JP4598908B2 - カチオン性リポソームとポリデオキシリボヌクレオチドとの複合体 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、カチオン性リポソームとポリデオキシリボヌクレオチドとにより形成された複合体の医薬としての使用に関する。より詳しくは、この発明は抗炎症活性を有する医薬として長期に顕著な安定性を有する上記複合体の使用に関する。
【０００２】
【従来技術】
リポソームは薬剤の全身投与用の賦形剤として使用できることがよく知られている。リポソームは静脈、皮下または筋肉注射によるか、あるいは注入によって投与される。
【０００３】
リポソームとＤＮＡとの複合体の構造に関して、オリゴデオキシリボヌクレオチドとプラスミドＤＮＡとが、カチオン性リポソームの外表面にイオン結合によって結合できることが知られている（C.F.Bennet et Al. Mol. Pharmacol. 41, 1023-1033,1992; Xiang Gao et Al. Biochem. Biophys. Res. Comm. 179, 280-285, 1991)。しかし、その複合体の貯蔵安定性ならびに抗炎症医薬としての用途についての指示はされていない。またオリゴヌクレオチドが８〜５０のヌクレオチドの鎖長さを有する場合に、これらはリポソームにエントラップされ得ることが特許出願ＷＯ９７／０４７８７号によって知られている。この文献には複合体の貯蔵安定性についての情報は与えられていない。
【０００４】
リポソームと、核酸の脱ポリマー化によって得られた分子量１６，０００Ｄａを有するポリデオキシリボヌクレオチドの複合体で、それらのポリマーが脂質小嚢内に含有されているものが記載されている（Gursoy et Alii, Pharmazie 48, (1993) H.7, 559-560)。同じものが上記のＷＯ９７／０４７８７号にも記載されている。
【０００５】
リポソームとオリゴヌクレオチドおよびポリデオキシリボヌクレオチドとの複合体は、これらヌクレオチドの薬理活性が顕著に増加する性質を有することも知られている（Bennet et Al, Gursoy et Al, 上記参照；A. Colige, Biochemistry 1993, 32, 7-11)。しかし、本出願人が行った実験によれば、これらの従来技術の複合体は、治療剤として使用できないことがわかった。というのは、それらを投与するのに必要な水性媒体に懸濁すると、それらは非常に速やかに活性が失われるからである。その他、複合体において、例えば、ステアリルアミンや四級アンモニウム塩系界面活性剤は強い毒性剤になって毒性の副作用の原因となりうる。複合体の分解は、水性相の物理的外観が経時変化し、乳白色（当初エマルジョン）から最終的に沈殿物の形成を伴った透明に変わることから明らかである。
【０００６】
ポリデオキシリボヌクレオチド、および特にデフィブロチドとして知られたものが、プロフィブリノリティック活性（R. Pescador et al. Thromb. Res.30:1-11, 1983）、抗血栓−血栓崩壊活性（R. Nida et Al., Pharmacol. Res. Commun. 14 (10), 949-957 1982）、抗高血圧活性（F. Trento et Al. XXVII Congr. Naz. Soc. It. Farmacol. Torino 25-29 September 1994, Abstract Book Pag. 703）、抗虚血活性、細胞保護活性（G. Rossoni et Al. J. Cardiovasc. Pharmacol. 27, 680-685 1986)および抗炎症活性（R. Scalia, Meth. Find. Exp. Clin. Pharmacol. 18(10) 669-676 1996）を有する医薬として周知である。１日投与量は６００〜１２００ｍｇである。これらのもののすべての薬理活性は、循環系血管内皮から内因性プロスタサイリンの治療上有効な量が局所的に放出される性質に本質的によっている（上記 R. Niada et alii，C Thiemermann et Alii, Am.J. Cardiol. 56 978-982 1985参照)。
【０００７】
【課題を解決するための手段及び発明の実施の形態】
本発明者らは、高い活性が持続し、毒性の副作用を有しないリポソームとポリデオキシリボヌクレオチドとの複合体が製造できることを、驚くべきことに、かつ予期に反してここに見出した。
【０００８】
この発見により、この発明の複合体を含有する水性エマルジョンを１日以上継続治療に、また注入剤として長期持続投与に使用することができる。
【０００９】
したがって、この発明の目的はカチオン性リポソームと、核酸の脱ポリマー化によって得ることができる分子量７０００〜６００００、好ましくは１００００〜６００００、最も好ましくは１５０００〜６００００Ｄａの範囲であるポリデオキシリボヌクレオチドとにより形成された複合体で、ポリデオキシリボヌクレオチドがリポソームの外表面に存在するものを医薬、特に抗炎症剤として使用することである。
【００１０】
そのリポソーム複合体は、その溶液にセチルピリジニウムクロライド溶液の小滴を添加すると第４級アンモニウムイオンとの沈殿を形成し、同じポリデオキシリボヌクレオチドとカチオン性リポソームとのリポソーム複合体の溶液で、ポリデオキシリボヌクレオチドがリポソーム内に存在するものを同じ条件下で処理して得ることができるものと異なっていることで特徴付けられる。
【００１１】
本発明の好ましい具体例によれば、ポリデオキシリボヌクレオチドはデフィブロチド（defibrotide）である。
【００１２】
したがって、本発明によれば、治療効果に影響することなく患者に投与される１日容量を減少させることが可能である。
【００１３】
リポソームは、水性相で形成される脂質小嚢であり、一般にリン脂質で構成されている。この化合物は、水と不溶性有機溶媒との存在下で球状シェルを形成し、その壁は二重層で、分子極性部分（親水性）はリポソームの外側にあり、かつ脂質部分（疎水性）は二重層の内側にある。この場合の小嚢は単層と称される。
また、多くの脂質層で構成される多層リポソームもある。
【００１４】
この発明によるリポソームとの複合体に使用される分子量１５０００〜６００００の範囲を有するポリデオキシリボヌクレオチドは、高分子量の核酸の抽出と、それに続く脱ポリマー化によって得ることができる。
【００１５】
