ましくは、ＰＥＧ−脂質がこの発明の方法及び組成物で用いられる場合には、それらは、アルコール及び／又はアルデヒド中に存在する。

様々な糖類例えばデキストロース、フルクトース、ラクトース、マルトース、マンニトール、スクロース、ソルビトール、トレハロースなど、界面活性剤例えばポリソルベート８０、ポリソルベート２０、ソルビタントリオレエート、チロキサポールなど、ポリマー例えばＰＥＧ、デキストランなど、塩例えばＮａＣｌ、ＣａＣｌ₂など、アルコール例えばセチルアルコール、及び緩衝剤を含む(これらに限られない)他の賦形剤をこの肺表面活性ポリペプチド、一種以上の脂質、及び有機溶媒系と、凍結乾燥前に合わせることができる。

好ましくは、肺表面活性ペプチドは、リン脂質及び遊離の脂肪酸又は脂肪アルコール例えばＤＰＰＣ(ジパルミトイルホスファチジルコリン)、ＰＯＰＧ(パルミトイルオレオイルホスファチジルグリセロール)及びパルミチン酸(ＰＡ)と合わせる。例えば、米国特許第５，７８９，３８１号を参照されたい(その開示を、本明細書中に、参考として、そっくりそのまま、すべての目的のために援用する)。

ある好適具体例において、この肺表面活性組成物は、ルシナクタントであり、又は他の合成表面活性タンパク質KLLLLKLLLLKLLLLKLLLL(ＫＬ４；SEQ ID NO:１)を含む肺表面活性配合物である。ルシナクタントは、ＤＰＰＣ、ＰＯＰＧ、パルミチン酸(ＰＡ)とＫＬ４ペプチドの結合物(重量比約７．５：２．５：１．３５：０．２６７)である。ある具体例において、この薬物生成物は、例えば１０、２０及び３０ｍｇ／ｍｌのリン脂質含有量の濃度で配合される。ある別の具体例においては、この薬物生成物は、一層高濃度例えば６０、９０、１２０ｍｇ／ｍｌ以上のリン脂質含有量で配合される(ＫＬ４濃度の増大を伴う)。

呼吸困難系及び他の肺の症状における使用のための現在使用されているか又は将来開発される任意の肺表面活性ペプチドは、本発明における利用に適している。現在の肺表面活性生成物には、ルシナクタント(Surfaxin(登録商標)、Discovery Laboratories, Inc., Warrington, PA)、ポラクタントアルファ(Curosurf(登録商標)、Chiesi Farmaceutici SpA, Parma, イタリア国)、及びベラクタント(Survanta(登録商標)、Abbott Laboratories, Inc., Abbott Park, IL)が含まれるが、これらに限られない。
１．凍結乾燥前の組成物

この発明のある方法における第一のステップは、有機溶媒系中の肺表面活性ペプチド、一種以上の脂質の実質的に均質な液体混合物を得ることである。用語「実質的に均質」とは、これらの成分が、例えば溶液中に、互いに一様に分散していることを意味する。典型的具体例において、実質的に均質な混合物は、溶液であり、時には−１０〜５０℃の範囲にある。

この肺表面活性ペプチドは、好ましくは、一種以上の脂質中に分散している。この肺表面活性ペプチドと一種以上の脂質を含む組成物は、本明細書中では、時に、「コロイド分散体」と呼ばれる。このコロイド分散体を得るために、これらの脂質を、典型的には、このペプチドと混合する。適宜、これらの脂質及びペプチドは、有機溶媒系と合わせる前に、緩衝水性媒質中で混合される。

ある好適具体例において、肺表面活性ペプチド、リン脂質及び遊離の脂肪酸又は脂肪アルコール例えばＤＰＰＣ(ジパルミトイルホスファチジルコリン)及びＰＯＰＧ(パルミトイル−オレイルホスファチジルグリセロール)及びパルミチン酸(ＰＡ)の混合物を、有機溶媒系と合わせて実質的に均質な液体混合物を形成する。個々の成分は、この混合物中で、任意の濃度で存在しうる。この分散体中のリン脂質の全濃度は、例えば、１ｍｌ当たり約１〜８０ｍｇ以上のリン脂質含有量に及びうる。適当な緩衝剤には、トリスアセテート、トリスヒドロクロリド、ナトリウムホスフェート、カリウムホスフェートなどが含まれるが、これらに限られない。これらの緩衝剤は、典型的には、市販品として入手可能である。

本発明の方法における使用に特に好適なコロイド分散体には、生理的に許容しうる水性緩衝液中のＤＰＰＣ、ＰＯＰＧ、ＰＡ及びＫＬ４(約７．５：２．５：１．３５：０．２６７の重量比)の分散体が含まれる。

本発明の典型的な方法は、肺表面活性組成物及び一種以上の脂質を有機溶媒系と合わせるステップを含む。この有機溶媒系は、一種類の有機溶媒を含む。この有機溶媒系は、肺表面活性ペプチド及び脂質を可溶化させて実質的に均質な液体混合物を形成するのに十分な量の有機溶媒を含む。ある典型的な具体例において、有機溶媒は、有機溶媒系の約２０〜１００体積％である。幾つかの他の具体例において、有機溶媒は、有機溶媒系の約２０〜７０体積％である。幾つかの他の具体例においては、この有機溶媒は、有機溶媒系の約４０〜６０体積％である。ある好適な具体例において、この有機溶媒は、有機溶媒系の約４０、５０、６０又は７０体積％である。典型的具体例において、この有機溶媒系は、水性媒質例えば水を更に含む。この有機溶媒系が２種以上の成分を含む場合には、それは、一般に、エマルジョン又は混和性溶液の形態である。「エマルジョン」が意味するものは、両相が液体であって典型的には互いに不混和性であるコロイドである。「混和性溶液」は、混合することのできる２つの液体を意味する。ある具体例において、この有機溶媒系は、更に、追加の賦形剤を含み、それには、様々な糖類例えばデキストロース、フルクトース、ラクトース、マルトース、マンニトール、スクロース、ソルビトール、トレハロースなど、界面活性剤例えばポリソルベート８０、ポリソルベート２０、ソルビタントリオレエート、チロキサポールなど、ポリマー例えばＰＥＧ、デキストランなど、塩例えばＮａＣｌ、ＣａＣｌ₂など、アルコール例えばセチルアルコールなど、及び緩衝剤が含まれるが、これらに限られない。ある好適具体例において、有機溶媒系は、実質的に塩を含まない。ある好適具体例においては、この有機溶媒系は、実質的に、ＮａＣｌを含まない。

ある具体例において、この有機溶媒系は、系のすべての成分を合わせることによって調製することができる。例えば、有機溶媒が室温の有機溶媒及び水性媒質からなる、ある具体例において、その水性媒質と有機溶媒を合わせて有機溶媒系を作成することができる。好ましくは、この有機溶媒系は、エマルジョン又は混和性溶液である。

選択した有機溶媒は、好ましくは、殺菌濾過及び凍結乾燥に適合性である。この発明で用いた溶媒は、好ましくは、凍結乾燥コンデンサーで集めることができるように、望ましい凍結及び分圧測定値を有する。ある典型的具体例において、選択した溶媒は、約−６０〜４０℃の凍結温度を有する。好ましくは、この発明の溶媒は、低級オキシ炭化水素、低級炭化水素、低級ハロオキシ炭化水素、低級スルホキシ炭化水素、低級環式炭化水素及びこれらの組合せよりなる群から選択される。

