KR20010042079A - 생리학적으로 활성인 폴리펩티드의 서방 제제 및 그것의제조 방법 - Google Patents

Abstract

생리학적으로 활성인 폴리펩티드를 생분해성 중합체의 유기 용매 용액 내에 분산시키고, 유기 용매를 제거하는 것을 포함하고 (여기서, 폴리펩티드는 수-혼화성 유기 용매 및/또는 휘발성염을 갖는 폴리펩티드의 수용액을 동결건조시킴으로써 수득된 분말임); 제제를 제조하는 방법에서 생리학적으로 활성인 폴리펩티드 분말의 취급의 용이함이 향상되고; 공업적으로 대규모로 서방 제제를 제조하는 것이 가능하며; 장기간 높고 안정적인 농도의 혈중 활성 성분, 생리학적으로 활성인 폴리펩티드의 낮은 초기 방출비, 및 서방 제제 내에 생리학적으로 활성인 폴리펩티드의 높은 포획비를 나타내는 서방 제제를 제공하는 서방 제제의 제조 방법.

Description

생리학적으로 활성인 폴리펩티드의 서방 제제 및 그것의 제조 방법 {SUSTAINED-RELEASE PREPARATION OF PHYSIOLOGICALLY ACTIVE POLYPEPTIDE AND PRODUCTION THEREOF}

생리학적으로 활성인 폴리펩티드 또는 그것의 유도체는 생체 내에서 다양한 약리학적 활성을 나타낸다고 알려져 있다. 이들 중 일부는 발달된 유전 공학 및 세포 기술에 따라, 에스케리키아 콜리(Escherichia coli), 효모, 동물 세포 또는 숙주 동물, 예컨대 염소 및 햄스터를 이용하여 대규모로 제조되었고, 의약으로서 사용되었다. 그러나, 상기 생리학적으로 활성인 폴리펩티드는 통상의 짧은 생물학적 반감기 때문에 자주 투여되어야 한다. 반복된 주입은 환자들에게 심각한 신체적인 부담을 가져다준다.

예컨대, 본래 뇌하수체 전엽에서 생성되고 분비되는 대표적인 호르몬인 성장 호르몬 (이하, 종종 GH 로 명명함) 은 생체 내 성장의 촉진, 글루코오스 및 지질의 대사, 단백질의 동화 및 세포 증식 및 분화와 같은 매우 다양한 생리학적 활성을 갖는 생리학적으로 활성인 폴리펩티드이다. GH 는 최근 유전자 재조합 기술 분야에서 에스케리키아 콜리를 이용함으로써 대규모로 제조되고, 임상적으로, 또한 전세계적으로 의약으로서 사용되고 있다. 그러나, GH 는 짧은 생물학적 반감기 때문에 유효 혈중 농도를 유지하기 위해 자주 투여되어야 한다. 특히, 뇌하수체 왜소증의 경우에, 유아 또는 젊은 환자들에게 수 개월 내지 10 년 이상의 장기간에 걸쳐, 매일 피하 투여가 실제적으로 수행되고 있다.

JP-A 3055/1996 (EP-A 633020) 은, 수용성 폴리펩티드가 수용액 중 지방산의 금속염 및 생분해성 중합체를 포함하는 생분해성 매트릭스를 투과하도록 하는 것을 포함하는 서방 제제, 및 상기 방법에 의해 제조된 서방 마이크로캡슐을 제조하는 방법을 개시한다.

JP-A 217691/1996 (WO 96/07399) 는 염화아연 등의 수용액 및 생리학적으로 활성인 물질의 수용성 펩티드 형을 사용함에 의한 불수용성 또는 약간 수용성인 다가 금속염의 제조, 및 상기 염 및 생분해성 중합체를 포함하는 서방 제제의 제조 방법을 개시한다.

WO 94/12158 은, 생분해성 중합체 및 인간의 GH (이하, 종종 hGH 이라 명명함) 를 포함하는 서방 제제를 제조하는 방법으로서, 중합체 용액에 중합체에 대해 0.1 내지 30 % (w/w) 의 양으로 수산화아연과 같은 중합체 부식 속도 조절제의 첨가를 개시한다. 상기 공개는 또한 생물학적 활성을 보유하면서, 액체 질소에 중합체 및 hGH 의 유기 용매 용액을 분무함으로써, 다공성 입자로서 마이크로캡슐을 제조하는 방법을 개시한다.

WO 92/17200 및 [Nature Medicine, Vol. 2, p. 795 (1996)] 은 인간의 GH 의아연염을 사용함으로써 서방 제제를 제조하는 방법을 개시한다.

WO 95/29664 는 고체 상태로 탄산아연과 같은 금속염을 중합체 용액에 분산시키고, 생리학적으로 활성인 물질 (호르몬 등) 을 첨가하고, 생리학적으로 활성인 물질 및 금속 양이온 성분을 각각 생분해성 중합체에 분산시키는 단계를 포함하는 서방 마이크로캡슐을 제조하는 방법을 개시한다.

비록 상기 기재된 바와 같이, 생리학적으로 활성인 폴리펩티드의 생리학적 활성을 보유하면서 서방 제제를 제조하기 위한 다양한 시도가 이루어졌으나, 일부의 생리학적으로 활성인 폴리펩티드가 제제 내에 생리학적으로 활성인 폴리펩티드의 낮은 포획비, 투여 후 초기 단계에서 과다 방출, 장시간에 걸친 지속적 방출에 도달하기 어려움 또는 장시간에 걸쳐 만족스러운 혈장 농도가 유지되기 어려움으로 인해, 임상적으로 만족스러운 제제는 아직 수득되지 않았다.

생리학적으로 활성인 폴리펩티드 분말 (고체상: 이하, 종종 S 상으로 명명함) 을 첨가하고 직접 중합체가 용해된 유기 용매 (O 상) 에 분산시킴으로써 수득되는 S/O 유화액이라 명명되는 것을 사용함으로써 서방 제제를 제조하는 방법에서, 생리학적으로 활성인 폴리펩티드를 상대적으로 안정한 방식으로 포획할 수 있다. 그러나, 다량의 생리학적으로 활성인 폴리펩티드가 효과적으로 고체로서 취급될 필요가 있다. 또한, 서방 제제를 제조하기 위한 방법에서, 입자 크기는 수득되는 서방 제제의 질에 크게 영향을 주기 때문에, S/O 분산액에서 분말의 입자 크기를 제어하는 것이 필수적인 등의 많은 문제들이 있다.

따라서, 대규모로 고수율의 안정된 품질을 갖는 서방 제제를 제조하는 것을 가능하게 하고, 또한 임의의 문제, 예컨대 제제를 제조하기 위한 방법에서 생리학적으로 활성인 폴리펩티드의 안정성의 유지, 취급에 있어서 우월한 분말의 제조, 및 분말의 미립화를 만족시키는 서방 제제의 제조 방법 필요하게 된다.

발명의 개시

본 발명자들은 상기 문제를 해결하기 위해 연구하여, 놀랍게도 먼저, 생리학적으로 활성인 폴리펩티드 분말은 제제를 제조하기 위한 방법에서 취급에 있어서 우월하고, 또한 작은 입자 크기를 갖는 한편, 수-혼화성 유기 용매 및/또는 휘발성염은 생리학적으로 활성인 폴리펩티드의 수용액에 첨가된 후, 생성된 용액이 동결건조됨으로써, 폴리펩티드의 생리학적 활성이 유지된다는 사실을 발견하였다. 또한, 본 발명자들은 놀랍게도, 상기 언급된 바와 같이 수득된 생리학적으로 활성인 폴리펩티드 분말이 유기 용매 내에 생분해성 중합체가 용해된 용액에 분산된 후, 유기 용매가 제거되어, 서방 제제가 제조됨으로써, 제제의 서방 효과 및 포획비가 향상된다는 사실을 발견하였다. 상기 언급된 바와 같이, 본 발명자들은 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 하기에 관한 것이다:

(1) 생리학적으로 활성인 폴리펩티드를 생분해성 중합체의 유기 용매 용액 내에 분산시키고, 유기 용매를 제거하는 것을 포함하는 서방 제제의 제조 방법으로서, 상기 폴리펩티드는 수-혼화성 유기 용매 및/또는 휘발성염을 갖는 폴리펩티드의 수용액을 동결건조시킴으로써 수득된 분말인 방법;

(2) 상기 (1) 에 있어서, 분말의 평균 입자 크기가 10 ㎛ 이하인 방법;

(3) 상기 (1) 에 있어서, 생리학적으로 활성인 폴리펩티드가 성장 호르몬인 방법;

(4) 상기 (3) 에 있어서, 성장 호르몬이 인간의 성장 호르몬인 방법;

(5) 상기 (1) 에 있어서, 수-혼화성 유기 용매가 알코올인 방법;

(6) 상기 (5) 에 있어서, 알코올이 메탄올 또는 에탄올인 방법;

(7) 상기 (5) 에 있어서, 알코올이 에탄올인 방법;

(8) 상기 (1) 에 있어서, 휘발성염이 암모늄염인 방법;

(9) 상기 (8) 에 있어서, 암모늄염이 암모늄 아세테이트, 암모늄 비카르보네이트 또는 암모늄 카르보네이트인 방법;

(10) 상기 (8) 에 있어서, 암모늄염이 암모늄 아세테이트인 방법;

(11) 상기 (5) 에 있어서, 생리학적으로 활성인 폴리펩티드의 수용액에 첨가된 알코올의 최종 농도가 0.03 내지 0.5 % (V/V) 인 방법;

(12) 상기 (8) 에 있어서, 생리학적으로 활성인 폴리펩티드에 대한 암모늄염의 몰 비가 10 내지 80 인 방법;

(13) 상기 (1) 에 있어서, 생분해성 중합체가 락트산/글리콜산 중합체인 방법;

(14) 상기 (13) 에 있어서, 락트산/글리콜산 중합체의 락트산/글리콜산의 몰 비가 100/0 내지 40/60 인 방법;

(15) 상기 (13) 에 있어서, 락트산/글리콜산 중합체의 중량 평균 분자량이 3,000 내지 50,000 인 방법;

(16) 상기 (13) 에 있어서, 락트산/글리콜산 중합체가 다가 금속염의 형태인 방법;

(17) 상기 (16) 에 있어서, 다가 금속이 아연인 방법;

(18) 상기 (1) 에 있어서, 서방 제제가 마이크로캡슐인 방법;

(19) 상기 (18) 에 있어서, 마이크로캡슐의 평균 입자 크기가 0.1 ㎛ 내지 300 ㎛ 인 방법;

(20) 상기 (1) 에 있어서, 서방 제제가 주사용인 방법;

(21) 상기 (1) 에 따른 방법에 의해 제조된 서방 제제;

(22) 생리학적으로 활성인 폴리펩티드의 수용액에 (i) 수-혼화성 유기 용매 및/또는 (ii) 휘발성염을 첨가하고, 생성된 용액을 동결건조시키는 것을 포함하는 생리학적으로 활성인 폴리펩티드 분말의 제조 방법;

(23) 상기 (22) 에 따른 방법에 의해 수득되는 생리학적으로 활성인 폴리펩티드 분말;

(24) 상기 (23) 에 있어서, 분말의 평균 입자 크기가 10 ㎛ 이하인 생리학적으로 활성인 폴리펩티드 분말;

(25) 의약품의 제조를 위한, 상기 (23) 에 따른 생리학적으로 활성인 폴리펩티드 분말의 용도;

(26) 작은 입자 크기를 갖는 생리학적으로 활성인 폴리펩티드 분말을 제조하기 위한, (i) 수-혼화성 유기 용매 및/또는 (ii) 휘발성염의 용도;

(27) 상기 (26) 에 있어서, 입자 크기가 10 ㎛ 이하인 (i) 수-혼화성 유기 용매 및/또는 (ii) 휘발성염의 용도;

(28) 상기 (1) 에 기재된 방법에 의해 수득된 서방 제제;

(29) 초기 방출비가 40 % 이하인, 생리학적으로 활성인 폴리펩티드 및 생분해성 중합체의 다가 금속염을 포함하는 서방 제제;

(30) 상기 (29) 에 있어서, 생리학적으로 활성인 폴리펩티드가 10 ㎛ 이하의 평균 입자 크기를 갖는 분말의 형태인 서방 제제;

(31) 상기 (29) 에 있어서, 생리학적으로 활성인 폴리펩티드가 성장 호르몬인 서방 제제;

(32) 상기 (29) 에 있어서, 생분해성 중합체가 락트산/글리콜산 중합체인 서방 제제;

(33) 상기 (29) 에 있어서, 서방 제제가 마이크로캡슐인 서방 제제;

(34) 상기 (33) 에 있어서, 마이크로캡슐의 평균 입자 크기가 0.1 내지 300 ㎛ 인 서방 제제;

(35) 상기 (29) 에 있어서, 1 주 내지 1 개월의 기간 동안 생리학적으로 활성인 폴리펩티드를 효과적으로 방출할 수 있는 서방 제제; 및

(36) 상기 (29) 에 있어서, 0.1 % 내지 30 % (W/W) 의 생리학적으로 활성인 폴리펩티드를 포함하는 서방 제제.