高分子量の核酸の抽出は、米国特許第３７７０７２０号（参照としてここに導入）に記載されたようにして行うことができる。分子量１５０００〜３００００の範囲のポリデオキシリボヌクレオチドは、米国特許第４９８５５５２号（ここに参照として導入）に記載された核酸の脱ポリマー化を行うことによって得ることができる。
【００１６】
さらに分子量３００００〜６００００の範囲のポリデオキシリボヌクレオチドは、米国特許第４９８５５５２号の方法と同じ条件を使用し、Method in Enzyme vol. III, p708-712で定義されたごとき可逆性ハイパークロミシティの値が２０〜４０％（非変性サンプルの可逆性ハイパークロミシティの吸収値に対して）の間にあるとき脱ポリマー化を停止するか、可逆性ハイパークロミシティの値が、分子量７０００以上またはそれに等しいポリデオキシリボヌクレオチドを得るための３以上または３に等しいときに脱ポリマー化を停止することによって得ることができることを確かめた。可逆性ハイパークロミシティは脱ポリマー化進行を伴うパラメータである。
【００１７】
カチオン性リポソームとの複合体を形成する好ましいポリデオキシリボヌクレオチドは、１５０００〜３００００の範囲の分子量を有するデフィブロチド（Ｄ．Ｃ．Ｉ．）として知られたものである（Informations Pharmaceutiques O.M.S.n.4, vol.1/1987 p272)。
【００１８】
本発明のリポソームの主要な脂質成分は、リポソームと、他の脂質とリポソーム中で結合できるホスファチジルコリンまたはホスファチジルエタノールアミンである（R.R.C.新版 "Liposomes, a practical approach" IRL Press 1994の文献を参照として導入）。好ましい付随した脂質はエルゴステロールおよびコレステロールである。
【００１９】
この発明の組成物に、公知の抗酸化剤から選択され、かつ前に挙げた引用文献中に列記されている１以上の抗酸化剤を添加することができる。好ましい抗酸化剤はα−トコフェロールである。
【００２０】
本発明のリポソームに、１以上のモノまたはジ置換アミノ基または４級アンモニウム基を含有するカチオン界面活性剤が添加される。その４級アンモニウム基は、炭素数８〜２２の範囲の１以上の脂肪族鎖を含有するものである。 炭素数１８の脂肪族鎖を有する４級アンモニウム界面活性剤が好ましい。
【００２１】
リポソーム脂質とカチオン性界面活性剤の全量におけるモル比は１０：０．０５〜１０：３、好ましくは１０：１である。ホスファチジルコリン（またはホスファチジルエタノールアミン）が、第２で異なる脂質とともに存在するときには、２つの脂質の各々と界面活性剤（ホスファチジルコリンまたはホスファチジルエタノールアミン：第２脂質：界面活性剤）の内部モル比は９：１：０．０５〜７：３：３、好ましくは８：２：１である。リポソーム量と活性成分（ポリデオキシリボヌクレオチド）の量との重量比は１０：２〜１０：０．１、好ましくは１０：１である。
【００２２】
この発明に使用されるカチオン性リポソーム複合体の製造は、D.C.Litzinger, Biochim Biophys. Acta 1281 139-149,1996または上記のＲ．Ｒ．Ｃ．の新版に記載のようにして行うことができる。特に、この発明の複合体を作るのに使用できる方法は次の工程からなる。
【００２３】
ａ．溶媒逆相蒸発法によるリポソームの作成（Azoka P. et Alii. Proc. Natl. Acad. Sci, USA 75 4194 1978参照）：極性（たとえば線状または分枝状Ｃ1〜Ｃ4低級脂肪族アルコール）または非極性（たとえば線状または分枝状Ｃ1〜Ｃ4ジアルキルエーテル、例えば、ジエチルエーテル、部分クロル化Ｃ1〜Ｃ2炭化水素、好ましくはクロロホルム）の有機相で、そこに脂質、カチオン性界面活性剤および抗酸化剤が溶解されているもの４部に、１部の水を加えて得られた２相系を０℃で５〜２０分間音波処理に付し、次いで有機相を減圧下、室温で蒸発させてエマルジョンを得る；
ｂ．次いでそのエマルジョンをＲ．Ｒ．Ｃ．新版の５２〜５４ページに記載の技術にしたがって、孔直径が１００〜６００ｎｍ、好ましくは４００ｎｍを有するポリカーボネート膜に通過させ、この工程を少なくとも３回行い、膜の孔の直径に匹敵する平均直径の小嚢を得る；
ｃ．この水性エマルジョンに凍結乾燥助剤（たとえばサッカロース、ソルビトール、マニトール、フルクトースのようなモノサッカライド、またはデキストラン、または異なる分子量を有するマルトデキストランのようなポリサッカライド）の水溶液を添加した後、凍結乾燥する。その際、助剤は脂質に対して少なくとも７倍過剰、好ましくは１０〜１５倍過剰で用いられる；
ｄ．凍結乾燥エマルジョンを含有する溶液にポリデオキシリボヌクレオチドの希釈滅菌等張水性溶液を滅菌環境下でかつ撹拌下に添加することによる医薬用の最終エマルジョンの製造。このエマルジョンはポリデオキシリボヌクレオチドがイオン結合でリポソーム外壁に結合されているリポソーム複合体を含有したものとして形成される。または滅菌等張溶液を、凍結乾燥リポソームを含有する容器に加え、得られたエマルジョンを、滅菌環境下でポリデオキシリボヌクレオチドを含有する溶液と混合させる。
【００２４】
本発明のリポソームの安定性は、エマルジョン作成直後と２５℃、暗所、滅菌状態下にて３０日間の後にアッセイを行って評価した。
【００２５】
エントラップしたポリデオキシリボヌクレオチドリポソーム複合体を含有するエマルジョン（Gursoyら、上記参照）を同じテストに付し、比較処方として用いた。
【００２６】
本発明の複合体は、長期に高い活性を有し、毒性の副作用のない抗高血圧剤および抗血栓剤としても使用できることを見出している。
【００２７】
薬理活性は次の実験モデルで測定された。
【００２８】
−抗炎症活性（Miyasakaら Eur. J. Pharmacol. 77 229-236 1982）
−動脈性高血圧（F.Trentoら、上記参照）
−抗血栓活性（R. Niada et alii, Thromb. Res. 23 233-246, 1981）。
【００２９】
抗炎症活性に関する実験において、動物胸膜滲出液のポリモルフォヌクレオチドに存在する骨髄パーオキシダーゼを評価した。酵素量は、誘発した炎症に直接比例している。結果は、対照に対して骨髄オーオキシダーゼ（ＭＰＯ）量のパーセント変動として表され、次式による。
【００３０】
（ＭＰＯ処理−ＭＰＯ対照）／ＭＰＯ対照
