KR100700869B1

KR100700869B1 - Ｐｔｈ, 완충제 및 안정제를 포함하는 안정한 ｐｔｈ조성물

Info

Publication number: KR100700869B1
Application number: KR1020050047668A
Authority: KR
Inventors: 강관엽; 박두홍; 전중원; 이용석
Original assignee: 재단법인 목암생명공학연구소
Priority date: 2005-06-03
Filing date: 2005-06-03
Publication date: 2007-03-29
Also published as: CN101189025A; US20090305965A1; KR20060126063A; WO2006129995A1; EP1909825A4; EP1909825A1; JP2008542364A

Abstract

본 발명은 완충제 및 안정제를 포함하는 안정한 PTH(parathyroid hormone) 조성물에 관한 것이고, 보다 구체적으로는 완충제로 숙신산, 말산, 히스티딘 또는 암모늄 바이카보네이트(ammonium bicarbonate)가 사용되고 안정제로 소비톨 또는 만니톨이 사용되는 안정한 PTH 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 PTH 조성물은 쉽게 분해되어 통상의 저분자량 약물보다 매우 불안정한 단백질인 PTH를 안정하게 제제화 하는데 이용될 수 있다.

PTH, 완충제, 숙신산, 암모늄 바이카보네이트

Description

ＰＴＨ, 완충제 및 안정제를 포함하는 안정한 ＰＴＨ 조성물{The stabilized parathyroid hormone composition comprising parathyroid hormone, buffer and stabilizing agent}

도 1은 pH 6.0 내지 8.0의 완충액(인산 염 용액)에서 50℃로 7 일 보존 후, HPLC를 이용하여 PTH의 안정성을 분석한 결과를 나타낸 그래프이고,

pH8: 인산염 용액 20mM pH7: 인산염 용액 20mM pH6: 인산염 용액 20mM

표준: 초기상태의 PTH(1-84)

도 2는 pH 4.0 내지 6.0의 완충액(구연산 염 용액)에 50℃로 7 일 보존 후, HPLC를 이용하여 PTH의 안정성을 분석한 결과를 나타낸 그래프이고,

pH4: 구연산염 용액 20mM pH5: 구연산염 용액 20mM

pH6: 구연산염 용액 20mM 표준: 초기상태의 PTH(1-84)

도 3은 숙신산, 말산 또는 시트르산 완충액에서 50℃로 7 일 보존 후, HPLC를 이용하여 PTH의 안정성을 분석한 결과를 나타낸 그래프이고,

시트르산: 20mM 구연산 나트륨, pH 5.0 완충용액

말산: 20mM sodium malate, pH 5.0 완충용액

숙신산: 20mM sodium succinate, pH 5.0 완충용액

표준상태: 초기상태의 PTH(1-84)

도 4는 완충제와 안정제를 포함하는 PTH 액상 조성물을 40℃로 7일 보존 후, HPLC를 이용하여 PTH의 안정성을 분석한 결과를 나타낸 그래프이고,

a. 숙신산과 소비톨을 함유하는 액상조성

b. 숙신산과 트레할로스를 함유하는 액상조성

c. 히스티딘과 소비톨을 함유하는 액상조성

d. 히스티딘과 트레할로스를 함유하는 액상조성

0: 초기 PTH(1-84) 1. 40도 1일 보관 3. 40도 3일 보관 7. 40도 7일 보관 도 5는 완충제와 안정제를 포함하는 PTH 동결건조 조성물을 수화하여50℃로 3일 보존 후, HPLC를 이용하여 PTH의 안정성을 분석한 결과를 나타낸 그래프이고,

동결건조 시료 a-d, 수화시 첨가용액: 증류수

a: 시트르산과 소비톨 함유 b. 숙신산과 소비톨 함유

c: 말산과 소비톨 함유 d. 히스티딘과 소비톨 함유

0 일: 수화후 초기 PTH(1-84), 3일: 수화후 50도에서 3일 후 PTH(1-84)

도 6은 휘발성 완충제 및 안정제를 포함하는 PTH 동결건조 조성물을 완충제를 포함하는 액상으로 수화하여 50℃ 로 3일 보존 후, HPLC를 이용하여 PTH의 안정성을 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.