この発明で用いるのに適した溶媒には、イソプロピルアルコール、メタノール、エタノール、アセトン、アセトニトリル、シクロヘキサン、クロロブタノール、ジメチルスルホキシド、ｔ−ブタノール、ヘキサノール、ベンジルアルコール、酢酸、ペンタノール(１−ペンタノール)、ｎ−ブタノール、ｎ−プロパノール、メチルアセテート、ジメチルカーボネート、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン、四塩化炭素、ヘキサフルオロアセトン、クロロブタノール、ジメチルスルホン、シクロヘキサン、及びこれらの組合せが含まれるが、これらに限られない。好ましい溶媒には、低級アルカノール例えばｔ−ブタノール、エタノール、イソプロピルアルコールなどが含まれる。

この発明の特に好適な溶媒は、ｔ−ブタノールである。ｔ−ブタノールは、様々な用途に利用される、広く用いられている溶媒である。それは、しばしば、リポソーム及び他のコロイド分散体の製造において代替溶媒として用いられてきたものであり、凍結乾燥法で用いるのに向いた物理化学的特性を示す。ｔ−ブタノールは、２３〜２６℃の融点と８３℃の沸点を有する。従って、幾つかの面において、それは、水と類似の特性を有し、揮発性であるので、典型的凍結乾燥中に容易に除去される。

ある具体例においては、この有機溶媒及び肺表面活性ペプチド及び一種以上の脂質を含むコロイド分散体を、室温で合わせてから、ボルテックスミキサーにより混合して、実質的に均質な液体混合物を形成する。典型的には、この混合は、約１〜５分間を要する。適宜、これは、その後、超音波処理、静的ミキサー、ブレードミキサー、ホモジェナイザーなどを用いることができる。この有機溶媒とコロイド分散体を混合して実質的に均質な液体混合物を形成する別の方法を、本発明において利用することができる。

本発明のある典型的具体例において、肺表面活性ペプチド、リン脂質及び遊離脂肪酸又は脂肪アルコールの相対的量は、肺表面活性ペプチド約１重量部；肺表面活性ペプチドの重量部に対して約２０〜１５０重量部のリン脂質；肺表面活性ペプチドの重量部に対して約０〜２５重量部の遊離脂肪酸又は脂肪アルコールである。ある具体例において、有機溶媒系の相対的量は、肺表面活性ペプチドの重量部に対して少なくとも約５００重量部である。ある具体例において、この有機溶媒系は、肺表面活性ペプチドの重量部に対して約５００〜５０，０００重量部で存在する。ある典型的具体例において、肺表面活性ペプチド、リン脂質、及び遊離脂肪酸又は脂肪アルコールの相対的量は、肺表面活性ペプチド例えばＫＬ４約１重量部；ＤＰＰＣ約２０〜１００重量部；ＰＯＰＧ約０〜５０重量部；及びパルミチン酸約０〜２５重量部である。
２．濾過

本発明のある具体例においては、肺表面活性ペプチド、一種以上の脂質、及び有機溶媒系を合わせて液体混合物を形成した後で、この混合物を殺菌する。幾つかの具体例においては、この実質的に均質な液体混合物を、凍結乾燥前にフィルター殺菌する。このステップは、液体混合物中の任意の夾雑物を除いて比較的無菌の混合物を与えるために行われる。「殺菌された」又は「比較的無菌の」が意味するのは、生成物の完全性及び／又は一様性を危機にさらさないような少ない量で、任意の夾雑物が存在するということである。

凍結乾燥前のこの随意のフィルター殺菌のステップは、無菌処理に含まれるステップを減じるということが企図され、それは、現在、現行の商業的製造方法によって求められている。更に、このステップは、高価な薄膜蒸発器の必要性をも排除するということが企図される。

適当なフィルターには、有機溶媒に適合性の無菌フィルターが含まれる。熟練した実務家は、用いる特定のフィルターが本発明にとって臨界的ではないということを理解するであろう。適当なフィルターには、例えば、セルロースフィルターが含まれる。特に好適なフィルターは、アルコール及び関連有機又は有機水性媒質に適合性であるので、ポリ(テトラフルオロエチレン)(ＰＴＦＥ)から作られたものである。他の好適なフィルターは、ポリ(エーテル-スルホン)から構成される。有機水性混合物に適合性の他のフィルターには、ポリビニリデンフルオリド、ポリプロピレン及びナイロンが含まれるが、これらに限られない。

ある典型的具体例において、フィルターの多孔度は、約０．２〜０．４５ミクロンとなろう。このフィルターのサイズは、そのフィルターを通過しうる液体混合物の体積を決定する。

濾過後に、これらの組成物を、適当な凍結乾燥バイアル中に置くことができる。これらのバイアルは、再構成後に単一投与量配合物であってよい。

これらのバイアルは、一般に、無菌的であり、満杯容積がバイアル当たり約５〜７５ｍｌである約５〜１００ミリリットルのバイアルであってよい。

本発明のある具体例においては、この肺表面活性ペプチド組成物は、最後に、例えば凍結乾燥後に殺菌される。ある具体例においては、最後の殺菌は、オートクレーブ、ガンマー線照射、又はｅ−ビーム殺菌によるものである。
３．凍結乾燥

本発明の典型的方法は、肺表面活性混合物を凍結乾燥するステップを含む。凍結乾燥は、殺菌の前又は後に生じうる。

凍結乾燥は、しばしば「フリーズドライ」と呼ばれる工程の技術名である。この工程において、水性混合物又は懸濁液は、固体に凍結され、次いで、それは、一般に、かなりの時間にわたって真空にさらされる。この真空は、水分子の「昇華」を引き起こし、即ち、水は、液体状態を通らずに気体となって固体が残る。

好適具体例において、凍結乾燥工程中に、有機溶媒系例えば水と低級アルカノールは、昇華によって相当除去される。好適具体例においては、凍結乾燥後に、５％未満の、好ましくは３％未満の、一層好ましくは２％未満の、尚一層好ましくは１％未満の又は０．１％未満の残留溶媒が残る。

本発明においては、任意の凍結乾燥法を用いることができる。凍結乾燥法は、当分野において公知であり、従って、ここでは詳細には述べない。

典型的な凍結乾燥法は、次のステップを含む：(１)試料を凍結乾燥チャンバー中に置き、棚温度を、凡そ大気圧で、約−４０〜−２０℃に下げ；(２)棚温度を、試料温度が−４０〜約−２０℃に達するまでその温度範囲に維持し；(３)その後、圧力を約５０〜６００ｍトルまで下げて且つ棚温度を、約−２０〜２０℃まで上げて、有機溶媒系の昇華が実質的に完了するまで維持し；そして(４)試料を約−２０〜２０℃にし、その時点でバイアルを無菌的に密閉する。

この凍結乾燥ステップは、肺表面活性ペプチド組成物例えばＫＬ４肺表面活性ペプチド組成物を生成し、それは、室温で長期間にわたって貯蔵することができる。残留水及び潜在的な残留有機溶媒が、貯蔵性に対する悪影響を最少にするようにデザインされた量で存在するということは注目される。例えば、ある好適具体例において、乾燥させた肺表面活性ペプチド組成物の最終的な水分含量は、約５重量％未満、好ましくは２．５重量％未満、一層好ましくは約３重量％未満であり、最も好ましくは約１．５重量％未満である。