본 발명에 사용되는 생분해성 중합체의 예로는 무촉매 탈수 축중합에 의해, 하나 이상의 α-히드록시카르복실산 (예. 글리콜산, 락트산 등), 히드록시디카르복실산 (예. 말산 등), 히드록시트리카르복실산 (예. 시트르산 등) 등으로부터 합성되고 유리 카르복실기(들)를 갖는 중합체, 그것들의 혼합물, 폴리-α-시아노아크릴산 에스테르, 폴리아미노산 (예. 폴리-γ-벤질-L-글루탐산 등) 및 말레산 무수물 공중합체 (예. 스티렌/말레산 공중합체 등) 를 들 수 있다. 상기 중합체는 동종중합체 또는 공중합체이다. 중합은 불규칙형, 블록형 또는 그래프트형일 수 있다. 상기 언급된 α-히드록시카르복실산, 히드록시디카르복실산 및 히드록시트리카르복실산이 그것들의 분자 구조 내에 광학 활성 중심을 갖는 경우, 그것들은 D-, L- 또는 DL-형일 수 있다.

상기 중합체들 중, 유리 말단 카르복실기를 갖는 생분해성 중합체, 예컨대 α-히드록시카르복실산 (예. 글리콜산, 락트산 등) 으로부터 합성되는 중합체 (예. 락트산/글리콜산 공중합체, 폴리락트산 등) 및 폴리-α-시아노아크릴산 에스테르가 바람직하다.

생분해성 중합체는 더욱 바람직하게는 α-히드록시카르복실산 등으로부터 합성되는 중합체, 특히 바람직하게는 락트산/글리콜산 공중합체 등이다.

본 명세서에서, 동종중합체, 예컨대 폴리락트산 및 폴리글리콜산 뿐만 아니라, 락트산/글리콜산 공중합체는 종종 단순히 락트산/글리콜산 중합체로 명명된다.

사용되는 생분해성 중합체가 락트산/글리콜산 중합체 (락트산/글리콜산 공중합체 또는 동종중합체) 인 경우, 그것의 조성비 (몰 %) 는 바람직하게는 약 100/0 내지 약 40/60, 더욱 바람직하게는 약 85/15 내지 약 50/50 이다.

상기 기재된 락트산/글리콜산 중합체의 중량 평균 분자량은 바람직하게는 약 3,000 내지 약 50,000, 더욱 바람직하게는 약 3,000 내지 약 25,000, 더 더욱 바람직하게는 약 5,000 내지 약 20,000 이다.

락트산/글리콜산 중합체의 분산도 (중량 평균 분자량/수 평균 분자량) 는 바람직하게는 약 1.2 내지 약 4.0, 더욱 바람직하게는 약 1.5 내지 약 3.5 이다.

중량 평균 분자량 및 분산도에 있어서, 본 명세서는, 전자는 폴리스티렌의 측면에서, 각각, 120,000, 52,000, 22,000, 9,200, 5,050, 2,950, 1,050, 580 및 162 의 중량 평균 분자량을 가진 참조 물질로서 9 개의 폴리스티렌을 사용하면서 겔 투과 크로마토그래피 (GPC) 에 의해 측정된 바와 같고, 후자는 그것으로부터 계산된다. 상기 측정은 이동상으로 클로로포름을 사용하여 GPC컬럼 KF804L X 2 (일본, Showa Denko 제조) 및 RI 모니터 L-3300 (일본, Hitachi, Ltd. 제조) 를 사용하면서 수행된다.

유리 말단 카르복실기(들)을 갖는 생분해성 중합체는 GPC 측정 기재의 수 평균 분자량 및 말단기 측량 기재의 수 평균 분자량이 거의 서로 일치한다. 말단기 측량 기재의 수 평균 분자량은 하기와 같이 계산된다:

생분해성 중합체 약 1 내지 3 g 을 아세톤 (25 ml) 및 메탄올 (5 ml) 의 혼합 용매에 용해시키고, 용액을 지시약으로서 페놀프탈레인을 사용하여 실온 (20 ℃) 에서 교반하면서, 0.05 N 수산화칼륨의 알코올성 용액으로 빠르게 적정하여, 카르복실기 함량을 구하고; 말단기 측량 기재의 수 평균 분자량을 하기 방정식으로부터 계산한다:

말단기 측량 기재의 수 평균 분자량 = 20000 × A/B

A : 생분해성 중합체의 중량 (g)

B : 적정 종결점에 도달할 때까지 첨가된 0.05 N 수산화칼륨의 알코올성 용액의 양 (ml)

말단기 측량 기재의 수 평균 분자량이 절대값인 반면, GPC 측정 기재의 수 평균 분자량은 여러가지 분석 조건 (예. 이동상의 종류, 컬럼의 종류, 참조 물질, 선택된 슬라이스의 두께, 선택된 기준선 등) 에 따라 변화하는 상대값이고; 따라서, 상기 두 값들의 절대 수치 대표값을 갖는 것은 어렵다. 그러나, GPC 측정 기재의 수 평균 분자량 및 말단기 측량 기재의 수 평균 분자량이 거의 일치한다는 설명은, 예컨대, 하나 이상의 α-히드록시카르복실산으로부터 합성되는 중합체에서, 말단기 측량 기재의 수 평균 분자량이 GPC 측정 기재의 수 평균 분자량의 약 0.5 내지 약 2 배, 바람직하게는 약 0.7 내지 약 1.5 배의 범위 이내인 것을 의미한다.

예컨대, 유리 말단 카르복실기(들)를 갖고, 무촉매 탈수 축중합에 의해 그것이 하나 이상의 α-히드록시카르복실산으로부터 합성되는 중합체의 경우, GPC 측정 기재의 수 평균 분자량 및 말단기 측량 기재의 수 평균 분자량은 서로 거의 일치한다. 반면, 실질적으로 유리 말단 카르복실기를 갖지 않고, 그것이 촉매를 사용하면서 개환 중합에 의해 고리화 이량체로부터 합성되는 중합체의 경우, 말단기 측량 기재의 수 평균 분자량은 GPC 측정 기재의 것보다 훨씬 더 높다 (약 2 배 이상). 그 차이는 유리 말단 카르복실기를 갖지 않는 중합체와 유리 말단 카르복실기(들)를 갖는 중합체를 분명하게 구별할 수 있도록 한다.

유리 말단 카르복실기(들)를 갖는 락트산/글리콜산 중합체는 그 자체로 공지된 방법, 예컨대 JP-A 28521/1986 (예. 무촉매 탈수 축중합 반응 또는 무기 고체 산 촉매의 존재 하에서의 탈수 축중합 반응에 의한 방법) 에 개시된 방법에 의해 제조될 수 있다.

락트산/글리콜산 중합체의 분해/제거 속도는, 조성비 또는 중량 평균 분자량에 따라 매우 다양하다. 분해/제거는 통상 글리콜산 비가 감소함에 따라 지연되기 때문에, 생리학적으로 활성인 폴리펩티드 방출 기간은 글리콜산 비를 저하시키거나 분자량을 증가시킴으로써, 연장 (예. 약 6 개월로) 될 수 있다. 이와 반대로, 약물 방출 기간은 글리콜산 비를 증가시키거나 분자량을 감소시킴으로써, 감소 (예. 약 1 주로) 될 수 있다. 약 1 주 내지 2 개월의 기간 동안 생리학적으로 활성인 폴리펩티드를 효과적으로 방출할 수 있는 서방 제제를 수득하기 위해, 조성비 및 중량 평균 분자량이 상기 기재된 범위 이내인 락트산/글리콜산을 사용하는 것이 바람직하다.

따라서, 본 발명에서 사용되는 생분해성 중합체의 조성은 바람직하게는, 원하는 생리학적으로 활성인 폴리펩티드의 종류 및 원하는 기간에 따라 선택된다. 특정 예에서, 예컨대 GH 가 생리학적으로 활성인 폴리펩티드로서 사용되는 경우, 생분해성 중합체는 바람직하게는 락트산/글리콜산 중합체, 더욱 바람직하게는 락트산/글리콜산 공중합체이다. 락트산/글리콜산 공중합체에서, 락트산/글리콜산 조성비 (몰 %) 는 바람직하게는 약 85/15 내지 약 50/50, 더욱 바람직하게는 약 75/25 내지 약 50/50 이다. 락트산/글리콜산 공중합체의 중량 평균 분자량은 바람직하게는 약 8,000 내지 약 20,000, 더욱 바람직하게는 약 10,000 내지 약 20,000 이다. 또한, 락트산/글리콜산 중합체의 분산도 (중량 평균 분자량/수 평균 분자량) 은 약 1.2 내지 약 4.0, 더욱 바람직하게는 약 1.5 내지 약 3.5 이다.

사용되는 락트산/글리콜산 중합체는 공지된 방법, 예컨대 상기 문헌 등에 기재된 방법에 의해 제조될 수 있다. 중합체는 바람직하게는, 무촉매 탈수 축중합에 의해 제조된 것이다. 말단기 측량 기재의 수 평균 분자량 및 GPC 측정 기재의 수 평균 분자량이 거의 서로 일치하는, 락트산/글리콜산 중합체 (PLGA) 가 사용되는 것이 바람직하다.

또한, 조성비 및/또는 중량 평균 분자량에서 상이한 두 가지 종류의 락트산/글리콜산 중합체는 주어진 비의 혼합물로 사용될 수 있다. 전형적인 예는 락트산/글리콜산의 조성비 (몰 %) 가 약 75/25 이고 중량 평균 분자량이 약 10,000 인 락트산/글리콜산 중합체, 및 락트산/글리콜산의 조성비 (몰 %) 가 약 50/50 이고, 중량 평균 분자량이 약 12,000 인 락트산/글리콜산 중합체의 혼합물이다. 상기 혼합물의 공중합체의 바람직한 중량비는 각각, 약 25/75 내지 약 75/25 이다.

본 발명에 사용되는 생분해성 중합체는 상기 언급된 생분해성 중합체의 금속염일 수 있다. 예컨대, WO 97/01331 에 기재된 생분해성 중합체 등의 여러가지 다가 금속염이 사용될 수 있다. 바람직하게, 락트산/글리콜산 중합체 등의 다가 금속염 (더욱 바람직하게는, 아연염, 칼슘염, 마그네슘염 등, 더 더욱 바람직하게는 아연염 등) 이 사용될 수 있다. 본 발명에 사용되는 다가 금속염은, 그것이 생체에 어떠한 부작용도 일으키지 않는한, 특별히 제한되지 않는다. 상기는, 다가 금속, 예컨대 이가염 (예. Fe, Zn, Cu, Ca, Mg, Al, Sn, Mn 등), 삼가염 (예. Fe, Al, Mn 등), 사가염 (예. Sn 등) 등에 의해 예시된다.

본 명세서에서, 생분해성 중합체는 종종, 그것의 금속염인 경우에도 생분해성 중합체로서 명명한다. 예컨대, 락트산/글리콜산 중합체는, 그것의 다가 금속염인 경우에도 락트산/글리콜산 중합체로서 명명된다.