동결건조 시료: 암모늄 바이카보네이트와 만니톨 함유

수화시 첨가용액 a-d, a: 시트르산, b: 숙신산, c: 말산, d: 히스티딘

0 일: 수화 후 초기 PTH(1-84), 3일: 수화 후 50도에서 3일 후 PTH(1-84)

본 발명은 완충제 및 안정제를 포함하는 안정한 PTH(parathyroid hormone) 조성물에 관한 것이고, 보다 상세하게는 완충제로 숙신산, 말산, 히스티딘 또는 암모늄 바이카보네이트(ammonium bicarbonate)가 사용되고 안정제로 소비톨 또는 만니톨이 사용되는 안정한 PTH 조성물에 관한 것이다.

인간 부갑상선 호르몬(parathyroid hormone, PTH)은 84개의 아미노산으로 구성된 단백질로서, 체내의 칼슘 대사를 조절하여 뼈의 성장 및 밀도를 조절하는 중요한 역할을 한다. 체내에서 PTH는 낮은 Ca²⁺ 농도에 의해 분비 촉진되고, 뼈와 신장에 작용하여 Ca²⁺의 순환을 촉진하는 것으로 보고되어 있으며(Mayer, G.P.(1979) Endocrinology 2, 607-611; Potts, J. T., Jr., Kronenberg, H. M., Rosenbaltt, M. (1982) Adv. Protein Chem.35, 323-396) PTH 의 이러한 생물학적 활성은 전체 아미노산 서열 중 일부만으로도 생물학적 활성을 나타낸다는 것이 알려졌고 이 중, PTH(1-34)는 대표적인 활성 단편으로 아미노 말단(N-terminus) 부위의 34개 아미노산으로 구성되어있다(Br. Med. J. 1980 280:1340-44). PTH(1-34)와 PTH(1-38)의 생물학적 활성은 유사하나 PTH(1-34)는 래트 실험에서 장기간 투여시 골육종을 유발하는 부작용이 발견되어(Barbehenn EK et al., Trends Endocrinol Metab. 2001 Nov;12(9):383) PTH(1-34) 장기투여시 위험성이 문제시 되고 있다.

유전 공학의 기술이 발달함에 따라 PTH는 여러 종류의 박테리아, 효모 등으로부터 재조합 단백질 형태로 생산이 가능해졌으나(J. Biol. Chem. 1989 264(8):4367-73)산화와 탈아미드화 등 화학적인 변성과 펩티드 결합 절단 등에 의해 활성이 쉽게 소실되는 것으로 알려져 있다. 실험적으로 84개의 아미노산으로 구성된 PTH(1-84)를 과산화수소 등의 산화제로 처리하였을 때 활성이 급격히 감소되는데, 이는 Met 8과 Met 18 잔기의 산화 때문임이 초기연구에 의해 이미 밝혀졌다(The Journal of Biological Chemistry, Vol. 259, No.9, 5507-5513, 1984). 또한, 산성 조건에서 Asp 잔기의 펩티드 결합 절단과 알칼리 조건에서 Asn의 탈아미드화가 쉽게 일어남이 밝혀졌다(Pharmaceutical Research. Vol. 14, No. 12, 1997).

PTH와 같이 생물학적으로 활성이 있는 펩타이드를 의학적 용도로 개발할 때, 분리나 보관시의 안정성을 고려하지 않을 수 없는데 상기와 같은 PTH의 불안정성은 제제화(formulation)에 큰 장애가 되어왔으며 이를 극복할 수 있는 안정한 조성물에 대한 연구가 제제화 관점에서 큰 주목을 받아왔다.

국제공개출원 WO 93/11785는 당 및 염화나트륨을 포함하는 안정화된 PTH 조성물을 개시하고 국제공개출원 WO 1999/31137은 안정한 결정형의 PTH 및 그 제조방법을 개시하고 있지만 상기 어느 문헌에도 완충제와 안정제를 포함하는 안정화된 PTH 조성물에 대해서는 기술하고 있지 않다.