この凍結乾燥した肺表面活性ペプチド組成物は、乾燥組成物となる。ある具体例において、この凍結乾燥した肺表面活性ペプチド組成物は、ケーキ形態又は易流動性粉末の形態である。好適具体例において、この凍結乾燥した肺表面活性ペプチド組成物は、ケーキ形態である。
４．再構成

ある典型的具体例において、凍結乾燥した肺表面活性組成物は、一度十分量の製薬上許容しうる分散剤と接触されれば、容易に再構成される。例えば、ある具体例において、凍結乾燥した肺表面活性組成物は、例えば約１〜１０分間にわたって、分散剤と混合されて、液体の肺表面活性組成物を与える。この分散剤は、好ましくは、無菌水である。この液体の肺表面活性組成物は、更に、等張塩溶液又は他の賦形剤によって希釈して、投与前に、所望の濃度を生成することができる。

本発明の典型的具体例において、生成された液体の肺表面活性組成物は、所望の特性例えば望ましい粘度及び表面張力特性を示す。

肺表面活性組成物は、理想的には、それらが容易に流れ又は肺の表面を横切って拡散することができるような低い表面張力値を有する。

用語「表面張力」は、表面／空気界面にあるものの表面の下の分子により発揮される引力を指し、これは、気体の低い分子濃度と比べて高い分子濃度の液体から生じる。低い値の表面張力を有する液体例えば非極性液体は、水より一層容易に流れる。典型的には、表面張力の値は、ニュートン／メートル又はダイン／センチメートルで表される。

「動的表面張力」は、ここで言及する場合、表面／空気界面及び表面／表面界面に対する動的表面張力である。動的表面張力を測定するための多くの代替方法、例えば、拘束泡表面張力測定又は脈動泡表面張力測定がある。動的表面張力を測定する一つの好適な方法は、以下に与える脈動泡表面張力測定である。

一つの典型的具体例において、肺表面活性組成物の動的表面張力は、パルセーティングバブルサーファクトメーター(ＰＢＳ、Electronetics Corp, フロリダ、Seminole)を用いて、３〜１０ｍｇ総リン脂質含量(ＴＰＬ)／ｍｌで測定される。その試料は、１３０ｍＭ ＮａＣｌを含む２０ｍＭ トリス−Ａｃ緩衝液(ｐＨ７．６)中で希釈される。希釈に際して、この試料を、１０秒間ボルテックスミキサーにかけ、３７℃水浴にて１０分間加熱する。水浴から取り出した後、その試料を１０秒間同ミキサーにかける。約５０μＬの試料を３７℃で、ＰＢＳにて分析する。泡は、ユーザーが形成して、１分間平衡化される。この泡を、次いで、２０サイクル／分の振動数で６分間脈動させ、その間、泡は、０．４ｍｍの最小半径から０．５５ｍｍの最大半径に循環する。ＰＢＳ機器中の圧力変換器は、圧力を測定し、これは、ラプラス方程式を用いて表面張力を計算するのに用いられる。１００サイクル後の表面張力を測定して、試料の最小動的表面張力として報告する。

本発明の好適な肺表面活性組成物は、低い表面張力を示す。ある具体例において、本発明は、１３０ｍＭ ＮａＣｌを含むトリス−Ａｃ緩衝液(ｐＨ７．６)中の１０ｍｇ−ＴＰＬ／ｍｌの濃度で、３７℃で２０サイクル／分振動数において、約１０ｍＮ／ｍ未満の低い動的表面張力を示す(泡半径は、Electronetics Corporationのパルセーティングバブルサーファクトメーター(ＰＢＳ)を用いて、５分間のサイクリングの後に測定して０．４〜０．５５ｍｍで変化する)肺表面活性組成物を提供する。ある具体例において、これらの肺表面活性組成物は、１０ｍｇ−ＴＰＬ／ｍｌの濃度で約５ｍＮ／ｍ未満の又は、３ｍｇ−ＴＰＬ／ｍｌの濃度で約５ｍＮ／ｍ未満の動的表面張力を示す。

加えて、肺表面活性物質は又、肺中に効果的に分布する組成物を与えるような低い粘度をも有する。加えて、一層低い粘度は、取扱い及び投与が一層容易である。

用語「粘度」は、特定の温度において流体により示される流れに対する内部抵抗；剪断応力の剪断速度に対する比を指す。液体は、１ダイン／平方センチメートルの力が、１平方センチメートル離れた面積１平方センチメートルの２つの平行な液体表面に、相互に１ｃｍ／秒の速度で去るように動きを引き起こすならば、１ポアズの粘度を有する。

見かけ粘度に言及する場合には、粘度の値が測定を行なう条件例えば採用した温度、剪断速度及び剪断応力に依存するものと理解される。見かけ粘度は、剪断応力の適用した剪断速度に対する比として定義される。見かけ粘度を測定するための多くの代替方法がある。例えば、粘度は、適当な錐体とプレート、平行なプレート又は他の種類の粘度計又はレオメーターによって試験することができる。見かけ粘度を測定する一つの好適な方法は、以下に与えるように、レオメーターを用いることである。

一つの典型的具体例において、表面活性配合物の見かけ粘度は、２５℃の温度で、レオメーター(例えば、４０ｍｍ／１°アクリル錐体を取り付けたＴＡ ＡＲ１０００レオメーター、TA Instruments, デラウェア、New Castle)を用いて測定される。約３５０μＬの未希釈の表面活性物質をレオメーター中に置き、２５℃で熱平衡化させる。ステップフロー手順を利用して、試料を、時間と共に剪断速度を直線的に増大させ(０〜２００秒^-1)、その後剪断速度を直線的に減少させる(２００〜０秒^-1)ことにより分析する。各上り及び下り勾配中に、１５ポイントを集める(約６分の全ラン時間を生じる)。上り及び下り勾配中に、１５７秒^-1の剪断速度で測定された粘度を平均して、各試料の見かけ粘度として報告する。

ここに記載した方法により製造された典型的な液体肺表面活性組成物は、４０ｍｍ／１°アクリル錐体を取り付けたレオメーター及び、経時的な剪断速度の０〜２００秒^-1に至る約３分間の直線的な増大とその後の経時的な剪断速度の２００〜０秒^-1に至る約３分間の直線的な減少を用いるステップフロー手順を用いて、温度２５℃で剪断速度１５７秒^-1で測定した場合に、３０ｍｇ−ＴＰＬ／ｍｌの濃度で約５０ｃＰ未満の見かけ粘度を示す。ある具体例においては、ここに記載した方法により製造した典型的な液体の肺表面活性組成物は、３０ｍｇ−ＴＰＬ／ｍｌの濃度で約３０ｃＰ未満の見かけ粘度を示し又は３０ｍｇ−ＴＰＬ／ｍｌの濃度で約１５ｃＰ未満の見かけ粘度さえ示す。
５．投与

ここに記載した肺表面活性組成物は、様々な呼吸障害の治療又は置換療法において用いることができ、ＲＤＳ(呼吸障害症候群)の幼児及びＡＲＤＳ(成人型呼吸窮迫症候群)の成人の救済及び予防処置において特に有用である。この発明の方法により製造した乾燥及び液体表面活性物質の両方は、呼吸治療の必要な患者に投与することができる。特に、乾燥肺表面活性組成物は、更に処理して、例えば、エアゾルの乾燥粉末として投与することができ、液体肺表面活性物質は、例えば、液体ボーラス又は湿潤エアゾルとして投与することができる。