상기 생분해성 중합체의 다가 금속염은 WO 97/01331 에 기재된 방법 또는 그 방법에 따른 기타 방법들에 의해 제조될 수 있다.

생분해성 중합체의 다가 금속염이 아연염인 경우, 유기 용매 내에 산화아연 및 생분해성 중합체의 반응에 의해 제조될 수 있다.

상기 방법에서, 우선 생분해성 중합체-산화아연 착체의 유기 용매 용액이 유기 용매 내에 산화아연 및 생분해성 중합체의 공존에 의해 제조된다. 그러한 경우, 비록 용매 내에 생분해성 중합체의 농도는 그것의 분자량 또는 유기 용매의 종류 등에 따라 변화하지만, 예컨대 그 농도는 약 0.1 내지 약 80 % (W/W), 바람직하게는 약 1 내지 약 70 % (W/W), 더욱 바람직하게는 약 2 내지 약 60 % (W/W) 이다. 비록 첨가된 산화아연의 양은 유기 용매의 종류에 따라 상이하지만, 예컨대 그 양은 JP-A 231252/1998 에 기재된 바와 같이, 생분해성 중합체의 양에 기준하여, 약 0.001 내지 약 2 % (W/W), 바람직하게는 약 0.01 내지 약 1.5 % (W/W), 더욱 바람직하게는 약 0.1 내지 약 1 % (W/W) 이다.

유기 용매 내에 산화아연 및 생분해성 중합체를 첨가하는 순서에 따라, 생분해성 중합체가 유기 용매 내에 용해됨으로써 제조된 용액에, 유기 용매 내에 현탁되거나 분말의 상태인 산화아연이 첨가되거나, 이와 반대로 산화아연이 유기 용매 내에 현탁됨으로써 제조된 현탁액 내에, 생분해성 중합체의 유기 용매 용액이 첨가될 수 있다. 생분해성 중합체 및 산화아연 양자가 분말의 상태로 혼합된 후, 유기 용매가 첨가될 수 있다.

본 발명에 사용되는 생리학적으로 활성인 폴리펩티드로는, 바람직하게는 약 1,000 내지 50,000, 더욱 바람직하게는 약 5,000 내지 약 40,000 의 분자량을 갖는 생리학적으로 활성인 폴리펩티드를 들 수 있다.

생리학적으로 활성인 폴리펩티드의 대표적인 활성은 호르몬성 활성이다. 생리학적으로 활성인 폴리펩티드는 천연 생성물, 합성 생성물, 반합성 생성물 및 그것들의 유도체 및 유사체일 수 있다. 생리학적으로 활성인 폴리펩티드의 작용 양식은 작동적이거나 길항적일 수 있다.

본 발명에서 사용을 위한 생리학적으로 활성인 폴리펩티드로는 펩티드 호르몬, 사이토카인, 펩티드 신경전달제, 조혈 인자, 여러가지 성장 인자, 효소, 폴리펩티드 항생제 및 진통 펩티드 등을 들 수 있다.

펩티드 호르몬의 예로는, 인슐린, 소마토스타틴, 소마토스타틴 유도체 (산도스타틴; USP 번호 제 4,087,390 호, 제 4,093,574, 4,100,117 및 제 4,253,998 호 참조), 성장 호르몬 (GH), 나트륨 이뇨 호르몬, 가스트린, 프로락틴, 부신피질자극 호르몬 (ACTH), ACTH 유도체 (예. 에비라티드), 멜라닌세포 자극 호르몬 (MSH), 갑상선 호르몬 방출 호르몬 (TRH), 및 그것들의 염 및 유도체 (JP-A 121273/1975 및 116465/1977 참조), 갑상선 자극 호르몬 (TSH), 황체 호르몬 (LH), 여포 자극 호르몬 (FSH), 인간 융모성 성선자극 호르몬 (HCG), 티모신, 모틸린, 바소프레신, 바소프레신 유도체 (데스모프레신, [Folia Endocrinologica Japonica, Vol. 54, No.5, pp. 676-691 (1978)] 참조), 옥시토신, 칼시토닌, 부갑상선 호르몬 (PTH), 글루카곤, 세크레틴, 판크레오지민, 콜레시스토키닌, 안지오텐신 및 인간 태반 락토겐 등을 들 수 있다. 펩티드 호르몬은 바람직하게는 인슐린 및 성장 호르몬 등이다.

사이토카인으로는 림포카인 및 모노카인 등을 들 수 있다. 림포카인으로는, 예컨대 인터페론 (알파, 베타 및 감마) 및 인터루킨 (IL-2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12) 등을 들 수 있다. 모노카인으로는, 예컨대 인터루킨-1 (IL-1) 및 종양 괴사 인자 (TNF) 등을 들 수 있다. 바람직한 사이토카인은 림포카인 등이고, 더욱 바람직한 사이토카인은 인터페론 등이고, 특히 바람직한 사이토카인은 인터페론-α이다.

펩티드 신경전달물질로는 물질 P, 세로토닌 및 GABA 등을 들 수 있다.

조혈 인자로는 에리트로포이에틴 (EPO), 콜로니 자극 인자 (G-CSF, GM-CSF, M-CSF 등), 트롬보포이에틴 (TPO), 혈소판 유래의 성장 인자 및 거핵세포 상승제 등을 들 수 있다.

여러가지 성장 인자로는, 예컨대 염기성 및 산성 섬유아세포 성장 인자 (FGF) 및 그것들의 군 (예. EGF, TGF-α, TGF-β, PDGF, 산성 FGF, 염기성 FGF, FGF-9 등), 신경 성장 인자 (NGF) 및 그것의 군 (예. BDNF, NT-3, NT-4, CNTF, GDNF 등), 인슐린 유사 성장 인자 (예. IGF-1, IGF-2 등) 및 골 형태형성 단백질 (BMP) 및 그것의 군 등을 들 수 있다.

효소로는, 예컨대 초산화물 디스뮤타제 (SOD), 유로키나제, 조직 플라스미노겐 활성화제 (TPA), 아스파라기나제 및 칼리크레인 등을 들 수 있다.

폴리펩티드 항생제로는, 예컨대 폴리믹신 B, 콜리스틴, 그라미시딘 및 바시트라신 등을 들 수 있다.

진통 펩티드로는, 예컨대 엔케팔린, 엔케팔린 유도체 (USP 번호 제 4,277,394 호 및 EP-A 31567 참조), 엔돌핀 및 키오토르핀 등을 들 수 있다.

또한, 생리학적으로 활성인 폴리펩티드로는, 티모포이에틴, 디노르핀, 봄베신, 카에룰레인, 티모스티물린, 흉선 체액성 인자 (THF), 혈액 흉선 인자 (FTS) 및 그것들의 유도체 (USP 번호 제 4,229,438 호), 기타 흉선 인자 [Igaku no Ayumi, Vol. 125, No. 10, pp. 835-843 (1983)], 뉴로텐신, 브라디키닌 및 엔도텔린 길항 펩티드 (EP-A 436189, 457195 및 JP-A 94692/1991 및 130299/1991 참조) 등을 들 수 있다.

특히 바람직한 생리학적으로 활성인 폴리펩티드로는 성장 호르몬 및 인슐린 등을 들 수 있고, 더욱 특히 바람직한 생리학적으로 활성인 폴리펩티드로는 성장 호르몬 (특히 인간 성장 호르몬) 을 들 수 있다.

본 발명에서, 생리학적으로 활성인 폴리펩티드가 금속을 함유하는 경우, 금속의 함량은 바람직하게는 0.1 % (w/w) 이하, 더욱 바람직하게는 0.01 % (w/w) 이하, 가장 바람직하게는 0.001 % (w/w) 이하이다. 이에, 실질적으로 금속이 없는 생리학적으로 활성인 폴리펩티드는 본 발명을 위해 가장 적합하다. 결정질 인슐린은, 예컨대 통상 소량의 중금속, 예컨대 아연, 니켈, 코발트 및 카드뮴 등을 함유한다. 0.4 % (w/w) 아연을 함유하는 인슐린은 안정한 육량체로 존재하고, 생분해성 중합체의 금속염과 상호작용하여 상대적으로 불활성인 것으로 나타난다.

필요하다면, 생리학적으로 활성인 폴리펩티드 내에 존재하는 금속은 미리 제거될 수 있다. 금속을 제거하는 방법으로서, 공지된 방법이 사용된다. 예컨대, 물에 대한 인슐린의 산성 수성 염산 용액 또는 암모늄 아세테이트의 수용액을 투석하고, 투석액을 동결건조시키는 것은, 최소 금속 함량을 가진 무정형 인슐린을 제공할 수 있다.

그 기원이 임의의 종인 성장 호르몬이 사용될 수 있으며, 그것은 바람직하게는 인간의 성장 호르몬이다. 또한, 비록 뇌하수체로부터 추출된 천연 생성물이 본 발명을 위해 사용될 수 있지만, 유전자 재조합형 GH (JP-B 12996/1994, JP-B 48987/1994 참조) 가 바람직하다. N-말단기에 메티오닌이 없이 천연형과 동일한 구조를 갖는 재조합형 hGH 가 더욱 바람직하다. 상기 GH 는 금속염의 형태일 수 있고, 실질적으로 어떠한 금속도 함유하지 않는 것이 또한 사용된다. hGH 의 22 K 달톤형 뿐만 아니라, hGH 의 20K 달톤형 (JP-A 101877/1995, JP-A 265404/1998 참조) 이 사용될 수 있다. 또한, hGH 의 유도체 또는 유사체 (WO99/03887 참조) 가 사용될 수 있다.

생리학적으로 활성인 폴리펩티드로서, 유기체로부터의 추출물 또는 정제 물질, 화학적으로 합성된 물질, 생물공학의 방법에 의한 생성물 등이 사용될 수 있고, 상기 방법에 의해 수득된 임의의 것이 사용될 수 있다. 대규모로 고순도를 가진 생성물을 합성하기 위해, 생물공학의 채택이 바람직하다. 상기 방법이 채택되는 임의의 경우, 생리학적으로 활성인 폴리펩티드가 조(crude) 제제, 예컨대 조직, 생체 유동액, 합성 물질 또는 재조합 세포 또는 재조합 진균으로부터 정화되거나 정제될 필요가 있다. 그러한 경우, 펩티드 또는 단백질을 분리하고 정제하기 위해 주지된 방법이 채택될 수 있다 ("Protein", Kazuo SATAKE 저, Asakura Syoten 출판; "Physiologically Active Peptide", pharmacia review, No. 3, Pharmaceutical Society of Japan). 특히, 일부의 액체 크로마토그래피를 배합함으로써 ("High-speed Liquid Chromatography of Protein or Peptide", Nobuo UI 등 편집, Kagakudojin 출판), 생리학적 활성의 손실 없이 고수율로 고순도의 생리학적으로 활성인 폴리펩티드를 수득하는 것이 가능하다. 필요하다면, 탈염의 단계가 바람직하게는 정제를 위한 방법의 최종 단계로서 채택될 수 있다. 수용액 내의 생리학적으로 활성인 폴리펩티드의 농도는, 예컨대 0.01 % (W/V) 내지 30 % (W/V), 바람직하게는 0.03 % (W/V) 내지 10 % (W/V), 더욱 바람직하게는 0.05 % (W/V) 내지 3 % (W/V) 등이나, 특별히 이에 제한되지 않는다. 생리학적으로 활성인 폴리펩티드가 hGH 인 경우, 수용액 내의 hGH 의 농도는 바람직하게는 0.01 % (W/V) 내지 5 % (W/V), 더욱 바람직하게는 0.05 % (W/V) 내지 0.5 % (W/V) 이다.