動脈性高血圧モデルにおいては、活性を測定するのに使用したパラメータはＬ−ＮＡＭＥの処理から３０分間まで内在硝酸酸化物の放出阻害をモニターした血圧である。抗血栓活性モデルにおいては、カロチド温度を局所の血管内皮損傷の誘引後６０分までモニターした。結果は対照に対してテストサンプルによって得られた曲線下の面積の変動％（ΔＡＵＣ％）として表し、次の比による。
【００３１】
（面積処理−面積対照）／面積対照
得られた結果は、それぞれ表１、２、３に示すが、本発明によるリポソームとポリデオキシリボヌクレオチドとの複合体は、対照の処方とは異なって安定であることを示す。
【００３２】
本発明によれば、治療効果を変化させることなく活性物質をより少ない量で患者に投与することが可能となる。
【００３３】
また、適宜処方された同じ複合体エマルジョンを、ならびに適当な活性物質濃度の同じ複合体エマルジョンを、上記した疾病に要求される全治療サイクルに使用することができる。
【００３４】
デフィブロチドとして知られたポリデオキシリボヌクレオチドは、抗血栓活性（R.Niada, Pharmacol. res. Comm.、上記参照）、抗虚血性、細胞保護性（C．Thiermemann、上記参照）、抗炎症活性（G. Rossaoni，J. Cardiovasc. Pharmacol.、上記参照）およびアテローム硬化症（P.Lobelら、Atherosclerosis 80，69-79
1989）を有することも知られている。その活性は、治療有効量で血流中での血管内皮プロスタサイクリンの局所放出に関連している。
【００３５】
本発明に記載のリポソーム−ポリデオキシリボヌクレオチド複合体は血管内皮プロスタサイクリンの持続放出を必要とする疾病の治療に使用できることを見出した。
【００３６】
本発明の複合体を含有する医薬製剤は、通常の担体や賦形剤を含有することができる。その製剤は、滅菌で非パイロジェン性のエマルジョンまたは凍結乾燥物の形であることができ、滅菌容器内に保存され、随時滅菌水性溶剤で溶解できるものがある。この場合リポソーム凍結乾燥物は別に保存され、ポリデオキシリボヌクレオチドはリポソームに加えられる水性滅菌溶剤にあらかじめ溶解されているのが好ましい。
【００３７】
滅菌水性溶剤としては、通常の緩衝剤（クエン酸塩またはリン酸塩）を含有する滅菌等張液を公知の保存剤とともに使用できる。
【００３８】
この発明の複合体を含有するエマルジョンの投与ルートは非経口、たとえば静脈、筋肉内または皮下注射や注入が挙げられる。
【００３９】
その製剤に含まれる活性成分の量は、ポリデオキシリボヌクレオチド１〜２０ｍｇ／ｍｌの範囲である。
【００４０】
リポソーム複合体で投与されるポリデオキシリボヌクレオチドの１日容量は１０〜２００ｍｇ、好ましくは２０〜１２０ｍｇの範囲である。
【００４１】
【実施例】
以下に、本発明の内容を明確にする目的で実施例を示すが、本発明はこの範囲に限定されるものではない。
実施例１ ポリデオキシリボヌクレオチド／リポソームの製造
本発明に使用されたリポソームの製造は、溶媒逆相蒸発法によって行われた。
【００４２】
１００ｍｇの大豆ホスファチジルコリン（ナッターマンホスホリピッドＧｍｂＨ社製、ホスフォリポン９０）、ジオクタデシルジメチルアンモニウムブロミド（フルカケミＡＧ社製、略名ＤＩＤＡＢ）と０．１重量％のα−トコフェロール（フルカケミＡＧ社製）をジエチルエーテルに溶解した。ホスファチジルコリンとカチオン性界面活性剤は１０：１のモル比で混合した。
【００４３】
有機相に再蒸留水を、水１部あたり有機相４部の比で加え、Ｗ／Ｏエマルジョンを得た。
【００４４】
このエマルジョンについて、ブランソン２２００ソニケーターバッジを用いて０℃で音波処理を１０分間行った。次いで、エーテルを減圧下に蒸発除去し、水性リポソーム系を得、これを孔直径０．４μｍのポリカーボネート膜（ヌクレオポール）に通過させた。この膜に通過させる工程は３回以上繰り返した。
【００４５】
脂質重量の１０倍に等しいマンニトール量を添加し、懸濁液を凍結乾燥した。
【００４６】
米国特許第４９８５５５２号による脱ポリマー化によって得た分子量２８０００のポリデオキシリボヌクレオチドの５０ｍｇを生理等張液の５ｍｌに溶解した。上記の得られた凍結乾燥物を５ｍｌの再蒸留水に溶解した。２つの水性相を混合し、撹拌した。得られたエマルジョンにおけるホスファチジルコリンの濃度は１０ｍｇ／ｍｌで、ポリデオキシリボヌクレオチドの濃度は５ｍｇ／ｍｌであった。
【００４７】
実施例２（比較）
リポソーム中にエントラップされたポリデオキシリボヌクレオチドを有する従来技術によるポリデオキシリボヌクレオチド／リポソームの製造（Gursoy et alii、Pharmazie 48(1993)Ｈ７ 559-560）
上記の同じ成分を有する実施例１の同じ有機相を容器中で別々に乾燥した。先の実施例のポリデオキシリボヌクレオチド溶液として作成した分子量１６０００のポリデオキシリボヌクレオチドの水溶液を添加した。活性物質を包むリポソーム小嚢を音波処理によって得た。ホスファチジルコリンとポリデオキシリボヌクレオチドの濃度は実施例１の複合体におけるものと同じであった。
【００４８】
実施例３
実施例１のポリデオキシリボヌクレオチド−リポソーム複合体の電気泳動法による生成の例証
電気泳動は、蛍光剤としてエチジウムブロミドの０．５μｇ／ｍｌを含有する３％アガロースゲル中で行った。電気泳動系は、１〜３ｍｍのゲル層を含有する小さな電気泳動室で構成され、５０ｍＶ電界が印加された。
【００４９】
ゲルには、陰極近くの６つの分離したゾーンに実施例１の溶液２０μｌ（ポリデオキシリボヌクレオチド濃度５ｍｇ／ｍｌ）、ポリデオキシリボヌクレオチド単独を４、３、２、１、０．５ｍｇ／ｍｌの濃度で含有する溶液をそれぞれシードした。
【００５０】
電界は４０分間印加した。ポリデオキシリボヌクレオチドはシードゾーンから陽極に向かって移動する。電気泳動の終わりに、アガロースゲルをエチジウムブロミドで染色した。リポソーム複合体は着色を示さない。ゲルにおいてポリデオキシリボヌクレオチド溶液のシードに対応するバンドが示され、その強度はシードした量に比例している。
【００５１】
実施例４
実施例１によって得たリポソーム−ポリデオキシリボヌクレオチド複合体とポリデオキシリボヌクレオチドがリポソーム内に含まれる複合体（比較の実施例２）の安定性の比較を、ラットでのポリデオキシリボヌクレオチドの抗炎症活性を評価することによって行った。その際ラットは新しく作った前記複合体の溶液のサンプルと、暗所、密閉容器中、２５℃で３０日間保存した前記溶液のサンプルとで処理した。
【００５２】
その際のラットは体重２５０〜２７０ｇのエスディー系雄性ラットであった。
【００５３】
各グループ１８匹で構成した３群を使用し、その各々に次の溶液の１つを所定量それぞれ静脈内注射した。
