JP4758525B2 - 生理活性ポリペプチドの徐放性製剤およびその製造法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、生理活性ポリペプチドを含有する徐放性製剤およびその製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
生理活性ポリペプチドは、生体において種々の薬理作用を示すことが知られており、このうちいくつかについては遺伝子工学、細胞工学の手法の発達により大腸菌、酵母、動物細胞あるいはヤギ、ハムスター等の生体を用いて大量に生産され、医薬品としての応用が図られている。しかしながら、これらの生理活性ポリペプチドは一般的に生体内での半減期が短いために、頻回投与が必要であり、注射に伴う患者の肉体的負担は無視できないものがある。
例えば、成長ホルモン（以下、ＧＨと略記することがある）は、元来下垂体前葉で産生・分泌される代表的なホルモンで、身体の成長促進に働くほか、糖・脂質代謝、蛋白同化、細胞増殖や分化に関与する等、幅広く多彩な生理作用を有する生理活性ポリペプチドであり、現在では遺伝子組換え技術を用いて大腸菌により大量生産され、医薬品として全世界で広く臨床応用されているが、ＧＨは生体内半減期が短く、有効血中濃度を維持するためには頻回投与が必要であり、特に下垂体性小人症の場合には、乳幼児あるいは若年患者に対して数カ月から１０年以上の長期に亘る連日皮下投与がなされているのが実情である。
【０００３】
特開平８−３０５５号公報（ＥＰ−Ａ−６３３０２０）には、水溶性ポリペプチドを生体内分解性ポリマーと脂肪酸金属塩とからなる生体内分解性マトリックスに水中で浸透させる徐放性製剤の製造法及び該製造法で調製された徐放性マイクロカプセルが開示されている。
特開平８−２１７６９１号公報（ＷＯ ９６／０７３９９）には、水溶性ペプチド性生理活性物質を塩化亜鉛水溶液等により水不溶性ないし水難溶性多価金属塩とし、これと生体内分解性ポリマーとを含有してなる徐放性製剤の製造法が開示されている。
ＷＯ ９４／１２１５８には、ヒトＧＨ（以下、ｈＧＨと略記することがある）と生体分解性ポリマーとの徐放性製剤の製造法として、ポリマーに対して０.１ないし３０％（Ｗ／Ｗ）の水酸化亜鉛等のポリマー分解促進剤をポリマー溶液に加えることができるとの記載がある。また、ｈＧＨとポリマーとを含有する有機溶媒溶液を液体窒素中に噴霧し多孔性粒子として生物活性を保持した形で徐放性マイクロカプセルを調製する方法が開示されている。
また、ＷＯ ９２／１７２００及びネイチャー メディシン（Nature Medicine）, 第２巻, ７９５頁（１９９６）には、ｈＧＨの亜鉛塩を用いる徐放性製剤の製造法が開示されている。
更に、ＷＯ ９５／２９６６４には、炭酸亜鉛等の金属塩を固体状でポリマー溶液に分散させた後、生理活性物質（ホルモン等）を添加し、生理活性物質と金属カチオンとを別々に生体分解性ポリマーに分散させてなる徐放性マイクロカプセルの製造法が開示されている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
前記のように生理活性ポリペプチドの生理活性を保持しながら徐放性製剤を製造する試みは種々なされているものの、生理活性ポリペプチドによっては、製剤内への生理活性ポリペプチドの取り込み率が低い、投与初期の過剰放出がある、長期にわたる安定した放出性が達成されない、十分な血中濃度が長期にわたって保持できない等の点で、未だ臨床上満足すべき製剤は得られていない。また、製造法においても大量生産を前提とする工業化に合致しないのが現状である。
生理活性ポリペプチド粉体（固相：以下、Ｓ相と略記することがある）を、ポリマーを溶解した有機溶媒（Ｏ相）に直接添加し分散させた、いわゆるＳ／Ｏエマルションを用いて徐放性製剤を製造する方法においては、比較的安定に生理活性ポリペプチドを封入することが可能であるが、一方で製剤工程において大量の生理活性ポリペプチド粉体を固体として効率的に取り扱う必要があり、更にはＳ／Ｏ分散液中の粉体粒径が、得られる徐放性製剤の品質に大きく影響するため、その制御が必須である等、製造上の問題が数多くある。
従って、製剤化工程中での生理活性ポリペプチドの安定性の保持、操作性のよい粉体の作成、粉体の微粒化等を全て満たし、しかも収率の良い、安定した品質の徐放性製剤および該徐放性製剤を大量生産できる製造法が望まれている。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは前記の問題点を解決するため鋭意研究を進め、生理活性ポリペプチド水溶液に水混和性の有機溶媒及び／又は揮発性の塩類を添加後、凍結乾燥することにより、予想外にも当該ポリペプチドの生理活性を保持したまま、製剤化工程において操作性がよく、しかも粒子径の小さな生理活性ポリペプチド粉体が得られることを初めて見出した。更に、このようにして得られた生理活性ポリペプチド粉体を、生体内分解性ポリマーの有機溶媒液に分散させた後、有機溶媒を除去して徐放性製剤を製造すると、意外にも徐放性製剤における生理活性ポリペプチドの封入率及び徐放性が改善されることを見出し、これらに基づいて本発明を完成した。
【０００６】
すなわち、本発明は、
（１）生理活性ポリペプチド水溶液に、水混和性の有機溶媒及び／又は揮発性の塩類を添加後、凍結乾燥して得られる生理活性ポリペプチド粉体を、生体内分解性ポリマーの有機溶媒液に分散させた後、有機溶媒を除去することを特徴とする徐放性製剤の製造法、
（２）生理活性ポリペプチド粉体が平均粒子径が１０μm以下のものである前記（１）記載の製造法、
（３）生理活性ポリペプチドが成長ホルモンである前記（１）記載の製造法、
（４）成長ホルモンがヒト成長ホルモンである前記（３）記載の製造法、
（５）水混和性の有機溶媒がアルコールである前記（１）記載の製造法、
（６）アルコールがメタノール又はエタノールである前記（５）記載の製造法、
（７）アルコールがエタノールである前記（５）記載の製造法、
（８）揮発性の塩類がアンモニウム塩である前記（１）記載の製造法、
（９）アンモニウム塩が酢酸アンモニウム、重炭酸アンモニウム又は炭酸アンモニウムである前記（８）記載の製造法、
（１０）アンモニウム塩が酢酸アンモニウムである前記（８）記載の製造法、
（１１）生理活性ポリペプチド水溶液に対する濃度が０.０３％（Ｖ／Ｖ）ないし０.５％（Ｖ／Ｖ）になる様にアルコールが添加される前記（５）記載の製造法、
（１２）生理活性ポリペプチドに対するモル比が１０倍ないし８０倍のアンモニウム塩が添加される前記（８）記載の製造法、
（１３）生体内分解性ポリマーが乳酸−グリコール酸重合体である前記（１）記載の製造法、
（１４）乳酸−グリコール酸重合体の乳酸／グリコール酸組成比（モル％）が１００／０ないし４０／６０である前記（１３）記載の製造法、
（１５）乳酸−グリコール酸重合体の重量平均分子量が３,０００ないし５０,０００である前記（１３）記載の製造法、
（１６）乳酸−グリコール酸重合体が多価金属塩である前記（１３）記載の製造法、
（１７）多価金属が亜鉛である前記（１６）記載の製造法、
（１８）徐放性製剤がマイクロカプセルである前記（１）記載の製造法、
（１９）マイクロカプセルの平均粒子径が０.１μmないし３００μmである前記（１８）記載の製造法、
（２０）徐放性製剤が注射用である前記（１）記載の製造法、
（２１）前記（１）記載の製造法により製造される徐放性製剤、
（２２）生理活性ポリペプチド水溶液に、水混和性の有機溶媒及び／又は揮発性塩類を添加後、凍結乾燥することを特徴とする生理活性ポリペプチド粉体の製造法、
（２３）前記（２２）記載の製造法により得られる生理活性ポリペプチド粉体、
（２４）生理活性ポリペプチド粉体が平均粒子径１０μm以下である前記（２３）記載の生理活性ポリペプチド粉体、
（２５）医薬製剤を製造するための、前記（２３）記載の生理活性ポリペプチド粉体の使用、
（２６）粒径の小さな生理活性ポリペプチド粉体を製造するための水混和性の有機溶媒及び／又は揮発性の塩類の使用
（２７）生理活性ポリペプチド粉体が平均粒子径が１０μm以下である前記（２６）記載の使用。
（２８）請求項１記載の製造法により得られうる徐放性製剤。
（２９）生理活性ポリペプチドの初期放出率が４０％以下である、生理活性ポリペプチドと生体内分解性ポリマーの多価金属塩を含有する徐放性製剤、
（３０）生理活性ポリペプチドが平均粒子径が１０μm以下の粉体である前記（２９）記載の徐放性製剤、
（３１）生理活性ポリペプチドが成長ホルモンである前記（２９）記載の徐放性製剤、
（３２）生体内分解性ポリマーが乳酸−グリコール酸重合体である前記（２９）記載の徐放性製剤、
（３３）徐放性製剤がマイクロカプセルである前記（２９）記載の徐放性製剤、
（３４）マイクロカプセルの平均粒子径が０.１ないし３００μmである前記（３３）記載の徐放性製剤、
（３５）１週間ないし１ヶ月型徐放性製剤である前記（２９）記載の徐放性製剤、
および
（３６）０．１ないし３０％（Ｗ／Ｗ）の生理活性ポリペプチドを徐放性製剤中に含有する前記（２９）記載の徐放性製剤等に関する。
【０００７】
本発明に用いられる生体内分解性ポリマーとしては、例えばα-ヒドロキシカルボン酸類（例えば、グリコール酸、乳酸等）、ヒドロキシジカルボン酸類（例えば、リンゴ酸等）、ヒドロキシトリカルボン酸（例えば、クエン酸等）等の１種以上から無触媒脱水重縮合で合成され、遊離のカルボキシル基を有する重合体あるいはこれらの混合物、ポリ-α-シアノアクリル酸エステル、ポリアミノ酸（例えば、ポリ-γ-ベンジル-L-グルタミン酸等）、無水マレイン酸系重合体（例えば、スチレン-マレイン酸重合体等）等が挙げられる。これらはホモポリマーまたはコポリマーのいずれであってもよい。重合の形式は、ランダム、ブロック、グラフトのいずれでもよい。また、上記のα-ヒドロキシカルボン酸類、ヒドロキシジカルボン酸類、ヒドロキシトリカルボン酸類が分子内に光学活性中心を有する場合、Ｄ−，Ｌ−，ＤＬ−体のいずれも用いることができる。
これらの中では、末端に遊離のカルボキシル基を有する生体内分解性ポリマー、例えばα-ヒドロキシカルボン酸類（例えば、グリコール酸、乳酸等）から合成された重合体（例えば、乳酸重合体、乳酸−グリコール酸共重合体等）、ポリ-α-シアノアクリル酸エステル等が好ましい。
生体内分解性ポリマーとしては、更に好ましくはα-ヒドロキシカルボン酸類から合成された重合体等、特に好ましくは乳酸-グリコール酸重合体等である。
【０００８】
本明細書においては、ポリ乳酸、ポリグリコール酸等の単重合体のみならず乳酸-グリコール酸共重合体も含めて、単に乳酸-グリコール酸重合体と称することがある。
生体内分解性ポリマーとして乳酸-グリコール酸重合体（乳酸-グリコール酸共重合体又は単重合体）を用いる場合、その組成比（モル％）は約１００／０ないし約４０／６０が好ましく、約８５／１５ないし約５０／５０が更に好ましい。
乳酸-グリコール酸重合体の重量平均分子量は、約３，０００ないし約５０，０００が好ましく、約３，０００ないし約２５，０００がより好ましく、約５，０００から約２０，０００が更に好ましい。
乳酸-グリコール酸重合体の分散度（重量平均分子量／数平均分子量）は約１.２ないし約４.０が好ましく、約１.５ないし約３.５が更に好ましい。
【０００９】
なお、本明細書での重量平均分子量及び分散度に関し、前者は重量平均分子量が１２０，０００、５２，０００、２２，０００、９，２００、５，０５０、２，９５０、１，０５０、５８０、１６２の９種類のポリスチレンを基準物質としてゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）で測定したポリスチレン換算の値、後者はこの値から算出した値である。測定は、ＧＰＣカラムＫＦ８０４Ｌ ｘ ２（昭和電工製）、ＲＩモニター Ｌ-３３００（日立製作所製）を使用し、移動相としてクロロホルムを用いて行う。
【００１０】
また、末端に遊離のカルボキシル基を有する生体内分解性ポリマーとは、末端基定量による数平均分子量と上記のＧＰＣ測定による数平均分子量がほぼ一致するポリマーであり、末端基定量による数平均分子量は以下のようにして算出される。
約１ｇないし約３ｇの生体内分解性ポリマーをアセトン(２５ml)とメタノール(５ml)との混合溶媒に溶解し、フェノールフタレインを指示薬としてこの溶液中のカルボキシル基を０.０５Ｎアルコール性水酸化カリウム溶液で、室温（２０℃）で撹拌下、速やかに滴定して末端基定量による数平均分子量を次式で算出した。
末端基定量による数平均分子量＝２００００×Ａ／Ｂ
Ａ：生体内分解性ポリマーの質量（ｇ）
Ｂ：滴定終点までに添加した０.０５Ｎアルコール性水酸化カリウム溶液 (ml)
末端基定量による数平均分子量が絶対値であるのに対して、ＧＰＣ測定による数平均分子量は、各種分析・解析条件（例えば、移動相の種類、カラムの種類、基準物質、スライス幅の選択、ベースラインの選択等）によって変動する相対値であるため、一義的な数値化は困難であるが、両測定による数平均分子量がほぼ一致するとは、例えば、α−ヒドロキシカルボン酸類から合成された重合体において、末端基定量による数平均分子量がＧＰＣ測定による数平均分子量の約０.５倍から約２倍の範囲内であること、好ましくは約０.７倍から約１.５倍の範囲内であることをいう。
例えば、１種類以上のα-ヒドロキシカルボン酸類から無触媒脱水重縮合法で合成され、末端に遊離のカルボキシル基を有する重合体では、ＧＰＣ測定による数平均分子量と末端基定量による数平均分子量とがほぼ一致する。これに対し、環状二量体から触媒を用いて開環重合法で合成され、末端に遊離のカルボキシル基を本質的には有しない重合体では、末端基定量による数平均分子量がＧＰＣ測定による数平均分子量の約２倍以上に大きく上回る。この相違によって末端に遊離のカルボキシル基を有する重合体は、末端に遊離のカルボキシル基を有しない重合体と明確に区別することができる。
【００１１】
末端に遊離のカルボキシル基を有する乳酸-グリコール酸重合体は、自体公知の製造法、例えば特開昭６１−２８５２１号公報に記載の方法（例えば無触媒下の脱水重縮合反応又は無機固体酸触媒下での脱水重縮合反応による製造方法等）に従って製造することができる。
乳酸-グリコール酸重合体の分解・消失速度は、組成比あるいは重量平均分子量によって大きく変化するが、一般的にはグリコール酸分率が低いほど分解・消失が遅いため、グリコール酸分率を低くするかあるいは分子量を大きくすることによって放出期間を長くすること（例えば、約６ヶ月）ができる。逆に、グリコール酸分率を高くするあるいは分子量を小さくすることによって放出期間を短くこと（例えば、約１週間）もできる。例えば、１週間ないし２ヶ月型徐放性製剤とするには、前記組成比及び重量平均分子量の範囲の乳酸-グリコール酸重合体を用いるのが好ましい。
【００１２】
従って、本発明において用いる生体内分解性ポリマーの組成は、目的とする生理活性ポリペプチドの種類、所望の徐放期間等に応じて、適宜選択されることが好ましい。その具体例としては、例えば、生理活性ポリペプチドとしてＧＨを用いる場合、乳酸−グリコール酸重合体を用いることが好ましく、該乳酸−グリコール酸重合体としては、その乳酸／グリコール酸組成比（モル％）が約８５／１５ないし約５０／５０の乳酸−グリコール酸共重合体が好ましく、更に好ましくは約７５／２５ないし約５０／５０の乳酸−グリコール酸共重合体である。またその重量平均分子量は約８,０００ないし約２０,０００が好ましく、更に好ましくは約１０,０００ないし約２０,０００である。また、乳酸−グリコール酸重合体の分散度（重量平均分子量／数平均分子量）は約１.２ないし約４.０が好ましく、更に好ましくは約１.５ないし約３.５である。
用いる乳酸−グリコール酸重合体は、前記公報記載の方法等、公知の方法に従い製造できる。該重合体は無触媒脱水重縮合で製造されたものが好ましい。前記ＧＰＣ測定法による数平均分子量と末端基定量法による数平均分子量とが、ほぼ一致する乳酸−グリコール酸重合体(ＰＬＧＡ）を用いることが好ましい。
また、該重合体は組成比及び／または重量平均分子量の異なる２種の乳酸−グリコール酸重合体を任意の割合で混合して用いてもよい。このような例としては、組成比（乳酸／グリコール酸）（モル％）が約７５／２５で重量平均分子量が約１０,０００の乳酸−グリコール酸共重合体と、組成比（乳酸／グリコール酸）（モル％）が約５０／５０で重量平均分子量が約１２,０００の乳酸−グリコール酸共重合体との混合物等が用いられる。混合する際の重量比は、好ましくは約２５／７５ないし約７５／２５である。
【００１３】