본 발명에서, 생리학적으로 활성인 폴리펩티드의 용액에 첨가될 수 있는, 수-혼화성 유기 용매는, 예컨대 알코올 (예. 메탄올, 에탄올, 이소프로판올 등, 바람직하게는 메탄올, 에탄올 등), 아세톤 등이다. 상기 유기 용매는 적절한 혼합비를 갖는 그것의 혼합물로 사용될 수 있다. 바람직한 유기 용매는 알코올, 더욱 바람직한 유기 용매는 에탄올 뿐이다. 수-혼화성 유기 용매의 첨가량 (농도) 은, 부피비로 약 0.03 내지 0.5 % (V/V), 바람직하게는 약 0.06 내지 0.25 % (V/V), 더욱 바람직하게는 약 0.1 내지 0.15 % (V/V) 이다. 수-혼화성 유기 용매를 첨가함으로써 수득되는 생리학적으로 활성인 폴리펩티드의 수용액을 동결건조시킴으로써, 취급이 용이하고 (조작에서 우월함) 매우 미세한 (작은 입자 크기를 가짐), 생리학적으로 활성인 폴리펩티드 분말을 제조할 수 있다.

본 발명에서, 휘발성염으로서, 생리학적으로 활성인 폴리펩티드의 수용액에 첨가될 수 있는 것은, 예컨대 암모늄염 (예. 암모늄 아세테이트, 암모늄 비카르보네이트, 암모늄 카르보네이트, 염화암모늄 등, 바람직하게는 암모늄 아세테이트 등) 이다. 휘발성염은 주어진 비에서 그것들의 혼합물로 사용될 수 있다. 생리학적으로 활성인 폴리펩티드의 수용액에 대한 휘발성염의 첨가량은, 몰 비로 약 10 배 내지 약 80 배 몰, 바람직하게는 약 10 배 내지 약 70 배 몰, 더욱 바람직하게는 약 15 배 내지 약 70 배 몰, 더 더욱 바람직하게는 약 20 배 내지 약 70 배 몰, 가장 바람직하게는 약 20 배 내지 약 50 배 몰이다. 수-혼화성 유기 유매가 첨가되는 것과 유사하게, 휘발성염을 첨가함으로써 수득되는 생리학적으로 활성인 폴리펩티드의 수용액을 동결건조시킴으로써, 취급이 용이하고 (조작에서 우월함) 매우 미세한 (작은 입자 크기를 가짐), 생리학적으로 활성인 폴리펩티드 분말을 제조할 수 있다.

본 발명에서, 생리학적으로 활성인 폴리펩티드의 수용액에 첨가되는 휘발성염 및/또는 수-혼화성 유기 용매는 단독으로 또는 그것들의 혼합물로 사용될 수 있다. 수-혼화성 유기 용매 및 휘발성염이 그것들의 혼합물로 사용되는 경우, 그것들은 각각 상기량에 따라, 생리학적으로 활성인 폴리펩티드의 수용액에 첨가될 수 있다.

상기 방법에 의해 수득되는, 수-혼화성 유기 용매 및/또는 휘발성염을 포함하는 생리학적으로 활성인 폴리펩티드의 수용액을 동결건조시키는 경우, 동결건조는, 임의의 분야, 예컨대 물과 관련된 임의의 분야 뿐만 아니라, 약제학 또는 식품과 관련된 임의의 분야에서 사용되는 임의의 방법을 채택할 수 있다 ("Development of Drugs" Vol. 11, Yoshinobu NAKAI 편집, Hirokawa Syoten 출판). 예컨대, 생리학적으로 활성인 폴리펩티드의 수용액이 바이알 또는 앰플 등에 충진된 후, 그 수용액은 동결 후 건조 방법을 수행한다. 그러한 경우, 비록 샘플은 장치 밖에서 동결시킨 후, 건조기에 넣을 수 있으나, 통상, 바람직하게 샘플은 장치 내에서 적절한 온도 제어 하에서 동결된다. 건조 방법은 점차적으로 수행될 수 있다. 최근의 동결건조 장치는 온도 제어 또는 진공 제어가 가능하고, 대상물인 생리학적으로 활성인 폴리펩티드에 대한 최적의 조건을 선택하는 것이 가능하다. 동결건조 방법을 수행하게 되는 생리학적으로 활성인 폴리펩티드의 농도는, 예컨대 수용액 내에서 0.01 % (W/V) 내지 30 % (W/V), 바람직하게는 0.03 % (W/V) 내지 10 % (W/V), 더욱 바람직하게는 0.05 % (W/V) 내지 3 % (W/V) 등이나, 그것에 특별히 제한되지는 않는다. 생리학적으로 활성인 폴리펩티드가 hGH 인 경우, 수용액 내의 hGH 의 농도는 바람직하게는 0.01 % (W/V) 내지 5 % (W/V), 더욱 바람직하게는 0.05 % (W/V) 내지 0.5 % (W/V) 이다.

본 발명에 사용되는 유기 용매는 바람직하게는 120 ℃ 이하의 비점을 갖는다. 이러한 유기 용매로는 할로겐화된 탄화수소 (예. 디클로로메탄, 클로로포름, 사염화탄소 등), 알코올 (예. 에탄올, 메탄올, 1,4-부탄디올, 1,5-펜탄디올 등), 에틸 아세테이트, 아세토니트릴 등을 들 수 있다. 상기 용매는 또한 주어진 비에서 혼합물로서 사용될 수 있다. 단독으로 사용되는 바람직한 유기 용매로는 예컨대, 디클로로메탄 및 아세토니트릴 등을 들 수 있다. 혼합물로서 사용되는 바람직한 유기 용매로는, 예컨대 할로겐화된 탄화수소 (예. 디클로로메탄, 클로로포름 등) 및 알코올 (예. 에탄올, 메탄올, 1,4-부탄디올, 1,5-펜탄디올) 또는 아세토니트릴의 배합을 들 수 있다. 특히, 디클로메탄 및 아세토니트릴의 배합이 널리 사용된다. 알코올 또는 아세토니트릴에 대한 할로겐화된 탄화수소의 혼합비 (부피비) 는 약 40 :1 내지 약 1:1, 바람직하게는 약 20:1 내지 약 1:1 의 범위이다. 특히, 탄화수소 할라이드 (예. 디클로메탄 등) 가 단독으로 사용되거나, 주로 9:1 내지 1:1 의 혼합비로 탄화수소 할라이드 및 아세토니트릴을 포함하는 혼합 용매가 사용되는 것이 바람직하다. 용액 중 생분해성 중합체의 농도는 분자량, 유기 용매의 종류 등에 따라 상이하다. 예컨대, 약 0.01 내지 약 80 % (W/W), 바람직하게는 약 0.1 내지 약 70 % (W/W), 더욱 바람직하게는 약 1 내지 약 60 % (W/W) 일 수 있다.

본 발명의 서방 제제는, 수-혼화성 유기 용매 및/또는 휘발성염이 첨가된 생리학적으로 활성인 폴리펩티드의 용액을 동결건조시킴으로써 수득되는 생리학적으로 활성인 폴리펩티드 분말 (S 상) 이, 유기 용매 내에 생분해성 중합체를 용해시킨 용액 (O 상) 내에 분산된, S/O 분산액으로부터 유기 용매를 제거함으로써 제조된다. 그 방법은, 예컨대 (A) 수 중 건조법 (S/O/W 법), (b) 상 분리법 (코아세르베이트법) 및 (c) 분무 건조법, 또는 이러한 방법들에 따른 기타 방법들이다. 하기에, 예컨대 서방 제제로서, 마이크로캡슐을 제조하기 위한 방법이 기재되어 있다.

(a) 수 중 건조법 (S/O/W 법)

본 방법에 따라, 우선 수-혼화성 유기 용매 및/또는 휘발성염이 생리학적으로 활성인 폴리펩티드의 수용액에 첨가된 후, 생리학적으로 활성인 폴리펩티드 분말 (S 상) 이 동결건조에 의해 제조된다. 생분해성 중합체가 유기 용매 내에 용해된 후, 상기 생리학적으로 활성인 폴리펩티드 분말이 생성된 유기 용매 용액 내에 분산된다. 생리학적으로 활성인 폴리펩티드 및 생분해성 중합체의 비 (중량비) 는 예컨대 약 1:1000 내지 약 1:1, 바람직하게는 약 1:200 내지 약 1:5, 더욱 바람직하게는 약 1:100 내지 약 1:5 이다. 바람직하게, 유기 용매 용액 내에 생리학적으로 활성인 폴리펩티드를 균일하게 분산시키기 위해, 외부 물리적 에너지가 첨가된다. 상기 방법으로서, 예컨대 초음파 방사, 터빈 교반기, 호모게나이저 등을 사용한다. 유기 용매 용액 중 생리학적으로 활성인 폴리펩티드의 평균 입자 크기에 있어서, 바람직하게는 약 10 ㎛ 이하, 더욱 바람직하게는 약 0.1 내지 10 ㎛, 더 더욱 바람직하게는 약 0.5 내지 5 ㎛ 이고, 이것은 본 발명에서의 방법에 의해 수득되는 생리학적으로 활성인 폴리펩티드 분말을 사용함으로써 용이하게 실현된다. 본 발명에서, 생리학적으로 활성인 폴리펩티드의 평균 입자 크기는, 호모게나이저를 사용함으로써 생리학적으로 활성인 폴리펩티드를 유기 용매, 예컨대 디클로로메탄에 분산시킨 후, 레이저 회절 입자 크기 분석기 (Shimadzu Corp. 으로부터 SALD2000A 의 상품명으로 시판됨) 를 사용함으로써 수득되는 값을 의미한다. 상기 방법에서, 생리학적으로 활성인 폴리펩티드는 약 20 내지 100 mg/ml 의 농도로 유기 용매 내에 첨가된 후, 약 30 내지 60 초 동안 약 20,000 rpm 으로 호모게나이저, 예컨대 폴리트론(Polytron) (Kinematica) 을 사용하여 분산된다. 그 분산액은, 레이저 회절 입자 크기 분석기를 사용하여 평균 입자 크기를 측정하기 위해, 유기 용매로 적절히 희석된다.

또한, 상기 언급된 방법으로 제조된 유기 용매 분산액 (S/O 분산액) 이 수성 용매 (W 상) 에 첨가된 후, 상기 언급된 것과 동일한 외부 물리적 에너지, 예컨대 초음파 방사, 터빈 교반기, 호모게나이저 등이 첨가되어, S/O/W 유화액이 형성된다. 그 후, O 상의 유기 용매가 증발되어 마이크로캡슐이 제조된다. 수상(water phase) 의 부피는, O 상의 부피에 기준해 통상 약 1 배 내지 10,000 배, 바람직하게는 약 2 배 내지 약 5,000 배, 더욱 바람직하게는 약 5 배 내지 약 2,000 배로부터 선택된다.

유화제가 상기 외부 수상 내에 첨가될 수 있다. 유화제로서, 통상 안정한 S/O/W 유화액을 형성할 수 있는 어떠한 물질도 사용될 수 있다. 상기 유화제로, 예컨대, 음이온성 계면 활성제, 비이온성 계면활성제, 폴리옥시에틸렌 피마자유의 유도체, 폴리비닐피롤리돈, 폴리비닐 알코올, 카르복시메틸 셀룰로오스, 레시틴, 젤라틴, 히알루론산 등이 있다. 상기 유화제는 주어진 비로 그것들의 혼합물로 사용될 수 있다. 외부 수상 중 유화제의 농도는 바람직하게는 약 0.001 % 내지 20 % (w/w), 더욱 바람직하게는 약 0.01 % 내지 10 % (w/w), 특히 바람직하게는 약 0.05 % 내지 5 % (w/w) 이다.

이에 수득된 마이크로캡슐은 원심분리 또는 여과에 의해 회수되고, 증류수로 세척되어, 마이크로캡슐 표면에 부착된 유화제 등이 제거되고, 증류수에 재분산되어, 동결건조된다. 그 후, 필요하다면, 마이크로캡슐 내의 물 및 유기 용매가 가열에 의해 더 제거된다. 감압 하에서 가열이 수행될 수 있다. 가열 조건에 있어서, 가열 및 건조는 생분해성 중합체의 유리 전이 온도 이상이고, 각 마이크로캡슐 입자의 응결을 일으킬 정도로 높지 않은 온도에서 수행된다. 가열 및 건조는, 바람직하게는 생분해성 중합체의 유리 전이 온도 내지 유리 전이 온도보다 약 30 ℃ 더 높은 온도에서 수행된다. 유리 전이 온도는, 온도가 분 당 10 내지 20 ℃ 의 속도로 증가되는 경우, 시차 주사 열량법을 사용하여 수득되는 중간 유리 전이점으로서 정의된다.