【００５４】
１．対照グループ：生理溶液２ｍｌ／ｋｇ、
２．リポソーム−ポリデオキシリボヌクレオチド複合体（実施例１）で処理したグループ：１ｍｇ／ｍｌのポリデオキシリボヌクレオチド濃度に等しい量で複合体を含有する生理溶液２ｍｇ／ｋｇ、
３．Ａ．Ｇｕｒｓｏｙら（上記参照）によるリポソーム−ポリデオキシリボヌクレオチド複合体での処理グループ：１ｍｇ／ｍｌのポリデオキシリボヌクレオチド濃度に等しい量で複合体を含有する生理溶液２ｍｇ／ｋｇ。
【００５５】
処置３０分後、緩和なエーテル麻酔下で、動物に１ｗ／ｖ％のカラギニン生理溶液の０．５ｍｌを胸膜内投与し、かつ水の５ｍｌを経口投与して腹膜炎を誘引した。
【００５６】
６時間後に動物を殺し、シリンジを用いて胸膜滲出物を回収し、ポリモルフォヌクレエート好中性白血球（ＰＭＮ）の含量を脊髄パーオキシダーゼ（ＭＰＯ）酵素（この細胞の特徴的な酵素である）をアッセイすることにより決定した。
【００５７】
アッセイはSchierwagen C.ら（Ｊ．Pharmacol. Methods 23 179 1990）の記載にしたがって行った。
【００５８】
滲出物サンプルを撹拌し、その０．２ｍｌを０．５ｗ／ｖ％ＨＴＡＢ（ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド）緩衝液の４．８ｍｌに添加した。次いで、サンプルを、細胞破壊を生ずるように−８０℃で凍結乾燥し、解凍し、次いで１分間、８０ワットの音波処理を行った。次いで、その製剤を、胸膜パーオキシダーゼ阻害物を分解するために２時間、６０℃に加熱し、次いで１１８００ｇにて４℃で５分間遠心分離した。
【００５９】
酵素の分光アッセイ（波長６５０ｎｍ）を行う前に、サンプルをＨＴＡＢ溶液で希釈して、純粋なＭＰＯ酵素を用いて得られた標準直線範囲のリーディング値にした。
【００６０】
結果は、対照でのＭＰＯ量に対する変動パーセントとして表し、以下の表１に報告する。
【００６１】
【表１】
【００６２】
表から明らかなように、２つの製剤の抗炎症活性は０時点で実質的に同じであるが、本発明による製剤の活性は３０日後に当初の値とは明らかに異ならず、一方、比較例のリポソーム含有製剤は当初の値に対して７０％の活性減少を示している。同時に後者の製剤は水相が透明で、再懸濁できない沈殿物が存在していることから、分解されたことが認められた。
この製剤で処理した動物は、明らかな痛みの兆候と顕著な呼吸困難を示した。
【００６３】
実施例５
実施例１によって得られたリポソームポリデオキシリボヌクレオチド複合体とポリデオキシリボヌクレオチドがリポソーム内に含まれる複合体（比較の実施例２）との安定性の比較を次のようにして行った。すなわち新たに作られた上記複合体を含有する溶液のサンプルと、同じ溶液を暗所で密閉容器中、２５℃にて３０日間放置したサンプルとを、内在性硝酸酸化物（ＮＯ）放出の阻害で誘引された高血圧を有するラットに投与し、ポリデオキシリボヌクレオチドの抗高血圧活性を評価した。
【００６４】
絶食させない体重２５０±２０ｇのエスディー系雄性ラットをエチルウレタンで麻酔した。平均動脈血圧（ＭＡＢＰ）を記録するために左頸動脈に、かつテスト組成物を投与するために右頸静脈に、それぞれ２つのカテーテルを挿入した。
器官にカニューレを挿入し、動物体温を３７℃に保持した。ＭＡＢＰを実験中、連続的に記録した。記録系における血液凝固を避けるためにヘパリン（５００Ｕ．Ｉ．／ｋｇ静注）を投与した。
【００６５】
３０分後にラットを均一グループ中で無作為化した。組成物またはプラセボでの処理をボウラスで行い、ただちに還流した。還流の開始から１時間後に全ての動物にＬ−ＮＡＭＥの静脈内ボウラス（１０ｍｇ／ｋｇ）を投与した。Ｌ−ＮＡＭＥの注射後３０分で還流を終了した。
【００６６】
組成物によって誘引された圧の変更を、Ｌ−ＮＡＭＥ処置に続く３０分間隔での曲線下における面積（ＡＵＣ）として表わした。
【００６７】
実験モデルにおいて、動物は４つのグループ（各グループ６匹）に分け、それらの各々に１ｍｌ／ｋｇのボウラスを静脈内投与し、ただちに２ｍｌ／ｋｇ／ｈの還流をさせた。詳細は次のごとくである。
【００６８】
１．対照グループ（ＣＴＲ）：生理溶液１ｍｌ／ｋｇボウラス＋還流で２ｍｌ／ｋｇ／ｈ、
２．生理溶液中１０ｍｇ／ｍｌの濃度での分子量２８０００のポリデオキシリボヌクレオチドのボウラスで処置したグループ（１０ｍｇ／ｋｇの容量（ボウラス））＋還流で２０ｍｇ／ｋｇ／ｈ、
３．生理溶液中ポリデオキシリボヌクレオチドの濃度５ｍｇ／ｍｌで、本発明によるリポソーム−ポリデオキシリボヌクレオチド複合体のボウラスで処置したグループ（５ｍｇ／ｋｇの容量（ボウラス））＋還流で１０ｍｇ／ｋｇ／ｈ、
４．生理溶液中５ｍｇ／ｍｌのポリデオキシリボヌクレオチド濃度で、比較の実施例２によるリポソームポリデオキシリボヌクレオチド複合体のボウラスで処置したグループ（５ｍｇ／ｋｇの容量（ボウラス））＋還流で１０ｍｇ／ｋｇ／ｈ。
【００６９】
上記に言及したリポソーム複合体を含有する新たに作成した溶液のサンプルと、同じ溶液を暗所、２５℃で密閉容器中貯蔵した同じ溶液のサンプルとを使用して測定した薬理活性を表２に報告する。
【００７０】
【表２】
【００７１】
２つの製剤は０時点でほとんど同じ抗高血圧活性を有し、３０日後に従来技術による製剤の活性は対応する当初値に対して約７０％低下したことを示している。
さらにその製剤で処理した動物は明らかな痛みの兆候と顕著な呼吸困難を示した。
【００７２】
実施例６
実施例１によるリポソームポリデオキシリボヌクレオチド複合体とポリデオキシリボヌクレオチドがリポソーム内に含まれる複合体（比較の実施例２）との安定性の比較を、ラットにおけるポリデオキシリボヌクレオチドの抗血栓活性を評価することによって行った。すなわち新たに作られた上記複合体を含有する溶液のサンプルと、暗所、密閉容器中２５℃で３０日間保存した同じ溶液のサンプルとをラットに投与した。
【００７３】
詳細は次のごとくである。
【００７４】
１６時間絶食させた体重２００〜２３０ｇのエスディー系雄性ラットをウレタン（１．２５ｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）で麻酔した。動物の右頸動脈と左頸静脈を単離した。双極性電極（イタリア、ビアレセ カメリオ ウゴ バシレのレジョンプロジューシングデバイス３５０）を左動脈に配置し、０．５ｃｍ距離で感熱性プローブをポリグラフに結合した。製剤を投与するためにカテーテルを血管に挿入した。
【００７５】