また、本発明で用いる生体内分解性ポリマーは、前記した生体内分解性ポリマーの金属塩であってもよく、例えば、ＷＯ９７／０１３３１号公報に記載の各種生体内分解性ポリマーの多価金属塩等が用いられる。好ましくは乳酸−グリコール酸重合体の多価金属塩（さらに好ましくは亜鉛塩，カルシウム塩，マグネシウム塩等、より好ましくは亜鉛塩等）等が用いられる。該多価金属塩の金属種としては、生体に悪影響を及ぼさない化合物であれば特に限定されず、例えば２価（例、鉄、亜鉛、銅、カルシウム、マグネシウム、アルミニウム、スズ、マンガン等）、３価（例、鉄、アルミニウム、マンガン等）、４価（例、スズ等）などの多価金属も用いることができる。
本明細書においては、生体内分解性ポリマーが金属塩の場合も含めて生体内分解性ポリマーと称することがあり、例えば乳酸−グリコール酸重合体が多価金属塩の場合も乳酸-グリコール酸重合体と称することがある。
これらの生体内分解性ポリマーの多価金属塩はＷＯ９７／０１３３１号公報に記載の方法及びこれに準じる方法により製造することができる。
また、生体内分解性ポリマーの多価金属塩が亜鉛塩の場合には、生体内分解性ポリマーと酸化亜鉛とを有機溶媒中で反応させることによって製造することもできる。
該製造法においては、まず生体内分解性ポリマーと酸化亜鉛とを有機溶媒中に共存させて、生体内分解性ポリマー・酸化亜鉛体の有機溶媒溶液を製造する。この際、生体内分解性ポリマーの溶液中濃度は分子量、有機溶媒等の種類によって異なるが、例えば約０.１ないし約８０％（Ｗ／Ｗ）、好ましくは約１ないし約７０％（Ｗ／Ｗ）、更に好ましくは約２ないし約６０％（Ｗ／Ｗ）である。また、添加する酸化亜鉛量は、特開平１０−２３１２５２号公報に記載されたように、有機溶媒の種類によって異なるが、例えば生体内分解性ポリマー量の約０.００１ないし約２％（Ｗ／Ｗ）、好ましくは約０.０１ないし約１.５％（Ｗ／Ｗ）、更に好ましくは約０.１ないし約１％（Ｗ／Ｗ）である。
有機溶媒への生体内分解性ポリマー及び酸化亜鉛の添加順序は、生体内分解性ポリマーの有機溶媒溶液に酸化亜鉛を粉末状であるいは該有機溶媒に懸濁した状態で添加してもよく、逆に酸化亜鉛の有機溶媒懸濁液中に生体内分解性ポリマーの有機溶媒溶液を添加してもよい。また、両者を粉末状で混和後、有機溶媒を添加してもよい。
【００１４】
本発明における生理活性ポリペプチドとしては、好ましくは分子量約１,０００ないし約５０,０００、更に好ましくは分子量約５,０００ないし約４０,０００の生理活性ポリペプチドが用いられる。
生理活性ポリペプチドの活性として代表的なものとしては、ホルモン作用が挙げられる。該生理活性ポリペプチドは天然物、合成物、半合成物のいずれでもよく、更にそれらの誘導体ないし類縁体でもよい。該生理活性ポリペプチドの作用機作は、作動性あるいは拮抗性のいずれでもよい。
本発明における生理活性ポリペプチドとしては、例えばペプチドホルモン、サイトカイン、ペプチド性神経伝達物質、造血因子、各種増殖因子、酵素、ポリペプチド系抗生物質、鎮痛性ペプチド等が用いられる。
ペプチドホルモンとしては、例えばインスリン、ソマトスタチン、ソマトスタチン誘導体（サンドスタチン，米国特許第４,０８７,３９０号，同第４,０９３,５７４号，同第４,１００,１１７号，同第４,２５３,９９８号参照）、成長ホルモン（ＧＨ）、ナトリウム利尿ペプチド、ガストリン、プロラクチン、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）、ＡＣＴＨ誘導体（エビラタイド等）、メラノサイト刺激ホルモン（ＭＳＨ）、甲状腺ホルモン放出ホルモン（ＴＲＨ）、その塩及びその誘導体（特開昭５０−１２１２７３号、特開昭５２−１１６４６５号公報参照）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、ヒト絨毛ゴナドトロピン（ＨＣＧ）、サイモシン（チモシン）、モチリン、バソプレシン、バソプレシン誘導体｛デスモプレシン〔日本内分泌学会雑誌，第５４巻 第５号 第６７６ないし６９１頁（１９７８）〕参照｝、オキシトシン、カルシトニン、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、グルカゴン、セクレチン、パンクレオザイミン、コレシストキニン、アンジオテンシン、ヒト胎盤ラクトーゲン等が用いられる。ペプチドホルモンとしては、好ましくはインスリン及び成長ホルモン等である。
サイトカインとしては、例えばリンホカイン、モノカイン等が用いられる。リンホカインとしては、例えばインターフェロン類（アルファ型、ベータ型、ガンマ型等）、インターロイキン類（例えば、ＩＬ−２，３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２等）等が用いられる。モノカインとしては、例えばインターロイキン−１（ＩＬ−１）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）等が用いられる。サイトカインとしては、好ましくはリンホカイン等、更に好ましくはインターフェロン等、特に好ましくはインターフェロンアルファ等である。
ペプチド性神経伝達物質としては、例えばサブスタンスＰ、セロトニン、ＧＡＢＡ等が用いられる。
【００１５】
造血因子としては、例えばエリスロポエチン（ＥＰＯ）、コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ，ＧＭ−ＣＳＦ，Ｍ−ＣＳＦ等）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、血小板増殖刺激因子、メガカリオサイトポテンシエーター等が用いられる。
各種増殖因子としては、例えば塩基性あるいは酸性の繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）あるいはこれらのファミリー（例えば、ＥＧＦ、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、ＰＤＧＦ，酸性ＦＧＦ，塩基性ＦＧＦ、ＦＧＦ−９等）、神経細胞増殖因子（ＮＧＦ）あるいはこれらのファミリー（例えば、ＢＤＮＦ、ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＣＮＴＦ、ＧＤＮＦ等）、インスリン様成長因子（例えば、ＩＧＦ−１，ＩＧＦ−２等）、骨増殖に関与する因子（ＢＭＰ）あるいはこれらのファミリー等が用いられる。
酵素としては、例えばスーパーオキシドディスミュターゼ（ＳＯＤ）、ウロキナーゼ、ティシュープラスミノーゲンアクティベーター（ＴＰＡ）、アスパラギナーゼ、カリクレイン等が用いられる。
ポリペプチド系抗生物質としては、例えばポリミキシンＢ、コリスチン、グラミシジン、バシトラシン等が用いられる。
鎮痛性ペプチドとしては、例えばエンケファリン、エンケファリン誘導体〔米国特許第４,２７７,３９４号，ヨーロッパ特許出願公開第３１５６７号公報参照〕，エンドルフィン、キョウトルフィン等が用いられる。
その他、生理活性ポリペプチドとしては、サイモポエチン、ダイノルフィン、ボムベシン、セルレイン、サイモスチムリン、胸腺液性因子（ＴＨＦ）、血中胸腺因子（ＦＴＳ）及びその誘導体（米国特許第４,２２９,４３８号参照）、及びその他の胸腺因子〔医学のあゆみ、第１２５巻，第１０号，８３５−８４３頁（１９８３年）〕、ニューロテンシン、ブラジキニン及びエンドセリン拮抗作用を有するペプチド類（ヨーロッパ特許公開第４３６１８９号，同第４５７１９５号，同第４９６４５２号，特開平３−９４６９２号，同３−１３０２９９号公報参照）等が挙げられる。
本発明に特に好ましく適用される生理活性ポリペプチドとしては、成長ホルモン、インスリン等が挙げられ、中でも成長ホルモン、とりわけヒト成長ホルモンが好ましい。
【００１６】
本発明において、生理活性ポリペプチドが金属を含有する場合、その金属含有量は０.１％（ｗ／ｗ）以下が好ましく、更に好ましくは０.０１％（ｗ／ｗ）以下、特に好ましくは０.００１％（ｗ／ｗ）以下であって実質的に金属を含まない生理活性ポリペプチドが最適である。例えば結晶性インスリンは、通常亜鉛、ニッケル、コバルト、カドミウム等の少量の重金属を含んでいる。０.４％（ｗ／ｗ）亜鉛を含んでいるインスリンは６量体で存在し、それ自身で安定に存在し、生体内分解性高分子重合物の金属塩との相互作用が弱められると考えられる。
必要な場合には、生理活性ポリペプチドに含有されている金属を前もって除去しておいてもよく、金属を除去する方法としては公知の方法が用いられる。例えばインスリンの塩酸酸性水溶液を、水あるいは酢酸アンモニウム塩溶液に対して透析したのち凍結乾燥することによりアモルファス状態で金属が最小限のインスリンが得られる。
成長ホルモンとしては、いずれの種由来のものでも良いが、好ましくはヒト成長ホルモンである。また、脳下垂体等から抽出される天然由来も本発明に用いられるが、好ましくは遺伝子組換え型ＧＨ（特公平６−１２９９６号公報、特公平６−４８９８７号公報参照）であり、更に好ましくはＮ末端にメチオニンを有さない天然型と同じ構造を有する組換え型ｈＧＨである。該ＧＨとしては金属塩であってもよいが、実質的に金属を含有しないＧＨも用いられる。ｈＧＨとしては、分子量約２２Ｋダルトンのみならず、分子量約２０Ｋダルトンのもの（特開平７−１０１８７７号公報、特開平１０−２６５４０４号公報参照）を用いてもよい。また、ｈＧＨの誘導体あるいはその関連タンパク質（ＷＯ９９／０３８８７号公報参照）を用いてもよい。
【００１７】
生理活性ポリペプチドとしては、生体より抽出・精製されたもの、化学的に合成されたもの、あるいは遺伝子組換え法により作製されたもの等、いずれの方法によって作製されたものでも用いられるが、高純度の製品を大量に合成するためには遺伝子組換え法の利用が好ましい。また、いずれの方法を採用する場合においても、生理活性ポリペプチドを含有する組織・体液、化学合成粗調製物、あるいは組換え細胞・菌体より、それぞれ当該ポリペプチドを純化・精製する必要がある。この場合、一般的なペプチドあるいは蛋白の分離精製法が使用できるが（「タンパク質」、佐竹一夫著、朝倉書店；「生理活性ペプチド」、ファルマシアレビュー、No.3、日本薬学会）、特に幾つかの液体クロマトグラフィーを組み合わせることにより（「タンパク質・ペプチドの高速液体クロマトグラフィー」、宇井信生ら共編、化学同人）、高純度の生理活性ポリペプチドをその生理活性を損なうことなく収率よく得られる。また、所望により精製法の最終工程において、脱塩操作に供されることが好ましい。水溶液中での生理活性ポリペプチド濃度は、特に限定されないが、例えば０．０１％（Ｗ／Ｖ）ないし３０％（Ｗ／Ｖ）、好ましくは０．０３％（Ｗ／Ｖ）ないし１０％（Ｗ／Ｖ）、特に好ましくは０．０５％（Ｗ／Ｖ）ないし３％（Ｗ／Ｖ）等である。生理活性ポリペプチドがｈＧＨである場合、水溶液中でのｈＧＨ濃度は、好ましくは約０.０１ないし約５％（Ｗ／Ｖ）、より好ましくは約０.０５ないし約０．５％（Ｗ／Ｖ）である。
【００１８】
本発明において生理活性ポリペプチド水溶液に添加される水混和性の有機溶媒としては、例えばアルコール類（例えば、メタノール、エタノール、イソプロパノール等、好ましくはメタノール、エタノール等）、アセトン等が挙げられる。これらは適宜の割合で混合して用いてもよいが、好ましくはアルコール類、特にエタノールを単独で用いることが望ましい。また、生理活性ポリペプチド水溶液への添加量（濃度）は、体積比において約０.０３ないし０.５％（Ｖ／Ｖ）であり、好ましくは約０.０６ないし０.２５％（Ｖ／Ｖ）、更に好ましくは約０.１ないし０.１５％（Ｖ／Ｖ）である。このような水混和性の有機溶媒の添加により得られる生理活性ポリペプチド水溶液を、更に凍結乾燥することにより、取り扱いが容易で（操作性のよい）、かつ微細な（粒子径の小さな）生理活性ポリペプチド粉体が作成できる。
本発明において生理活性ポリペプチド水溶液に添加される揮発性の塩類としては、例えばアンモニウム塩（例えば酢酸アンモニウム、重炭酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、塩化アンモニウム等、好ましくは酢酸アンモニウム等）が挙げられる。これらは適宜の割合で混合して用いてもよい。揮発性の塩類の生理活性ポリペプチド水溶液への添加量は、モル比において約１０倍ないし約８０倍モルであり、好ましくは約１０倍ないし約７０倍モルであり、さらに好ましくは約１５倍ないし約７０倍モルであり、より好ましくは約２０倍ないし約７０倍モルであり、最も好ましくは約２０倍ないし約５０倍モルである。水混和性の有機溶媒を添加する場合と同様に、揮発性塩類の添加により得られる生理活性ポリペプチド水溶液を、更に凍結乾燥することにより、取り扱いが容易で（操作性のよい）、かつ微細な（粒子径の小さな）微細生理活性ポリペプチド粉体が作成できる。
本発明において、生理活性ポリペプチド水溶液に添加される水混和性の有機溶媒及び／又は揮発性の塩類は、単独で用いてもよいし、適宜組み合わせて用いてもよい。水混和性の有機溶媒及び揮発性の塩類を組み合せて用いる時は、上記のそれぞれの添加量に従って、生理活性ポリペプチド水溶液に添加することができる
上記の方法により得られた水混和性の有機溶媒及び／又は揮発性の塩類を含有する生理活性ポリペプチド水溶液は、本発明の凍結乾燥操作に供されるが、本操作としては医薬品・食品関係のみならず、水に関わるあらゆる分野で利用されている方法が使用される（「医薬品の開発」第11巻、仲井由宣編集、広川書店）。例えば生理活性ポリペプチド水溶液をバイアル又はアンプル内等に充填し、次いで水溶液を凍結後、乾燥処理に供する。この場合、機外で凍結した後、乾燥機に供してもよいが、通常は機内で十分な温度制御のもとに凍結するのが好ましい。また、乾燥操作においても段階的に実施することができる。近年の凍結乾燥機は、これらの温度制御又は真空制御が可能であり、対象とする生理活性ポリペプチドに最適の条件が選ばれる。凍結乾燥操作に供する水溶液中での生理活性ポリペプチド濃度は、特に限定されないが、例えば０．０１％（Ｗ／Ｖ）ないし３０％（Ｗ／Ｖ）、好ましくは０．０３％（Ｗ／Ｖ）ないし１０％（Ｗ／Ｖ）、特に好ましくは０．０５％（Ｗ／Ｖ）ないし３％（Ｗ／Ｖ）等である。生理活性ポリペプチドがｈＧＨである場合、水溶液中でのｈＧＨ濃度は、好ましくは約０.０１ないし約５％（Ｗ／Ｖ）、より好ましくは約０.０５ないし約０．５％（Ｗ／Ｖ）である。
【００１９】
本発明における生体内分解性ポリマーの溶解に用いる有機溶媒は、沸点１２０℃以下であることが好ましい。該有機溶媒としては、例えばハロゲン化炭化水素（例えば、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素等）、アルコール類（例えば、エタノール、メタノール、１,４−ブタンジオール、１,５−ペンタンジオール等）、酢酸エチル、アセトニトリル等が挙げられる。これらは適宜の割合で混合して用いてもよい。有機溶媒を単独で用いる場合、例えばジクロロメタン、アセトニトリル等が好ましい。有機溶媒を混合溶媒として用いる場合、例えばハロゲン化炭化水素（例えば、ジクロロメタン、クロロホルム等）と、アルコール類（例えば、エタノール、メタノール、１,４−ブタンジオール、１,５−ペンタンジオール等）あるいはアセトニトリルとの組み合わせが好ましい。特に、ジクロロメタンとアセトニトリルとの組み合わせが汎用される。ハロゲン化炭化水素と、アルコール類あるいはアセトニトリルとの混合比（体積比）は約４０：１ないし約１：１であり、好ましくは約２０：１ないし約１：１である。特に、ハロゲン化炭化水素（ジクロロメタン等）を単独、あるいはハロゲン化炭化水素とアセトニトリルとの９：１ないし１：１の混合溶媒を用いることが望ましい。また、生体内分解性ポリマーの溶液中濃度は分子量、有機溶媒等の種類によって異なるが、例えば約０.０１ないし約８０％（Ｗ／Ｗ）、好ましくは約０.１ないし約７０％（Ｗ／Ｗ）、更に好ましくは約１ないし約６０％（Ｗ／Ｗ）である。
【００２０】
本発明の徐放性製剤は、水混和性の有機溶媒及び／又は揮発性塩類を添加した生理活性ポリペプチド溶液を凍結乾燥して得られる粉体（Ｓ相）を、生体内分解性ポリマーを溶解した有機溶媒液（Ｏ相）に分散させた、Ｓ／Ｏ型分散液から溶媒を除去することにより製造される。その製造法としては、例えば（a）水中乾燥法（Ｓ／Ｏ／Ｗ法）、（b）相分離法（コアセルベーション法）及び（c）噴霧乾燥法、あるいはこれらに準じた方法等が挙げられる。以下に徐放性製剤として、例えばマイクロカプセルを製造する場合の製造方法について記述する。
（a）水中乾燥法（Ｓ／Ｏ／Ｗ法）