エアゾル製剤として用いる場合には、この表面活性組成物は、微粉末形態で、適宜適当な噴射剤と組み合わせて供給することができる。有用な噴射剤は、典型的には、周囲条件で気体であり、圧力下で濃縮され、例えば、低級アルカン及びフッ素化アルカン例えばフレオンが含まれる。この表面活性組成物がエアゾルとして送達されるある具体例において、そのエアゾルは、圧力下で適当な容器にパッケージ化することができる。ある別の具体例においては、これらの凍結乾燥された粉末を、乾燥粉末吸入システム内でのユニット又は多投与パケットとしての取込みのために、微粉砕又は他の手段によって更に処理することができる。この表面活性物質の適当な投薬量は、エアゾル化しても液体ボーラスとして送達しても、患者の年齢及び障害の重さに依存し、所属臨床医によって容易に確認することができる。肺表面活性物質の実際の投薬量は、当然、曝露の程度及び患者の特定の状態(例えば、患者の年齢、大きさ、適合性、症状の程度、感受性因子など)などの因子によって変化する。「有効な投与量」とは、ここでは、投与により効果を生じる投与量を意味する。

肺表面活性物質は、臨床状況において、特に、肺表面活性物質の未熟児への供給だけでなく、急性呼吸窮迫症候群、急性肺傷害、胎便吸引症候群などの患者にも特別の用途を見出す。

この表面活性物質を未熟児に与えた場合には、その表面活性組成物のアリコートを、好ましくは気管内点滴注入法によって、送達して、治療された患者の肺における表面活性物質の効果的な投与量を与える。好ましくは、単一の表面活性物質投与量は、例えば、約２０〜３００ｍｇ−ＴＰＬ／ｋｇ、一層好ましくは、約６０〜１７５ｍｇ−ＴＰＬ／ｋｇに及ぶ。表面活性物質の正確な投与量は、患者の年齢及び病状、治療する病気の重さ、及び所属臨床医に周知の他の因子などの因子に依存するということは、当然、理解される。この表面活性組成物がエアゾルとして送達される同時係属中の米国出願第１１／１３０，７８３号(２００５年５月１７日出願)(参考としてそっくりそのまま本明細書中に援用する)に開示されたようなある具体例において、肺表面活性物質の有効な投与量は、例えば、約２〜１７５ｍｇ−ＴＰＬ／ｋｇの表面活性物質である。他の送達方法には、洗浄、肺洗浄などが含まれる。そうならば、用いられる投与量範囲は、当業者の技量内にある。

加えて、これらの方法及びシステムは又、幼児及び他の小児科の患者集団に見られる他の臨床的障害例えば嚢胞性繊維症、感染過程への介入、細気管支炎などの治療にも有用である。

ここに記載の肺表面活性組成物からの恩恵を受けることのできる患者は、妊娠期間が２４週ほどの未熟な新生児から成人にまで及ぶというこが企図される。

他の呼吸障害に悩まされている患者は、この発明の方法及びシステムによって恩恵を受けることができる。これらの呼吸障害には、新生児肺高血圧症、新生児気管支肺形成異常、慢性閉塞性肺疾患、急性及び慢性気管支炎、肺気腫、細気管支炎、気管支拡張症、放射線肺炎、過敏性肺炎、急性炎症性喘息、急性煙吸入、熱性肺傷害、喘息例えばアレルギー喘息及び医原性喘息、珪肺症、気道閉塞、嚢胞性繊維症、肺胞タンパク症、アルファ−１−プロテアーゼ欠乏症、肺炎症性疾患、肺炎、急性呼吸窮迫症候群、急性肺傷害、特発性呼吸窮迫症候群、特発性肺繊維症、副鼻腔炎、鼻炎、気管炎、耳炎などが含まれるが、これらに限られない。従って、本発明は、患者におけるこれらの疾患を治療するための方法、システム及び装置を提供する。

ある具体例において、本発明の肺表面活性組成物を製造する方法は、表面活性物質生産規模変更可能性、均質な製品の再生産性及び現行の商業的製品を超える製造容易さへの改良である。

下記の実施例は、請求項記載の発明を説明するために与えるものであり、それらの制限と解釈すべきではない。

別途示さないかぎり、すべての温度は、摂氏温度である。これらの実施例及び他所においても、下記の略号は、下記の意味を有する：
ｍｌ ＝ ミリリットル
ｖ／ｖ ＝ 体積／体積
ｍｇ ＝ ミリグラム
ＨＰＬＣ＝ 高性能液体クロマトグラフィー
ＴＰＬ ＝ 総リン脂質
μｌ又はｕｍ＝マイクロリットル
ｍＮ／ｍ＝ ミリニュートン／メートル
ｍ ＝ メートル
ｃＰ ＝ センチポアズ
ＰＳＡ ＝ 粒径分析
ＰＢＳ ＝ 脈動泡表面張力測定
μｍ又はｕｍ＝マイクロメートル又はミクロン
ＲＴ ＝室温
ｍｉｎ ＝分
ＴＢＡ ＝ｔ−ブタノール
実施例１
有機溶媒系及び融点

溶媒混合物が液体でいるための温度範囲を決定するために、１００、９５、９０、８０及び５０％ｖ／ｖ(体積／体積)のｔ−ブタノールの水性緩衝液中の溶液を調製して、室温(例えば、２５℃)、２〜８℃及び−２０℃で平衡化させた。これらの溶液が固体か液体かに関して観察を行なった。生のｔ−ブタノールは、典型的には、２５．４℃で凍結する。ｔ−ブタノールへの水の添加は、表１に示したように融点を下げた。即ち、９５、９０、８０及び５０％ｖ／ｖのｔ−ブタノール溶液は、すべて、室温並びに２〜８℃で貯蔵した場合の両方において液体のままであった。これらのデータは、ｔ−ブタノール／水混合物の冷却又は加温環境中での貯蔵及び／又は利用は、相変化(即ち、凍結)により阻害されないことを示している。

実施例２
溶解度測定
ｉ．個々の成分の溶解度

各脂質及びペプチドのアリコートを、正確に重量測定して、１．５ｍｌエッペンドルフチューブに入れる。標的の重量は、ＤＰＰＣ、ＰＯＰＧ及びパルミチン酸(ＰＡ)については約２５ｍｇ、セチルアルコール(ＣＡ)については５０ｍｇ、ＫＬ４については１０ｍｇであった。各チューブに０．２ｍｌの溶媒を加えた。各チューブをボルテックスミキサーにかけてから数分間超音波処理して溶解を促進した。次いで、試料を３７℃の浴中に約３０分間置き、その後、取り出してカウンター上に３０分間置いた。それ故、サンプリング時の温度は、２５〜３７℃であった。３つの独立のエッペンドルフチューブを用意して各溶質−溶媒の組合わせについて試験した。各チューブの視覚的観察を、ａ）透明(即ち、見かけ上、完全に溶解している)か、ｂ）溶解しない物質を含むか、又はｃ）不確定に見えるかについて行なった。次いで、各チューブの少量のアリコートを採って、ＨＰＬＣランニング緩衝液中に希釈して、ＨＰＬＣにより分析した。ＨＰＬＣを、ＣＩＳカラムを用いて、確立された方法により行なった。