(b) 상 분리법 (코아세르베이트법)

마이크로캡슐이 본 방법에 의해 제조되는 경우, 코아세르베이트제는 교반 하에서 상기 (a) 로서 기재된 S/O 분산액에 점차 첨가되어, 마이크로캡슐을 침전시키고, 고형화한다. 사용되는 코아세르베이트제의 양은 부피로 약 0.01 내지 약 1,000 배, 바람직하게는 약 0.05 내지 약 500 배, 특히 바람직하게는 약 0.1 내지 약 200 배이다. 그것이 생분해성 중합체의 용해를 위한 유기 용매와 혼화성인, 중합성 미네랄 오일 또는 식물유 화합물이고, 사용되는 중합체를 용해시키지 않는 한, 어떠한 코아세르베이트제도 사용될 수 있다. 구체적으로, 상기 코아세르베이트제의 예로는 실리콘 오일, 참깨유, 대두유, 옥수수유, 면실유, 코코넛유, 아마인유, 미네랄 오일, n-헥산 및 n-헵탄 등을 들 수 있다. 그 중 2 개 이상이 배합되어 사용될 수 있다. 이에 수득된 마이크로캡슐은 여과에 회수되고, 헵탄 등으로 반복 세척되어, 코아세르베이트가 제거될 수 있다. 또한, 상기 (a) 와 동일한 방식으로 세척이 수행된 후, 동결건조된다.

수 중 건조법 또는 코아세르베이트법에 의한 마이크로캡슐의 제조시에, 입자의 응결을 방지하기 위해 항응결제가 첨가될 수 있다. 항응결제의 예로는, 예컨대 수-혼화성 다당류, 예컨대 만니톨, 락토오스, 글루코오스, 전분 (예. 옥수수 전분 등), 히알루론산 및 그것의 알칼리 금속염; 단백질, 예컨대 글리신, 피브린 및 콜라겐; 및 무기염, 예컨대 염화나트륨 및 인산수소나트륨 등을 들 수 있다.

(c) 분무 건조법

마이크로캡슐이 본 방법에 의해 제조되는 경우, 상기 기재된 S/O 분산액은 분무 건조기의 건조 챔버에 노즐을 통해 분무되어, 매우 단시간 내에 미세한 방울로 유기 용매가 휘발되어 마이크로캡슐이 제조된다. 상기 노즐로는, 예컨대 이류체 노즐형, 압력 노즐형 및 회전 디스크형 등을 들 수 있다. 필요하다면, 기타 노즐을 통해 상기 기재된 항응결제의 수용액을 분무하여, 각 마이크로캡슐 입자의 응결을 방지하는 것이 또한 유리하다. 이에 수득된 마이크로캡슐은 상기 (a) 에서와 동일한 방식으로 세척된 후, (필요하다면 감압 하에서) 필요하다면 가열하여, 물 및 유기 용매가 제거된다.

본 발명의 서방 제제는 바람직하게는 미립의 상태이다. 왜냐하면, 서방 제제는 통상 피하 주사 또는 근육내 주사용으로 사용되는 주사 바늘을 통해 적용되기 때문에, 두려움으로 인해 환자는 과다한 통증을 느껴야 한다. 서방 제제의 입자 크기는, 예컨대 평균 입자 크기로서 약 0.1 내지 300 ㎛, 바람직하게는 약 1 내지 150 ㎛, 더욱 바람직하게는 약 2 내지 100 ㎛ 이다.

본 발명의 서방 제제에 포함된 생리학적으로 활성인 폴리펩티드의 양은, 예컨대 약 0.1 내지 30 % (W/W), 바람직하게는 약 0.2 내지 20 % (W/W), 더욱 바람직하게는 약 0.5 내지 10 % (W/W) 이다. 생리학적으로 활성인 폴리펩티드의 평균 입자 크기는 바람직하게는 10 ㎛ 이하, 더욱 바람직하게는 0.1 내지 10 ㎛, 더 더욱 바람직하게는 0.5 내지 5 ㎛ 이다.

본 발명의 서방 제제에 포함된 생분해성 중합체의 양은, 예컨대 약 30 내지 99.9 % (W/W), 바람직하게는 약 60 내지 97 % (W/W), 더욱 바람직하게는 약 70 내지 90 % (W/W) 이다.

서방 제제로부터 생리학적으로 활성인 폴리펩티드의 초기 방출비는, 바람직하게는 40 % 이하, 더욱 바람직하게는 약 1 내지 40 %, 더 더욱 바람직하게는 약 3 내지 35 % 이다. 초기 방출비는 피하 투여 후 1 일 (24 시간) 동안의 것을 의미한다. 이 비는 처음 24 시간 동안의 초기 방출량에 의해 계산된다. 초기 방출량은 본 발명의 서방 제제의 피하 투여 후 24 시간 동안 혈액 농도의 AUC (농도하 면적) 을 측정하고; 생리학적으로 활성인 폴리펩티드 용액의 피하 투여에 의해 얻어진, 용량-AUC 의 표준 보정 곡선에 AUC 값을 적용하여 구할 수 있다.

본 발명의 서방 제제는 원 물질로서 마이크로캡슐을 사용하여 여러가지 투여 형태로 제조하기 위해 사용될 수 있고, 비경구 제제 (예. 주사 또는 근육, 하피(hypodermis), 조직 등 내에 이식을 위한 제제, 비강, 직장, 자궁 등의 점막 투여를 위한 제제), 경구 제제 (예. 캡슐, 예컨대 경질 캡슐 및 연질 캡슐, 고체 제제, 예컨대 과립 및 분말, 용액, 예컨대 현탁액 등) 등으로 투여될 수 있다.

특히, 본 발명의 서방 제제는 바람직하게는 주사용이다. 예컨대, 서방 제제가 마이크로캡슐인 경우, 마이크로캡슐이 분산제 (예. 계면활성제, 예컨대 트윈 80, HCO-60 등, 다당류, 예컨대 카르복시메틸 셀룰로오스, 소듐 알기네이트, 히알루론산 등), 보존제 (예. 메틸 파라벤, 프로필파라벤 등 ), 등장화제 (예. 염화나트륨, 만니톨, 소르비톨, 글루코오스 등) 등과 함께 현탁화된, 수성 현탁액에 의해 실제적인 주사용 서방 제제를 수득할 수 있다. 마이크로캡슐이 식물유, 예컨대 참깨유, 옥수수유, 그것들의 레시틴과 같은 인지질과의 혼합물 또는 중쇄 지방산 트리글리세리드 (예. Miglyol 812) 와 함께 현탁화된, 오일성 현탁액에 의해 실제적인 주사용 서방 제제를 수득할 수도 있다.

서방 제제가 예컨대 마이크로캡슐인 경우, 주사가능 현탁액을 위한 서방 제제의 입자 크기는 분산도 및 주사용 바늘 통과도에 대한 요구를 만족시키는 범위로부터 선택될 수 있다. 예컨대, 입자 크기는 평균 입자 크기로서, 약 0.1 내지 약 300 ㎛, 바람직하게는 약 1 내지 약 150 ㎛, 더욱 바람직하게는 약 2 내지 약 100 ㎛ 이다.

무균 제제로서 상기 마이크로캡슐을 제조하는 방법으로는, 전체 제조 과정이 무균인 방법, 무균제로서 감마선이 사용되는 방법, 및 제조 과정 동안 방부제가 첨가되는 방법을 들 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

본 발명의 서방 제제는 낮은 독성으로 포유류 (예. 인간, 소, 돼지, 개, 고양이, 마우스, 랫트, 토끼 등) 에 안전하게 사용될 수 있다.

서방 제제의 적응증은, 사용되는 생리학적으로 활성인 폴리펩티드에 따라 변화한다. 서방 제제는, 인슐린이 생리학적으로 활성인 폴리펩티드로서 사용되는 경우, 당뇨병; 인터페론-α가 사용되는 경우, 바이러스성 간염 (예. C 형 간염, HBe 항원-양성 활동성 간염 등) 및 암 (예. 신장암, 다발성 골수종 등); 에리트로포이에틴이 사용되는 경우, 빈혈 (예. 신장 투석 중 빈혈 등); G-CSF 가 사용되는 경우, 호중구 감소증 (예. 항암 요법 등) 및 감염; IL-2 가 사용되는 경우, 암 (예. 혈관내피종 등); FGF 가 사용되는 경우, 골절, 외상 (예. 욕창 등), 치주염 및 위장 궤양; FGF-9 가 사용되는 경우, 혈소판감소증; NGF 가 사용되는 경우, 노인성 치매 및 신경병증; TPA 가 사용되는 경우, 혈전증; 종양 괴사 인자가 사용되는 경우, 암의 예방 또는 치료에 유용하다. 또한, GH 를 포함하는 서방 제제는, GH 의 성장 호르몬 작용에 기재하여, 터너 증후군, 만성 신부전증, 연골 무형성증 및 성인 뇌하수체 기능저하증 뿐만 아니라 뇌하수체 왜소증에 적용된다. 또한, GH 는 다운 증후군, 실버 증후군, 연골 형성 저하증 및 유년 만성 관절염과 같은 질병에 적용되어 우수한 치료 효과를 제공하는 것으로 보고되어 있기 때문에, GH 를 포함하는 서방 제제가 상기 질병들에 적용될 수 있다. GH 를 포함하는 서방 제제는 또한 울혈성 심부전 등을 예방 또는 치료하는데 유용하다.

비록 생리학적으로 활성인 폴리펩티드의 종류 및 함량, 방출 기간, 목표 질병, 대상 동물 종 및 기타 요인에 따라 변화하지만, 서방 제제의 용량은 생체 내에 생리학적으로 활성인 폴리펩티드의 유효 농도가 유지되는 한, 임의의 수준으로 맞추어 질 수 있다. 예컨대, 서방 제제가 2 주 방출용으로 디자인된 것인 경우, 생리학적으로 활성인 폴리펩티드의 용량은, 성인 1 명 당 바람직하게는 체중 kg 당 약 0.0001 내지 약 10 mg, 더욱 바람직하게는 체중 kg 당 약 0.05 내지 약 1 mg 의 범위로부터 적절히 선택될 수 있다. 서방 제제의 바람직한 투여 빈도는, 생리학적으로 활성인 폴리펩티드의 종류 및 함량, 투여 형태, 방출 기간, 목표 질병, 대상 동물 종 및 기타 요인에 따라, 1 주 1 회, 2 주 1 회, 1 개월 1 회, 2 개월 1 회 등으로부터 적절히 선택될 수 있다. 서방 제제는, 바람직하게는 1 주 내지 1 개월, 더욱 바람직하게는 1 주 내지 3 주, 더 더욱 바람직하게는 10 일 내지 20 일의 기간 동안 생리학적으로 활성인 폴리펩티드를 효과적으로 방출할 수 있다. 상기 중, 2 주의 기간 동안 생리학적으로 활성인 폴리펩티드를 효과적으로 방출할 수 있는 서방 제제가 가장 바람직하다. 이는 2 주 1 회 투여되는 서방 제제를 의미한다.

서방 제제 내에 활성 성분으로서 생리학적으로 활성인 폴리펩티드가 예컨대 인슐린인 경우, 당뇨병 성인에게 투여 당 용량은, 유효 성분으로서, 통상 체중 kg 당 약 0.001 내지 약 1 mg, 바람직하게는 체중 kg 당 약 0.01 내지 약 0.2 mg 의 범위로부터 적절히 선택된다. 바람직한 투여 빈도는 1 주 1 회이다.