本法によれば、まず生理活性ポリペプチド水溶液に水混和性の有機溶媒及び／又は揮発性塩類を添加した後、凍結乾燥により生理活性ポリペプチド粉体（Ｓ相）を作成する。次に生体内分解性ポリマーを有機溶媒に溶解し、この有機溶媒液中に上記の生理活性ポリペプチド粉体を添加し分散させる。この際、生理活性ポリペプチドと生体内分解性ポリマーとの比率（重量比）は、例えば約１：１０００ないし約１：１、好ましくは約１：２００ないし約１：５、更に好ましくは約１：１００ないし約１：５である。また、生理活性ポリペプチド粉体を有機溶媒液中に均一に分散させるため、外部物理的エネルギーを加えることが好ましい。その方法としては例えば、超音波照射、タービン型撹拌器、ホモジナイザー等が用いられる。この時の有機溶媒液中での生理活性ポリペプチドの平均粒子径としては約１０μm以下、さらに好ましくは約０．１μmないし約１０μm、より好ましくは約０．５μmないし５μmであることが望ましく、本発明の製造法により得られた生理活性ポリペプチド粉体を用いることにより容易に達成される。本発明における生理活性ポリペプチドの平均粒子径は、ホモジナイザーを用いて該生理活性ポリペプチドをジクロロメタン等の有機溶媒中で分散した後に、レーザー解析式粒度分布測定装置（ＳＡＬＤ２０００Ａ：島津）により得られる値を示す。その際、生理活性ポリペプチドはジクロロメタン等の有機溶媒に、例えば約２０ないし１００mg／mlの濃度で添加後、ホモジナイザー（例えば、ポリトロン（キネマチカ社））を用いて約２０，０００ｒｐｍで約３０秒ないし１分間攪拌することにより分散液とされ、さらに上記粒度分布測定装置の測定可能な範囲となるように適宜、該有機溶媒で希釈し、供試される。
次いでこのようにして調製された有機溶媒分散液（Ｓ／Ｏ型分散液）を、更に水性溶媒（Ｗ相）中に添加して、上記と同様の外部物理的エネルギー、例えば超音波照射、タービン型撹拌器、あるいはホモジナイザー等によりＳ／Ｏ／Ｗ型エマルションを形成させる。以後、油相溶媒を蒸発させマイクロカプセルを製造する。この際の水相体積は、一般的には油相体積の約１倍ないし約１０,０００倍から選ばれる。更に好ましくは約２倍ないし約５,０００倍から選ばれる。特に好ましくは約５倍ないし約２,０００倍から選ばれる。
上記外水相中には、乳化剤を加えてもよい。該乳化剤としては、一般的に安定なＳ／Ｏ／Ｗエマルションを形成できるものであれば何れでもよい。乳化剤としては、例えばアニオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、ポリオキシエチレンヒマシ油誘導体、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、カルボキシメチルセルロース、レシチン、ゼラチン、ヒアルロン酸等が挙げられる。これらは適宜組み合わせて使用してもよい。外水相中の乳化剤の濃度は、好ましくは約０.００１％ないし２０％（ｗ／ｗ）である。更に好ましくは約０.０１％ないし１０％（ｗ／ｗ）、特に好ましくは約０.０５％ないし５％（ｗ／ｗ）である。
【００２１】
このようにして得られたマイクロカプセルは、遠心分離あるいは濾過操作により分取した後、マイクロカプセルの表面に付着している乳化剤等を蒸留水による洗浄で除去し、再び蒸留水等に分散して凍結乾燥する。その後必要であれば、加温してマイクロカプセル中の水分及び有機溶媒を更に除去する。減圧下に加温してもよい。加温条件としては、用いた生体内分解性ポリマーのガラス転移温度以上で、マイクロカプセルの各粒子が互いに付着しない程度の温度で加熱乾燥する。好ましくは、生体内分解性ポリマーのガラス転移温度からガラス転移温度より約３０℃高い温度の範囲で加熱乾燥する。ここでガラス転移温度とは、示差走査熱量計を用い、加温速度毎分１０ないし２０℃で昇温した際に得られる中間点を云う。
【００２２】
（b）相分離法（コアセルベーション法）
本法においては、前記（a）のＳ／Ｏ型分散液にコアセルベーション剤を撹拌下徐々に加えマイクロカプセルを析出、固化させる。該コアセルベーション剤は、上記分散液の約０.０１倍ないし約１,０００倍の体積量が加えられる。更に好ましくは、約０.０５倍ないし約５００倍、特に好ましくは約０.１倍ないし約２００倍の体積量である。コアセルベーション剤としては、生体内分解性ポリマーを溶解する有機溶媒と混和する高分子系、鉱物油系又は植物油系の化合物で使用した生体内分解性ポリマーを溶解しないものであればよい。具体的には、例えばシリコン油、ゴマ油、大豆油、コーン油、綿実油、ココナッツ油、アマニ油、鉱物油、ｎ−ヘキサン、ｎ−ヘプタン等が用いられる。これらは２種以上混合して用いてもよい。このようにして得られたマイクロカプセルを濾過分取した後、ヘプタン等により繰り返し洗浄してコアセルベーション剤を除去する。更に、前記（a）と同様に洗浄し、次いで凍結乾燥する。
水中乾燥法及びコアセルベーション法でのマイクロカプセルの製造では、粒子同士の凝集を防ぐために凝集防止剤を加えてもよい。該凝集防止剤としては、例えばマンニトール、ラクトース、ブドウ糖、デンプン類（例えば、コーンスターチ等）、ヒアルロン酸あるいはこのアルカリ金属塩等の水溶性多糖、グリシン、フィブリン、コラーゲン等の蛋白質、塩化ナトリウム、リン酸水素ナトリウム等の無機塩類等が適宜用いられる。
【００２３】
（c）噴霧乾燥法
本法においては、前記（a）のＳ／Ｏ型分散液を、ノズルを用いてスプレードライヤー（噴霧乾燥器）の乾燥室内へ噴霧し、極めて短時間に微粒化液滴内の有機溶媒を揮発させ、マイクロカプセルを製造する。該ノズルとしては、例えば二流体ノズル型、圧力ノズル型、回転ディスク型等がある。この際所望により、上記の分散液と同時に、マイクロカプセル粒子同志の凝集防止を目的として前記凝集防止剤の水溶液を別ノズルより噴霧することも有効である。このようにして得られたマイクロカプセルは、前記（a）と同様にして洗浄し、必要であれば加温（要すれば減圧下）により、水分及び有機溶媒を更に除去する。
【００２４】
本発明の徐放性製剤は微粒子状であることが好ましい。なぜならば徐放性製剤は、皮下あるいは筋肉内注射に通常使用される注射針を通して投与される方が、患者に対し過度の苦痛を与えることがないからである。該徐放性製剤の粒子径は、例えば平均粒子径として約０.１ないし３００μm、好ましくは約１ないし１５０μm、特に好ましくは約２ないし１００μmである。
本発明の徐放性製剤に含まれる生理活性ポリペプチドの含量は、例えば約０.１ないし３０％（Ｗ／Ｗ）、好ましくは約０.２ないし２０％（Ｗ／Ｗ）、更に好ましくは約０.５ないし１０％（Ｗ／Ｗ）である。該生理活性ポリペプチドの平均粒子径は好ましくは約１０μm以下、さらに好ましくは約０．１μmないし１０μm、より好ましくは約０．５μmないし５μmである。
また、本発明の徐放性製剤に含まれる生体内分解性ポリマーの含量は、例えば約３０ないし９９．９％（Ｗ／Ｗ）、好ましくは約６０ないし９７％（Ｗ／Ｗ）、さらに好ましくは約７０ないし９０％（Ｗ／Ｗ）である。
本発明の徐放性製剤の生理活性ポリペプチドの初期放出率［投与後１日（２４時間）までの放出率］は、好ましくは約４０％以下、さらに好ましくは約１ないし４０％、より好ましくは約３ないし３５％である。なお、該初期放出率は本発明の徐放性製剤皮下投与後２４時間までの血中濃度のＡＵＣ（Area Under the Concentration）を、生理活性ポリペプチド溶液皮下投与後２４時間までのＡＵＣから得られる投与量−ＡＵＣ直線に適用させることにより初期放出量が得られ、さらに初期放出率が算出される。
【００２５】
本発明の徐放性製剤は、例えばマイクロカプセルとして、あるいはマイクロカプセルを原料物質として種々の剤形に製剤化し、非経口剤（例えば、筋肉内、皮下、臓器等への注射剤又は埋め込み剤、鼻腔、直腸、子宮等への経粘膜剤等）、経口剤（例えば、カプセル剤（例えば、硬カプセル剤、軟カプセル剤等）、顆粒剤、散剤等の固形製剤、懸濁剤等の液剤等）等として投与することができる。
本発明の徐放性製剤は特に注射用であることが好ましい。例えば、徐放性製剤がマイクロカプセルである場合、マイクロカプセルを分散剤（例えば、Tween 80、HCO-60 等の界面活性剤、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ヒアルロン酸等の多糖類等）、保存剤（例えば、メチルパラベン、プロピルパラベン等）、等張化剤（例えば、塩化ナトリウム、マンニトール、ソルビトール、ブドウ糖等）等と共に水性懸濁剤とすることにより実用的な注射用徐放製剤が得られる。また、ゴマ油、コーン油等の植物油あるいはこれにレシチン等のりん脂質を混合したもの、あるいは中鎖脂肪酸トリグリセリド（例えば、ミグリオール８１２）と共に分散して油性懸濁剤として実際に使用できる徐放性注射剤とする。
【００２６】
徐放性製剤が例えばマイクロカプセルである場合、マイクロカプセルの粒子径は、懸濁注射剤として使用する場合には、その分散度、通針性を満足する範囲であればよく、例えば平均粒子径として約０.１ないし約３００μmの範囲が挙げられる。平均粒子径は、好ましくは約１ないし約１５０μm、特に好ましくは約２ないし約１００μmの範囲である。
上記したマイクロカプセルを無菌製剤にするには、製造全工程を無菌にする方法、ガンマ線で滅菌する方法、防腐剤を添加する方法等が挙げられるが、特に限定されない。
【００２７】
本発明の徐放性製剤は、低毒性で、哺乳動物（例えば、ヒト、牛、豚、犬、ネコ、マウス、ラット、ウサギ等）に対して安全に用いることができる。
徐放性製剤の適応は、使用する生理活性ポリペプチドにより種々異なる。生理活性ポリペプチドが、例えばインスリンである場合には、糖尿病等、インターフェロン−αである場合には、ウイルス性肝炎（例えば、Ｃ型肝炎、ＨＢe 抗原陽性活動性肝炎等）、癌（例えば、腎癌、多発性骨髄腫等）等、エリスロポエチンの場合には貧血（例えば、腎透析時貧血等）等、Ｇ−ＣＳＦの場合には好中球減少症（例えば、制ガン剤治療時）、感染症等、ＩＬ−２の場合には癌（例えば、血管内皮腫等）等、ＦＧＦの場合には骨折、創傷(床ずれ等)、歯周病、消化管潰瘍等、ＦＧＦ−９の場合には血小板減少症等、ＮＧＦの場合には老人性痴呆、神経病（ニューロパシー）等、ＴＰＡの場合には血栓症等、腫瘍壊死因子の場合には癌等の治療又は予防に有効である。また、ＧＨ含有徐放性製剤では、ＧＨの成長ホルモン作用に基づき、下垂体性小人症の他、ターナー症候群、慢性腎疾患、軟骨異栄養症、更には成人性下垂体不全症に適応できる。また、ＧＨはダウン症候群、シルバー症候群、骨形成不全症、あるいは若年性慢性関節症等の疾患にも適応され、有効な治療効果を得たとの報告もあり、ＧＨ含有徐放性製剤はこれらの疾患にも適応可能である。更にはうっ血性心不全症等の治療又は予防にも有効である。
【００２８】
徐放性製剤の投与量は、生理活性ポリペプチドの種類と含量、放出の持続時間、対象疾病、対象動物等によって種々異なるが、該生理活性ポリペプチドの有効濃度が体内で保持される量であればよい。該生理活性ポリペプチドの投与量としては、例えば徐放性製剤が２週間型製剤である場合、好ましくは成人１人当たり約０.０００１ないし約１０mg／kg体重の範囲から適宜選ぶことができる。更に好ましくは約０.０５ないし約１mg／kg体重の範囲から適宜選ぶことができる。投与回数は、１週間に１回、２週間に１回、１ヶ月に１回、２ヶ月に１回等、該生理活性ポリペプチドの種類と含量、剤型、放出の持続時間、対象疾病、対象動物等によって適宜選ぶことができる。好ましくは１週間ないし１ヶ月型徐放性製剤、さらに好ましくは１ないし３週間型徐放性製剤、より好ましくは１０ないし２０日型徐放性製剤、とりわけ好ましくは２週間型徐放性製剤が挙げられる。
徐放性製剤の有効成分である生理活性ポリペプチドが、例えばインスリンである場合には、糖尿病の成人に対する投与量は、有効成分として通常、約０.００１ないし約１mg／kg体重、好ましくは約０.０１ないし約０.２mg／kg体重の範囲から適宜選び、１週間に１回投与するのがよい。
【００２９】
徐放性製剤の有効成分である生理活性ポリペプチドが、ＧＨの場合には、投与量は、ＧＨの種類と含量、放出の持続時間、対象疾病、対象動物等によって種々異なるが、該ＧＨの有効濃度が体内で保持される量であればよい。前記した疾患の治療において、例えば徐放性製剤が２週間型製剤である場合、ＧＨの投与量は有効成分として、好ましくは、小児あるいは成人１人当たり約０.０１ないし約５mg／kg体重（約０．０３ないし約１５ ＩＵ／kg体重）の範囲から適宜選択して安全に投与することができる。更に好ましくは約０.０５ないし約１mg／kg体重（約０．１５ないし約３ ＩＵ／kg体重）の範囲から適宜選ぶことができる。投与回数は、１週間に１回、２週間に１回あるいは１ケ月に１回等、ＧＨ含量、剤型、放出の持続時間、対象疾病、対象動物等によって適宜選ぶことができる。好ましくは１週間ないし１ヶ月型徐放性製剤、さらに好ましくは１ないし３週間型徐放性製剤、より好ましくは１０ないし２０日型徐放性製剤、とりわけ好ましくは２週間型徐放性製剤が挙げられる。
徐放性製剤は、常温あるいは冷所に保存することが好ましい。徐放性製剤は、冷所に保存することが更に好ましい。ここでいう常温あるいは冷所とは、日本薬局方において定義されるものである。すなわち、常温とは１５ないし２５℃を、冷所とは１５℃以下を意味する。冷所のうち、とりわけ２ないし８℃が好ましい。
【００３０】
【発明の実施の形態】
以下に参考例、実施例、比較例及び試験例を挙げて、更に具体的に説明するが、これらは本発明を限定するものではない。また、本発明の明細書においてアミノ酸等の略号で表示する場合には、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Commission on Biochemical Nomenclature による略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、その例を下に示す。またアミノ酸に関して光学異性がある場合は、特に明示しなければＬ−体を示す。
ＳＤＳ ： ドデシル硫酸ナトリウム
Ｇly ： グリシン
Ａla ： アラニン
Ｖal ： バリン
Ｌeu ： ロイシン
Ｉle ： イソロイシン
Ｓer ： セリン
Ｔhr ： スレオニン
Ｃys ： システイン
Ｍet ： メチオニン
Ｇlu ： グルタミン酸
Ｇln ： グルタミン
Ａsp ： アスパラギン酸
Ａsn ： アスパラギン
Ｌys ： リジン
Ａrg ： アルギニン
Ｈis ： ヒスチジン
Ｐhe ： フェニルアラニン
Ｔyr ： チロシン
Ｔrp ： トリプトファン
Ｐro ： プロリン
Ａsx ： Ａsp ＋ Ａsn
Ｇlx ： Ｇlu ＋ Ｇln
【００３１】
【実施例】
参考例１ Ｔ７プロモーターを用いたヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）発現ベクターの構築
ｈＧＨの構造遺伝子はプラスミド pＨＧＨ１０７（特公平６−１２９９６号公報に記載、寄託番号ＡＴＣＣ３１５３８及びＡＴＣＣ４００１１）からＥcoＲＩ及びＥcoＲＶで切断し約０.７５kbの断片を単離した。一方、pＥＴ−３Ｃ〔Rosenberg et al.，ジーン（Gene）、５６巻、１２５頁（１９８７年）〕をＮdeＩ及びＢamＨＩで切断し、Ｔ７プロモーター及びアンピシリン耐性遺伝子を有する約４.６kbの断片を単離した。
両断片をＴ４ＤＮＡポリメラーゼ（ＤＮＡ Blunting kit、宝酒造株式会社製）で平滑末端とし、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで連結したのち、大腸菌ＪＭ１０９に導入し、アンピシリン耐性を指標として形質転換体を選択した。出現したコロニーの中から１２個を拾い、これらからプラスミドを調製し制限酵素ＰstＩによる切断パターンを調べたところ、６個のコロニーからのプラスミドにおいてｈＧＨ遺伝子が正しい方向で挿入されていることがわかった。この中の１株から得られたプラスミドをpＴＧＡ２０１と命名した。
【００３２】
参考例２ 大腸菌でのＭet−ｈＧＨの発現
大腸菌ＪＭ１０９を、Ｔ７ファージのＲＮＡポリメラーゼ遺伝子で組み換えられているラムダファージ（スチュディエ、スプラ）で溶原化した。その後、参考例１で得られたｈＧＨ発現ベクターｐＴＧＡ２０１をこの大腸菌ＪＭ１０９（ＤＥ３）へ導入し、大腸菌ＪＭ１０９（ＤＥ３）／pＴＧＡ２０１を得た。
この形質転換細胞を、５０μg／mlのアンピシリンを含むＬＢ培地（１％ペプトン、０.５％酵母エキス、０.５％塩化ナトリウム）１リットルを含む２リットル容フラスコ中で３０℃、１６時間振とう培養した。得られた培養液を、０.０２％ニューポールＬＢ−６２５（消泡剤；三洋化成工業製）及び５０μg／mlのアンピシリンを含む２０リットルのＬＢ培地を仕込んだ５０リットル容発酵槽へ移植して、３７℃、６時間通気撹拌培養した。この培養液を３６０リットルの主発酵培地（１.６８％リン酸一水素ナトリウム、０.３％リン酸二水素カリウム、０.１％塩化アンモニウム、０.０５％塩化ナトリウム、０.０２４６％硫酸マグネシウム、０.０２％ニューポールＬＢ−６２５、０.０００５％塩酸チアミン、１.５％ブドウ糖、１.５％カザミノ酸）を仕込んだ５００リットル容発酵槽に移植して、３７℃で通気撹拌培養を開始した。培養液の濁度が約５００クレット単位になった時点で、５.９５mg／リットル分のイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加し、更に培養を続け、４時間後に培養液を遠心分離して、約４.５kgの湿菌体を得、−８０℃に凍結保存した。