한편, 국제공개출원 WO 1999/29337은 아세테이트 또는 타르트레이트와 당류 를 포함하는 PTH 조성물에 관한 것으로, 상기 문헌도 본 발명과 같이 안정제와 완충제를 포함하는 PTH 조성물에 관해 기술하고 있으나, 본 발명의 조성물과는 완충제, 안정제의 성분이 다르고 본 발명의 조성물이 상기 문헌의 PTH 조성물보다 분해가 쉽게 일어나지 않으며(표 3 참조) 동결건조 하였을 때는 안정성이 월등히 높아지므로(표 4 참조) 상기 문헌의 PTH 조성물보다 안정성이 높다. 또한, 상기 문헌은 PTH의 일부인 PTH(1-34)의 안정화에 초점을 맞추고 있으나, 본 발명은 전장 PTH인 PTH(1-84)의 안정화가 매우 높은 수준으로 유지됨을 보여준 것에 그 특징이 있다 하겠다. 일반적으로 아미노산의 길이가 길어질수록 분해가 쉬워 불안정하기 때문에 전장 PTH는 제제화가 어려웠으나 시판중인 PTH(1-34)가 장기간 투여 시 골육종을 유발하는 부작용이 보고됨에 따라(FDA는 이러한 위험성을 상품화된 PTH(1-34)인 Forteo 의 경고문으로 삽입하도록 하였다) 여러 제약회사들은 위험성이 없는 전장 PTH 제제를 개발하기 위해 노력해 왔다.

이에, 본 발명자들은 숙신산, 히스티딘, 말산 또는 암모늄 바이카보네이트를 완충제로 사용하고 소비톨을 안정제로 사용하였을 때 본 발명의 PTH 조성물이 쉽게 분해되지 않아 통상의 저분자량 약물보다 매우 불안정한 단백질 PTH를 안정하게 제제화 하는데 이용될 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 PTH, 완충제, 안정제를 포함하는 부갑상선 호르몬 액상 조 성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명은 PTH, 완충제, 안정제를 포함하며 수분함량 2% 미만으로 동결건조된 부갑상선 호르몬 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은

1) 치료 유효량의 PTH, 2) 조성액의 pH를 4 내지 6 범위로 조절할 수 있는 양의 완충제, 3) 0.05-20 중량부 범위의 안정제를 포함하는 부갑상선 호르몬 액상 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기와 같은 조성으로 이루어지며 수분함량 2% 미만으로 동결건조된 부갑상선 호르몬 조성물을 제공한다.

아울러, 동결건조된 조성물을 이용하여 주사액을 만드는 방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은

인간 부갑상선 호르몬(parathyroid hormone, PTH)은 84개의 아미노산으로 구성되어 있고, 체내의 칼슘 대사를 조절하여 뼈의 성장 및 밀도를 조절하는 중요한 역할을 한다. PTH의 이러한 활성은 전체 아미노산 서열 중 일부만으로도 생물학적 활성을 갖고 있음이 이미 보고되었고, 아미노 말단(N-terminus) 부위의 34개 아미노산으로 구성되어있는 PTH(1-34)는 PTH 활성을 갖는 대표적인 PTH 단편으로 알려져 있다(Br. Med. J. 1980 280:1340-44). 본 발명에서 PTH는 1-84 개 아미노산 서열을 갖는 PTH 뿐 아니라 상기 아미노산 서열에서 유래된 PTH 활성을 갖는 모든 단편들을 포함하며, 처음 34 개 이상의 N-말단부 잔기, 예를 들어 PTH(1-34), PTH(1-37), PTH(1-38) 및 PTH(1-41)을 포함하고 PTH 안정성 및 반감기를 개선시키는 1 내지 5 개 아미노산 치환체를 포함한다. 예를 들어 산화에 대한 PTH의 안정성을 개선시키는 류신 또는 다른 소수성 아미노산으로 8 및(또는) 18 번 위치의 메티오닌 잔기를 대체하고 프로테아제에 대한 PTH의 안정성을 개선시키는 트립신-불감응성 아미노산 , 예를 들어 히스티딘 또는 다른 아미노산으로 25번 내지 27 번 지역의 아미노산을 대체한 PTH 아미노산 치환체를 포함한다. 바람직하게는 미생물을 이용한 재조합 생산 방법 (USP 5,010,010)에 의해 생산 되었거나 화학 합성 방법 (USP 4,427,827)으로 제조된 84개 아미노산으로 구성된 PTH를 대상으로 한다.