個々の脂質及びＫＬ４の、ｔ−ブタノール／水溶液中への、３７℃での溶解度測定の結果を、表２に示す。これらの試験条件の多くは、脂質及び／又はペプチドの３７℃での完全な溶解を生じた。これは、各試料／チューブの視覚的観察、並びにＨＰＬＣで測定された濃度と溶媒容積で除した試料重量との比較(データは示してない)の両方によって証明された。この溶媒溶解度の最小値を、表２に見出すことができる。ＰＯＰＧは、１００％及び９９％ｔ−ブタノールに多いに不溶性で、このアッセイの検出限界より低濃度(約５ｍｇ／ｍｌ)であった。こうして、溶解度の上限を表２に見出すことができる。

表２は、脂質及びＫＬ４が一般に、標的濃度と比較してｔ−ブタノール−水溶液に非常に溶解性であることを示しており、これは、製造方法につき実行可能である(標的濃度は、充填／凍結乾燥につき３０ｍｇ／ｍｌのＴＰＬが想定されている)。標的が適さない唯一の状況は、１００％及び９９％のｔ−ブタノールのＰＯＰＧについてであった。
ii．脂質／ＫＬ４を合せた溶解度

個々の成分についての溶解度の測定に加えて、脂質とＫＬ４を合わせて、ｔ−ブタノール−水溶液中での溶解についても、３０ｍｇ／ｍｌの総リン脂質含量(ＴＰＬ)及び僅かなＫＬ４表面活性組成物で試験した。

即ち、ＤＰＰＣ、ＰＯＰＧ、ＰＡ及びＫＬ４の重量を測定して２０ｍｌのシンチレーションバイアルに、重量比３：１：０．５４：０．１０７で合わせて入れた。適当な容量の溶媒(即ち、１２ｍｌが３０ｍｇ／ｍｌのＴＰＬを達成した)を加えて、９５、９０、８０、７０、６０、５０、４０及び３０％ｖ／ｖ ｔ−ブタノールを得た。バイアルを、浴中で約５０℃で超音波処理して、溶液が透明になるまで１〜３分間穏やかに攪拌した。最終的溶液において溶解度につき視覚的観察(すべて完全に透明であった)並びにＨＰＬＣ測定を行なった。

すべての溶液は、５０℃での１〜３分間の浴中超音波処理後に、脂質とＫＬ４を、３０ｍｇ／ｍｌで完全に溶解した(視覚的観察)。これらの溶液における脂質及びＫＬ４含量についてのＨＰＬＣ分析は、完全に溶解した視覚的観察を確認した。
実施例３
濾過回収率

ポリ(テトラフルオロエチレン)(ＰＴＦＥ)は、一般にアルコールと適合性であり、特にｔ−ブタノールと適合性の物質である。その上、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓは、無菌的製造方法のための殺菌フィルターのラインを、ＰＴＦＥＳａｒｔｏｆｌｕｏｒ(登録商標)を利用して製造する。Ｓａｒｔｏｆｌｕｏｒ(登録商標)注射器は、フィルターシステム上の脂質及びペプチド保持のレベルを同定するために得られた。ポリ(エチレン−スルホン)(ＰＥＳ)よりなる注射器フィルターも又、評価された。
i．９０％ｖ／ｖ ｔ−ブタノール溶液の濾過

脂質及びペプチドの重量を測定して、乾燥した２０ｍｌシンチレーションバイアル中にて合わせた(４５０ｍｇ ＤＰＰＣ、１５０ｍｇ ＰＯＰＧ、８１ｍｇ ＰＡ及び１５．９ｍｇ ＫＬ４(純度調節))。このバイアルに１０ｍｌの９０％ｖ／ｖのｔ−ブタノールを加えた。９０％ｖ／ｖのｔ−ブタノール溶媒組成物は、溶解度に基づいて選択されたということに留意されたい。この溶液を３７℃に加温して、数分間浴中超音波処理してこれらの成分を溶解させた。これらの９０％ｖ／ｖのｔ−ブタノール脂質溶液を、同ＰＴＦＥ及びＰＥＳフィルターを順次的に１０回続けて通過させた(フィルター当たり約５ｍｌ)。アリコート(２００ｕｌ)を、０、１、５、７及び１０回フィルターを通過させた後に、ＨＰＬＣ試験のために採った。溶媒のみの対照用群を、このフィルターを通過させて、ＨＰＬＣにて試験して、浸出がないことを確実にした。

溶媒単独又は溶媒プラス脂質／ＫＬ４の、ＰＴＦＥ又はＰＥＳフィルター通過の際に、有意の圧力差は認められなかった。即ち、すべての溶液は、ＰＴＦＥ及びＰＥＳフィルターを容易に通過するようであった。

９０％ｖ／ｖのｔ−ブタノールを用いた殺菌濾過研究からのＨＰＬＣの結果は図１及び２に示してある。脂質又はＫＬ４の濃度の有意の変化は、０〜１０回のＰＴＦＥ及びＰＥＳフィルター通過について認められなかった。
ii．４０〜７０％ｖ／ｖのｔ−ブタノール溶液の濾過

濾過研究を、７０、６０、５０及び４０％ｖ／ｖのｔ−ブタノールの３０ｍｇ／ｍｌ ＴＰＬ溶液を、上記のＳａｒｔｏｒｉｕｓＰＴＦＥ注射器フィルターを通過させることにより行なった。これらのＴＰＬ溶液は、２７０ｍｇ ＤＰＰＣ、９０ｍｇ ＰＯＰＧ、４８．６ｍｇ ＰＡ、及び９．５ｍｇ ＫＬ４(純度調節)を、１２ｍｌの溶媒に溶解して含んだ。各脂質／ＫＬ４溶液の試料を採って、一回のフィルター通過の前後に、ＨＰＬＣにより分析した。

脂質及びＫＬ４を３０ｍｇ／ｍｌＴＰＬで含む７０、６０、５０及び４０％ｖ／ｖのｔ−ブタノールの濾過研究からの結果を、表３に示す。即ち、各成分の、濾過後に測定された濃度は、濾過前に測定された濃度と比較して、回収率として記録され言及される。表３は、７０、６０、５０及び４０％のｔ−ブタノールを用いた濾過中に脂質の有意の損失がないことを示しており、これは上記の９０％ｖ／ｖのｔ−ブタノールについての観察と一致する。回収率は、出発濃度の９５〜１０２％であり、平均で、ＰＡ、ＤＰＰＣ及びＰＯＰＧについて、それぞれ、９９、９９、及び９８％であった。

実施例４
凍結乾燥
下記よりなる、利用した最初の凍結乾燥サイクル：
１．大気圧で−３０℃に下げた棚温度。
２．試料温度が−３０℃に達するまで−３０℃に維持した棚温度。
３．５００ｍトルに減じた圧力及び０℃まで高めた棚温度。
４．サイクルは、一度試料が０℃に達したならば完了する。
Ａ部