上記の形質転換大腸菌ＪＭ１０９（ＤＥ３）／pＴＧＡ２０１は、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−５６３２として通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（ＮＩＢＨ）に寄託され、また受託番号ＩＦＯ １６００１として財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）に寄託されている。
【００３３】
参考例３ Ｍet−ｈＧＨの活性化
参考例２で得られた菌体２kgに５０mＭトリス／ＨＣl、８Ｍグアニジン塩酸塩溶液（pＨ８.０）６リットルを加えて菌体を溶解後、遠心分離（１００００rpm、１２０分間）を行った。得られた上澄液６リットルに５０mＭトリス／ＨＣl、０.２８mＭＧＳＳＧ、１.４mＭＧＳＨ、０.７Ｍアルギニン（pＨ８.０）１８リットルを加えて pＨ８.０に調整した後、４℃で５日間活性化を行った。
【００３４】
参考例４ Ｍet−ｈＧＨの精製
参考例３で活性化の終了した再生液をペリコンカセットシステム（ＰＴＧＣ膜、ミリポア社）で、２０mＭトリス／ＨＣl、２.５Ｍ尿素（pＨ８.０）を加えながら電気伝導度が１０mＳ以下になるまで脱塩、濃縮を行った後、得られた濃縮液を遠心分離（１００００rpm、６０分間）し、濃縮液の上清５リットルを得た。ついでこの液を２０mＭトリス／ＨＣl、２.５Ｍ尿素（pＨ８.０）で平衡化したＤＥＡＥ−トヨパール６５０Ｍカラム（２０cmφ×８４cm、東ソー社）に吸着させ、十分に洗浄した後、０ないし２５％Ｂ（Ｂ＝２０mＭトリス／ＨＣl、２.５Ｍ尿素、１Ｍ塩化ナトリウム、pＨ８.０）の濃度勾配で１００分間、３００ml／分の流速で溶出を行い、Ｍet−ｈＧＨ画分として１０リットルの溶出液を得た。更に、この溶出液をペリコンカセットシステム（ＰＴＧＣ膜、ミリポア社）で濃縮、脱塩した。更に、高速液体クロマトグラフ法（ギルソンＨＰＬＣシステム、ギルソン社）により、この溶液をＤＥＡＥ−５ＰＷカラム（２１cm×３０cm、東ソー社）に通液吸着させた後、Ａ＝５０mＭトリス／ＨＣl＋２.５Ｍ尿素（pＨ８.０）、Ｂ＝５０mＭＭＥＳ［２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸］＋２.５Ｍ尿素（pＨ４.０）とによる７０ないし８５％Ｂの pＨ勾配で、７０分間、３２０ml／分の流速で溶出を行い、Ｍet−ｈＧＨ画分６リットルを得た。この溶出液に２Ｍトリス／ＨＣl（pＨ７.８）溶液３００ml加えて pＨ７.２に調整し、ついでペリコンカセットシステム（ＰＴＧＣ膜、ミリポア社）で濃縮、脱塩し、９，９７９ミリグラムのＭet−ｈＧＨを得た。
【００３５】
参考例５ Ｎ末端Ｍetの除去
参考例４で得たＭet−ｈＧＨ溶液１６５０mlに２.５Ｍグリオキシル酸、３５mＭ硫酸銅、６Ｍピリジン溶液４１３mlを加え、よく撹拌した後、２５℃で６０分間反応させた。次いで、２０mＭトリス／ＨＣl、２.５Ｍ尿素（pＨ８.０）で平衡化したセファデックスＧ−２５カラム（１１.３cmφ×１２５cm、ファルマシア社）に３リットル／ｈの流速で通液し、平衡化と同じ緩衝液を用いて展開し、溶出してきたＭet−ｈＧＨのジケトン体画分を、よく撹拌しながら直接４Ｍ酢酸、４Ｍ酢酸ナトリウム、８０mＭｏ−フェニレンジアミン、３Ｍ尿素溶液４リットル中に加えた。溶出終了後、この反応溶液８リットルを４℃に３日間静置した。静置後、ペリコンカセットシステム（ＰＴＧＣ膜、ミリポア社）で４リットルに濃縮し、２０mＭトリス／ＨＣl、２.５Ｍ尿素（pＨ８.０）で平衡化したセファデックスＧ−２５カラム（１１.３cmφ×１４０cm、ファルマシア社）に３リットル／ｈの流速で通液し、ｈＧＨ画分４.７リットルを集めた。更に、高速液体クロマトグラフ法（ギルソンＨＰＬＣシステム、ギルソン社）により、この溶液をＤＥＡＥ−５ＰＷカラム（２１cm×３０cm、東ソー社）に通液吸着させた後、Ａ＝５０mＭトリス／ＨＣl＋２.５Ｍ尿素（pＨ８.０）、Ｂ＝５０mＭＭＥＳ［２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸］＋２.５Ｍ尿素（pＨ４.０）とによる７０ないし８５％Ｂの pＨ勾配で、７０分間、３２０ml／分の流速で溶出を行い、ｈＧＨ画分１０リットルを得た。このｈＧＨ画分に２Ｍトリス／ＨＣl（pＨ７.８）溶液を５００ml加えて pＨ７.２に調整後、ミニタンII（ＰＴＧＣ膜、ミリポア社）で濃縮し、この濃縮液５００mlを蒸留水で平衡化したセファクリルＳ−１００カラム（１１３.cmφ×５０cm、ファルマシア社）に２リットル／ｈの流速で通液、展開しｈＧＨ画分１６５１mlを得た。更に、この溶液をミリパック６０（ミリポア社）でろ過し、ｈＧＨ溶液１４８７ml（３３０９mgのｈＧＨ）を得た。
【００３６】
参考例６ ｈＧＨの性状確認
（ａ）ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いた分析
参考例５で得られたｈＧＨに１００mＭＤＴＴを含むサンプルバッファー［Laemmli, Nature, 227, 680（1970）］を等量加えてよく撹拌し、９５℃で２分間加熱後、マルチゲル１０／２０（第一化学薬品）で電気泳動を行った。泳動後のゲルをクーマシー・ブリリアント・ブルー（Coomassie brilliant blue）で染色した結果、約２２ｋｄに単一バンドが認められたことから、精製ｈＧＨはほぼ単一であることが確認された。
【００３７】
（ｂ）アミノ酸組成分析
アミノ酸組成をアミノ酸分析計（Ｌ−８５００Ａ，日立）を用いて決定した。その結果、得られたｈＧＨのアミノ酸組成はｃＤＮＡの塩基配列から推定されるアミノ酸組成と一致した（表１）。
【表１】
酸加水分解（６Ｎ ＨＣl−４％チオグリコール酸、１１０℃、２４及び４８時間加水分解の平均値）
１）０時間に外挿した値
２）未検出
約２０μｇを用いて分析を行った。
【００３８】
（ｃ）Ｎ末端アミノ酸配列分析
Ｎ末端アミノ酸配列を気相プロテインシーケンサー（アプライドバイオシステムズ社、モデル４７７Ａ）を用いて決定した。その結果、得られたｈＧＨのＮ末端アミノ酸配列はｃＤＮＡの塩基配列から推定されたｈＧＨのＮ末端アミノ酸配列と一致した（表２）。
【表２】
１）フェニルチオヒダントイン
１ｎｍｏｌを用いて分析を行った。
【００３９】
（ｄ）Ｃ末端アミノ酸分析
Ｃ末端アミノ酸をアミノ酸分析計（Ｌ−８５００Ａ，日立）を用いて決定した。得られたｈＧＨのＣ末端アミノ酸はｃＤＮＡの塩基配列から推定されたＣ末端アミノ酸と一致した（表３）。
【表３】
気相ヒドラジン分解法（１００℃，６時間）
１８ｎｍｏｌを用いて分析を行った。
（ｅ）ｈＧＨの活性測定
参考例５で得られた精製ｈＧＨのＮｂ２細胞〔ジャーナル・オブ・クリニカル・エンドクリノロジー・アンド・メタボリズム、５１巻、１０５８頁（１９８０）〕に対する増殖促進効果は、標準品と同等であった。
【００４０】
実施例１
（1）ｈＧＨ粉体の製造
参考例５に準じて得られた遺伝子組換え型ｈＧＨ水溶液（最終ｈＧＨ濃度＝２mg／ml）に、エタノール［最終濃度（Ｖ／Ｖ％）＝０.０３％，０.０６％，０.１％，０.１５％，０.２５％，０.５％）］を添加し、凍結乾燥することにより６種のｈＧＨ粉体を得た。
（2）ｈＧＨ含有マイクロカプセルの製造
乳酸−グリコール酸共重合体（乳酸／グリコール＝５０／５０，ポリスチレン換算平均分子量＝１２,０００，粘度＝０.１４５dl／ｇ）１.８５ｇと酸化亜鉛１０mgとをジクロロメタン３.０mlに溶解した。この有機溶媒液に上記（1）のｈＧＨ粉体１４０mgを添加し、ポリトロン（キネマチカ社）を用いて微粒化した。このＳ／Ｏ分散液を０.１％ポリビニルアルコール水溶液８００mlに添加し、ホモミキサーを用いて撹拌・乳化した。室温で３時間撹拌してジクロロメタンを揮散させた後、遠心分離（約１,５００rpm）することによりマイクロカプセルを分取した。次いで蒸留水４００mlを用いて２回洗浄後、Ｄ−マンニトール０.２ｇを添加し凍結乾燥した。更に残留溶媒除去のため、４６℃で３日間真空乾燥して６種のｈＧＨ含有マイクロカプセルを得た。
【００４１】
実施例２
（1）ｈＧＨ粉体の製造
参考例５に準じて得られた遺伝子組換え型ｈＧＨ水溶液（最終ｈＧＨ濃度＝２mg／ml）に、酢酸アンモニウムの１０，２０，２５，４０，５０，７０及び１００倍モル等量を添加し、凍結乾燥することにより７種のｈＧＨ粉体を得た。
（2）ｈＧＨ含有マイクロカプセルの製造
実施例１（2）と同様の操作により、上記（1）記載のｈＧＨ粉体を用いて７種のｈＧＨ含有マイクロカプセルを得た。
【００４２】
比較例１
（1）ｈＧＨ粉体の製造
参考例５に準じて得られた遺伝子組換え型ｈＧＨ水溶液（最終ｈＧＨ濃度＝２mg／ml）に、エタノール及び／又は酢酸アンモニウムを添加せずに、凍結乾燥することによりｈＧＨ粉体を得た。
（2）ｈＧＨ含有マイクロカプセルの製造
実施例１（2）と同様の操作により、上記（1）記載のｈＧＨ粉体を用いてｈＧＨ含有マイクロカプセルを得た。
【００４３】
試験例１
実施例１（1）及び比較例１（1）において得られるｈＧＨ粉体について、その取扱い易さを、粉体容積（嵩高さ）及び静電気への帯電性の観点から判定した。結果を〔表４〕に示す。
〔表４〕の結果から明らかなように、エタノール無添加のｈＧＨ粉体に比べ、エタノールを添加したｈＧＨ粉体では取り扱い易さが格段に向上した。
【００４４】
試験例２
実施例１（2）及び比較例１（2）の中間工程において得られるｈＧＨ粉体／ＰＬＧＡ有機溶媒のＳ／Ｏ分散液５０μl に、更にジクロロメタン２mlを添加した後、ｈＧＨ粉体の平均粒子径をレーザー回折式粒度分布測定装置（ＳＡＬＤ２０００Ａ：島津）を用いて測定した。結果を〔表４〕に示す。
〔表４〕の結果から明らかなように、エタノール無添加のｈＧＨ粉体は平均粒子径が１０μm以上であるのに対し、エタノールを添加したｈＧＨ粉体はいずれも平均粒子径が１０μm以下の微細粉末であった。
【表４】
【００４５】
試験例３
実施例１（2）及び比較例１（2）で製造したｈＧＨ含有マイクロカプセルを用いて以下の試験を実施した。
（1）ｈＧＨ含量
マイクロカプセル５mgに０．３ｍｌのアセトニトリルを添加後、超音波処理に付した。得られたアセトニトリル溶液に０．７ｍｌの１０mＭリン酸食塩緩衝液（ｐＨ８.０）を添加し、主薬であるｈＧＨを抽出した。次いでこのｈＧＨ抽出液を下記条件のサイズ排除高速液体クロマトグラフィーに供してｈＧＨ含量を測定し、封入率を算定した。結果を〔表５〕に示す。
カラム：ＴＳＫgelＧ ３０００ＳＷXL（Tosoh）
抽出液：０.２Ｍリン酸緩衝液（pＨ６.８）−０.２Ｍ ＮaＣl
流 速：０.６ml／min
〔表５〕の結果から明らかなように、エタノール無添加のｈＧＨ粉体を用いて製造したｈＧＨ含有マイクロカプセルに比べ、エタノールを添加したｈＧＨ粉体を用いて製造したｈＧＨ含有マイクロカプセルでは高いｈＧＨ封入率が得られた。
【表５】
【００４６】
（2）in vivo 放出性
免疫抑制ＳＤラット（雄性，６週齢）にマイクロカプセルを皮下投与し（ｈＧＨ量として６mg／ラット）、経時的に採血後、その血清中のｈＧＨ濃度をラジオイムノアッセイ（Ａb ビーズＨＧＨ：栄研化学）により測定し、ｈＧＨ徐放性を評価した。免疫抑制ＳＤラットは、プログラフ（藤沢薬品）を、マイクロカプセル投与３日前に０.４mg／ラット、投与時、４日後、７日後、１１日後及び１４日後にそれぞれ０.２mg／ラットを皮下投与して作成した。結果を〔図１〕に示す。
〔図１〕の結果から明らかなように、エタノールを添加したｈＧＨ粉体を用いて得られたｈＧＨ含有マイクロカプセルでは、初期放出［投与後１日（２４時間）までの放出量］が小さく、その後の持続濃度［投与後１日（２４時間）を超え２週間までの放出量］が高かった。すなわち、エタノールを添加したｈＧＨ粉体を用いることにより、初期放出の抑制と、２週に亘る高い血中ｈＧＨ濃度が達成された。
【００４７】
試験例４
実施例２（1）及び比較例１（1）において得られるｈＧＨ粉体について、その取り扱い易さを、粉体容積（嵩高さ）及び静電気への帯電性の観点から判定した。結果を〔表６〕に示す。
〔表６〕の結果から明らかなように、酢酸アンモニウム無添加のｈＧＨ粉体に比べ、酢酸アンモニウムを添加したｈＧＨ粉体では取扱い易さが格段に向上した。
【００４８】
試験例５
実施例２（2）及び比較例１（2）の中間工程において得られるｈＧＨ粉体／ＰＬＧＡ有機溶媒のＳ／Ｏ分散液を、試験例２と同様の操作によりレーザー回折式粒度分布測定装置（ＳＡＬＤ２０００Ａ：島津）に供して、ｈＧＨの平均粒子径を測定した。結果を〔表６〕に示す。
【表６】
【００４９】
試験例６
実施例２（2）及び比較例１（2）で製造したｈＧＨ含有マイクロカプセルを用いて以下の実験を実施した。
（1）ｈＧＨ含量
試験例１（1）と同様の操作により、各種マイクロカプセルのｈＧＨ封入率を測定した。結果を〔表７〕に示す。
〔表７〕の結果から明らかなように、酢酸アンモニウム無添加のｈＧＨ粉体を用いて製造したｈＧＨ含有マイクロカプセルに比べ、酢酸アンモニウムを添加したｈＧＨ粉体を用いて製造したｈＧＨ含有マイクロカプセルでは高いｈＧＨ封入率が得られた。
（２）初期放出率
以下に示す方法により、マイクロカプセルの初期放出率を算出した。結果を〔表７〕に示す。
免疫抑制ＳＤラット（雄性，６週齢）にｈＧＨ水溶液（濃度５，１０，２０mg/Kg）を皮下投与し、経時的に２４時間まで採血後、その血清中のｈＧＨ濃度をラジオイムノアッセイ（Ａb ビーズＨＧＨ：栄研化学）により測定し、各濃度におけるＡＵＣを求め、投与量−ＡＵＣ（Area Under the Concentration）直線を得た。
また、免疫抑制ＳＤラット（雄性，６週齢）にマイクロカプセル（ｈＧＨ量として６ｍｇ）を皮下投与し、経時的に２４時間まで採血後、その血清中のｈＧＨ濃度をラジオイムノアッセイ（Ａb ビーズＨＧＨ：栄研化学）により測定し、各マイクロカプセルにおけるＡＵＣを求めた。得られたＡＵＣを投与量−ＡＵＣ直線に適用することにより初期放出量を得、初期放出率を算出した。
【表７】
（2）in vivo 放出性
試験例１（2）と同様の操作により、マイクロカプセルの免疫抑制ＳＤラットにおけるｈＧＨ徐放性を評価した。結果を〔図２〕に示す。
〔図２〕の結果から明らかなように、酢酸アンモニウムを添加したｈＧＨ粉体を用いて得られたｈＧＨ含有マイクロカプセルでは、初期放出［投与後１日（２４時間）までの放出量］が小さく、その後の持続濃度［投与後１日（２４時間）を超え２週間までの放出量］が高かった。すなわち、酢酸アンモニウムを添加したｈＧＨ粉体を用いることにより、初期放出の抑制と、２週に亘る高い血中ｈＧＨ濃度が達成された。
【００５０】
【発明の効果】
本発明によれば、製剤工程における生理活性ポリペプチド粉体の取り扱い易さを改善し、徐放性製剤の工業的大量生産を可能にする。また、徐放性製剤への生理活性ポリペプチドの封入率を高め、初期放出率が低く長期に亘り安定した高い血中維持濃度を示す徐放性製剤を提供できる。
【００５１】
【図面の簡単な説明】
【図１】免疫抑制ＳＤラットにおける、エタノールを添加したｈＧＨ粉体を用いて得られたｈＧＨ含有マイクロカプセル投与後の血清中のｈＧＨ濃度推移を示すグラフである。
【図２】免疫抑制ＳＤラットにおける、酢酸アンモニウムを添加したｈＧＨ粉体を用いて得られたｈＧＨ含有マイクロカプセル投与後の血清中のｈＧＨ濃度推移を示すグラフである。
【発明の属する技術分野】
本発明は、生理活性ポリペプチドを含有する徐放性製剤およびその製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
生理活性ポリペプチドは、生体において種々の薬理作用を示すことが知られており、このうちいくつかについては遺伝子工学、細胞工学の手法の発達により大腸菌、酵母、動物細胞あるいはヤギ、ハムスター等の生体を用いて大量に生産され、医薬品としての応用が図られている。しかしながら、これらの生理活性ポリペプチドは一般的に生体内での半減期が短いために、頻回投与が必要であり、注射に伴う患者の肉体的負担は無視できないものがある。