PTH는 산화와 탈아미드화 등의 화학적인 변성과 펩티드 결합 절단 등에 의해 쉽게 분해되며 전장 PTH(1-84)는 크기가 가장 커 분해가 더욱 쉽기 때문에, 의학적 용도로 사용하기 위해서는 PTH를 안정화시키는 것이 가장 중요한데, 이를 위하여 본 발명자들은 여러 가지 완충제와 안정제를 혼합한 다양한 조성의 PTH 조성물을 제작하여 안정성이 가장 높은 조성물이 무엇인지 알아보았다.

먼저, 재조합 E. coli로 부터 생산된 PTH(1-84)(서열번호 1)를 사용하여 안정한 PTH 조성물 제작을 위한 pH를 선택하기로 하였다. 이를 위하여 pH 별로 대표 적인 완충용액을 제조하고 이에 PTH(1-84)를 첨가한 후 조성물의 안정성을 비교한 결과, 가장 안정성이 높은 PTH 조성물의 pH는 5.0임을 확인하였다(표 1 참조). 안정성 비교는 남아있는 PTH의 양을 역상 HPLC로 측정하는 방법으로 수행하였다.

본 발명자들은 상기 결과에 따라, 완충제의 pH를 5.0으로 정한 후 완충제의 종류를 달리하여 적합한 완충제를 선택하기로 하였다. 숙신산, 말산, 히스티딘, 아세트산, 글리신 또는 시트르산을 완충제로 사용한 PTH(1-84) 조성물을 50 ℃에서 7일 보관 후, 역상 HPLC를 이용하여 잔존하는 PTH(1-84) 양을 측정하였다. 그 결과, 안정한 PTH 조성물 제작을 위한 완충제의 종류는 숙신산, 말산, 아세트산, 시트르산 또는 그의 염 또는 히스티딘, 아르기닌 또는 글라이신의 아미노산류이며 바람직하게는 숙신산, 말산, 히스티딘 또는 그의 염임을 확인하였다(표 2 참조).

본 발명자들은 상기 결과에 따라, 잔존하는 PTH의 양이 가장 많은 상위 3가지 물질인 숙신산, 말산 또는 히스티딘을 완충제로 정한 후 안정제의 종류를 달리하여 적합한 안정제를 선택하기로 하였다. 소비톨 또는 만니톨을 안정제로 사용한 PTH(1-84) 조성물을 40℃에서 7일간 보관한 후, 역상 HPLC를 이용하여 잔존하는 PTH(1-84)양을 측정하였다. 그 결과, 안정한 PTH 조성물 제작을 위한 안정제의 종류는 소비톨, 만니톨, 트레할로스, 수크로스, EDTA 또는 tween 80이며 바람직하게는 소비톨 또는 만니톨임을 확인하였다(표 3 참조).

PTH 액상 조성물을 제작하였을 때, PTH 농도는 10㎍/mL 내지 5000㎍/mL 이며, 바람직하게는 50㎍/mL 내지 500㎍/mL 이고 추가로 비경구적으로 허용되는 보존제를 포함하고 바람직하게는 m-크레졸 또는 벤질 알콜을 포함한다.

또한, 본 발명은

1) 치료 유효량의 PTH, 2) 조성액의 pH를 4 내지 8.5 범위로 조절할 수 있는 양의 완충제, 3) 0.05-20 중량부 범위의 안정제를 포함하는 수분함량 2% 미만의 동결건조된 부갑상선 호르몬 조성물을 제공한다.

본 발명자들은 상기 결과에 따라 안정한 PTH 조성물을 제작하기에 가장 적합하다고 판단된 완충제와 안정제를 포함하는 액상의 PTH 조성물 및 추가로 완충제가 암모늄 바이카보네이트이고 안정제가 소비톨 또는 만니톨인 액상의 PTH 조성물을 제작하여 수분 함량 2% 이하로 동결건조시킨 후 4 ℃ 에 보관하였다. 이 때, 완충제로 사용되는 암모늄 바이카보네이트는 산성 조건하에서 기화하므로 액상 조성물의 pH를 7 내지 8.5로 조정하여 제조한 후, 동결건조시켰다. 동결건조된 PTH 조성물은 수화과정을 통해 주사액으로 제조될 수 있으며 동결건조 시 포함된 완충제가 숙신산, 말산, 히스티딘인 경우 증류수를 이용하여 수화시켰으며, 동결건조 시 포함된 완충제가 암모늄 바이카보네이트인 경우 휘발성으로 동결건조 과정 중 증발되므로 완충용액을 이용하여 수화시켰다.