凍結乾燥用バイアル(２０ｍｌ)に、２ｍｌの３０ｍｇ／ｍｌのＫＬ４肺表面活性物質(ＤＰＰＣ(４５ｍｇ)、ＰＯＰＧ(１５ｍｇ)、ＰＡ(８．１ｍｇ)及びＫＬ４(１．６ｍｇ)を、９５、９０、８０及び５０％ｖ／ｖのｔ−ブタノールに溶解して含む)を充填した(条件当たり３つのバイアル)。試料を、上記のサイクルにより凍結乾燥した。凍結乾燥されたケーキを、室温でのトリス−ＮａＣｌによる水和時間、脈動泡表面張力測定(ＰＢＳ)、粘度、及び粒径分析(ＰＳＡ)により分析した。

これらの脂質−ＫＬ４固体は、すべて、選択した溶媒に、３０ｍｇ／ｍｌＴＰＬで溶解した。すべての溶媒組成物は、軽い衝撃(即ち、通常の取扱い)に対して安定な円筒状の白色ケーキを生成した。

手の動きによるシェーカーを用いた水和時間は、最初の溶媒の組成によって変化した。５０％ｖ／ｖのｔ−ブタノールから形成されたケーキは、手動作のタイマーを使用して最短の５分未満で水和したが、９５％ｖ／ｖのｔ−ブタノールから形成されたケーキは、３５分以内にこれらの脂質を完全には水和しなかった。すべての再構成された配合物は、３ｍｇ／ｍｌＴＰＬで測定して約０ｍＮ／ｍの良好な表面活性の読みを示した。これらの水和した配合物の粘度は、かなり変化した。最低粘度は、「５０％ｔ−ブタノール」配合物から測定された１７ｃＰであったが、「９５％ｔ−ブタノール」配合物からの最高粘度の読みは、ほぼ１ｌｏｇ大きい１６５ｃＰであった。
Ｂ部

各２０ｍｌの凍結乾燥バイアルに、２ｍｌの、３０ｍｇ／ｍｌの肺表面活性物質(９５、９０、８０、７０、６０、５０、４０及び３０％ｖ／ｖのｔ−ブタノールに溶解させたＤＰＰＣ、ＰＯＰＧ、ＰＡ及びＫＬ４よりなる)を充填した。各成分の量は、Ａ部と同じであった。５つのバイアルを、各条件につき用意した。

すべての溶媒組成物は、これらの脂質／ＫＬ４を完全に溶解した。すべての溶媒からの凍結乾燥後のケーキは、円筒状の、白い、通常の取扱いに対して安定なものであった。これらのケーキの水分含量は、すべてまったく低く、カールフィッシャー滴定により測定して１．０〜２．３％であり、明確な傾向を示さなかった。見かけ粘度は、ｔ−ブタノール含量が減少するにつれて減少したが、表面活性は、試験したすべての組成物について、ＰＢＳにより測定して優秀であった。
実施例５
i．溶媒の調製

溶媒混合物(４０，５０，６０，７０及び８０％ ＴＢＡ)の各々をＤＩ水中で重量測定することにより調製した。
ii．合わせた固体液体成分調製物

製剤の場合につき及び溶媒混合物中のすべての４種類の成分の溶解度の測定に必要とされる重量測定する量を減じるために、乾燥脂質組成物を、ポストＴＦＥ法により調製した脂質の３０ｍｇ/ｍｌ水溶液を凍結乾燥することにより調製した。２つのかかる配合物を調製した。これらの配合物の一つをＤＩ水により水和して、第二の配合部をトリス−Ａ(ｐＨ７．６)緩衝液で水和した。水和を、低粘度を確実にし、それ故に取り扱いを容易にするために、バイアルの充填の日と同じ日に行なった。次いで、１０ｍＬのバイアルに、標的配合物を充填して、３０、４５，６０，９０及び１２０ｍｇ／ｍｌの濃度を、ＮａＣｌを伴う及び伴わない両配合物につき達成した。すべてのバイアルは、半栓をして熱電対を各濃度につき一つの代表するバイアルに付けた。

試料バイアルを凍結乾燥して、一次乾燥を最大４０００分まで延長して、それらの試料の完全な乾燥を確実にした(熱電対とＴＣＶＧ読みの両方で表示)。これらの乾燥したケーキの視覚的観察に加えて、凍結乾燥後残留水分を、熱電対バイアルの各々につきカールフィッシャー法により測定して、低い水分が達成されたことを確認した。

補助溶媒混合物を実験室で室温に熱平衡化させた後に、規定の量を重量測定することにより各倍あるに正確に添加した。溶媒添加後に、倍あるの内容物を穏やかに混合した。初めに、溶解度を、視覚的観察により記録した(即ち、次を表示する：透明な溶液、濁った、相分離した、大きい凝集物、小さい凝集物、ゲル)。穏やかな混合によっては完全に溶解しなかった試料を３０℃で、透明になるまで又は５分間の最大持続時間にわたって浴中超音波処理した。３０℃で超音波処理にかけた試料を、２時間の最少時間にわたって室温に再平衡化させた。成分の溶解度(ＤＰＰＣ、ＰＯＰＧ，ＰＡ及びＫＬ４の定量)を、各バイアルからの１ｍｌの試料の２２℃での遠心分離により得られた透明な上清のＨＰＬＣによって測定した。

配合物を、ＮａＣｌを伴って及び伴わずに、試験すべき各溶媒組成物にて調製した。この研究のために、９．１ｍｌ充填についての標的重量を測定して、各配合物の組成物を重量測定して２０ｍｌバイアルに入れた。すべてのバイアルにセミストッパーを付けて、凍結乾燥棚に配列した。

試料バイアルを、単一のリオサイクルを用いて、一層詳細には、−４０℃に凍結し、チャンバー内を真空吸引して２００ｍＴにし、棚温度を５℃にすることにより凍結乾燥した。一次乾燥を、最大４０００分まで延長して、試料の完全な乾燥を、製品熱電対(これらは、図２に示したように、中央及び２つの極めて端のバイアルに置かれた)及びＴＣＶＧ読みの両方により示されるように、確実にした。
iii．生成物の特性
Ａ．ケーキの外観及び再構成時間

円筒状の特性を示し、崩壊又は溶融の証拠を示さない、一様なケーキが、すべての配合物について認められた。ケーキは、色においてオフホワイトであり、丈夫でもあって、ゆるい粉末に崩壊する傾向を有しなかった。すべてのケーキについての再構成時間を表４にまとめてある。ここで、特に注意すべきは、この研究の観察は、各事例において一つのバイアルの再構成に基くものであったということである。

表４．凍結乾燥したＴＢＡ補助溶媒配合物の範囲についての、塩を伴う場合と伴わない場合の再構成時間のまとめ

表４の結果から、再構成時間は、塩の存在下で僅かに減少するようであるが、多少、補助溶媒の組成に依存することが見出された。
Ｂ．見かけ粘度

各試料について２５℃で行なった見かけ粘度の測定は、７〜１５ｃＰの範囲内の値を生成し、表５にまとめたように、粘度は、ＮａＣｌを含む配合物について全体的に一層高かった。その上、ＮａＣｌを含む配合物の粘度測定は、補助溶媒組成物によって影響されなかったが、塩を含まない配合物は、補助溶媒組成物の関数であることが見出され、補助溶媒組成物の減少と共に粘度の減少を示した。