例えば、成長ホルモン（以下、ＧＨと略記することがある）は、元来下垂体前葉で産生・分泌される代表的なホルモンで、身体の成長促進に働くほか、糖・脂質代謝、蛋白同化、細胞増殖や分化に関与する等、幅広く多彩な生理作用を有する生理活性ポリペプチドであり、現在では遺伝子組換え技術を用いて大腸菌により大量生産され、医薬品として全世界で広く臨床応用されているが、ＧＨは生体内半減期が短く、有効血中濃度を維持するためには頻回投与が必要であり、特に下垂体性小人症の場合には、乳幼児あるいは若年患者に対して数カ月から１０年以上の長期に亘る連日皮下投与がなされているのが実情である。
【０００３】
特開平８−３０５５号公報（ＥＰ−Ａ−６３３０２０）には、水溶性ポリペプチドを生体内分解性ポリマーと脂肪酸金属塩とからなる生体内分解性マトリックスに水中で浸透させる徐放性製剤の製造法及び該製造法で調製された徐放性マイクロカプセルが開示されている。
特開平８−２１７６９１号公報（ＷＯ ９６／０７３９９）には、水溶性ペプチド性生理活性物質を塩化亜鉛水溶液等により水不溶性ないし水難溶性多価金属塩とし、これと生体内分解性ポリマーとを含有してなる徐放性製剤の製造法が開示されている。
ＷＯ ９４／１２１５８には、ヒトＧＨ（以下、ｈＧＨと略記することがある）と生体分解性ポリマーとの徐放性製剤の製造法として、ポリマーに対して０.１ないし３０％（Ｗ／Ｗ）の水酸化亜鉛等のポリマー分解促進剤をポリマー溶液に加えることができるとの記載がある。また、ｈＧＨとポリマーとを含有する有機溶媒溶液を液体窒素中に噴霧し多孔性粒子として生物活性を保持した形で徐放性マイクロカプセルを調製する方法が開示されている。
また、ＷＯ ９２／１７２００及びネイチャー メディシン（Nature Medicine）, 第２巻, ７９５頁（１９９６）には、ｈＧＨの亜鉛塩を用いる徐放性製剤の製造法が開示されている。
更に、ＷＯ ９５／２９６６４には、炭酸亜鉛等の金属塩を固体状でポリマー溶液に分散させた後、生理活性物質（ホルモン等）を添加し、生理活性物質と金属カチオンとを別々に生体分解性ポリマーに分散させてなる徐放性マイクロカプセルの製造法が開示されている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
前記のように生理活性ポリペプチドの生理活性を保持しながら徐放性製剤を製造する試みは種々なされているものの、生理活性ポリペプチドによっては、製剤内への生理活性ポリペプチドの取り込み率が低い、投与初期の過剰放出がある、長期にわたる安定した放出性が達成されない、十分な血中濃度が長期にわたって保持できない等の点で、未だ臨床上満足すべき製剤は得られていない。また、製造法においても大量生産を前提とする工業化に合致しないのが現状である。
生理活性ポリペプチド粉体（固相：以下、Ｓ相と略記することがある）を、ポリマーを溶解した有機溶媒（Ｏ相）に直接添加し分散させた、いわゆるＳ／Ｏエマルションを用いて徐放性製剤を製造する方法においては、比較的安定に生理活性ポリペプチドを封入することが可能であるが、一方で製剤工程において大量の生理活性ポリペプチド粉体を固体として効率的に取り扱う必要があり、更にはＳ／Ｏ分散液中の粉体粒径が、得られる徐放性製剤の品質に大きく影響するため、その制御が必須である等、製造上の問題が数多くある。
従って、製剤化工程中での生理活性ポリペプチドの安定性の保持、操作性のよい粉体の作成、粉体の微粒化等を全て満たし、しかも収率の良い、安定した品質の徐放性製剤および該徐放性製剤を大量生産できる製造法が望まれている。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは前記の問題点を解決するため鋭意研究を進め、生理活性ポリペプチド水溶液に水混和性の有機溶媒及び／又は揮発性の塩類を添加後、凍結乾燥することにより、予想外にも当該ポリペプチドの生理活性を保持したまま、製剤化工程において操作性がよく、しかも粒子径の小さな生理活性ポリペプチド粉体が得られることを初めて見出した。更に、このようにして得られた生理活性ポリペプチド粉体を、生体内分解性ポリマーの有機溶媒液に分散させた後、有機溶媒を除去して徐放性製剤を製造すると、意外にも徐放性製剤における生理活性ポリペプチドの封入率及び徐放性が改善されることを見出し、これらに基づいて本発明を完成した。
【０００６】
すなわち、本発明は、
（１）生理活性ポリペプチド水溶液に、水混和性の有機溶媒及び／又は揮発性の塩類を添加後、凍結乾燥して得られる生理活性ポリペプチド粉体を、生体内分解性ポリマーの有機溶媒液に分散させた後、有機溶媒を除去することを特徴とする徐放性製剤の製造法、
（２）生理活性ポリペプチド粉体が平均粒子径が１０μm以下のものである前記（１）記載の製造法、
（３）生理活性ポリペプチドが成長ホルモンである前記（１）記載の製造法、
（４）成長ホルモンがヒト成長ホルモンである前記（３）記載の製造法、
（５）水混和性の有機溶媒がアルコールである前記（１）記載の製造法、
（６）アルコールがメタノール又はエタノールである前記（５）記載の製造法、
（７）アルコールがエタノールである前記（５）記載の製造法、
（８）揮発性の塩類がアンモニウム塩である前記（１）記載の製造法、
（９）アンモニウム塩が酢酸アンモニウム、重炭酸アンモニウム又は炭酸アンモニウムである前記（８）記載の製造法、
（１０）アンモニウム塩が酢酸アンモニウムである前記（８）記載の製造法、
（１１）生理活性ポリペプチド水溶液に対する濃度が０.０３％（Ｖ／Ｖ）ないし０.５％（Ｖ／Ｖ）になる様にアルコールが添加される前記（５）記載の製造法、
（１２）生理活性ポリペプチドに対するモル比が１０倍ないし８０倍のアンモニウム塩が添加される前記（８）記載の製造法、
（１３）生体内分解性ポリマーが乳酸−グリコール酸重合体である前記（１）記載の製造法、
（１４）乳酸−グリコール酸重合体の乳酸／グリコール酸組成比（モル％）が１００／０ないし４０／６０である前記（１３）記載の製造法、
（１５）乳酸−グリコール酸重合体の重量平均分子量が３,０００ないし５０,０００である前記（１３）記載の製造法、
（１６）乳酸−グリコール酸重合体が多価金属塩である前記（１３）記載の製造法、
（１７）多価金属が亜鉛である前記（１６）記載の製造法、
（１８）徐放性製剤がマイクロカプセルである前記（１）記載の製造法、
（１９）マイクロカプセルの平均粒子径が０.１μmないし３００μmである前記（１８）記載の製造法、
（２０）徐放性製剤が注射用である前記（１）記載の製造法、
（２１）前記（１）記載の製造法により製造される徐放性製剤、
（２２）生理活性ポリペプチド水溶液に、水混和性の有機溶媒及び／又は揮発性塩類を添加後、凍結乾燥することを特徴とする生理活性ポリペプチド粉体の製造法、
（２３）前記（２２）記載の製造法により得られる生理活性ポリペプチド粉体、
（２４）生理活性ポリペプチド粉体が平均粒子径１０μm以下である前記（２３）記載の生理活性ポリペプチド粉体、
（２５）医薬製剤を製造するための、前記（２３）記載の生理活性ポリペプチド粉体の使用、
（２６）粒径の小さな生理活性ポリペプチド粉体を製造するための水混和性の有機溶媒及び／又は揮発性の塩類の使用
（２７）生理活性ポリペプチド粉体が平均粒子径が１０μm以下である前記（２６）記載の使用。
（２８）請求項１記載の製造法により得られうる徐放性製剤。
（２９）生理活性ポリペプチドの初期放出率が４０％以下である、生理活性ポリペプチドと生体内分解性ポリマーの多価金属塩を含有する徐放性製剤、
（３０）生理活性ポリペプチドが平均粒子径が１０μm以下の粉体である前記（２９）記載の徐放性製剤、
（３１）生理活性ポリペプチドが成長ホルモンである前記（２９）記載の徐放性製剤、
（３２）生体内分解性ポリマーが乳酸−グリコール酸重合体である前記（２９）記載の徐放性製剤、
（３３）徐放性製剤がマイクロカプセルである前記（２９）記載の徐放性製剤、
（３４）マイクロカプセルの平均粒子径が０.１ないし３００μmである前記（３３）記載の徐放性製剤、
（３５）１週間ないし１ヶ月型徐放性製剤である前記（２９）記載の徐放性製剤、
および
（３６）０．１ないし３０％（Ｗ／Ｗ）の生理活性ポリペプチドを徐放性製剤中に含有する前記（２９）記載の徐放性製剤等に関する。
【０００７】
本発明に用いられる生体内分解性ポリマーとしては、例えばα-ヒドロキシカルボン酸類（例えば、グリコール酸、乳酸等）、ヒドロキシジカルボン酸類（例えば、リンゴ酸等）、ヒドロキシトリカルボン酸（例えば、クエン酸等）等の１種以上から無触媒脱水重縮合で合成され、遊離のカルボキシル基を有する重合体あるいはこれらの混合物、ポリ-α-シアノアクリル酸エステル、ポリアミノ酸（例えば、ポリ-γ-ベンジル-L-グルタミン酸等）、無水マレイン酸系重合体（例えば、スチレン-マレイン酸重合体等）等が挙げられる。これらはホモポリマーまたはコポリマーのいずれであってもよい。重合の形式は、ランダム、ブロック、グラフトのいずれでもよい。また、上記のα-ヒドロキシカルボン酸類、ヒドロキシジカルボン酸類、ヒドロキシトリカルボン酸類が分子内に光学活性中心を有する場合、Ｄ−，Ｌ−，ＤＬ−体のいずれも用いることができる。
これらの中では、末端に遊離のカルボキシル基を有する生体内分解性ポリマー、例えばα-ヒドロキシカルボン酸類（例えば、グリコール酸、乳酸等）から合成された重合体（例えば、乳酸重合体、乳酸−グリコール酸共重合体等）、ポリ-α-シアノアクリル酸エステル等が好ましい。
生体内分解性ポリマーとしては、更に好ましくはα-ヒドロキシカルボン酸類から合成された重合体等、特に好ましくは乳酸-グリコール酸重合体等である。
【０００８】
本明細書においては、ポリ乳酸、ポリグリコール酸等の単重合体のみならず乳酸-グリコール酸共重合体も含めて、単に乳酸-グリコール酸重合体と称することがある。
生体内分解性ポリマーとして乳酸-グリコール酸重合体（乳酸-グリコール酸共重合体又は単重合体）を用いる場合、その組成比（モル％）は約１００／０ないし約４０／６０が好ましく、約８５／１５ないし約５０／５０が更に好ましい。
乳酸-グリコール酸重合体の重量平均分子量は、約３，０００ないし約５０，０００が好ましく、約３，０００ないし約２５，０００がより好ましく、約５，０００から約２０，０００が更に好ましい。
乳酸-グリコール酸重合体の分散度（重量平均分子量／数平均分子量）は約１.２ないし約４.０が好ましく、約１.５ないし約３.５が更に好ましい。
【０００９】
なお、本明細書での重量平均分子量及び分散度に関し、前者は重量平均分子量が１２０，０００、５２，０００、２２，０００、９，２００、５，０５０、２，９５０、１，０５０、５８０、１６２の９種類のポリスチレンを基準物質としてゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）で測定したポリスチレン換算の値、後者はこの値から算出した値である。測定は、ＧＰＣカラムＫＦ８０４Ｌ ｘ ２（昭和電工製）、ＲＩモニター Ｌ-３３００（日立製作所製）を使用し、移動相としてクロロホルムを用いて行う。
【００１０】
また、末端に遊離のカルボキシル基を有する生体内分解性ポリマーとは、末端基定量による数平均分子量と上記のＧＰＣ測定による数平均分子量がほぼ一致するポリマーであり、末端基定量による数平均分子量は以下のようにして算出される。
約１ｇないし約３ｇの生体内分解性ポリマーをアセトン(２５ml)とメタノール(５ml)との混合溶媒に溶解し、フェノールフタレインを指示薬としてこの溶液中のカルボキシル基を０.０５Ｎアルコール性水酸化カリウム溶液で、室温（２０℃）で撹拌下、速やかに滴定して末端基定量による数平均分子量を次式で算出した。
末端基定量による数平均分子量＝２００００×Ａ／Ｂ
Ａ：生体内分解性ポリマーの質量（ｇ）
Ｂ：滴定終点までに添加した０.０５Ｎアルコール性水酸化カリウム溶液 (ml)
末端基定量による数平均分子量が絶対値であるのに対して、ＧＰＣ測定による数平均分子量は、各種分析・解析条件（例えば、移動相の種類、カラムの種類、基準物質、スライス幅の選択、ベースラインの選択等）によって変動する相対値であるため、一義的な数値化は困難であるが、両測定による数平均分子量がほぼ一致するとは、例えば、α−ヒドロキシカルボン酸類から合成された重合体において、末端基定量による数平均分子量がＧＰＣ測定による数平均分子量の約０.５倍から約２倍の範囲内であること、好ましくは約０.７倍から約１.５倍の範囲内であることをいう。
例えば、１種類以上のα-ヒドロキシカルボン酸類から無触媒脱水重縮合法で合成され、末端に遊離のカルボキシル基を有する重合体では、ＧＰＣ測定による数平均分子量と末端基定量による数平均分子量とがほぼ一致する。これに対し、環状二量体から触媒を用いて開環重合法で合成され、末端に遊離のカルボキシル基を本質的には有しない重合体では、末端基定量による数平均分子量がＧＰＣ測定による数平均分子量の約２倍以上に大きく上回る。この相違によって末端に遊離のカルボキシル基を有する重合体は、末端に遊離のカルボキシル基を有しない重合体と明確に区別することができる。
【００１１】
末端に遊離のカルボキシル基を有する乳酸-グリコール酸重合体は、自体公知の製造法、例えば特開昭６１−２８５２１号公報に記載の方法（例えば無触媒下の脱水重縮合反応又は無機固体酸触媒下での脱水重縮合反応による製造方法等）に従って製造することができる。
乳酸-グリコール酸重合体の分解・消失速度は、組成比あるいは重量平均分子量によって大きく変化するが、一般的にはグリコール酸分率が低いほど分解・消失が遅いため、グリコール酸分率を低くするかあるいは分子量を大きくすることによって放出期間を長くすること（例えば、約６ヶ月）ができる。逆に、グリコール酸分率を高くするあるいは分子量を小さくすることによって放出期間を短くこと（例えば、約１週間）もできる。例えば、１週間ないし２ヶ月型徐放性製剤とするには、前記組成比及び重量平均分子量の範囲の乳酸-グリコール酸重合体を用いるのが好ましい。
【００１２】
従って、本発明において用いる生体内分解性ポリマーの組成は、目的とする生理活性ポリペプチドの種類、所望の徐放期間等に応じて、適宜選択されることが好ましい。その具体例としては、例えば、生理活性ポリペプチドとしてＧＨを用いる場合、乳酸−グリコール酸重合体を用いることが好ましく、該乳酸−グリコール酸重合体としては、その乳酸／グリコール酸組成比（モル％）が約８５／１５ないし約５０／５０の乳酸−グリコール酸共重合体が好ましく、更に好ましくは約７５／２５ないし約５０／５０の乳酸−グリコール酸共重合体である。またその重量平均分子量は約８,０００ないし約２０,０００が好ましく、更に好ましくは約１０,０００ないし約２０,０００である。また、乳酸−グリコール酸重合体の分散度（重量平均分子量／数平均分子量）は約１.２ないし約４.０が好ましく、更に好ましくは約１.５ないし約３.５である。
用いる乳酸−グリコール酸重合体は、前記公報記載の方法等、公知の方法に従い製造できる。該重合体は無触媒脱水重縮合で製造されたものが好ましい。前記ＧＰＣ測定法による数平均分子量と末端基定量法による数平均分子量とが、ほぼ一致する乳酸−グリコール酸重合体(ＰＬＧＡ）を用いることが好ましい。
また、該重合体は組成比及び／または重量平均分子量の異なる２種の乳酸−グリコール酸重合体を任意の割合で混合して用いてもよい。このような例としては、組成比（乳酸／グリコール酸）（モル％）が約７５／２５で重量平均分子量が約１０,０００の乳酸−グリコール酸共重合体と、組成比（乳酸／グリコール酸）（モル％）が約５０／５０で重量平均分子量が約１２,０００の乳酸−グリコール酸共重合体との混合物等が用いられる。混合する際の重量比は、好ましくは約２５／７５ないし約７５／２５である。
【００１３】
また、本発明で用いる生体内分解性ポリマーは、前記した生体内分解性ポリマーの金属塩であってもよく、例えば、ＷＯ９７／０１３３１号公報に記載の各種生体内分解性ポリマーの多価金属塩等が用いられる。好ましくは乳酸−グリコール酸重合体の多価金属塩（さらに好ましくは亜鉛塩，カルシウム塩，マグネシウム塩等、より好ましくは亜鉛塩等）等が用いられる。該多価金属塩の金属種としては、生体に悪影響を及ぼさない化合物であれば特に限定されず、例えば２価（例、鉄、亜鉛、銅、カルシウム、マグネシウム、アルミニウム、スズ、マンガン等）、３価（例、鉄、アルミニウム、マンガン等）、４価（例、スズ等）などの多価金属も用いることができる。
本明細書においては、生体内分解性ポリマーが金属塩の場合も含めて生体内分解性ポリマーと称することがあり、例えば乳酸−グリコール酸重合体が多価金属塩の場合も乳酸-グリコール酸重合体と称することがある。
これらの生体内分解性ポリマーの多価金属塩はＷＯ９７／０１３３１号公報に記載の方法及びこれに準じる方法により製造することができる。
また、生体内分解性ポリマーの多価金属塩が亜鉛塩の場合には、生体内分解性ポリマーと酸化亜鉛とを有機溶媒中で反応させることによって製造することもできる。