１５分の安定下の後、頸動脈温度を電極による血管内皮損傷感応前５分から感応後６０まで連続的に記録した。これは容器の低下する温度と血流減少の相関によって内管腔トロンビン生成を直接測定するものである。血管内皮損傷は一連の５回の電気刺激で起こした。刺激は１分間隔で、損傷動脈で測定したインピーダンスが１０ｍＡであるように行った。インピーダンスはテスターで測定して刺激の最初の３０秒間、各動物で調整し、約３０Ｖの負荷電圧を印加した。
【００７６】
頸動脈温度を電気刺激直前（基本値）および刺激後一定の間隔（５、１０、１５、３０、４５および６０分）で測定した。
【００７７】
各グループは１０〜１２のラットで形成した。
【００７８】
全ての処置は、電気刺激の開始５分前に静脈内ボウラスを投与して行った。
【００７９】
グループは次のごとくであった。
１．動物を上記のごとく操作し、モニターしたが電気刺激に付さなかった対照グループＳＨＡＭ、
２．生理溶液（１．５ｍｌ／ｋｇ、ｉ．ｖ．）で処置した対照グループ、
３．リポソーム−ポリデオキシリボヌクレオチド複合体（実施例１）で処置したグループ：ポリデオキシリボヌクレオチド濃度が５ｍｇ／ｍｌに等しい量で複合体を含有する生理溶液、投与量７．５ｍｇ／ｋｇ、
４．A. Gursoyら（上記参照）によるリポソーム−ポリデオキシリボヌクレオチド複合体で処置したグループ：ポリデオキシリボヌクレオチド濃度が５ｍｇ／ｍｌに等しい量で複合体を含有する生理溶液、投与量７．５ｍｇ／ｋｇ。
【００８０】
活性は上記２つの複合体の溶液を作成した時点と、暗所、２５℃でその溶液を３０日間放置した後に測定した。結果を表３に報告する。
【００８１】
【表３】
【００８２】
表から明らかなように０時点における２つの製剤の抗血栓活性は実質的に比較しえるものであるが、３０日後の従来技術による製剤の活性は対応する当初値に比較して約７０％低下していることがわかる。
【００８３】
実施例７
本発明に使用したリポソームを含有し、単回投与用の医薬製剤は次のとおりである。
【００８４】
凍結乾燥リポソームを含有する３ｍｌの滅菌培養：
−ホスフォリポン９０ １００ｍｇ
−ＤＩＤＡＢ １０ｍｇ
−α−トコフェロール ０．１ｍｇ
−サッカロース １ｇ
使用前に注射用の水１ｍｌを添加する。次いで１ｍｌのディスポーザブル滅菌シリンジ中であらかじめ作られた次の滅菌溶液に滅菌状態で上記の溶液を添加する。
【００８５】
−ポリデオキシリボヌクレオチド（実施例１参照） １０ｍｇ
−クエン酸３ナトリウム２水溶物 ２．５ｍｇ
−注射用水と保存剤、加えて１ｍｌ
【００８６】
実施例８ 全治療サイクルに使用すべき即席医薬製剤
凍結乾燥リポソームを含有する３０ｍｌ滅菌ビン
−ホスフォリポン９０ １ｇ
−ＤＩＤＡＢ １００ｍｇ
−α−トコフェロール １ｍｇ
−サッカロース １０ｇ
使用前にビン中に１０ｍｌの注射用水を添加する。そこで得られるエマルジョンに、１５ｍｌのビンまたは１０ｍｌのディスポーザブルの予め作られたシリンジ中に含有させた次の滅菌容器を添加する。
【００８７】
−ポリデオキシリボヌクレオチド（実施例１参照） １００ｍｇ
−クエン酸３ナトリウム２水和物 ２５ｍｇ
−注射用水と保存剤、加えて１０ｍｌ
上記製剤は５日間の継続する治療に２０ｇ／容量を提供する。
【発明の属する技術分野】
本発明は、カチオン性リポソームとポリデオキシリボヌクレオチドとにより形成された複合体の医薬としての使用に関する。より詳しくは、この発明は抗炎症活性を有する医薬として長期に顕著な安定性を有する上記複合体の使用に関する。
【０００２】
【従来技術】
リポソームは薬剤の全身投与用の賦形剤として使用できることがよく知られている。リポソームは静脈、皮下または筋肉注射によるか、あるいは注入によって投与される。
【０００３】
リポソームとＤＮＡとの複合体の構造に関して、オリゴデオキシリボヌクレオチドとプラスミドＤＮＡとが、カチオン性リポソームの外表面にイオン結合によって結合できることが知られている（C.F.Bennet et Al. Mol. Pharmacol. 41, 1023-1033,1992; Xiang Gao et Al. Biochem. Biophys. Res. Comm. 179, 280-285, 1991)。しかし、その複合体の貯蔵安定性ならびに抗炎症医薬としての用途についての指示はされていない。またオリゴヌクレオチドが８〜５０のヌクレオチドの鎖長さを有する場合に、これらはリポソームにエントラップされ得ることが特許出願ＷＯ９７／０４７８７号によって知られている。この文献には複合体の貯蔵安定性についての情報は与えられていない。
【０００４】
リポソームと、核酸の脱ポリマー化によって得られた分子量１６，０００Ｄａを有するポリデオキシリボヌクレオチドの複合体で、それらのポリマーが脂質小嚢内に含有されているものが記載されている（Gursoy et Alii, Pharmazie 48, (1993) H.7, 559-560)。同じものが上記のＷＯ９７／０４７８７号にも記載されている。
【０００５】
リポソームとオリゴヌクレオチドおよびポリデオキシリボヌクレオチドとの複合体は、これらヌクレオチドの薬理活性が顕著に増加する性質を有することも知られている（Bennet et Al, Gursoy et Al, 上記参照；A. Colige, Biochemistry 1993, 32, 7-11)。しかし、本出願人が行った実験によれば、これらの従来技術の複合体は、治療剤として使用できないことがわかった。というのは、それらを投与するのに必要な水性媒体に懸濁すると、それらは非常に速やかに活性が失われるからである。その他、複合体において、例えば、ステアリルアミンや四級アンモニウム塩系界面活性剤は強い毒性剤になって毒性の副作用の原因となりうる。複合体の分解は、水性相の物理的外観が経時変化し、乳白色（当初エマルジョン）から最終的に沈殿物の形成を伴った透明に変わることから明らかである。
【０００６】
ポリデオキシリボヌクレオチド、および特にデフィブロチドとして知られたものが、プロフィブリノリティック活性（R. Pescador et al. Thromb. Res.30:1-11, 1983）、抗血栓−血栓崩壊活性（R. Nida et Al., Pharmacol. Res. Commun. 14 (10), 949-957 1982）、抗高血圧活性（F. Trento et Al. XXVII Congr. Naz. Soc. It. Farmacol. Torino 25-29 September 1994, Abstract Book Pag. 703）、抗虚血活性、細胞保護活性（G. Rossoni et Al. J. Cardiovasc. Pharmacol. 27, 680-685 1986)および抗炎症活性（R. Scalia, Meth. Find. Exp. Clin. Pharmacol. 18(10) 669-676 1996）を有する医薬として周知である。１日投与量は６００〜１２００ｍｇである。これらのもののすべての薬理活性は、循環系血管内皮から内因性プロスタサイリンの治療上有効な量が局所的に放出される性質に本質的によっている（上記 R. Niada et alii，C Thiemermann et Alii, Am.J. Cardiol. 56 978-982 1985参照)。