서방 제제 중 활성 성분으로서 생리학적으로 활성인 폴리펩티드가 GH 인 경우, 비록 GH 의 종류 및 함량, 방출 기간, 목표 질병, 대상 동물 종 및 기타 요인에 따라 변화하지만, 생체 내의 GH 의 유효 농도가 유지되는 한, 용량은 임의의 수준에도 맞추어질 수 있다. 상기 기재된 질병의 치료에 있어서, 안전한 투여를 위해 서방 제제가 2 주 방출용으로 고안된 것인 경우, 소아 또는 성인 1 명 당 GH 의 용량은 체중 kg 당 약 0.01 내지 약 5 mg (체중 kg 당 약 0.03 내지 약 15 IU/mg), 더욱 바람직하게는 체중 kg 당 약 0.05 내지 약 1 mg (체중 kg 당 약 0.15 내지 약 3 IU/mg) 에서 적절히 선택될 수 있다. 바람직한 투여 빈도는 GH 의 함량, 투여 형태, 방출 기간, 목표 질병, 대상 동물 종 및 기타 요인에 따라, 1 주 1 회, 2 주 1 회, 1 개월 1 회 등으로부터 적절히 선택될 수 있다. GH 를 포함하는 서방 제제는, 바람직하게는 1 주 내지 1 개월, 더욱 바람직하게는 1 주 내지 3 주, 더 더욱 바람직하게는 10 일 내지 20 일의 기간 동안 효과적으로 GH 를 방출할 수 있다. 상기 중, 2 주 동안 효과적으로 GH 를 방출할 수 있는, GH 를 포함하는 서방 제제가 가장 바람직하다. 그것은 2 주 1 회 투여되는 서방 제제를 의미한다.

서방 제제는 바람직하게는 상온 또는 냉소에서 저장된다. 더욱 바람직하게, 서방 제제는 냉소에 저장된다. "상온" 및 "냉소" 는 일본 약전에 정의되어 있다. 즉, "상온" 은 15 내지 25 ℃ 를 의미하고, "냉소" 는 15 ℃ 이하의 온도를 의미한다. "냉소" 는 더욱 바람직하게는 약 2 내지 8 ℃ 이다.

본 발명은 생리학적으로 활성인 폴리펩티드를 포함하는 서방 제제 및 그것의 제조 방법에 관한 것이다.

도 1 은 에탄올이 첨가된 GH 분말을 사용함으로써 수득된 GH 를 포함하는 마이크로캡슐을 면역 억제된 SD 랫트에 투여한 후 혈장 내의 GH 농도 변화를 나타내며, 그림 중, -●- 는 0.10 % 에탄올을 나타내고, -○- 는 0.25 % 에탄올을 나타내고, -▲- 는 0.50 % 에탄올을 나타낸다.

도 2 는 암모늄 아세테이트가 첨가된 GH 분말을 사용함으로써 수득되는 GH 를 포함하는 마이크로캡슐을 면역 억제된 SD 랫트에 투여한 후, 혈장 내의 GH 농도 변화를 나타내는 그래프이고, 그 중 -▲- 는 25 배 몰의 암모늄 아세테이트를 나타내고, -●- 는 50 배 몰의 암모늄 아세테이트를 나타낸다.

[발명을 수행하기 위한 최량의 조건]

본 발명은 하기 참조예, 실시예 및 실험예에 의해 더욱 상세히 이하 기재되어 있으며, 이는 본 발명의 범위를 제한하기 위한 것은 아니다. 본 발명의 명제서에서, 아미노산 약어는 생화학 명명법 상 IUPAC-IUB 위원회에 의해 추천되는 것 또는 통상 관련 분야에서 사용되는 것에 기재한다. 그 예는 하기에 나와 있다 (약어는 달리 명시되지 않으면 L-형을 나타낸다):

SDS: 소듐 도데실술페이트

Gly: 글리신

Ala: 알라닌

Val: 발린

Leu: 류신

Ile: 이소류신

Ser: 세린

Thr: 트레오닌

Cys: 시스테인

Met: 메티오닌

Glu: 글루탐산

Gln: 글루타민

Asp: 아스파르트산

Asn: 아스파라긴

Lys: 리신

Arg: 아르기닌

His: 히스티딘

Phe: 페닐알라닌

Tyr: 티로신

Trp: 트립토판

Pro: 프롤린

Asx: Asp + Asn

Glx: Glu + Gln

참조예 1

T7 프로모터를 사용하는 인간 성장 호르몬 (hGH) 에 대한 발현 벡터의 구조

hGH 의 구조 유전자를, EcoRI 및 EcoRV 로 절단함으로써, 일본 특허 공보 제 12996/1994 에 개시된 플라스미드 pHGH107 (ATCC 31538 또는 ATCC 40011) 로부터 약 0.75 kb 단편으로 분리하였다. 한편, T7 프로모터 및 암피실린 내성 유전자를 NdeI 및 BamHI 로 절단함으로써, pET-3C 로부터 약 4.6 kb 단편으로 분리하였다 [Rosenberg 등, Gene, 56, 125 (1987)].

2 개의 단편 모두를 T4 DNA 폴리머라제 (DNA 블런팅 키트 (blunting kit); Takara Shuzo, Inc.) 로 처리하고, T4 DNA 리가제로 결찰한 후, 에스케리키아 콜리 (Escherichia coli) JM109 로 도입하고, 암피실린 내성 형질전환체를 선택하였다. 수득된 12 개의 콜로니로부터, 플라스미드를 제조하고, PstI 로 분해하였다. 그 결과로서, hGH 유전자가 6 개의 콜로니로부터 플라스미드 내에 바른 방향으로 삽입된 것을 발견하였다. 6 개의 콜로니 중 1 개의 형질전환체로부터 수득된 플라스미드를 pTGA201 로 명명하였다.

참조예 2

에스케리키아 콜리에서 Met-hGH 의 발현

에스케리키아 콜리 JM109 를 T7 파지의 RNA 폴리머라제 유전자를 갖는 λ 파지 (Studie, Supura) 로 변형시켰다. 그 후, 수득한 에스케리키아 콜리 JM109 (DE3) 에, 참조예 1 에서 수득한 hGH 발현 벡터 pTGA201 을 도입하여, 에스케리키아 콜리 JM109 (DE3)/pTGA201 을 수득하였다.

에스케리키아 콜리 JM109 (DE3)/pTGA201 을 50 ㎍/ml 암피실린을 포함하는 1 ℓ의 LB 배지 [1 % 펩톤, 0.5 % 효모 추출물, 0.5 % 염화나트륨] 를 포함하는 2 ℓ용적의 플라스크에 주입한 후, 30 ℃ 에서 16 시간 동안 회전식 진탕 배양을 수행하였다. 그 후, 생성된 배양액을 20 ℓLB 배지 [0.02 % 형성방지제 (New Pole LB-625; Sanyo Kasei Kogyo), 50 ㎍/ml 암피실린] 를 포함하는 50 ℓ단지 발효기로 옮긴 후, 37 ℃ 에서 6 시간 동안 통기 및 교반 하에서 배양하였다. 그 후, 생성된 배약액을 360 ℓ액체 제조 배지 (1.68 % 인산수소나트륨, 0.3 % 인산이수소칼륨, 0.1 % 염화암모늄, 0.05 % 염화나트륨, 0.0246 % 황산마그네슘, 0.02 % New Pole LB-625, 0.0005 % 염산티아민, 1.5 % 글루코오스, 1.5 % 카사미노산(casamino acid)) 를 포함하는 500 ℓ단지 발효기로 옮긴 후, 37 ℃ 에서 통기 및 교반 하에 배양하였다. 클레트 밸브가 약 500 인 경우, 5.95 mg/L/분의 이소프로필-β-D-티오갈락토피로노시드 (IPTG) 를 배지에 첨가하고, 배양을 4 시간 동안 더 지속하였다. 배양액을 원심분리하여, -80 ℃ 에서 동결된 약 4.5 kg 의 습윤 세포를 수득하였다.

상기 변형된 에스케리키아 콜리 JM109 (DE3)/pTGA201 을 일본 국제통상부, 산업 과학 기술국, 생물과학 및 인간공학 국립 학회 (NIBH) 에 의탁하였고, 수납 번호 FERM BP-5632 를 부여받았다. 그것을 또한 일본 오사카의 발효 학회 (IFO) 에 의탁하였고, 수납 번호 IFO 16001 을 부여받았다.

참조예 3

Met-hGH 의 활성화

참조예 2 에서 수득한 2 kg 의 습윤 세포를 6 ℓ의 50 mM 트리스-HCl 및 염산구아니딘 (pH 8.0) 에 용해시킨 후, 원심분리하였다 (10000 rpm, 120 분). 6 ℓ의 생성된 상층액에, 50 mM 트리스-HCl, 0.28 mM GSSG 및 0.7 M Arg 을 함유하는 용액 (pH 8.0) 18 ℓ를 첨가하여, pH 를 8.0 으로 조정한 후, 4 ℃ 에서 5 일 동안 정치하여, Met-hGH 를 계속하여 활성화시켰다.

참조예 4

Met-hGH 의 정제

참조예 3 에서 수득한 용액을, 전기 전도가 10 mS 이하가 될 때까지, 20 mM 트리스-HCl 및 2.5 M 요소의 용액 (pH 8.0) 을 첨가하면서, 펠리콘(Pellicon) 카세트 시스템 (PTGC 막; Millipore Corporation) 에 의해 염석 및 농축시켰다. 수득한 농축물을 원심분리하여 (10000 rpm, 60 분), 5 ℓ의 상층액을 수득하였다. 상층액을 20 mM 트리스-HCl 및 2.5 M 요소의 용액 (pH 8.0) 으로 평형화된 DEAE-Toyopearl 650 M 컬럼 (20 cmφ X 84 cm, Tosoh) 에 로딩한 후, 흡착 및 세척하였다. 컬럼을 100 분 동안 300 ml/분의 유속으로 0-25 % 용액 B (B = 20 mM 트리스-HCl, 2.5 M 요소, 1 M NaCl, pH 8.0) 로 이루어진 농도구배를 사용하여 용리하였다. Met-hGH 를 포함하는 용리된 용액 10 ℓ를 펠리콘 카세트 시스템 (PTGC 막; Millipore) 에 의해 다시 염석 및 농축시켰다. 농축된 용액을 HPLC 법 (Gilson HPLC 시스템; Gilson) 을 사용하여, DEAE-5PW 컬럼 (21 cmφX 30 cm, Tosoh) 을 통과시켰다. 컬럼을 70 분 동안 320 ml/분의 유속으로 70-85 % 용액 B (A = 50 mM 트리스-HCl 및 2.5 M 요소 (pH 8.0); B = 50 mM MES [2-(N-모르폴리노)에탄 술포네이트] 및 2.5 M 요소 (pH 4.0)) 로 이루어진 pH 구배를 사용하여 용리하였다. 수득한 Met-hGH 분획 6 ℓ에, 2 M 트리스-HCl (pH 7.8) 을 첨가하여, pH 를 7.2 로 조정한 후, 펠리콘 카세트 시스템 (PTGC 막; Millipore) 에 의해 염석 및 농축시켜, Met-hGH 9,979 mg 을 수득하였다.