該製造法においては、まず生体内分解性ポリマーと酸化亜鉛とを有機溶媒中に共存させて、生体内分解性ポリマー・酸化亜鉛体の有機溶媒溶液を製造する。この際、生体内分解性ポリマーの溶液中濃度は分子量、有機溶媒等の種類によって異なるが、例えば約０.１ないし約８０％（Ｗ／Ｗ）、好ましくは約１ないし約７０％（Ｗ／Ｗ）、更に好ましくは約２ないし約６０％（Ｗ／Ｗ）である。また、添加する酸化亜鉛量は、特開平１０−２３１２５２号公報に記載されたように、有機溶媒の種類によって異なるが、例えば生体内分解性ポリマー量の約０.００１ないし約２％（Ｗ／Ｗ）、好ましくは約０.０１ないし約１.５％（Ｗ／Ｗ）、更に好ましくは約０.１ないし約１％（Ｗ／Ｗ）である。
有機溶媒への生体内分解性ポリマー及び酸化亜鉛の添加順序は、生体内分解性ポリマーの有機溶媒溶液に酸化亜鉛を粉末状であるいは該有機溶媒に懸濁した状態で添加してもよく、逆に酸化亜鉛の有機溶媒懸濁液中に生体内分解性ポリマーの有機溶媒溶液を添加してもよい。また、両者を粉末状で混和後、有機溶媒を添加してもよい。
【００１４】
本発明における生理活性ポリペプチドとしては、好ましくは分子量約１,０００ないし約５０,０００、更に好ましくは分子量約５,０００ないし約４０,０００の生理活性ポリペプチドが用いられる。
生理活性ポリペプチドの活性として代表的なものとしては、ホルモン作用が挙げられる。該生理活性ポリペプチドは天然物、合成物、半合成物のいずれでもよく、更にそれらの誘導体ないし類縁体でもよい。該生理活性ポリペプチドの作用機作は、作動性あるいは拮抗性のいずれでもよい。
本発明における生理活性ポリペプチドとしては、例えばペプチドホルモン、サイトカイン、ペプチド性神経伝達物質、造血因子、各種増殖因子、酵素、ポリペプチド系抗生物質、鎮痛性ペプチド等が用いられる。
ペプチドホルモンとしては、例えばインスリン、ソマトスタチン、ソマトスタチン誘導体（サンドスタチン，米国特許第４,０８７,３９０号，同第４,０９３,５７４号，同第４,１００,１１７号，同第４,２５３,９９８号参照）、成長ホルモン（ＧＨ）、ナトリウム利尿ペプチド、ガストリン、プロラクチン、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）、ＡＣＴＨ誘導体（エビラタイド等）、メラノサイト刺激ホルモン（ＭＳＨ）、甲状腺ホルモン放出ホルモン（ＴＲＨ）、その塩及びその誘導体（特開昭５０−１２１２７３号、特開昭５２−１１６４６５号公報参照）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、ヒト絨毛ゴナドトロピン（ＨＣＧ）、サイモシン（チモシン）、モチリン、バソプレシン、バソプレシン誘導体｛デスモプレシン〔日本内分泌学会雑誌，第５４巻 第５号 第６７６ないし６９１頁（１９７８）〕参照｝、オキシトシン、カルシトニン、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、グルカゴン、セクレチン、パンクレオザイミン、コレシストキニン、アンジオテンシン、ヒト胎盤ラクトーゲン等が用いられる。ペプチドホルモンとしては、好ましくはインスリン及び成長ホルモン等である。
サイトカインとしては、例えばリンホカイン、モノカイン等が用いられる。リンホカインとしては、例えばインターフェロン類（アルファ型、ベータ型、ガンマ型等）、インターロイキン類（例えば、ＩＬ−２，３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２等）等が用いられる。モノカインとしては、例えばインターロイキン−１（ＩＬ−１）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）等が用いられる。サイトカインとしては、好ましくはリンホカイン等、更に好ましくはインターフェロン等、特に好ましくはインターフェロンアルファ等である。
ペプチド性神経伝達物質としては、例えばサブスタンスＰ、セロトニン、ＧＡＢＡ等が用いられる。
【００１５】
造血因子としては、例えばエリスロポエチン（ＥＰＯ）、コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ，ＧＭ−ＣＳＦ，Ｍ−ＣＳＦ等）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、血小板増殖刺激因子、メガカリオサイトポテンシエーター等が用いられる。
各種増殖因子としては、例えば塩基性あるいは酸性の繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）あるいはこれらのファミリー（例えば、ＥＧＦ、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、ＰＤＧＦ，酸性ＦＧＦ，塩基性ＦＧＦ、ＦＧＦ−９等）、神経細胞増殖因子（ＮＧＦ）あるいはこれらのファミリー（例えば、ＢＤＮＦ、ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＣＮＴＦ、ＧＤＮＦ等）、インスリン様成長因子（例えば、ＩＧＦ−１，ＩＧＦ−２等）、骨増殖に関与する因子（ＢＭＰ）あるいはこれらのファミリー等が用いられる。
酵素としては、例えばスーパーオキシドディスミュターゼ（ＳＯＤ）、ウロキナーゼ、ティシュープラスミノーゲンアクティベーター（ＴＰＡ）、アスパラギナーゼ、カリクレイン等が用いられる。
ポリペプチド系抗生物質としては、例えばポリミキシンＢ、コリスチン、グラミシジン、バシトラシン等が用いられる。
鎮痛性ペプチドとしては、例えばエンケファリン、エンケファリン誘導体〔米国特許第４,２７７,３９４号，ヨーロッパ特許出願公開第３１５６７号公報参照〕，エンドルフィン、キョウトルフィン等が用いられる。
その他、生理活性ポリペプチドとしては、サイモポエチン、ダイノルフィン、ボムベシン、セルレイン、サイモスチムリン、胸腺液性因子（ＴＨＦ）、血中胸腺因子（ＦＴＳ）及びその誘導体（米国特許第４,２２９,４３８号参照）、及びその他の胸腺因子〔医学のあゆみ、第１２５巻，第１０号，８３５−８４３頁（１９８３年）〕、ニューロテンシン、ブラジキニン及びエンドセリン拮抗作用を有するペプチド類（ヨーロッパ特許公開第４３６１８９号，同第４５７１９５号，同第４９６４５２号，特開平３−９４６９２号，同３−１３０２９９号公報参照）等が挙げられる。
本発明に特に好ましく適用される生理活性ポリペプチドとしては、成長ホルモン、インスリン等が挙げられ、中でも成長ホルモン、とりわけヒト成長ホルモンが好ましい。
【００１６】
本発明において、生理活性ポリペプチドが金属を含有する場合、その金属含有量は０.１％（ｗ／ｗ）以下が好ましく、更に好ましくは０.０１％（ｗ／ｗ）以下、特に好ましくは０.００１％（ｗ／ｗ）以下であって実質的に金属を含まない生理活性ポリペプチドが最適である。例えば結晶性インスリンは、通常亜鉛、ニッケル、コバルト、カドミウム等の少量の重金属を含んでいる。０.４％（ｗ／ｗ）亜鉛を含んでいるインスリンは６量体で存在し、それ自身で安定に存在し、生体内分解性高分子重合物の金属塩との相互作用が弱められると考えられる。
必要な場合には、生理活性ポリペプチドに含有されている金属を前もって除去しておいてもよく、金属を除去する方法としては公知の方法が用いられる。例えばインスリンの塩酸酸性水溶液を、水あるいは酢酸アンモニウム塩溶液に対して透析したのち凍結乾燥することによりアモルファス状態で金属が最小限のインスリンが得られる。
成長ホルモンとしては、いずれの種由来のものでも良いが、好ましくはヒト成長ホルモンである。また、脳下垂体等から抽出される天然由来も本発明に用いられるが、好ましくは遺伝子組換え型ＧＨ（特公平６−１２９９６号公報、特公平６−４８９８７号公報参照）であり、更に好ましくはＮ末端にメチオニンを有さない天然型と同じ構造を有する組換え型ｈＧＨである。該ＧＨとしては金属塩であってもよいが、実質的に金属を含有しないＧＨも用いられる。ｈＧＨとしては、分子量約２２Ｋダルトンのみならず、分子量約２０Ｋダルトンのもの（特開平７−１０１８７７号公報、特開平１０−２６５４０４号公報参照）を用いてもよい。また、ｈＧＨの誘導体あるいはその関連タンパク質（ＷＯ９９／０３８８７号公報参照）を用いてもよい。
【００１７】
生理活性ポリペプチドとしては、生体より抽出・精製されたもの、化学的に合成されたもの、あるいは遺伝子組換え法により作製されたもの等、いずれの方法によって作製されたものでも用いられるが、高純度の製品を大量に合成するためには遺伝子組換え法の利用が好ましい。また、いずれの方法を採用する場合においても、生理活性ポリペプチドを含有する組織・体液、化学合成粗調製物、あるいは組換え細胞・菌体より、それぞれ当該ポリペプチドを純化・精製する必要がある。この場合、一般的なペプチドあるいは蛋白の分離精製法が使用できるが（「タンパク質」、佐竹一夫著、朝倉書店；「生理活性ペプチド」、ファルマシアレビュー、No.3、日本薬学会）、特に幾つかの液体クロマトグラフィーを組み合わせることにより（「タンパク質・ペプチドの高速液体クロマトグラフィー」、宇井信生ら共編、化学同人）、高純度の生理活性ポリペプチドをその生理活性を損なうことなく収率よく得られる。また、所望により精製法の最終工程において、脱塩操作に供されることが好ましい。水溶液中での生理活性ポリペプチド濃度は、特に限定されないが、例えば０．０１％（Ｗ／Ｖ）ないし３０％（Ｗ／Ｖ）、好ましくは０．０３％（Ｗ／Ｖ）ないし１０％（Ｗ／Ｖ）、特に好ましくは０．０５％（Ｗ／Ｖ）ないし３％（Ｗ／Ｖ）等である。生理活性ポリペプチドがｈＧＨである場合、水溶液中でのｈＧＨ濃度は、好ましくは約０.０１ないし約５％（Ｗ／Ｖ）、より好ましくは約０.０５ないし約０．５％（Ｗ／Ｖ）である。
【００１８】
本発明において生理活性ポリペプチド水溶液に添加される水混和性の有機溶媒としては、例えばアルコール類（例えば、メタノール、エタノール、イソプロパノール等、好ましくはメタノール、エタノール等）、アセトン等が挙げられる。これらは適宜の割合で混合して用いてもよいが、好ましくはアルコール類、特にエタノールを単独で用いることが望ましい。また、生理活性ポリペプチド水溶液への添加量（濃度）は、体積比において約０.０３ないし０.５％（Ｖ／Ｖ）であり、好ましくは約０.０６ないし０.２５％（Ｖ／Ｖ）、更に好ましくは約０.１ないし０.１５％（Ｖ／Ｖ）である。このような水混和性の有機溶媒の添加により得られる生理活性ポリペプチド水溶液を、更に凍結乾燥することにより、取り扱いが容易で（操作性のよい）、かつ微細な（粒子径の小さな）生理活性ポリペプチド粉体が作成できる。
本発明において生理活性ポリペプチド水溶液に添加される揮発性の塩類としては、例えばアンモニウム塩（例えば酢酸アンモニウム、重炭酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、塩化アンモニウム等、好ましくは酢酸アンモニウム等）が挙げられる。これらは適宜の割合で混合して用いてもよい。揮発性の塩類の生理活性ポリペプチド水溶液への添加量は、モル比において約１０倍ないし約８０倍モルであり、好ましくは約１０倍ないし約７０倍モルであり、さらに好ましくは約１５倍ないし約７０倍モルであり、より好ましくは約２０倍ないし約７０倍モルであり、最も好ましくは約２０倍ないし約５０倍モルである。水混和性の有機溶媒を添加する場合と同様に、揮発性塩類の添加により得られる生理活性ポリペプチド水溶液を、更に凍結乾燥することにより、取り扱いが容易で（操作性のよい）、かつ微細な（粒子径の小さな）微細生理活性ポリペプチド粉体が作成できる。
本発明において、生理活性ポリペプチド水溶液に添加される水混和性の有機溶媒及び／又は揮発性の塩類は、単独で用いてもよいし、適宜組み合わせて用いてもよい。水混和性の有機溶媒及び揮発性の塩類を組み合せて用いる時は、上記のそれぞれの添加量に従って、生理活性ポリペプチド水溶液に添加することができる
上記の方法により得られた水混和性の有機溶媒及び／又は揮発性の塩類を含有する生理活性ポリペプチド水溶液は、本発明の凍結乾燥操作に供されるが、本操作としては医薬品・食品関係のみならず、水に関わるあらゆる分野で利用されている方法が使用される（「医薬品の開発」第11巻、仲井由宣編集、広川書店）。例えば生理活性ポリペプチド水溶液をバイアル又はアンプル内等に充填し、次いで水溶液を凍結後、乾燥処理に供する。この場合、機外で凍結した後、乾燥機に供してもよいが、通常は機内で十分な温度制御のもとに凍結するのが好ましい。また、乾燥操作においても段階的に実施することができる。近年の凍結乾燥機は、これらの温度制御又は真空制御が可能であり、対象とする生理活性ポリペプチドに最適の条件が選ばれる。凍結乾燥操作に供する水溶液中での生理活性ポリペプチド濃度は、特に限定されないが、例えば０．０１％（Ｗ／Ｖ）ないし３０％（Ｗ／Ｖ）、好ましくは０．０３％（Ｗ／Ｖ）ないし１０％（Ｗ／Ｖ）、特に好ましくは０．０５％（Ｗ／Ｖ）ないし３％（Ｗ／Ｖ）等である。生理活性ポリペプチドがｈＧＨである場合、水溶液中でのｈＧＨ濃度は、好ましくは約０.０１ないし約５％（Ｗ／Ｖ）、より好ましくは約０.０５ないし約０．５％（Ｗ／Ｖ）である。
【００１９】
本発明における生体内分解性ポリマーの溶解に用いる有機溶媒は、沸点１２０℃以下であることが好ましい。該有機溶媒としては、例えばハロゲン化炭化水素（例えば、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素等）、アルコール類（例えば、エタノール、メタノール、１,４−ブタンジオール、１,５−ペンタンジオール等）、酢酸エチル、アセトニトリル等が挙げられる。これらは適宜の割合で混合して用いてもよい。有機溶媒を単独で用いる場合、例えばジクロロメタン、アセトニトリル等が好ましい。有機溶媒を混合溶媒として用いる場合、例えばハロゲン化炭化水素（例えば、ジクロロメタン、クロロホルム等）と、アルコール類（例えば、エタノール、メタノール、１,４−ブタンジオール、１,５−ペンタンジオール等）あるいはアセトニトリルとの組み合わせが好ましい。特に、ジクロロメタンとアセトニトリルとの組み合わせが汎用される。ハロゲン化炭化水素と、アルコール類あるいはアセトニトリルとの混合比（体積比）は約４０：１ないし約１：１であり、好ましくは約２０：１ないし約１：１である。特に、ハロゲン化炭化水素（ジクロロメタン等）を単独、あるいはハロゲン化炭化水素とアセトニトリルとの９：１ないし１：１の混合溶媒を用いることが望ましい。また、生体内分解性ポリマーの溶液中濃度は分子量、有機溶媒等の種類によって異なるが、例えば約０.０１ないし約８０％（Ｗ／Ｗ）、好ましくは約０.１ないし約７０％（Ｗ／Ｗ）、更に好ましくは約１ないし約６０％（Ｗ／Ｗ）である。
【００２０】
本発明の徐放性製剤は、水混和性の有機溶媒及び／又は揮発性塩類を添加した生理活性ポリペプチド溶液を凍結乾燥して得られる粉体（Ｓ相）を、生体内分解性ポリマーを溶解した有機溶媒液（Ｏ相）に分散させた、Ｓ／Ｏ型分散液から溶媒を除去することにより製造される。その製造法としては、例えば（a）水中乾燥法（Ｓ／Ｏ／Ｗ法）、（b）相分離法（コアセルベーション法）及び（c）噴霧乾燥法、あるいはこれらに準じた方法等が挙げられる。以下に徐放性製剤として、例えばマイクロカプセルを製造する場合の製造方法について記述する。
（a）水中乾燥法（Ｓ／Ｏ／Ｗ法）
本法によれば、まず生理活性ポリペプチド水溶液に水混和性の有機溶媒及び／又は揮発性塩類を添加した後、凍結乾燥により生理活性ポリペプチド粉体（Ｓ相）を作成する。次に生体内分解性ポリマーを有機溶媒に溶解し、この有機溶媒液中に上記の生理活性ポリペプチド粉体を添加し分散させる。この際、生理活性ポリペプチドと生体内分解性ポリマーとの比率（重量比）は、例えば約１：１０００ないし約１：１、好ましくは約１：２００ないし約１：５、更に好ましくは約１：１００ないし約１：５である。また、生理活性ポリペプチド粉体を有機溶媒液中に均一に分散させるため、外部物理的エネルギーを加えることが好ましい。その方法としては例えば、超音波照射、タービン型撹拌器、ホモジナイザー等が用いられる。この時の有機溶媒液中での生理活性ポリペプチドの平均粒子径としては約１０μm以下、さらに好ましくは約０．１μmないし約１０μm、より好ましくは約０．５μmないし５μmであることが望ましく、本発明の製造法により得られた生理活性ポリペプチド粉体を用いることにより容易に達成される。本発明における生理活性ポリペプチドの平均粒子径は、ホモジナイザーを用いて該生理活性ポリペプチドをジクロロメタン等の有機溶媒中で分散した後に、レーザー解析式粒度分布測定装置（ＳＡＬＤ２０００Ａ：島津）により得られる値を示す。その際、生理活性ポリペプチドはジクロロメタン等の有機溶媒に、例えば約２０ないし１００mg／mlの濃度で添加後、ホモジナイザー（例えば、ポリトロン（キネマチカ社））を用いて約２０，０００ｒｐｍで約３０秒ないし１分間攪拌することにより分散液とされ、さらに上記粒度分布測定装置の測定可能な範囲となるように適宜、該有機溶媒で希釈し、供試される。