【０００７】
【課題を解決するための手段及び発明の実施の形態】
本発明者らは、高い活性が持続し、毒性の副作用を有しないリポソームとポリデオキシリボヌクレオチドとの複合体が製造できることを、驚くべきことに、かつ予期に反してここに見出した。
【０００８】
この発見により、この発明の複合体を含有する水性エマルジョンを１日以上継続治療に、また注入剤として長期持続投与に使用することができる。
【０００９】
したがって、この発明の目的はカチオン性リポソームと、核酸の脱ポリマー化によって得ることができる分子量７０００〜６００００、好ましくは１００００〜６００００、最も好ましくは１５０００〜６００００Ｄａの範囲であるポリデオキシリボヌクレオチドとにより形成された複合体で、ポリデオキシリボヌクレオチドがリポソームの外表面に存在するものを医薬、特に抗炎症剤として使用することである。
【００１０】
そのリポソーム複合体は、その溶液にセチルピリジニウムクロライド溶液の小滴を添加すると第４級アンモニウムイオンとの沈殿を形成し、同じポリデオキシリボヌクレオチドとカチオン性リポソームとのリポソーム複合体の溶液で、ポリデオキシリボヌクレオチドがリポソーム内に存在するものを同じ条件下で処理して得ることができるものと異なっていることで特徴付けられる。
【００１１】
本発明の好ましい具体例によれば、ポリデオキシリボヌクレオチドはデフィブロチド（defibrotide）である。
【００１２】
したがって、本発明によれば、治療効果に影響することなく患者に投与される１日容量を減少させることが可能である。
【００１３】
リポソームは、水性相で形成される脂質小嚢であり、一般にリン脂質で構成されている。この化合物は、水と不溶性有機溶媒との存在下で球状シェルを形成し、その壁は二重層で、分子極性部分（親水性）はリポソームの外側にあり、かつ脂質部分（疎水性）は二重層の内側にある。この場合の小嚢は単層と称される。
また、多くの脂質層で構成される多層リポソームもある。
【００１４】
この発明によるリポソームとの複合体に使用される分子量１５０００〜６００００の範囲を有するポリデオキシリボヌクレオチドは、高分子量の核酸の抽出と、それに続く脱ポリマー化によって得ることができる。
【００１５】
高分子量の核酸の抽出は、米国特許第３７７０７２０号（参照としてここに導入）に記載されたようにして行うことができる。分子量１５０００〜３００００の範囲のポリデオキシリボヌクレオチドは、米国特許第４９８５５５２号（ここに参照として導入）に記載された核酸の脱ポリマー化を行うことによって得ることができる。
【００１６】
さらに分子量３００００〜６００００の範囲のポリデオキシリボヌクレオチドは、米国特許第４９８５５５２号の方法と同じ条件を使用し、Method in Enzyme vol. III, p708-712で定義されたごとき可逆性ハイパークロミシティの値が２０〜４０％（非変性サンプルの可逆性ハイパークロミシティの吸収値に対して）の間にあるとき脱ポリマー化を停止するか、可逆性ハイパークロミシティの値が、分子量７０００以上またはそれに等しいポリデオキシリボヌクレオチドを得るための３以上または３に等しいときに脱ポリマー化を停止することによって得ることができることを確かめた。可逆性ハイパークロミシティは脱ポリマー化進行を伴うパラメータである。
【００１７】
カチオン性リポソームとの複合体を形成する好ましいポリデオキシリボヌクレオチドは、１５０００〜３００００の範囲の分子量を有するデフィブロチド（Ｄ．Ｃ．Ｉ．）として知られたものである（Informations Pharmaceutiques O.M.S.n.4, vol.1/1987 p272)。
【００１８】
本発明のリポソームの主要な脂質成分は、リポソームと、他の脂質とリポソーム中で結合できるホスファチジルコリンまたはホスファチジルエタノールアミンである（R.R.C.新版 "Liposomes, a practical approach" IRL Press 1994の文献を参照として導入）。好ましい付随した脂質はエルゴステロールおよびコレステロールである。
【００１９】
この発明の組成物に、公知の抗酸化剤から選択され、かつ前に挙げた引用文献中に列記されている１以上の抗酸化剤を添加することができる。好ましい抗酸化剤はα−トコフェロールである。
【００２０】
本発明のリポソームに、１以上のモノまたはジ置換アミノ基または４級アンモニウム基を含有するカチオン界面活性剤が添加される。その４級アンモニウム基は、炭素数８〜２２の範囲の１以上の脂肪族鎖を含有するものである。 炭素数１８の脂肪族鎖を有する４級アンモニウム界面活性剤が好ましい。
【００２１】
リポソーム脂質とカチオン性界面活性剤の全量におけるモル比は１０：０．０５〜１０：３、好ましくは１０：１である。ホスファチジルコリン（またはホスファチジルエタノールアミン）が、第２で異なる脂質とともに存在するときには、２つの脂質の各々と界面活性剤（ホスファチジルコリンまたはホスファチジルエタノールアミン：第２脂質：界面活性剤）の内部モル比は９：１：０．０５〜７：３：３、好ましくは８：２：１である。リポソーム量と活性成分（ポリデオキシリボヌクレオチド）の量との重量比は１０：２〜１０：０．１、好ましくは１０：１である。
【００２２】
この発明に使用されるカチオン性リポソーム複合体の製造は、D.C.Litzinger, Biochim Biophys. Acta 1281 139-149,1996または上記のＲ．Ｒ．Ｃ．の新版に記載のようにして行うことができる。特に、この発明の複合体を作るのに使用できる方法は次の工程からなる。
【００２３】