동결 건조 상태의 PTH에서 완충제와 안정제의 농도는 주사로 투여하기 위해 액상으로 만들었을 때의 최종 농도로 표현된다. 건조물의 조성은 주사로 투여하기 위하여 물 또는 완충액 또는 혼합액(완충제와 안정제의 혼합액)을 첨가하여 최종 액상을 만들었을 때, PTH는 10㎍/mL 내지 5000㎍/mL 이며, 바람직하게는 50㎍/mL 내지 500㎍/mL 이고 완충제는 0.1 내지 100 mM, 안정제는 0.05 내지 20 중량부 범 위가 되는 것이 바람직하며, 이때 최종 pH는 4 - 6 범위가 되는 것이 바람직하다.

상기와 같이 액상으로 만든 후, 50 ℃에서 3일간 보관하고 역상 HPLC를 이용하여 잔존하는 PTH의 양을 측정하였다. 그 결과, 동결건조 후 증류수로 수화한 조성물의 잔존 PTH는 80% 이상으로 본 발명의 동결건조 조성물 역시 매우 안정함을 확인하였다(표 4 참조). 특히 암모늄 바이카보네이트는 잔존 PTH가 90% 이상으로 매우 안정함을 확인하였다(표 4 참조).

추가로 비경구적으로 허용되는 보존제를 포함하고 바람직하게는 m-크레졸 또는 벤질 알콜을 포함한다.

본 발명의 조성물은 상기 성분에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.

본 발명의 조성물은, 투여를 위해서 상기 기재한 성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형으로 제제화할 수 있으며, 표적 기관에 특이적으로 작용할 수 있도록 표적 기관 특이적 항체 또는 기타 리간드를 상기 담체와 결합시켜 사용할 수 있다. 또한 PTH(1-84)에 화학적 접합물을 결합시키거나 PTH(1-84)와 폴리머를 혼합하여 사용할 수 있다. 예를 들어 PTH 화학적 접합물 또는 폴리머 혼합물은 PTH의 지속형 또는 서방형 제형을 목적으로 PTH가 폴리에틸렌글리콜, 폴리비닐알코올 등과 화학적으로 결합된 접합물 또는 poly lactic-co-glycolic acid(PLGA)와 혼합된 미세입자(microparticle) 등의 예가 있을 수 있다.

본 발명의 조성물의 투여방법은 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 목적하는 방법에 따라 비경구 투여(예를 들어 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)하거나 경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여가 바람직하며, 피하주사나 정맥내 주사에 의한 투여가 더욱 바람직하다. 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 일일 투여량은 화합물의 경우 약 0.1 μg/kg 내지 2 mg/kg 이고, 바람직하게는 0.5 μg/kg 내지 100μg/kg이며, 하루 일회 내지 수회에 나누어 투여하는 것이 더욱 바람직하다.

본 발명의 조성물을 마우스에 정맥내 주사에 의하여 투여하여 독성 실험을 수행한 결과, 독성시험에 의한 50% 치사량(LD₅₀)은 적어도 4mg/kg 이상인 안전한 물질로 판단된다.

본 발명의 조성물은 단독으로, 또는 수술, 호르몬 치료, 약물 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 안정한 PTH(1-84) 조성물 제작을 위한 pH 선택