次いでこのようにして調製された有機溶媒分散液（Ｓ／Ｏ型分散液）を、更に水性溶媒（Ｗ相）中に添加して、上記と同様の外部物理的エネルギー、例えば超音波照射、タービン型撹拌器、あるいはホモジナイザー等によりＳ／Ｏ／Ｗ型エマルションを形成させる。以後、油相溶媒を蒸発させマイクロカプセルを製造する。この際の水相体積は、一般的には油相体積の約１倍ないし約１０,０００倍から選ばれる。更に好ましくは約２倍ないし約５,０００倍から選ばれる。特に好ましくは約５倍ないし約２,０００倍から選ばれる。
上記外水相中には、乳化剤を加えてもよい。該乳化剤としては、一般的に安定なＳ／Ｏ／Ｗエマルションを形成できるものであれば何れでもよい。乳化剤としては、例えばアニオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、ポリオキシエチレンヒマシ油誘導体、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、カルボキシメチルセルロース、レシチン、ゼラチン、ヒアルロン酸等が挙げられる。これらは適宜組み合わせて使用してもよい。外水相中の乳化剤の濃度は、好ましくは約０.００１％ないし２０％（ｗ／ｗ）である。更に好ましくは約０.０１％ないし１０％（ｗ／ｗ）、特に好ましくは約０.０５％ないし５％（ｗ／ｗ）である。
【００２１】
このようにして得られたマイクロカプセルは、遠心分離あるいは濾過操作により分取した後、マイクロカプセルの表面に付着している乳化剤等を蒸留水による洗浄で除去し、再び蒸留水等に分散して凍結乾燥する。その後必要であれば、加温してマイクロカプセル中の水分及び有機溶媒を更に除去する。減圧下に加温してもよい。加温条件としては、用いた生体内分解性ポリマーのガラス転移温度以上で、マイクロカプセルの各粒子が互いに付着しない程度の温度で加熱乾燥する。好ましくは、生体内分解性ポリマーのガラス転移温度からガラス転移温度より約３０℃高い温度の範囲で加熱乾燥する。ここでガラス転移温度とは、示差走査熱量計を用い、加温速度毎分１０ないし２０℃で昇温した際に得られる中間点を云う。
【００２２】
（b）相分離法（コアセルベーション法）
本法においては、前記（a）のＳ／Ｏ型分散液にコアセルベーション剤を撹拌下徐々に加えマイクロカプセルを析出、固化させる。該コアセルベーション剤は、上記分散液の約０.０１倍ないし約１,０００倍の体積量が加えられる。更に好ましくは、約０.０５倍ないし約５００倍、特に好ましくは約０.１倍ないし約２００倍の体積量である。コアセルベーション剤としては、生体内分解性ポリマーを溶解する有機溶媒と混和する高分子系、鉱物油系又は植物油系の化合物で使用した生体内分解性ポリマーを溶解しないものであればよい。具体的には、例えばシリコン油、ゴマ油、大豆油、コーン油、綿実油、ココナッツ油、アマニ油、鉱物油、ｎ−ヘキサン、ｎ−ヘプタン等が用いられる。これらは２種以上混合して用いてもよい。このようにして得られたマイクロカプセルを濾過分取した後、ヘプタン等により繰り返し洗浄してコアセルベーション剤を除去する。更に、前記（a）と同様に洗浄し、次いで凍結乾燥する。
水中乾燥法及びコアセルベーション法でのマイクロカプセルの製造では、粒子同士の凝集を防ぐために凝集防止剤を加えてもよい。該凝集防止剤としては、例えばマンニトール、ラクトース、ブドウ糖、デンプン類（例えば、コーンスターチ等）、ヒアルロン酸あるいはこのアルカリ金属塩等の水溶性多糖、グリシン、フィブリン、コラーゲン等の蛋白質、塩化ナトリウム、リン酸水素ナトリウム等の無機塩類等が適宜用いられる。
【００２３】
（c）噴霧乾燥法
本法においては、前記（a）のＳ／Ｏ型分散液を、ノズルを用いてスプレードライヤー（噴霧乾燥器）の乾燥室内へ噴霧し、極めて短時間に微粒化液滴内の有機溶媒を揮発させ、マイクロカプセルを製造する。該ノズルとしては、例えば二流体ノズル型、圧力ノズル型、回転ディスク型等がある。この際所望により、上記の分散液と同時に、マイクロカプセル粒子同志の凝集防止を目的として前記凝集防止剤の水溶液を別ノズルより噴霧することも有効である。このようにして得られたマイクロカプセルは、前記（a）と同様にして洗浄し、必要であれば加温（要すれば減圧下）により、水分及び有機溶媒を更に除去する。
【００２４】
本発明の徐放性製剤は微粒子状であることが好ましい。なぜならば徐放性製剤は、皮下あるいは筋肉内注射に通常使用される注射針を通して投与される方が、患者に対し過度の苦痛を与えることがないからである。該徐放性製剤の粒子径は、例えば平均粒子径として約０.１ないし３００μm、好ましくは約１ないし１５０μm、特に好ましくは約２ないし１００μmである。
本発明の徐放性製剤に含まれる生理活性ポリペプチドの含量は、例えば約０.１ないし３０％（Ｗ／Ｗ）、好ましくは約０.２ないし２０％（Ｗ／Ｗ）、更に好ましくは約０.５ないし１０％（Ｗ／Ｗ）である。該生理活性ポリペプチドの平均粒子径は好ましくは約１０μm以下、さらに好ましくは約０．１μmないし１０μm、より好ましくは約０．５μmないし５μmである。
また、本発明の徐放性製剤に含まれる生体内分解性ポリマーの含量は、例えば約３０ないし９９．９％（Ｗ／Ｗ）、好ましくは約６０ないし９７％（Ｗ／Ｗ）、さらに好ましくは約７０ないし９０％（Ｗ／Ｗ）である。
本発明の徐放性製剤の生理活性ポリペプチドの初期放出率［投与後１日（２４時間）までの放出率］は、好ましくは約４０％以下、さらに好ましくは約１ないし４０％、より好ましくは約３ないし３５％である。なお、該初期放出率は本発明の徐放性製剤皮下投与後２４時間までの血中濃度のＡＵＣ（Area Under the Concentration）を、生理活性ポリペプチド溶液皮下投与後２４時間までのＡＵＣから得られる投与量−ＡＵＣ直線に適用させることにより初期放出量が得られ、さらに初期放出率が算出される。
【００２５】
本発明の徐放性製剤は、例えばマイクロカプセルとして、あるいはマイクロカプセルを原料物質として種々の剤形に製剤化し、非経口剤（例えば、筋肉内、皮下、臓器等への注射剤又は埋め込み剤、鼻腔、直腸、子宮等への経粘膜剤等）、経口剤（例えば、カプセル剤（例えば、硬カプセル剤、軟カプセル剤等）、顆粒剤、散剤等の固形製剤、懸濁剤等の液剤等）等として投与することができる。
本発明の徐放性製剤は特に注射用であることが好ましい。例えば、徐放性製剤がマイクロカプセルである場合、マイクロカプセルを分散剤（例えば、Tween 80、HCO-60 等の界面活性剤、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ヒアルロン酸等の多糖類等）、保存剤（例えば、メチルパラベン、プロピルパラベン等）、等張化剤（例えば、塩化ナトリウム、マンニトール、ソルビトール、ブドウ糖等）等と共に水性懸濁剤とすることにより実用的な注射用徐放製剤が得られる。また、ゴマ油、コーン油等の植物油あるいはこれにレシチン等のりん脂質を混合したもの、あるいは中鎖脂肪酸トリグリセリド（例えば、ミグリオール８１２）と共に分散して油性懸濁剤として実際に使用できる徐放性注射剤とする。
【００２６】
徐放性製剤が例えばマイクロカプセルである場合、マイクロカプセルの粒子径は、懸濁注射剤として使用する場合には、その分散度、通針性を満足する範囲であればよく、例えば平均粒子径として約０.１ないし約３００μmの範囲が挙げられる。平均粒子径は、好ましくは約１ないし約１５０μm、特に好ましくは約２ないし約１００μmの範囲である。
上記したマイクロカプセルを無菌製剤にするには、製造全工程を無菌にする方法、ガンマ線で滅菌する方法、防腐剤を添加する方法等が挙げられるが、特に限定されない。
【００２７】
本発明の徐放性製剤は、低毒性で、哺乳動物（例えば、ヒト、牛、豚、犬、ネコ、マウス、ラット、ウサギ等）に対して安全に用いることができる。
徐放性製剤の適応は、使用する生理活性ポリペプチドにより種々異なる。生理活性ポリペプチドが、例えばインスリンである場合には、糖尿病等、インターフェロン−αである場合には、ウイルス性肝炎（例えば、Ｃ型肝炎、ＨＢe 抗原陽性活動性肝炎等）、癌（例えば、腎癌、多発性骨髄腫等）等、エリスロポエチンの場合には貧血（例えば、腎透析時貧血等）等、Ｇ−ＣＳＦの場合には好中球減少症（例えば、制ガン剤治療時）、感染症等、ＩＬ−２の場合には癌（例えば、血管内皮腫等）等、ＦＧＦの場合には骨折、創傷(床ずれ等)、歯周病、消化管潰瘍等、ＦＧＦ−９の場合には血小板減少症等、ＮＧＦの場合には老人性痴呆、神経病（ニューロパシー）等、ＴＰＡの場合には血栓症等、腫瘍壊死因子の場合には癌等の治療又は予防に有効である。また、ＧＨ含有徐放性製剤では、ＧＨの成長ホルモン作用に基づき、下垂体性小人症の他、ターナー症候群、慢性腎疾患、軟骨異栄養症、更には成人性下垂体不全症に適応できる。また、ＧＨはダウン症候群、シルバー症候群、骨形成不全症、あるいは若年性慢性関節症等の疾患にも適応され、有効な治療効果を得たとの報告もあり、ＧＨ含有徐放性製剤はこれらの疾患にも適応可能である。更にはうっ血性心不全症等の治療又は予防にも有効である。
【００２８】
徐放性製剤の投与量は、生理活性ポリペプチドの種類と含量、放出の持続時間、対象疾病、対象動物等によって種々異なるが、該生理活性ポリペプチドの有効濃度が体内で保持される量であればよい。該生理活性ポリペプチドの投与量としては、例えば徐放性製剤が２週間型製剤である場合、好ましくは成人１人当たり約０.０００１ないし約１０mg／kg体重の範囲から適宜選ぶことができる。更に好ましくは約０.０５ないし約１mg／kg体重の範囲から適宜選ぶことができる。投与回数は、１週間に１回、２週間に１回、１ヶ月に１回、２ヶ月に１回等、該生理活性ポリペプチドの種類と含量、剤型、放出の持続時間、対象疾病、対象動物等によって適宜選ぶことができる。好ましくは１週間ないし１ヶ月型徐放性製剤、さらに好ましくは１ないし３週間型徐放性製剤、より好ましくは１０ないし２０日型徐放性製剤、とりわけ好ましくは２週間型徐放性製剤が挙げられる。
徐放性製剤の有効成分である生理活性ポリペプチドが、例えばインスリンである場合には、糖尿病の成人に対する投与量は、有効成分として通常、約０.００１ないし約１mg／kg体重、好ましくは約０.０１ないし約０.２mg／kg体重の範囲から適宜選び、１週間に１回投与するのがよい。
【００２９】
徐放性製剤の有効成分である生理活性ポリペプチドが、ＧＨの場合には、投与量は、ＧＨの種類と含量、放出の持続時間、対象疾病、対象動物等によって種々異なるが、該ＧＨの有効濃度が体内で保持される量であればよい。前記した疾患の治療において、例えば徐放性製剤が２週間型製剤である場合、ＧＨの投与量は有効成分として、好ましくは、小児あるいは成人１人当たり約０.０１ないし約５mg／kg体重（約０．０３ないし約１５ ＩＵ／kg体重）の範囲から適宜選択して安全に投与することができる。更に好ましくは約０.０５ないし約１mg／kg体重（約０．１５ないし約３ ＩＵ／kg体重）の範囲から適宜選ぶことができる。投与回数は、１週間に１回、２週間に１回あるいは１ケ月に１回等、ＧＨ含量、剤型、放出の持続時間、対象疾病、対象動物等によって適宜選ぶことができる。好ましくは１週間ないし１ヶ月型徐放性製剤、さらに好ましくは１ないし３週間型徐放性製剤、より好ましくは１０ないし２０日型徐放性製剤、とりわけ好ましくは２週間型徐放性製剤が挙げられる。
徐放性製剤は、常温あるいは冷所に保存することが好ましい。徐放性製剤は、冷所に保存することが更に好ましい。ここでいう常温あるいは冷所とは、日本薬局方において定義されるものである。すなわち、常温とは１５ないし２５℃を、冷所とは１５℃以下を意味する。冷所のうち、とりわけ２ないし８℃が好ましい。
【００３０】
【発明の実施の形態】
以下に参考例、実施例、比較例及び試験例を挙げて、更に具体的に説明するが、これらは本発明を限定するものではない。また、本発明の明細書においてアミノ酸等の略号で表示する場合には、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Commission on Biochemical Nomenclature による略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、その例を下に示す。またアミノ酸に関して光学異性がある場合は、特に明示しなければＬ−体を示す。
ＳＤＳ ： ドデシル硫酸ナトリウム
Ｇly ： グリシン
Ａla ： アラニン
Ｖal ： バリン
Ｌeu ： ロイシン
Ｉle ： イソロイシン
Ｓer ： セリン
Ｔhr ： スレオニン
Ｃys ： システイン
Ｍet ： メチオニン
Ｇlu ： グルタミン酸
Ｇln ： グルタミン
Ａsp ： アスパラギン酸
Ａsn ： アスパラギン
Ｌys ： リジン
Ａrg ： アルギニン
Ｈis ： ヒスチジン
Ｐhe ： フェニルアラニン
Ｔyr ： チロシン
Ｔrp ： トリプトファン
Ｐro ： プロリン
Ａsx ： Ａsp ＋ Ａsn
Ｇlx ： Ｇlu ＋ Ｇln
【００３１】
【実施例】
参考例１ Ｔ７プロモーターを用いたヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）発現ベクターの構築
ｈＧＨの構造遺伝子はプラスミド pＨＧＨ１０７（特公平６−１２９９６号公報に記載、寄託番号ＡＴＣＣ３１５３８及びＡＴＣＣ４００１１）からＥcoＲＩ及びＥcoＲＶで切断し約０.７５kbの断片を単離した。一方、pＥＴ−３Ｃ〔Rosenberg et al.，ジーン（Gene）、５６巻、１２５頁（１９８７年）〕をＮdeＩ及びＢamＨＩで切断し、Ｔ７プロモーター及びアンピシリン耐性遺伝子を有する約４.６kbの断片を単離した。
両断片をＴ４ＤＮＡポリメラーゼ（ＤＮＡ Blunting kit、宝酒造株式会社製）で平滑末端とし、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで連結したのち、大腸菌ＪＭ１０９に導入し、アンピシリン耐性を指標として形質転換体を選択した。出現したコロニーの中から１２個を拾い、これらからプラスミドを調製し制限酵素ＰstＩによる切断パターンを調べたところ、６個のコロニーからのプラスミドにおいてｈＧＨ遺伝子が正しい方向で挿入されていることがわかった。この中の１株から得られたプラスミドをpＴＧＡ２０１と命名した。
【００３２】
参考例２ 大腸菌でのＭet−ｈＧＨの発現
大腸菌ＪＭ１０９を、Ｔ７ファージのＲＮＡポリメラーゼ遺伝子で組み換えられているラムダファージ（スチュディエ、スプラ）で溶原化した。その後、参考例１で得られたｈＧＨ発現ベクターｐＴＧＡ２０１をこの大腸菌ＪＭ１０９（ＤＥ３）へ導入し、大腸菌ＪＭ１０９（ＤＥ３）／pＴＧＡ２０１を得た。
この形質転換細胞を、５０μg／mlのアンピシリンを含むＬＢ培地（１％ペプトン、０.５％酵母エキス、０.５％塩化ナトリウム）１リットルを含む２リットル容フラスコ中で３０℃、１６時間振とう培養した。得られた培養液を、０.０２％ニューポールＬＢ−６２５（消泡剤；三洋化成工業製）及び５０μg／mlのアンピシリンを含む２０リットルのＬＢ培地を仕込んだ５０リットル容発酵槽へ移植して、３７℃、６時間通気撹拌培養した。この培養液を３６０リットルの主発酵培地（１.６８％リン酸一水素ナトリウム、０.３％リン酸二水素カリウム、０.１％塩化アンモニウム、０.０５％塩化ナトリウム、０.０２４６％硫酸マグネシウム、０.０２％ニューポールＬＢ−６２５、０.０００５％塩酸チアミン、１.５％ブドウ糖、１.５％カザミノ酸）を仕込んだ５００リットル容発酵槽に移植して、３７℃で通気撹拌培養を開始した。培養液の濁度が約５００クレット単位になった時点で、５.９５mg／リットル分のイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加し、更に培養を続け、４時間後に培養液を遠心分離して、約４.５kgの湿菌体を得、−８０℃に凍結保存した。
上記の形質転換大腸菌ＪＭ１０９（ＤＥ３）／pＴＧＡ２０１は、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−５６３２として通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（ＮＩＢＨ）に寄託され、また受託番号ＩＦＯ １６００１として財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）に寄託されている。
【００３３】