ａ．溶媒逆相蒸発法によるリポソームの作成（Azoka P. et Alii. Proc. Natl. Acad. Sci, USA 75 4194 1978参照）：極性（たとえば線状または分枝状Ｃ1〜Ｃ4低級脂肪族アルコール）または非極性（たとえば線状または分枝状Ｃ1〜Ｃ4ジアルキルエーテル、例えば、ジエチルエーテル、部分クロル化Ｃ1〜Ｃ2炭化水素、好ましくはクロロホルム）の有機相で、そこに脂質、カチオン性界面活性剤および抗酸化剤が溶解されているもの４部に、１部の水を加えて得られた２相系を０℃で５〜２０分間音波処理に付し、次いで有機相を減圧下、室温で蒸発させてエマルジョンを得る；
ｂ．次いでそのエマルジョンをＲ．Ｒ．Ｃ．新版の５２〜５４ページに記載の技術にしたがって、孔直径が１００〜６００ｎｍ、好ましくは４００ｎｍを有するポリカーボネート膜に通過させ、この工程を少なくとも３回行い、膜の孔の直径に匹敵する平均直径の小嚢を得る；
ｃ．この水性エマルジョンに凍結乾燥助剤（たとえばサッカロース、ソルビトール、マニトール、フルクトースのようなモノサッカライド、またはデキストラン、または異なる分子量を有するマルトデキストランのようなポリサッカライド）の水溶液を添加した後、凍結乾燥する。その際、助剤は脂質に対して少なくとも７倍過剰、好ましくは１０〜１５倍過剰で用いられる；
ｄ．凍結乾燥エマルジョンを含有する溶液にポリデオキシリボヌクレオチドの希釈滅菌等張水性溶液を滅菌環境下でかつ撹拌下に添加することによる医薬用の最終エマルジョンの製造。このエマルジョンはポリデオキシリボヌクレオチドがイオン結合でリポソーム外壁に結合されているリポソーム複合体を含有したものとして形成される。または滅菌等張溶液を、凍結乾燥リポソームを含有する容器に加え、得られたエマルジョンを、滅菌環境下でポリデオキシリボヌクレオチドを含有する溶液と混合させる。
【００２４】
本発明のリポソームの安定性は、エマルジョン作成直後と２５℃、暗所、滅菌状態下にて３０日間の後にアッセイを行って評価した。
【００２５】
エントラップしたポリデオキシリボヌクレオチドリポソーム複合体を含有するエマルジョン（Gursoyら、上記参照）を同じテストに付し、比較処方として用いた。
【００２６】
本発明の複合体は、長期に高い活性を有し、毒性の副作用のない抗高血圧剤および抗血栓剤としても使用できることを見出している。
【００２７】
薬理活性は次の実験モデルで測定された。
【００２８】
−抗炎症活性（Miyasakaら Eur. J. Pharmacol. 77 229-236 1982）
−動脈性高血圧（F.Trentoら、上記参照）
−抗血栓活性（R. Niada et alii, Thromb. Res. 23 233-246, 1981）。
【００２９】
抗炎症活性に関する実験において、動物胸膜滲出液のポリモルフォヌクレオチドに存在する骨髄パーオキシダーゼを評価した。酵素量は、誘発した炎症に直接比例している。結果は、対照に対して骨髄オーオキシダーゼ（ＭＰＯ）量のパーセント変動として表され、次式による。
【００３０】
（ＭＰＯ処理−ＭＰＯ対照）／ＭＰＯ対照
動脈性高血圧モデルにおいては、活性を測定するのに使用したパラメータはＬ−ＮＡＭＥの処理から３０分間まで内在硝酸酸化物の放出阻害をモニターした血圧である。抗血栓活性モデルにおいては、カロチド温度を局所の血管内皮損傷の誘引後６０分までモニターした。結果は対照に対してテストサンプルによって得られた曲線下の面積の変動％（ΔＡＵＣ％）として表し、次の比による。
【００３１】
（面積処理−面積対照）／面積対照
得られた結果は、それぞれ表１、２、３に示すが、本発明によるリポソームとポリデオキシリボヌクレオチドとの複合体は、対照の処方とは異なって安定であることを示す。
【００３２】
本発明によれば、治療効果を変化させることなく活性物質をより少ない量で患者に投与することが可能となる。
【００３３】
また、適宜処方された同じ複合体エマルジョンを、ならびに適当な活性物質濃度の同じ複合体エマルジョンを、上記した疾病に要求される全治療サイクルに使用することができる。
【００３４】
デフィブロチドとして知られたポリデオキシリボヌクレオチドは、抗血栓活性（R.Niada, Pharmacol. res. Comm.、上記参照）、抗虚血性、細胞保護性（C．Thiermemann、上記参照）、抗炎症活性（G. Rossaoni，J. Cardiovasc. Pharmacol.、上記参照）およびアテローム硬化症（P.Lobelら、Atherosclerosis 80，69-79
1989）を有することも知られている。その活性は、治療有効量で血流中での血管内皮プロスタサイクリンの局所放出に関連している。
【００３５】
本発明に記載のリポソーム−ポリデオキシリボヌクレオチド複合体は血管内皮プロスタサイクリンの持続放出を必要とする疾病の治療に使用できることを見出した。
【００３６】
本発明の複合体を含有する医薬製剤は、通常の担体や賦形剤を含有することができる。その製剤は、滅菌で非パイロジェン性のエマルジョンまたは凍結乾燥物の形であることができ、滅菌容器内に保存され、随時滅菌水性溶剤で溶解できるものがある。この場合リポソーム凍結乾燥物は別に保存され、ポリデオキシリボヌクレオチドはリポソームに加えられる水性滅菌溶剤にあらかじめ溶解されているのが好ましい。
【００３７】
滅菌水性溶剤としては、通常の緩衝剤（クエン酸塩またはリン酸塩）を含有する滅菌等張液を公知の保存剤とともに使用できる。
【００３８】
この発明の複合体を含有するエマルジョンの投与ルートは非経口、たとえば静脈、筋肉内または皮下注射や注入が挙げられる。
【００３９】
その製剤に含まれる活性成分の量は、ポリデオキシリボヌクレオチド１〜２０ｍｇ／ｍｌの範囲である。
【００４０】
リポソーム複合体で投与されるポリデオキシリボヌクレオチドの１日容量は１０〜２００ｍｇ、好ましくは２０〜１２０ｍｇの範囲である。
【００４１】
【実施例】
以下に、本発明の内容を明確にする目的で実施例を示すが、本発明はこの範囲に限定されるものではない。
実施例１ ポリデオキシリボヌクレオチド／リポソームの製造
本発明に使用されたリポソームの製造は、溶媒逆相蒸発法によって行われた。
【００４２】
１００ｍｇの大豆ホスファチジルコリン（ナッターマンホスホリピッドＧｍｂＨ社製、ホスフォリポン９０）、ジオクタデシルジメチルアンモニウムブロミド（フルカケミＡＧ社製、略名ＤＩＤＡＢ）と０．１重量％のα−トコフェロール（フルカケミＡＧ社製）をジエチルエーテルに溶解した。ホスファチジルコリンとカチオン性界面活性剤は１０：１のモル比で混合した。
【００４３】
有機相に再蒸留水を、水１部あたり有機相４部の比で加え、Ｗ／Ｏエマルジョンを得た。
【００４４】