본 발명에 사용한 PTH(1-84)(서열번호 1)는 재조합 E. coli로 부터 생산된 것을 사용하였다. 본 발명은 대한민국 특허 10-0230578 에 명시된 방법으로 제작된 발현벡터(pA15UP, p153PTH , pm153PTH)로 형질전환된 대장균 균주 MC1061 를 대한민국 특허 10-0255270 에 명기된 유가식 회분 발효방법으로 발현한 후 순수 분리한 PTH(1-84)를 사용하였다. 구체적으로, PTH(1-84)는 포스포 리불로스카이나제의 단편의 카르복실-말단에 유로키나제 절단 부위를 매개로 융합 단백질 형태로 E. coli 에서 봉입체로 발현된다. 발현이 유도된 균체를 세포파쇄 후 봉입체를 회수하여 우레아(Urea)에 녹인 후, 우레아를 투석이나 Sephadex G25(Sigma)를 이용한 젤여과(gelfiltration)로 우레아를 제거하여 융합단백질을 리폴딩(refolding)시켰다. 융합 단백질을 적정 비율 (융합 단 백질: 유로키나제=100:1)의 유로키나제로 처리하여 포스포리불로키나제 단편을 제거 후 양이온 교환 크로마토 그래피와 역상 크로마토 그래피로 PTH(1-84)를 순수 분리 하였다.

안정한 PTH의 조성물의 pH 선정을 위해 pH별로 대표적인 완충용액을 제조하여 PTH(1-84)가 100 ug/ml 되도록 첨가한 후, 50 ℃에서 7일간 보관하여 pH별 조성물의 안정성을 비교하였다. 안정성 비교는 역상 HPLC를 이용하여 잔존하는 안정 한(intact) PTH(1-84)의 양을 분석함으로써 수행하였다.

역상 HPLC 분석 조건은 C18 HPLC column(0.46 X 25 cm)를 0.1 % TFA를 함유하는 아세토니트릴 35% 완충용액으로 평형시킨 후, 분석할 조성물을 주입하고 아세토니트릴 비율을 45 % 까지 점차적으로(gradient) 증가시키며 용리시켰다. 이때 흡광도는 214 nm에서 측정하였으며, 유속은 0.8 ml /min로 하였다. 잔존하는 안정한 PTH의 양은 초기 PTH 피크 면적을 100%로 할 때, 각 시료당 남아있는 PTH의 피크 면적을 %로 나타내었다.

표 1은 시험한 완충제의 종류와 조성 그리고 7일 후, 잔존하는 안정한 PTH(1-84) 양을 나타낸 결과이다.

pH	안정한 PTH (%)
pH 4.0 (20 mM citrate)	75
pH 5.0 (20 mM citrate)	84
pH 6.0 (20 mM citrate)	80
pH 6.0 (20 mM phosphate)	75
pH 7.0 (20 mM phosphate)	50
pH 8.0 (20 mM phosphate)	20

상기 실험 결과에 따라, 안정한 PTH 조성물 제작을 위한 pH는 5.0으로 결정하였다.

<실시예 2> 안정한 PTH(1-84) 조성물 제작을 위한 완충제 선택

상기 <실시예 1>의 결과에 따라, 완충제의 pH를 5.0으로 정한 후 완충제를 종류를 달리하여 적합한 완충제를 선택하기로 하였다. 이 때, PTH(1-84)의 농도는 100 ug/ml 이며, 사용한 완충제 종류와 농도 그리고 50 ℃에서 7일 후, 잔존하는 안정한 PTH(1-84) 양은 표 2에 나타내었다. 안정한 PTH의 분석 방법은 <실시예 1> 과 동일하게 수행하였다.

<비교예 1>

완충제의 종류를 제외한 다른 조건은 상기 <실시예 2>와 동일하게 수행하였다.

완충제		안정한 PTH (%)
실시예 2	20 mM succinate (pH 5.0)	84
	20 mM malate (pH 5.0)	84
	20 mM histidine (pH 5.0)	82
비교예 1	20 mM acetate (pH 5.0)	70
	20 mM glycine (pH 5.0)	58
	20 mM citrate (pH 5.0)	80

상기 표 2의 결과에 따라, 안정한 PTH 조성물 제작을 위한 완충제의 종류는 숙신산, 말산 또는 히스티딘으로 결정하였다.