참조예 5

N-말단 Met 의 제거

참조예 4 에서 수득한 Met-hGH 용액 1650 ml 에, 35 mM 황산구리, 2.5 M 글리옥실산 및 6 M 피리딘을 포함하는 413 ml 용액을 첨가하고, 그 혼합물을 교반하고, 25 ℃ 에서 60 분 동안 정치시켰다. 반응 용액을 20 mM 트리스-HCl 및 2.5 M 요소의 용액 (pH 8.0) 으로 평형화된 Sephadex G-25 컬럼 (11.3 cmφ X 125 cm, Pharmacia) 을 통해 3 ℓ/h 의 유속으로 통과시키고, 동일한 용액으로 컬럼을 세척하여, Met-hGH 의 디케톤 유도체의 분획을 수집하였다. 용리된 분획을 4 M 아세트산, 4 M 아세트산나트륨, 80 mM ο-페닐렌디아민 및 3 M 요소의 용액 4 ℓ에 교반하면서 직접 첨가하였다. 용리 후, 반응 용액 8 ℓ를 4 ℃ 에서 3 일 동안 정치시켰다. 그 용액을 펠리콘 카세트 시스템 (PTGC 막; Millipore) 에 의해 염석시켰다. 농축된 용액 4 ℓ를 20 mM 트리스-HCl 및 2.5 M 요소의 용액 (pH 8.0) 으로 평형화된 Sephadex G-25 컬럼 (11.3 cmφ X 140 cm, Pharmacia) 를 통해 3 ℓ/h 의 유속으로 통과시켜, hGH 분획 4.7 ℓ를 수집하였다. 수득한 분획을 HPLC 법 (Gilson HPLC 시스템; Gilson) 을 사용하여, DEAE-5PW 컬럼 (21 cmφX 30 cm, Tosoh) 을 통과시켰다. 컬럼을 70 분 동안 320 ml/분의 유속으로 70 내지 85 % 용액 B (A = 50 mM 트리스-HCl 및 2.5 M 요소 (pH 8.0); B = 50 mM MES [2-(N-모르폴리노)에탄 술포네이트] 및 2.5 M 요소 (pH 4.0)) 로 이루어진 pH 구배를 사용하여 용리하여, hGH 분획 10 ℓ를 수집하였다. 수득한 hGH 분획에, 2 M 트리스-HCl (pH 7.8) 용액 500 ml 를 첨가하여, pH 를 7.2 로 조정한 후, 미니탄(Minitan) II (PTGC 막; Millipore) 로 농축시켰다. 농축된 용액 500 ml 를 증류수로 평형화된 Sephacryl S-100 컬럼 (11.3 cmφ X 50 cm, Pharmacia) 을 통해 2 ℓ/h 의 유속으로 통과시켜, hGH 분획 1651 ml 를 수집한 후, 밀리팩(Millipack) 60 (Millipore) 으로 여과하여, hGH 용액 1487 ml (hGH 3309 mg) 를 수득하였다.

참조예 6

hGH 의 형태의 확인

(a) SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 사용한 분석

참조예 5 에서 수득한 hGH 용액에, 100 mM DTT 를 함유하는 동일한 부피의 샘플 완충액 [Laemmli, Nature, 227, 680 (1970)] 을 첨가하고, 혼합물을 95 ℃ 에서 2 분 동안 가열한 후, Multi Gel 10/20 (Daiichi Pure Chemicals) 로 전기영동하였다. 전기영동 후, 겔을 코마시 브릴리안트 블루로 염색하고, 약 22 kd 의 정제 단백질에 단일 띠를 수득하였다. 따라서, hGH 가 거의 한 가지인 것이 확인되었다.

(b) 아미노산 조성의 분석

참조예 5 에서 수득한 hGH 를 아미노산 분석기 (L-8500A, Hitachi) 를 사용하여, 아미노산 조성을 결정하는데 사용하였다. 참조예 5 에서 수득한 hGH 의 아미노산 조성은 hGH 의 cDNA 서열로부터 예측한 것과 일치하였다. 그 결과는 표 1 에 나와 있다.

산 가수분해 (6 N HCl, 4 % 티오글리콜산, 110 ℃, 24 및 48 시간 가수분해 후에 수득된 평균값)

¹⁾가수분해 시간이 0 시간이라고 추정하여 외삽한 값

²⁾검출 안 됨

분석은 hGH 20 ㎍ 을 사용하여 수행하였다.

(c) N-말단 아미노산 서열의 분석

참조예 5 에서 수득한 hGH 의 N-말단 아미노산 서열을, 기체상 단백질 서열측정기 (Applied Biosystems, 477A 모델) 을 사용하여 구하였다. 참조예 5 에서 수득한 hGH 의 N-말단 아미노산 서열은 hGH 의 cDNA 서열로부터 예측한 것과 일치하였다. 그 결과는 표 2 에 나와 있다.

¹⁾페닐티오히단토인

분석은 hGH 1 nmol 을 사용하여 수행하였다.

(d) C-말단 아미노산의 분석

참조예 5 에서 수득한 hGH 를 아미노산 분석기 (L-8500A, Hitachi) 를 사용하여 C-말단 아미노산 서열을 구하는데 사용하였다. 참조예 5 에서 수득한 hGH 의 C-말단 아미노산은 hGH 의 cDNA 서열로부터 예측한 것과 일치하였다. 그 결과는 표 3 에 나와 있다.

C-말단 아미노산의 분석

C-말단 아미노산 수율(%)

Phe 52

증기상 히드라진 첨가 분해 (100 ℃, 6 시간)

분석은 hGH 18 nmol 을 사용하여 수행하였다.

(e) hGH 활성의 결정

참조예 5 에서 수득한 정제된 hGH 의 분석을 [Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism, 51, 1058 (1980)] 에 기재된 방법에 따라 Nb 2 세포를 사용하여 수행하고, 참조예 5 에서 수득한 정제된 hGH 가 실질적으로 표준 생성물과 동일한 세포 성장 강화 활성을 갖는 것을 알아내었다.

실시예 1

(1) hGH 분말의 제조

참조예 5 에 따라 제조된 재조합 hGH (hGH 의 최종 농도 = 2 mg/ml) 의 수용액에 에탄올을 첨가하였다 [최종 농도 (V/V %) = 0.03 %, 0.06 %, 0.1 %, 0.15 %, 0.25 %, 0.5 %)]. 그 후, 생성된 용액을 동결건조하여, 6 종의 hGH 분말을 수득하였다.

(2) hGH 를 포함하는 마이크로캡슐의 제조

락트산/글리콜산 공중합체 (락트산/글리콜 = 50/50, 폴리스티렌으로 전환된 값으로서 평균 분자량 = 12,000, 점도 = 0.145 dl/g) 1.85 g 및 산화아연 10 mg 을 디클로로메탄 3.0 ml 에 용해시켰다. 상기 (1) 에서 제조된 hGH 분말 140 mg 을 상기 유기 용매 용액에 첨가하였다. 그 후, 폴리트론 (Kinematica 시판) 을 사용함으로써 미립화하였다. S/O 분산액을 0.1 % 폴리비닐 알코올 수용액 800 ml 에 첨가하였다. 그 후, 생성액을 교반하고, 호모믹서를 사용하여 유화시켰다. 디클로로메탄을 실온에서 3 시간 동안 교반하여 증발시킨 후, 분산액을 원심분리하여 (약 1,500 rpm), 마이크로캡슐을 수집하였다. 후속적으로, 마이크로캡슐을 증류수 400 ml 로 2 회 세척하고, D-만니톨 0.2 g 을 첨가한 후, 동결건조시켰다. 또한, 생성된 물질을 46 ℃ 에서 3 일 동안 진공내 건조하여, 남은 용매를 제거하여, hGH 를 포함하는 6 종의 마이크로캡슐을 수득하였다.

실시예 2

(1) hGH 분말의 제조

암모늄 아세테이트 등몰의 10, 20, 25, 40, 50, 70 및 100 배를 참조예 5 에 따라 제조된 재조합 hGH의 수용액 (hGH 의 최종 농도 = 2 mg/ml) 에 첨가하였다. 그 후, 생성액을 동결건조하여, 7 종의 hGH 분말을 수득하였다.

(2) hGH 를 포함하는 마이크로캡슐의 제조

상기 실시예 1 (2) 에 기재된 방법에 따라, 상기 (1) 에서 제조된 hGH 분말을 사용함으로써, hGH 를 포함하는 7 종의 마이크로캡슐을 수득하였다.

비교예 1

(1) hGH 분말의 제조

에탄올 또는 암모늄 아세테이트 중 어느 것도 참조예 5 에 따라 제조된 재조합 hGH의 수용액 (hGH 의 최종 농도 = 2 mg/ml) 에 첨가하지 않았다. 용액을 동결건조하여, hGH 분말을 수득하였다.

(2) hGH 를 포함하는 마이크로캡슐의 제조

상기 실시예 1 (2) 에 기재된 바와 같은 방법에 따라, 상기 (1) 에서 제조된 hGH 분말을 사용함으로써, hGH 를 포함하는 마이크로캡슐을 수득하였다.

실험예 1

실시예 1 (1) 및 비교예 1 (1) 에서 수득된 hGH 분말에 있어서, 취급의 용이함을 분말의 부피 및 정전기에 대한 하전의 관점으로 평가하였다. 그 결과가 표 4 에 나와 있다.

표 4 의 결과로부터 분명히 이해되는 것처럼, 에탄올 없이 제조된 hGH 분말과 비교하여, 에탄올을 사용하여 제조된 hGH 분말은 취급의 용이함에 있어서, 대단히 향상되었다.

실험예 2

디클로로메탄 2 ml 를 실시에 1 (2) 및 비교예 1 (2) 의 방법 중간에 수득된 hGH 분말/PLGA 유기 용매인 S/O 분산액 50 ㎕ 에 첨가하였다. 그 후, hGH 분말의 평균 입자 크기를, 레이저 회절 입자 크기 분석기 (Shimadzu Corp. 으로부터 상품명 SALD2000A 로 시판됨) 를 사용함으로써 측정하였다. 그 결과가 표 4 에 나와 있다.

표 4 의 결과로부터 분명히 이해되는 것처럼, 에탄올 없이 제조된 hGH 분말이 10 ㎛ 이상의 평균 입자 크기를 가지는 반면, 에탄올을 사용하여 제조된 hGH 분말은 10 ㎛ 이하의 평균 입자 크기를 가졌다.

에탄올의 농도	취급의 용이함	평균 입자 크기
0.03 %	+	8.2 ㎛
0.06 %	++	5.6 ㎛
0.10 %	++	5.0 ㎛
0.15 %	++	6.1 ㎛
0.25 %	++	8.0 ㎛
0.50 %	++	9.1 ㎛
에탄올을 사용하지 않은 경우	-	10.2 ㎛

* 분말의 부피 및 정전기에 대한 하전의 관점에서 3 등급으로 평가함

(-: 어려움, +: 용이함, ++: 대단히 용이함)

실험예 3

실시예 1 (2) 및 비교예 1 (2) 에서 제조된 hGH 를 포함하는 마이크로캡슐을 사용함으로써, 하기 시험을 수행하였다.

(1) hGH 함량

아세토니트릴 0.3 ml 를 5 mg 의 마이크로캡슐에 첨가하고, 혼합물을 초음파처리하였다. 10 mM 인산염 완충 식염수 (pH 8.0) 0.7 ml 를 생성된 용액에 첨가하여, 활성 성분인 hGH 를 추출하였다. 후속적으로, hGH 추출물을 하기 조건에서 크기별 배제 고성능 액체 크로마토그래피를 수행한 후, hGH 함량을 측정하여, 포획비를 계산하였다. 그 결과가 표 5 에 나와 있다.

컬럼: TSKgelG 3000SW_XL(Tosoh 로부터 시판됨)

추출물: 0.2 M 인산염 완충 식염수 (pH 6.8) - 0.2 M NaCl

유속: 0.6 ml/분

표 5 의 결과로부터 분명히 이해되는 것처럼, 에탄올 없이 제조된 hGH 분말을 사용함으로써 제조되는 마이크로캡슐 (hGH 포함) 과 비교하여, 에탄올을 사용하여 제조된 hGH 분말을 사용함으로써 제조되는 hGH 포함하는 마이크로캡슐은 더 큰 hGH 포획비를 나타내었다.

에탄올의 농도	hGH 포획비
0.10 %	92 %
0.25 %	90 %
0.50 %	85 %
에탄올을 사용하지 않은 경우	77 %

(2) 생체 내 방출 프로파일

마이크로캡슐을 면역 억제된 SD 랫트 (수컷, 생후 6 주) 에 피하 투여하였다 (hGH 의 양으로서 6 mg/랫트). 그 후, 시간이 지남에 따라, 랫트 혈액을 연속적으로 수집하였다. 혈장 중 hGH 의 농도를 방사선면역측정법 (EIKEN CHEMICAL CO., LTD. 로부터 상품명 Ab beads HGH 로 시판됨) 으로 측정하여, hGH 방출 프로파일을 평가하였다. 면역 억제된 SD 랫트를, 마이크로캡슐 첫 번째 투여 3 일전 0.4 mg/랫트, 첫 번째 투여일 0.2 mg/랫트 및 첫 번째 투여 후 제 4 일, 제 7 일, 제 11 일 및 제 14 일에 0.2 mg/랫트의 양으로 상품명 Prograf (Fujisawa Phamrmaceutical Co., Ltd. 로부터 시판됨) 의 피하 주사에 의해 제조하였다. 그 결과가 도 1 에 나와 있다.