参考例３ Ｍet−ｈＧＨの活性化
参考例２で得られた菌体２kgに５０mＭトリス／ＨＣl、８Ｍグアニジン塩酸塩溶液（pＨ８.０）６リットルを加えて菌体を溶解後、遠心分離（１００００rpm、１２０分間）を行った。得られた上澄液６リットルに５０mＭトリス／ＨＣl、０.２８mＭＧＳＳＧ、１.４mＭＧＳＨ、０.７Ｍアルギニン（pＨ８.０）１８リットルを加えて pＨ８.０に調整した後、４℃で５日間活性化を行った。
【００３４】
参考例４ Ｍet−ｈＧＨの精製
参考例３で活性化の終了した再生液をペリコンカセットシステム（ＰＴＧＣ膜、ミリポア社）で、２０mＭトリス／ＨＣl、２.５Ｍ尿素（pＨ８.０）を加えながら電気伝導度が１０mＳ以下になるまで脱塩、濃縮を行った後、得られた濃縮液を遠心分離（１００００rpm、６０分間）し、濃縮液の上清５リットルを得た。ついでこの液を２０mＭトリス／ＨＣl、２.５Ｍ尿素（pＨ８.０）で平衡化したＤＥＡＥ−トヨパール６５０Ｍカラム（２０cmφ×８４cm、東ソー社）に吸着させ、十分に洗浄した後、０ないし２５％Ｂ（Ｂ＝２０mＭトリス／ＨＣl、２.５Ｍ尿素、１Ｍ塩化ナトリウム、pＨ８.０）の濃度勾配で１００分間、３００ml／分の流速で溶出を行い、Ｍet−ｈＧＨ画分として１０リットルの溶出液を得た。更に、この溶出液をペリコンカセットシステム（ＰＴＧＣ膜、ミリポア社）で濃縮、脱塩した。更に、高速液体クロマトグラフ法（ギルソンＨＰＬＣシステム、ギルソン社）により、この溶液をＤＥＡＥ−５ＰＷカラム（２１cm×３０cm、東ソー社）に通液吸着させた後、Ａ＝５０mＭトリス／ＨＣl＋２.５Ｍ尿素（pＨ８.０）、Ｂ＝５０mＭＭＥＳ［２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸］＋２.５Ｍ尿素（pＨ４.０）とによる７０ないし８５％Ｂの pＨ勾配で、７０分間、３２０ml／分の流速で溶出を行い、Ｍet−ｈＧＨ画分６リットルを得た。この溶出液に２Ｍトリス／ＨＣl（pＨ７.８）溶液３００ml加えて pＨ７.２に調整し、ついでペリコンカセットシステム（ＰＴＧＣ膜、ミリポア社）で濃縮、脱塩し、９，９７９ミリグラムのＭet−ｈＧＨを得た。
【００３５】
参考例５ Ｎ末端Ｍetの除去
参考例４で得たＭet−ｈＧＨ溶液１６５０mlに２.５Ｍグリオキシル酸、３５mＭ硫酸銅、６Ｍピリジン溶液４１３mlを加え、よく撹拌した後、２５℃で６０分間反応させた。次いで、２０mＭトリス／ＨＣl、２.５Ｍ尿素（pＨ８.０）で平衡化したセファデックスＧ−２５カラム（１１.３cmφ×１２５cm、ファルマシア社）に３リットル／ｈの流速で通液し、平衡化と同じ緩衝液を用いて展開し、溶出してきたＭet−ｈＧＨのジケトン体画分を、よく撹拌しながら直接４Ｍ酢酸、４Ｍ酢酸ナトリウム、８０mＭｏ−フェニレンジアミン、３Ｍ尿素溶液４リットル中に加えた。溶出終了後、この反応溶液８リットルを４℃に３日間静置した。静置後、ペリコンカセットシステム（ＰＴＧＣ膜、ミリポア社）で４リットルに濃縮し、２０mＭトリス／ＨＣl、２.５Ｍ尿素（pＨ８.０）で平衡化したセファデックスＧ−２５カラム（１１.３cmφ×１４０cm、ファルマシア社）に３リットル／ｈの流速で通液し、ｈＧＨ画分４.７リットルを集めた。更に、高速液体クロマトグラフ法（ギルソンＨＰＬＣシステム、ギルソン社）により、この溶液をＤＥＡＥ−５ＰＷカラム（２１cm×３０cm、東ソー社）に通液吸着させた後、Ａ＝５０mＭトリス／ＨＣl＋２.５Ｍ尿素（pＨ８.０）、Ｂ＝５０mＭＭＥＳ［２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸］＋２.５Ｍ尿素（pＨ４.０）とによる７０ないし８５％Ｂの pＨ勾配で、７０分間、３２０ml／分の流速で溶出を行い、ｈＧＨ画分１０リットルを得た。このｈＧＨ画分に２Ｍトリス／ＨＣl（pＨ７.８）溶液を５００ml加えて pＨ７.２に調整後、ミニタンII（ＰＴＧＣ膜、ミリポア社）で濃縮し、この濃縮液５００mlを蒸留水で平衡化したセファクリルＳ−１００カラム（１１３.cmφ×５０cm、ファルマシア社）に２リットル／ｈの流速で通液、展開しｈＧＨ画分１６５１mlを得た。更に、この溶液をミリパック６０（ミリポア社）でろ過し、ｈＧＨ溶液１４８７ml（３３０９mgのｈＧＨ）を得た。
【００３６】
参考例６ ｈＧＨの性状確認
（ａ）ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いた分析
参考例５で得られたｈＧＨに１００mＭＤＴＴを含むサンプルバッファー［Laemmli, Nature, 227, 680（1970）］を等量加えてよく撹拌し、９５℃で２分間加熱後、マルチゲル１０／２０（第一化学薬品）で電気泳動を行った。泳動後のゲルをクーマシー・ブリリアント・ブルー（Coomassie brilliant blue）で染色した結果、約２２ｋｄに単一バンドが認められたことから、精製ｈＧＨはほぼ単一であることが確認された。
【００３７】
（ｂ）アミノ酸組成分析
アミノ酸組成をアミノ酸分析計（Ｌ−８５００Ａ，日立）を用いて決定した。その結果、得られたｈＧＨのアミノ酸組成はｃＤＮＡの塩基配列から推定されるアミノ酸組成と一致した（表１）。
【表１】
１）０時間に外挿した値
２）未検出
約２０μｇを用いて分析を行った。
【００３８】
（ｃ）Ｎ末端アミノ酸配列分析
Ｎ末端アミノ酸配列を気相プロテインシーケンサー（アプライドバイオシステムズ社、モデル４７７Ａ）を用いて決定した。その結果、得られたｈＧＨのＮ末端アミノ酸配列はｃＤＮＡの塩基配列から推定されたｈＧＨのＮ末端アミノ酸配列と一致した（表２）。
【表２】
１ｎｍｏｌを用いて分析を行った。
【００３９】
（ｄ）Ｃ末端アミノ酸分析
Ｃ末端アミノ酸をアミノ酸分析計（Ｌ−８５００Ａ，日立）を用いて決定した。得られたｈＧＨのＣ末端アミノ酸はｃＤＮＡの塩基配列から推定されたＣ末端アミノ酸と一致した（表３）。
【表３】
１８ｎｍｏｌを用いて分析を行った。
（ｅ）ｈＧＨの活性測定
参考例５で得られた精製ｈＧＨのＮｂ２細胞〔ジャーナル・オブ・クリニカル・エンドクリノロジー・アンド・メタボリズム、５１巻、１０５８頁（１９８０）〕に対する増殖促進効果は、標準品と同等であった。
【００４０】
実施例１
（1）ｈＧＨ粉体の製造
参考例５に準じて得られた遺伝子組換え型ｈＧＨ水溶液（最終ｈＧＨ濃度＝２mg／ml）に、エタノール［最終濃度（Ｖ／Ｖ％）＝０.０３％，０.０６％，０.１％，０.１５％，０.２５％，０.５％）］を添加し、凍結乾燥することにより６種のｈＧＨ粉体を得た。
（2）ｈＧＨ含有マイクロカプセルの製造
乳酸−グリコール酸共重合体（乳酸／グリコール＝５０／５０，ポリスチレン換算平均分子量＝１２,０００，粘度＝０.１４５dl／ｇ）１.８５ｇと酸化亜鉛１０mgとをジクロロメタン３.０mlに溶解した。この有機溶媒液に上記（1）のｈＧＨ粉体１４０mgを添加し、ポリトロン（キネマチカ社）を用いて微粒化した。このＳ／Ｏ分散液を０.１％ポリビニルアルコール水溶液８００mlに添加し、ホモミキサーを用いて撹拌・乳化した。室温で３時間撹拌してジクロロメタンを揮散させた後、遠心分離（約１,５００rpm）することによりマイクロカプセルを分取した。次いで蒸留水４００mlを用いて２回洗浄後、Ｄ−マンニトール０.２ｇを添加し凍結乾燥した。更に残留溶媒除去のため、４６℃で３日間真空乾燥して６種のｈＧＨ含有マイクロカプセルを得た。
【００４１】
実施例２
（1）ｈＧＨ粉体の製造
参考例５に準じて得られた遺伝子組換え型ｈＧＨ水溶液（最終ｈＧＨ濃度＝２mg／ml）に、酢酸アンモニウムの１０，２０，２５，４０，５０，７０及び１００倍モル等量を添加し、凍結乾燥することにより７種のｈＧＨ粉体を得た。
（2）ｈＧＨ含有マイクロカプセルの製造
実施例１（2）と同様の操作により、上記（1）記載のｈＧＨ粉体を用いて７種のｈＧＨ含有マイクロカプセルを得た。
【００４２】
比較例１
（1）ｈＧＨ粉体の製造
参考例５に準じて得られた遺伝子組換え型ｈＧＨ水溶液（最終ｈＧＨ濃度＝２mg／ml）に、エタノール及び／又は酢酸アンモニウムを添加せずに、凍結乾燥することによりｈＧＨ粉体を得た。
（2）ｈＧＨ含有マイクロカプセルの製造
実施例１（2）と同様の操作により、上記（1）記載のｈＧＨ粉体を用いてｈＧＨ含有マイクロカプセルを得た。
【００４３】
試験例１
実施例１（1）及び比較例１（1）において得られるｈＧＨ粉体について、その取扱い易さを、粉体容積（嵩高さ）及び静電気への帯電性の観点から判定した。結果を〔表４〕に示す。
〔表４〕の結果から明らかなように、エタノール無添加のｈＧＨ粉体に比べ、エタノールを添加したｈＧＨ粉体では取り扱い易さが格段に向上した。
【００４４】
試験例２
実施例１（2）及び比較例１（2）の中間工程において得られるｈＧＨ粉体／ＰＬＧＡ有機溶媒のＳ／Ｏ分散液５０μl に、更にジクロロメタン２mlを添加した後、ｈＧＨ粉体の平均粒子径をレーザー回折式粒度分布測定装置（ＳＡＬＤ２０００Ａ：島津）を用いて測定した。結果を〔表４〕に示す。
〔表４〕の結果から明らかなように、エタノール無添加のｈＧＨ粉体は平均粒子径が１０μm以上であるのに対し、エタノールを添加したｈＧＨ粉体はいずれも平均粒子径が１０μm以下の微細粉末であった。
【表４】
試験例３
実施例１（2）及び比較例１（2）で製造したｈＧＨ含有マイクロカプセルを用いて以下の試験を実施した。
（1）ｈＧＨ含量
マイクロカプセル５mgに０．３ｍｌのアセトニトリルを添加後、超音波処理に付した。得られたアセトニトリル溶液に０．７ｍｌの１０mＭリン酸食塩緩衝液（ｐＨ８.０）を添加し、主薬であるｈＧＨを抽出した。次いでこのｈＧＨ抽出液を下記条件のサイズ排除高速液体クロマトグラフィーに供してｈＧＨ含量を測定し、封入率を算定した。結果を〔表５〕に示す。
カラム：ＴＳＫgelＧ ３０００ＳＷXL（Tosoh）
抽出液：０.２Ｍリン酸緩衝液（pＨ６.８）−０.２Ｍ ＮaＣl
流 速：０.６ml／min
〔表５〕の結果から明らかなように、エタノール無添加のｈＧＨ粉体を用いて製造したｈＧＨ含有マイクロカプセルに比べ、エタノールを添加したｈＧＨ粉体を用いて製造したｈＧＨ含有マイクロカプセルでは高いｈＧＨ封入率が得られた。
【表５】
（2）in vivo 放出性
免疫抑制ＳＤラット（雄性，６週齢）にマイクロカプセルを皮下投与し（ｈＧＨ量として６mg／ラット）、経時的に採血後、その血清中のｈＧＨ濃度をラジオイムノアッセイ（Ａb ビーズＨＧＨ：栄研化学）により測定し、ｈＧＨ徐放性を評価した。免疫抑制ＳＤラットは、プログラフ（藤沢薬品）を、マイクロカプセル投与３日前に０.４mg／ラット、投与時、４日後、７日後、１１日後及び１４日後にそれぞれ０.２mg／ラットを皮下投与して作成した。結果を〔図１〕に示す。
〔図１〕の結果から明らかなように、エタノールを添加したｈＧＨ粉体を用いて得られたｈＧＨ含有マイクロカプセルでは、初期放出［投与後１日（２４時間）までの放出量］が小さく、その後の持続濃度［投与後１日（２４時間）を超え２週間までの放出量］が高かった。すなわち、エタノールを添加したｈＧＨ粉体を用いることにより、初期放出の抑制と、２週に亘る高い血中ｈＧＨ濃度が達成された。
【００４７】
試験例４
実施例２（1）及び比較例１（1）において得られるｈＧＨ粉体について、その取り扱い易さを、粉体容積（嵩高さ）及び静電気への帯電性の観点から判定した。結果を〔表６〕に示す。
〔表６〕の結果から明らかなように、酢酸アンモニウム無添加のｈＧＨ粉体に比べ、酢酸アンモニウムを添加したｈＧＨ粉体では取扱い易さが格段に向上した。
【００４８】
試験例５
実施例２（2）及び比較例１（2）の中間工程において得られるｈＧＨ粉体／ＰＬＧＡ有機溶媒のＳ／Ｏ分散液を、試験例２と同様の操作によりレーザー回折式粒度分布測定装置（ＳＡＬＤ２０００Ａ：島津）に供して、ｈＧＨの平均粒子径を測定した。結果を〔表６〕に示す。
【表６】
試験例６
実施例２（2）及び比較例１（2）で製造したｈＧＨ含有マイクロカプセルを用いて以下の実験を実施した。
（1）ｈＧＨ含量
試験例１（1）と同様の操作により、各種マイクロカプセルのｈＧＨ封入率を測定した。結果を〔表７〕に示す。
〔表７〕の結果から明らかなように、酢酸アンモニウム無添加のｈＧＨ粉体を用いて製造したｈＧＨ含有マイクロカプセルに比べ、酢酸アンモニウムを添加したｈＧＨ粉体を用いて製造したｈＧＨ含有マイクロカプセルでは高いｈＧＨ封入率が得られた。
（２）初期放出率
以下に示す方法により、マイクロカプセルの初期放出率を算出した。結果を〔表７〕に示す。
免疫抑制ＳＤラット（雄性，６週齢）にｈＧＨ水溶液（濃度５，１０，２０mg/Kg）を皮下投与し、経時的に２４時間まで採血後、その血清中のｈＧＨ濃度をラジオイムノアッセイ（Ａb ビーズＨＧＨ：栄研化学）により測定し、各濃度におけるＡＵＣを求め、投与量−ＡＵＣ（Area Under the Concentration）直線を得た。
また、免疫抑制ＳＤラット（雄性，６週齢）にマイクロカプセル（ｈＧＨ量として６ｍｇ）を皮下投与し、経時的に２４時間まで採血後、その血清中のｈＧＨ濃度をラジオイムノアッセイ（Ａb ビーズＨＧＨ：栄研化学）により測定し、各マイクロカプセルにおけるＡＵＣを求めた。得られたＡＵＣを投与量−ＡＵＣ直線に適用することにより初期放出量を得、初期放出率を算出した。
【表７】
試験例１（2）と同様の操作により、マイクロカプセルの免疫抑制ＳＤラットにおけるｈＧＨ徐放性を評価した。結果を〔図２〕に示す。
〔図２〕の結果から明らかなように、酢酸アンモニウムを添加したｈＧＨ粉体を用いて得られたｈＧＨ含有マイクロカプセルでは、初期放出［投与後１日（２４時間）までの放出量］が小さく、その後の持続濃度［投与後１日（２４時間）を超え２週間までの放出量］が高かった。すなわち、酢酸アンモニウムを添加したｈＧＨ粉体を用いることにより、初期放出の抑制と、２週に亘る高い血中ｈＧＨ濃度が達成された。
【００５０】
【発明の効果】
本発明によれば、製剤工程における生理活性ポリペプチド粉体の取り扱い易さを改善し、徐放性製剤の工業的大量生産を可能にする。また、徐放性製剤への生理活性ポリペプチドの封入率を高め、初期放出率が低く長期に亘り安定した高い血中維持濃度を示す徐放性製剤を提供できる。
【００５１】
【図面の簡単な説明】
【図１】免疫抑制ＳＤラットにおける、エタノールを添加したｈＧＨ粉体を用いて得られたｈＧＨ含有マイクロカプセル投与後の血清中のｈＧＨ濃度推移を示すグラフである。
【図２】免疫抑制ＳＤラットにおける、酢酸アンモニウムを添加したｈＧＨ粉体を用いて得られたｈＧＨ含有マイクロカプセル投与後の血清中のｈＧＨ濃度推移を示すグラフである。
Claims (14)
- 生理活性ポリペプチド水溶液に、（１）生理活性ポリペプチド水溶液に対する濃度が０．０３％（Ｖ／Ｖ）ないし０．５％（Ｖ／Ｖ）のエタノール及び／又は（２）生理活性ポリペプチドに対するモル比が１０倍ないし８０倍の酢酸アンモニウムを添加後、凍結乾燥して得られる生理活性ポリペプチド粉体を、生体内分解性ポリマーの有機溶媒液に分散させた後、有機溶媒を除去することを特徴とする徐放性製剤の製造法。
- 生理活性ポリペプチド粉体が平均粒子径１０μｍ以下のものである請求項１記載の製造法。
- 生理活性ポリペプチドが成長ホルモンである請求項１記載の製造法。
- 成長ホルモンがヒト成長ホルモンである請求項３記載の製造法。
- 生体内分解性ポリマーが乳酸−グリコール酸重合体である請求項１記載の製造法。
- 乳酸−グリコール酸重合体の乳酸／グリコール酸組成比（モル％）が１００／０ないし４０／６０である請求項５記載の製造法。
- 乳酸−グリコール酸重合体の重量平均分子量が３，０００ないし５０，０００である請求項５記載の製造法。
- 乳酸−グリコール酸重合体が多価金属塩である請求項５記載の製造法。
- 多価金属が亜鉛である請求項８記載の製造法。
- 徐放性製剤がマイクロカプセルである請求項１記載の製造法。
- マイクロカプセルの平均粒子径が０．１ないし３００μｍである請求項１０記載の製造法。
- 徐放性製剤が注射用である請求項１記載の製造法。
- 生理活性ポリペプチド水溶液に、（１）生理活性ポリペプチド水溶液に対する濃度が０．０３％（ｖ／ｖ）ないし０．５％（ｖ／ｖ）のエタノール及び／又は（２）生理活性ポリペプチドに対するモル比が１０倍ないし８０倍の酢酸アンモニウムを添加後、凍結乾燥することを特徴とする生理活性ポリペプチド粉体の製造法。
- 平均粒子径が１０μｍ以下である生理活性ポリペプチド粉体を製造するための（１）生理活性ポリペプチド水溶液に対する濃度が０．０３％（ｖ／ｖ）ないし０．５％（ｖ／ｖ）のエタノール及び／又は（２）生理活性ポリペプチドに対するモル比が１０倍ないし８０倍の酢酸アンモニウムの使用。
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