<실시예 3> 안정한 PTH(1-84) 조성물 제작을 위한 안정제 선택

상기 <실시예 2>의 결과에 따라, 완충제를 종류를 숙신산, 말산 또는 히스티딘으로 정한 후, 안정제를 달리하여 적합한 안정제를 선택하기로 하였다. 이 때, 액상내의 PTH(1-84)의 농도는 100 ug/ml 이며, 포함된 완충제와 안정제의 종류와 농도 그리고 40℃에서 7일 후, 잔존하는 안정한 (intact) PTH(1-84)양은 표 3에 나타내었다. 안정한 PTH(1-84)의 분석 방법은 <실시예 1>의 방법과 동일하게 진행하였다.

<비교예 2>

안정제의 종류를 제외한 다른 조건은 상기 <실시예 3>과 동일하게 수행하였다.

<비교예 3>

완충제의 종류를 제외한 다른 조건은 상기 <실시예 3>과 동일하게 수행하였다.

완충제		안정제	안정한 PTH (%)
실시예 3	20mM sodium succinate (pH 5.0)	5% (w/v), sorbitol	89
	20mM sodium succinate (pH 5.0)	5% (w/v), mannitol	81
	20mM sodium malate (pH 5.0)	5%(w/v), sorbitol	88
	20mM, sodium malate (pH 5.0)	5% (w/v), mannitol	78
	20 mM histidine (pH 5.0)	5% (w/v) sorbitol	86
	20mM histidine (pH 5.0)	5%(w/v), mannitol	75
비교예 2	20mM sodium succinate (pH 5.0)	0.005 % (w/v) tween80	48
	20mM, sodium malate (pH 5.0)	5% (w/v) trehalose	79
	20mM sodium malate (pH 5.0)	0.005 % (w/v) tween80	63
	20mM, histidine (pH 5.0)	5%(w/v) trehalose	70
	20mM histidine (pH 5.0)	0.005 % (w/v) tween 80	59
비교예 3	20mM citrate (pH 5.0)	5% (w/v), mannitol	78
비교예 3	20mM citrate (pH 5.0)	5% (w/v), sorbitol	75

상기 실시예 3과 비교예 2의 결과에 따라, 안정한 PTH 조성물 제작을 위한 안정제는 솔비톨 또는 만니톨로 결정하였다. 또한 실시예 3과 비교예 3의 결과로부터, 본 발명의 조성물이 citrate를 완충제로 사용하는 PTH 조성물보다 효과가 높음을 확인하였다.

<실시예 4> 동결건조 후 증류수로 수화된 PTH 조성물의 안정성 확인

100 ug/ml 농도의 PTH(1-84) 그리고 완충제와 안정제를 포함하는 액상의 PTH(1-84) 조성물 또는 100 ug/ml 농도의 PTH(1-84)에 암모늄 바이카보네이트와 안정제를 혼합한 조성물을 동결건조 후 4 ℃ 에 보관하였다. 주사로 투여하기 위하여 상기 동결 건조물을 증류수 또는 완충용액으로 수화시켜 액상으로 만든 후, 50 ℃에서 3일 후 조성물의 안정성을 측정하였다. 동결건조된 PTH(1-84)의 액상조성 그리고 잔존하는 안정한 PTH(1-84) 양은 표 4에 나타내었다. 안정한 PTH(1-84)의 분석 방법은 <실시예 1>과 동일하게 진행하였다.

<비교예 4>

완충제의 종류를 제외한 다른 조건은 상기 <실시예 4>와 동일하게 수행하였다.

동결건조된 PTH 액상 조성			수화시 첨가한 액상 조성	안정한 PTH (%)
완충제		안정제	수화시 첨가한 액상 조성	안정한 PTH (%)
실시예4	20 mM succinate (pH 5.0)	5%(w/v) sorbitol	증류수	94
	20 mM histidine (pH 5.0)	5%(w/v) sorbitol	증류수	91
	20 mM malate (pH 5.0)	5%(w/v) sorbitol	증류수	90
	10 mM Ammonium bicarbonate	5%(w/v), sorbitol	20 mM succinate (pH 5.0)	93
	10 mM, Ammonium bicarbonate	5%(w/v), sorbitol	20 mM malate (pH 5.0)	93
	10 mM, Ammonium bicarbonate	5%(w/v), sorbitol	20 mM histidine (pH 5.0)	92
	10 mM, Ammonium bicarbonate	5%(w/v), mannitol	20 mM succinate (pH 5.0)	92
	10 mM, Ammonium bicarbonate	5%(w/v), mannitol	20 mM malate (pH 5.0)	91
	10 mM, Ammonium bicarbonate	5%(w/v), mannitol	20 mM histidine (pH 5.0)	91
비교예4	20 mM citrate (pH 5.0)	5%(w/v) sorbitol	증류수	89