表５．ＮａＣｌを含む又は含まない再構成ＴＢＡ配合物の見かけ粘度の測定。
Ｃ．表面活性

すべての再構成された配合物のイン・ビトロ表面活性(３ｍｇ−ＴＰＬ／ｍｌでＰＢＳにより測定)を図３に示した。最小表面張力の生成放出基準は、１０ｍＮ／ｍ以下であり、まとめた結果は、すべての塩を含まない配合物が、低い表面活性を示したことを示していて、種々の補助溶媒組成物にて測定された値が区別しえず、即ち、表面活性は、補助溶媒組成の関数であることが見出されなかった。塩を含む配合物について測定された値は、僅かに高かったし又、溶媒組成は、測定に悪影響を与えるようには見えなかった。

塩を含む場合と含まない場合の代表的バイアルについての測定された残留水分含量(３つの測定値の平均)を図４にグラフにより与えた。試験したすべての試料について、残留水分は低く、平均水分含量は、０．２％であり、配合物中の塩含有量又はＴＢＡ％に依存することは見出されなかった。

表６は、塩のある場合とない場合の、変化する組成のＴＢＡ補助溶媒(５０、６０及び７０％を試験)を含む予備凍結乾燥した配合物についてのイン・ビボ活性の結果をまとめてある。すべての試料は、イン・ビボアッセイを容易に通過することが見出され、対照群に対して１５０％を超えてｐ＜０．０５の、コンプライアンスの平均増加として規定された。コンプライアンスの増加がこれらの実験を行なうＵＣＳＤグループにより認められた最強のものの幾つかであると報告されても、このアッセイが配合物を互いに比較するためにデザインされている／されたということに注意しなければならない。

表６．変化する組成のＴＢＡ補助溶媒を含む予備凍結乾燥した配合物のイン・ビボ活性の結果のまとめ。

上記の発見は、ＮａＣｌを含まない６０％ＴＢＡが最適補助溶媒であることを示している。それ故、追跡の溶解度研究を行なって、この溶解度データが個々の成分並びに混合した系の両方について丈夫であることを確認した。表７は、この溶解度研究の結果をまとめてある。

表７．ＮａＣｌを含まない６０％ＴＢＡ補助溶媒における個々の成分についての達成しうる溶解濃度のまとめ。

６０％ＴＢＡにおける個々の成分の溶解度(表７)の、混合した成分系における同成分との比較において、ＰＡの溶解度は、他の成分により有意に影響を受けてそれらの存在下で増大していることがわかる。即ち、ＰＡ単独では、室温で６０％ＴＢＡ中で４２．５ｍｇ／ｍｌの溶解度を有するが、混合成分溶液では、１０ｍｇ／ｍｌでＰＡは、完全には溶解しないようである。

前述の記載から、組成物及び方法における様々な改変及び変更が当業者には想起するであろう。添付の請求の範囲に入るかかる改変はすべて、その中に含まれるものである。列記した各々の範囲は、範囲のすべてのコンビネーション及びサブコンビネーション並びにそれらに含まれる特定の数字を含む。

上で引用したすべての刊行物及び特許文献は、すべての目的のために、個別に示したのと同程度に、参考としてそっくりそのまま、本明細書中に援用する。

前述の発明が、明快な理解のために実施例によって詳述されていても、ある種の変更及び改変が、この開示により理解され、過度の実験なしで、添付の請求の範囲内で実施しうるということは明らかであり、それらは、説明のために与えたものであり、制限ではない。

この発明の典型的組成物中に存在する脂質の測定された濃度を、無菌濾過のフィルター通過数と比較して示している図である。 この発明の典型的組成物中に存在するＫＬ４ポリペプチドの測定された濃度を、無菌濾過のフィルター通過数と比較して示している図である。 典型的な再構成された凍結乾燥ＫＬ４配合物の、塩を伴うか又は伴わない表面活性データを示している図である。 塩を伴うか又は伴わない、典型的な凍結乾燥ＫＬ４配合物についての残留水分データを示している図である。

Claims (45)