도 1 의 결과로부터 분명히 이해되는 것처럼, 에탄올을 사용하여 제조된 hGH 분말을 사용함으로써 제조되는 마이크로캡슐 (hGH 포함) 과 비교하여, 초기 방출 (투여 후 1 일 (24 시간) 동안 방출된 hGH 의 양) 은 적으나, 연속 농도 (즉, 초기 방출을 제외한 투여 후 2 주 동안 방출된 hGH 의 양) 은 많았다. 즉, 에탄올을 사용하여 제조된 hGH 분말에 의해, 초기 농도는 감소하였고, 2 주 동안 고농도의 혈중 hGH 를 수득하였다.

실험예 4

실시예 2 (1) 및 비교예 1 (1) 에서 수득된 hGH 분말에 있어서, 취급의 용이함을 분말의 부피 및 정전기에 대한 하전의 측면에서 평가하였다. 그 결과가 표 6 에 나와 있다.

표 6 의 결과로부터 분명히 이해되는 것처럼, 암모늄 아세테이트 없이 제조된 hGH 분말과 비교하여, 암모늄 아세테이트를 사용하여 제조된 hGH 분말은 취급의 용이함에 있어서, 대단히 향상되었다.

실험예 5

상기 실험예 2 에 기재된 바와 같은 방법에 따라, 실시예 2 (2) 및 비교예 1 (2) 의 방법의 중간에 수득된 hGH 분말/PLGA 유기 용매인 S/O 분산액을 레이저 회절 입자 크기 분석기 (Shimadzu Corp. 으로부터 상품명 SALD2000A 로 시판됨) 를 사용하여, hGH 분말의 평균 입자 크기를 측정하였다. 그 결과가 표 6 에 나와 있다.

첨가된 암모늄 아세테이트의 양	취급의 용이함	평균 입자 크기
10 배 몰	+	2.8 ㎛
20 배 몰	++	3.0 ㎛
25 배 몰	++	4.1 ㎛
40 배 몰	++	4.2 ㎛
50 배 몰	++	4.0 ㎛
70 배 몰	++	7.2 ㎛
100 배 몰	-	11.8 ㎛
암모늄 아세테이트를 사용하지 않은 경우	-	10.2 ㎛

* 분말의 부피 및 정전기에 대한 하전의 측면에서 3 등급으로 평가됨

(-: 어려움, +: 용이함, ++: 대단히 용이함)

실험예 6

실시예 2 (2) 및 비교예 1 (2) 에서 제조된 hGH 를 포함하는 마이크로캡슐을 사용함으로써, 하기 시험을 수행하였다.

(1) hGH 함량

상기 실험예 1 (1) 에 기재된 바와 같은 방법에 따라, 각 마이크로캡슐의 hGH 포획비를 평가하였다. 그 결과가 표 7 에 나와 있다.

표 7 의 결과로부터 분명히 이해되는 것처럼, 암모늄 아세테이트 없이 제조된 hGH 분말을 사용함으로써 제조되는 마이크로캡슐 (hGH 포함) 과 비교하여, 암모늄 아세테이트를 사용하여 제조된 hGH 분말을 사용함으로써 제조되는 마이크로캡슐 (hGH 포함) 은 더 큰 hGH 포획비를 나타내었다.

(2) 초기 방출

하기 언급된 방법에 따라, 마이크로캡슐의 초기 방출비가 계산되었다. 그 결과가 또한 표 7 에 나와 있다.

hGH 수용액 (농도: 5, 10, 20 mg/kg) 를 면역 억제된 SD 랫트 (수컷, 생후 6 주) 에 피하 투여하였다. 그 후, 투여 후 24 시간까지 시간이 지남에 따라, 랫트 혈액을 연속적으로 수집하였다. 각 수용액 내에, 랫트 혈액의 혈장 중 hGH 의 농도를 방사선면역측정법 (Ab beads HGH: Eiken Kagaku Co.) 에 의해 측정하였다. 각 수용액의 수득된 AUC 값에 기재하여, 투여 용량 및 AUC 의 보정 곡선을 얻었다.

마이크로캡슐을 면역 억제된 SD 랫트 (수컷, 생후 6 주) 에 피하 투여하였다 (hGH 의 양으로서 6 mg/랫트). 그 후, 투여 후 24 시간까지 시간이 지남에 따라, 랫트 혈액을 연속적으로 수집하였다. 혈장 중 hGH 의 농도를 방사선면역분석법 (EIKEN CHEMICAL CO., LTD. 로부터 상품명 Ab beads HGH 로 시판됨) 으로 측정하여, hGH 방출 프로파일을 평가하였다. 수득된 AUC 값을 투여 용량 및 AUC 의 상기 보정 곡선에 적용하여, hGH 의 초기 방출량을 구한 후, 그것으로부터 초기 방출비를 계산하였다.

첨가된 암모늄 아세테이트의 양	hGH 포획비	초기 방출비
10 배 몰	100 %	11.0 %
20 배 몰	92 %	11.8 %
25 배 몰	95 %	19.8 %
40 배 몰	85 %	20.0 %
50 배 몰	83 %	23.3 %
70 배 몰	82 %	29.5 %
100 배 몰	70 %	48.7 %
암모늄 아세테이트를 사용하지 않은 경우	77 %	41.7 %

(3) 생체 내 방출 프로파일

상기 실험예 1 (2) 에 기재된 바와 같은 방법에 따라, 마이크로캡슐의 hGH 방출 프로파일을 면역 억제된 SD 랫트를 사용함으로써 평가하였다. 그 결과가 도 2 에 나와 있다.

도 2 의 결과로부터 분명히 이해되는 것처럼, 암모늄 아세테이트 없이 제조된 hGH 분말을 사용함으로써 제조되는 마이크로캡슐 (hGH 포함) 에 있어서, 초기 방출 (투여 후 1 일 (24 시간) 동안 방출된 hGH 의 양) 은 적으나, 연속 농도 (즉, 초기 방출을 제외한 투여 후 2 주 동안 방출된 hGH 의 양) 은 많았다. 즉, 암모늄 아세테이트를 사용하여 제조된 hGH 분말에 의해, 초기 방출은 감소하였고, 2 주 동안 고농도의 혈중 hGH 를 수득하였다.

본 발명에 따라, 제형물을 제조하기 위한 방법에서, 생리학적으로 활성인 폴리펩티드 분말의 취급의 용이함이 향상되고, 공업적으로 대규모로 서방 제제를 제조하는 것이 가능하다. 또한, 장기간 높고 안정적인 농도의 혈중 활성 성분, 및 생리학적으로 활성인 폴리펩티드의 낮은 초기 방출비를 나타내는 서방 제제를 제공한다. 본 방법은 서방 제제 내에 생리학적으로 활성인 폴리펩티드의 포획비를 향상시킨다.

Claims (36)

1. 생리학적으로 활성인 폴리펩티드를 생분해성 중합체의 유기 용매 용액 내에 분산시키고, 유기 용매를 제거하는 것을 포함하는 서방 제제의 제조 방법으로서, 상기 폴리펩티드는 수-혼화성 유기 용매 및/또는 휘발성염을 갖는 폴리펩티드의 수용액을 동결건조시킴으로써 수득된 분말인 방법.
2. 제 1 항에 있어서, 분말의 평균 입자 크기가 10 ㎛ 이하인 방법.
3. 제 1 항에 있어서, 생리학적으로 활성인 폴리펩티드가 성장 호르몬인 방법.
4. 제 3 항에 있어서, 성장 호르몬이 인간의 성장 호르몬인 방법.
5. 제 1 항에 있어서, 수-혼화성 유기 용매가 알코올인 방법.
6. 제 5 항에 있어서, 알코올이 메탄올 또는 에탄올인 방법.
7. 제 5 항에 있어서, 알코올이 에탄올인 방법.
8. 제 1 항에 있어서, 휘발성염이 암모늄염인 방법.
9. 제 8 항에 있어서, 암모늄염이 암모늄 아세테이트, 암모늄 비카르보네이트 또는 암모늄 카르보네이트인 방법.
10. 제 8 항에 있어서, 암모늄염이 암모늄 아세테이트인 방법.
11. 제 5 항에 있어서, 생리학적으로 활성인 폴리펩티드의 수용액에 첨가된 알코올의 최종 농도가 0.03 내지 0.5 % (V/V) 인 방법.
12. 제 8 항에 있어서, 생리학적으로 활성인 폴리펩티드에 대한 암모늄염의 몰 비가 10 내지 80 인 방법.
13. 제 1 항에 있어서, 생분해성 중합체가 락트산/글리콜산 중합체인 방법.
14. 제 13 항에 있어서, 락트산/글리콜산 중합체의 락트산/글리콜산의 몰 비가 100/0 내지 40/60 인 방법.
15. 제 13 항에 있어서, 락트산/글리콜산 중합체의 중량 평균 분자량이 3,000 내지 50,000 인 방법.
16. 제 13 항에 있어서, 락트산/글리콜산 중합체가 다가 금속염의 형태인 방법.
17. 제 16 항에 있어서, 다가 금속이 아연인 방법.
18. 제 1 항에 있어서, 서방 제제가 마이크로캡슐인 방법.
19. 제 18 항에 있어서, 마이크로캡슐의 평균 입자 크기가 0.1 ㎛ 내지 300 ㎛ 인 방법.
20. 제 1 항에 있어서, 서방 제제가 주사용인 방법.
21. 제 1 항에 따른 방법에 의해 제조된 서방 제제.
22. 생리학적으로 활성인 폴리펩티드의 수용액에 (1) 수-혼화성 유기 용매 및/또는 (2) 휘발성염을 첨가하고, 생성된 용액을 동결건조시키는 것을 포함하는 생리학적으로 활성인 폴리펩티드 분말의 제조 방법.
23. 제 22 항에 따른 방법에 의해 수득되는 생리학적으로 활성인 폴리펩티드 분말.
24. 제 23 항에 있어서, 분말의 평균 입자 크기가 10 ㎛ 이하인 생리학적으로 활성인 폴리펩티드 분말.
25. 의약품의 제조를 위한, 제 23 항에 따른 생리학적으로 활성인 폴리펩티드 분말의 용도.
26. 작은 입자 크기를 갖는 생리학적으로 활성인 폴리펩티드 분말을 제조하기 위한, (1) 수-혼화성 유기 용매 및/또는 (2) 휘발성염의 용도.
27. 제 26 항에 있어서, 입자 크기가 10 ㎛ 이하인 (1) 수-혼화성 유기 용매 및/또는 (2) 휘발성염의 용도.
28. 제 1 항에 청구된 방법에 의해 수득된 서방 제제.
29. 초기 방출비가 40 % 이하인, 생리학적으로 활성인 폴리펩티드 및 생분해성 중합체의 다가 금속염을 포함하는 서방 제제.
30. 제 29 항에 있어서, 생리학적으로 활성인 폴리펩티드가 10 ㎛ 이하의 평균 입자 크기를 갖는 분말의 형태인 서방 제제.
31. 제 29 항에 있어서, 생리학적으로 활성인 폴리펩티드가 성장 호르몬인 서방 제제.
32. 제 29 항에 있어서, 생분해성 중합체가 락트산/글리콜산 중합체인 서방 제제.
33. 제 29 항에 있어서, 서방 제제가 마이크로캡슐인 서방 제제.
34. 제 33 항에 있어서, 마이크로캡슐의 평균 입자 크기가 0.1 내지 300 ㎛ 인 서방 제제.
35. 제 29 항에 있어서, 1 주 내지 1 개월의 기간 동안 생리학적으로 활성인 폴리펩티드를 효과적으로 방출할 수 있는 서방 제제.
36. 제 29 항에 있어서, 0.1 % 내지 30 % (W/W) 의 생리학적으로 활성인 폴리펩티드를 포함하는 서방 제제.