표 4에 나타난 바와 같이, 본 발명의 PTH 조성물을 동결건조 후 증류수로 수화한 조성물도 잔존 PTH가 90% 이상으로 매우 안정함을 확인하였고 완충제로 암모늄 바이카보네이트, 안정제로 소비톨 또는 만니톨을 사용하여 PTH 조성물을 동결건조 후 숙신산, 말산 또는 히스티딘을 포함하는 완충용액으로 수화한 조성물도 잔존 PTH가 90% 이상으로 매우 안정함을 확인하였다.

본 발명의 완충제 및 안정제를 포함하는 안정한 PTH(parathyroid hormone) 조성물은 화학적으로 변성이 많은 전장의 PTH(1-84)를 안정하게 제제화한 것이며, 특히 동결건조 시 휘발되는 암모늄 바이카보네이트(ammonium bicarbonate)를 포함하는 본 발명의 동결건조 조성물은 액상으로 만든 후에도 안정성이 매우 뛰어나므로 안정한 PTH 제제로 유용하게 사용될 수 있다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

1) 치료 유효량의 부갑상선 호르몬(Parathyroid hormone, PTH); 2) 히스티딘, 숙신산, 말산 및 그들의 염으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하며, 조성액의 pH를 4 내지 6 범위로 조절할 수 있는 양의 완충제; 및 3) 0.05-20 (w/v)%의 안정제를 포함하는 부갑상선 호르몬 액상 조성물.

삭제

제 1항에 있어서, 안정제는 소비톨 또는 만니톨인 것을 특징으로 하는 부갑상선 호르몬 액상 조성물.

제 1항에 있어서, 완충제는 숙신산이고 안정제는 소비톨인 것을 특징으로 하는 부갑상선 호르몬 액상 조성물.

제 1항에 있어서, 완충제는 말산이고 안정제는 소비톨인 것을 특징으로 하는 부갑상선 호르몬 액상 조성물.

제 1항에 있어서, 완충제는 히스티딘이고 안정제는 소비톨인 것을 특징으로 하는 부갑상선 호르몬 액상 조성물.

제 1항에 있어서, 추가로 비경구적으로 허용되는 보존제를 포함하는 부갑상선 호르몬 액상 조성물.

제 7항에 있어서, 상기 보존제가 m-크레졸 또는 벤질 알콜인 것을 특징으로 하는 부갑상선 호르몬 액상 조성물.

1) 치료 유효량의 부갑상선 호르몬(Parathyroid hormone, PTH); 2) 히스티딘, 숙신산, 말산, 암모늄 바이카보네이트 및 그들의 염으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하며, 조성액의 pH를 4.0 내지 8.5범위로 조절할 수 있는 양의 완충제; 및 3) 0.05-20 (w/v)%의 안정제를 포함하는 수분함량 2% 미만의 동결건조된 부갑상선 호르몬 조성물.

삭제

제 9항에 있어서, 안정제는 소비톨 또는 만니톨인 것을 특징으로 하는 동결건조된 부갑상선 호르몬 조성물.

제 9항에 있어서, 완충제는 숙신산이고 안정제는 소비톨인 동결건조된 부갑상선 호르몬 조성물.

제 9항에 있어서, 완충제는 히스티딘이고 안정제는 소비톨인 동결건조된 부갑상선 호르몬 조성물.

제 9항에 있어서, 완충제는 암모늄 바이카보네이트이고 안정제는 만니톨 또는 소비톨인 동결건조된 부갑상선 호르몬 조성물.

제 9항, 제 11항 내지 제 14항 중 어느 한 항의 동결건조된 부갑상선 호르몬 조성물에 증류수 또는 완충용액을 가하여 부갑상선 호르몬의 주사액을 제조하는 방법.

제 15항에 있어서, 상기 완충용액은 히스티딘, 숙신산, 말산 및 그들의 염으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 부갑상선 호르몬의 주사액을 제조하는 방법.