1. 肺表面活性組成物を製造する方法であって、下記を含む当該方法：
   肺表面活性ポリペプチド及び一種以上の脂質を、有機溶媒系を用いて合わせ、該系は、該肺表面活性ポリペプチドと脂質を可溶化して実質的に均質な液体混合物を形成するのに十分な量の有機溶媒を含み；そして
   該液体混合物を凍結乾燥して凍結乾燥された肺表面活性ポリペプチド組成物を得る。
2. 実質的に均質な液体混合物を、凍結乾燥前に濾過する、請求項１に記載の方法。
3. 実質的に均質な液体混合物を、凍結乾燥前にフィルター殺菌する、請求項１に記載の方法。
4. 肺表面活性ポリペプチド組成物を、凍結乾燥後に殺菌する、請求項１に記載の方法。
5. 肺表面活性ポリペプチドが、動物由来のポリペプチドである、請求項１〜４の何れか一つに記載の方法。
6. 肺表面活性ポリペプチドが、合成ポリペプチドである、請求項１〜３の何れか一つに記載の方法。
7. 肺表面活性ポリペプチドが、組換えポリペプチドである、請求項１〜６の何れか一つに記載の方法。
8. 合成表面活性ポリペプチドが、SEQ ID NO:１、SEQ ID NO:２、SEQ ID NO:３、SEQ ID NO:４、SEQ ID NO:５、SEQ ID NO:６、SEQ ID NO:７、SEQ ID NO:８、SEQ ID NO:９、SEQ ID NO:１０、SEQ ID NO:１１、SEQ ID NO:１２、又はSEQ ID NO:１３を含む、請求項１〜４の何れか一つに記載の方法。
9. 肺表面活性ポリペプチドが、SEQ ID NO:１(ＫＬ４)を含む、請求項１〜４の何れか一つに記載の方法。
10. 一種以上の脂質を、一種以上のポリエチレングリコール(ＰＥＧ)基と結合させる、請求項１〜９の何れか一つに記載の方法。
11. 一種以上の脂質を、リン脂質、脂肪酸、脂肪アルコール、中性脂肪、ホスファチド、油、糖脂質、表面活性剤(表面活性物質)、脂肪族アルコール、ワックス、テルペン、ステロイド及びこれらの組合せよりなる群から選択する、請求項１〜１０の何れか一つに記載の方法。
12. 一種以上の脂質を、ホスファチジルコリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、ジアシルグリセリド、ホスファチジン酸、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴ脂質、ステロール、カージオリピン、脂肪酸、セラミド、セレブロシド及びこれらの組合せよりなる群から選択する、請求項１〜１０の何れか一つに記載の方法。
13. 一種以上の脂質を、リン脂質及び遊離脂肪酸又は脂肪アルコールよりなる群から選択する、請求項１〜１０の何れか一つに記載の方法。
14. 一種以上の脂質を、ジパルミトイルホスファチジルコリン(ＤＰＰＣ)、パルミトイルオレオイルホスファチジルグリセロール(ＰＯＰＧ)及びパルミチン酸よりなる群から選択する、請求項１３に記載の方法。
15. 有機溶媒系が、約２０〜７０体積％の有機溶媒を含み、残りが水性溶媒である、請求項１〜１４の何れか一つに記載の方法。
16. 有機溶媒系が、約４０〜６０体積％の有機溶媒を含む、請求項１５に記載の方法。
17. 有機溶媒系が、約５０体積％の有機溶媒を含む、請求項１６に記載の方法。
18. 有機溶媒が、低級オキシ炭化水素、低級ハロ炭化水素、低級ハロオキシ炭化水素、低級スルホキシ炭化水素、低級環式炭化水素又はこれらの組合せを含む、請求項１〜１７の何れか一つに記載の方法。
19. 有機溶媒が、低級オキシ炭化水素を含む、請求項１８に記載の方法。
20. オキシ炭化水素が、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソ−プロパノール、ｎ−ブタノール、イソ−ブタノール、２−ブタノール、ｔ−ブタノール、ペンタノール、イソ−ペンタノール、２−ペンタノール、３−ペンタノール、ｔ−ペンタノール、メチルエチルケトン、ベンジルアルコール、酢酸、メチルエチルケトン、又はこれらの組合せである、請求項１９に記載の方法。
21. オキシ炭化水素が、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソ−プロパノール、ｎ−ブタノール、イソ−ブタノール、２−ブタノール、ｔ−ブタノール、又はこれらの組合せである、請求項１９に記載の方法。
22. オキシ炭化水素が、ｔ−ブタノールである、請求項２１に記載の方法。
23. 有機溶媒が、低級ハロ炭化水素を含む、請求項１８に記載の方法。
24. ハロ炭化水素が、四塩化炭素である、請求項２３に記載の方法。
25. 有機溶媒が、低級ハロオキシ炭化水素を含む、請求項１８に記載の方法。
26. ハロオキシ炭化水素が、ヘキサフルオロアセトンである、請求項２５に記載の方法。
27. 有機溶媒が、低級スルホキシ炭化水素を含む、請求項１８に記載の方法。
28. スルホキシ炭化水素が、ジメチルスルホキシド、ジメチルスルホン又はこれらの組合せである、請求項２７に記載の方法。
29. 請求項１〜２８の何れか一つに記載の方法により製造された乾燥肺表面活性組成物。
30. SEQ ID NO:１(ＫＬ４)を含む、請求項２９に記載の肺表面活性組成物。
31. 液体肺表面活性組成物を製造する方法であって、下記を含む当該方法：
    請求項１〜２８の何れか一つに記載の方法により製造された凍結乾燥した肺表面活性物質を得、そして
    該凍結乾燥した肺表面活性物質を十分量の製薬上許容しうる分散剤により再構成して、液体肺表面活性組成物を生成する。
32. 肺表面活性物質が、SEQ ID NO:１(ＫＬ４)を含む、請求項３１に記載の方法。
33. 請求項３１に記載の方法により製造された液体肺表面活性組成物。
34. 請求項３２に記載の方法により製造された液体肺表面活性組成物。
35. １３０ｍＭ ＮａＣｌを含むトリス−Ａｃ緩衝液(ｐＨ７．６)中で、３７℃で、エレクトロニクスコーポレーションパルセーティングバブルサーファクトメーター(ＰＢＳ)を用いて、５分のサイクルの後に測定して、泡半径が０．４〜０．５５ｍｍで変化する２０サイクル／分の振動数で、１０ｍｇ−ＴＰＬ／ｍｌの濃度で約１０ｍＮ／ｍ未満の動的表面張力を示す、請求項３３に記載の液体肺表面活性組成物。
36. １３０ｍＭ ＮａＣｌを含むトリス−Ａｃ緩衝液(ｐＨ７．６)中で、３７℃で、エレクトロニクスコーポレーションパルセーティングバブルサーファクトメーター(ＰＢＳ)を用いて、５分のサイクルの後に測定して、泡半径が０．４〜０．５５ｍｍで変化する２０サイクル／分の振動数で、１０ｍｇ−ＴＰＬ／ｍｌの濃度で約５ｍＮ／ｍ未満の動的表面張力を示す、請求項３５に記載の液体肺表面活性組成物。
37. １３０ｍＭ ＮａＣｌを含むトリス−Ａｃ緩衝液(ｐＨ７．６)中で、３７℃で、エレクトロニクスコーポレーションパルセーティングバブルサーファクトメーター(ＰＢＳ)を用いて、５分のサイクルの後に測定して、泡半径が０．４〜０．５５ｍｍで変化する２０サイクル／分の振動数で、３ｍｇ−ＴＰＬ／ｍｌの濃度で約５ｍＮ／ｍ未満の動的表面張力を示す、請求項３３に記載の液体肺表面活性組成物。
38. SEQ ID NO:１(ＫＬ４ポリペプチド)、ジパルミトイルホスファチジルコリン(ＤＰＰＣ)、パルミトイルオレオイルホスファチジルグリセロール(ＰＯＰＧ)及びパルミチン酸を、十分量の製薬上許容しうる分散剤に分散させて含む、請求項３５に記載の液体肺表面活性組成物。
39. １３０ｍＭ ＮａＣｌを含むトリス−Ａｃ緩衝液(ｐＨ７．６)中で、４０ｍｍ／１°アクリル錐体を取り付けたレオメーター及び、経時的な剪断速度の０〜２００秒^-1に至る約３分間の直線的な増大とその後の経時的な剪断速度の２００〜０秒^-1に至る約３分間の直線的な減少を用いるステップフロー手順を用いて、温度２５℃で剪断速度１５７秒^-1で測定した場合に、３０ｍｇ−ＴＰＬ／ｍｌの濃度で約５０ｃＰより小さい見かけ粘度を示す、請求項３３に記載の液体肺表面活性組成物。
40. １３０ｍＭ ＮａＣｌを含むトリス−Ａｃ緩衝液(ｐＨ７．６)中で、４０ｍｍ／１°アクリル錐体を取り付けたレオメーター及び、経時的な剪断速度の０〜２００秒^-1に至る約３分間の直線的な増大とその後の経時的な剪断速度の２００〜０秒^-1に至る約３分間の直線的な減少を用いるステップフロー手順を用いて、温度２５℃で剪断速度１５７秒^-1で測定した場合に、３０ｍｇ−ＴＰＬ／ｍｌの濃度で約３０ｃＰより小さい見かけ粘度を示す、請求項３９に記載の液体肺表面活性組成物。
41. １３０ｍＭ ＮａＣｌを含むトリス−Ａｃ緩衝液(ｐＨ７．６)中で、４０ｍｍ／１°アクリル錐体を取り付けたレオメーター及び、経時的な剪断速度の０〜２００秒^-1に至る約３分間の直線的な増大とその後の経時的な剪断速度の２００〜０秒^-1に至る約３分間の直線的な減少を用いるステップフロー手順を用いて、温度２５℃で剪断速度１５７秒^-1で測定した場合に、３０ｍｇ−ＴＰＬ／ｍｌの濃度で約１５ｃＰより小さい見かけ粘度を示す、請求項３９に記載の液体肺表面活性組成物。
42. SEQ ID NO:１(ＫＬ４ポリペプチド)、ジパルミトイルホスファチジルコリン(ＤＰＰＣ)、パルミトイルオレオイルホスファチジルグリセロール(ＰＯＰＧ)及びパルミチン酸を、十分量の製薬上許容しうる分散剤に分散させて含む、請求項３９に記載の液体肺表面活性組成物。
43. 患者における呼吸障害を治療する方法であって、請求項１〜２８の何れか一つに記載の方法により製造した凍結乾燥した肺表面活性組成物を該患者に投与することを含む当該方法。
44. 患者における呼吸障害を治療する方法であって、請求項３５に記載の凍結乾燥した肺表面活性組成物を該患者に投与することを含む当該方法。
45. 患者における呼吸障害を治療する方法であって、請求項３９に記載の凍結乾燥した肺表面活性組成物を該患者に投与することを含む当該方法。

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