このエマルジョンについて、ブランソン２２００ソニケーターバッジを用いて０℃で音波処理を１０分間行った。次いで、エーテルを減圧下に蒸発除去し、水性リポソーム系を得、これを孔直径０．４μｍのポリカーボネート膜（ヌクレオポール）に通過させた。この膜に通過させる工程は３回以上繰り返した。
【００４５】
脂質重量の１０倍に等しいマンニトール量を添加し、懸濁液を凍結乾燥した。
【００４６】
米国特許第４９８５５５２号による脱ポリマー化によって得た分子量２８０００のポリデオキシリボヌクレオチドの５０ｍｇを生理等張液の５ｍｌに溶解した。上記の得られた凍結乾燥物を５ｍｌの再蒸留水に溶解した。２つの水性相を混合し、撹拌した。得られたエマルジョンにおけるホスファチジルコリンの濃度は１０ｍｇ／ｍｌで、ポリデオキシリボヌクレオチドの濃度は５ｍｇ／ｍｌであった。
【００４７】
実施例２（比較）
リポソーム中にエントラップされたポリデオキシリボヌクレオチドを有する従来技術によるポリデオキシリボヌクレオチド／リポソームの製造（Gursoy et alii、Pharmazie 48(1993)Ｈ７ 559-560）
上記の同じ成分を有する実施例１の同じ有機相を容器中で別々に乾燥した。先の実施例のポリデオキシリボヌクレオチド溶液として作成した分子量１６０００のポリデオキシリボヌクレオチドの水溶液を添加した。活性物質を包むリポソーム小嚢を音波処理によって得た。ホスファチジルコリンとポリデオキシリボヌクレオチドの濃度は実施例１の複合体におけるものと同じであった。
【００４８】
実施例３
実施例１のポリデオキシリボヌクレオチド−リポソーム複合体の電気泳動法による生成の例証
電気泳動は、蛍光剤としてエチジウムブロミドの０．５μｇ／ｍｌを含有する３％アガロースゲル中で行った。電気泳動系は、１〜３ｍｍのゲル層を含有する小さな電気泳動室で構成され、５０ｍＶ電界が印加された。
【００４９】
ゲルには、陰極近くの６つの分離したゾーンに実施例１の溶液２０μｌ（ポリデオキシリボヌクレオチド濃度５ｍｇ／ｍｌ）、ポリデオキシリボヌクレオチド単独を４、３、２、１、０．５ｍｇ／ｍｌの濃度で含有する溶液をそれぞれシードした。
【００５０】
電界は４０分間印加した。ポリデオキシリボヌクレオチドはシードゾーンから陽極に向かって移動する。電気泳動の終わりに、アガロースゲルをエチジウムブロミドで染色した。リポソーム複合体は着色を示さない。ゲルにおいてポリデオキシリボヌクレオチド溶液のシードに対応するバンドが示され、その強度はシードした量に比例している。
【００５１】
実施例４
実施例１によって得たリポソーム−ポリデオキシリボヌクレオチド複合体とポリデオキシリボヌクレオチドがリポソーム内に含まれる複合体（比較の実施例２）の安定性の比較を、ラットでのポリデオキシリボヌクレオチドの抗炎症活性を評価することによって行った。その際ラットは新しく作った前記複合体の溶液のサンプルと、暗所、密閉容器中、２５℃で３０日間保存した前記溶液のサンプルとで処理した。
【００５２】
その際のラットは体重２５０〜２７０ｇのエスディー系雄性ラットであった。
【００５３】
各グループ１８匹で構成した３群を使用し、その各々に次の溶液の１つを所定量それぞれ静脈内注射した。
【００５４】
１．対照グループ：生理溶液２ｍｌ／ｋｇ、
２．リポソーム−ポリデオキシリボヌクレオチド複合体（実施例１）で処理したグループ：１ｍｇ／ｍｌのポリデオキシリボヌクレオチド濃度に等しい量で複合体を含有する生理溶液２ｍｇ／ｋｇ、
３．Ａ．Ｇｕｒｓｏｙら（上記参照）によるリポソーム−ポリデオキシリボヌクレオチド複合体での処理グループ：１ｍｇ／ｍｌのポリデオキシリボヌクレオチド濃度に等しい量で複合体を含有する生理溶液２ｍｇ／ｋｇ。
【００５５】
処置３０分後、緩和なエーテル麻酔下で、動物に１ｗ／ｖ％のカラギニン生理溶液の０．５ｍｌを胸膜内投与し、かつ水の５ｍｌを経口投与して腹膜炎を誘引した。
【００５６】
６時間後に動物を殺し、シリンジを用いて胸膜滲出物を回収し、ポリモルフォヌクレエート好中性白血球（ＰＭＮ）の含量を脊髄パーオキシダーゼ（ＭＰＯ）酵素（この細胞の特徴的な酵素である）をアッセイすることにより決定した。
【００５７】
アッセイはSchierwagen C.ら（Ｊ．Pharmacol. Methods 23 179 1990）の記載にしたがって行った。
【００５８】
滲出物サンプルを撹拌し、その０．２ｍｌを０．５ｗ／ｖ％ＨＴＡＢ（ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド）緩衝液の４．８ｍｌに添加した。次いで、サンプルを、細胞破壊を生ずるように−８０℃で凍結乾燥し、解凍し、次いで１分間、８０ワットの音波処理を行った。次いで、その製剤を、胸膜パーオキシダーゼ阻害物を分解するために２時間、６０℃に加熱し、次いで１１８００ｇにて４℃で５分間遠心分離した。
【００５９】
酵素の分光アッセイ（波長６５０ｎｍ）を行う前に、サンプルをＨＴＡＢ溶液で希釈して、純粋なＭＰＯ酵素を用いて得られた標準直線範囲のリーディング値にした。
【００６０】
結果は、対照でのＭＰＯ量に対する変動パーセントとして表し、以下の表１に報告する。
【００６１】
【表１】
表から明らかなように、２つの製剤の抗炎症活性は０時点で実質的に同じであるが、本発明による製剤の活性は３０日後に当初の値とは明らかに異ならず、一方、比較例のリポソーム含有製剤は当初の値に対して７０％の活性減少を示している。同時に後者の製剤は水相が透明で、再懸濁できない沈殿物が存在していることから、分解されたことが認められた。
この製剤で処理した動物は、明らかな痛みの兆候と顕著な呼吸困難を示した。
【００６３】
実施例５
実施例１によって得られたリポソームポリデオキシリボヌクレオチド複合体とポリデオキシリボヌクレオチドがリポソーム内に含まれる複合体（比較の実施例２）との安定性の比較を次のようにして行った。すなわち新たに作られた上記複合体を含有する溶液のサンプルと、同じ溶液を暗所で密閉容器中、２５℃にて３０日間放置したサンプルとを、内在性硝酸酸化物（ＮＯ）放出の阻害で誘引された高血圧を有するラットに投与し、ポリデオキシリボヌクレオチドの抗高血圧活性を評価した。
【００６４】
絶食させない体重２５０±２０ｇのエスディー系雄性ラットをエチルウレタンで麻酔した。平均動脈血圧（ＭＡＢＰ）を記録するために左頸動脈に、かつテスト組成物を投与するために右頸静脈に、それぞれ２つのカテーテルを挿入した。
器官にカニューレを挿入し、動物体温を３７℃に保持した。ＭＡＢＰを実験中、連続的に記録した。記録系における血液凝固を避けるためにヘパリン（５００Ｕ．Ｉ．／ｋｇ静注）を投与した。
【００６５】
３０分後にラットを均一グループ中で無作為化した。組成物またはプラセボでの処理をボウラスで行い、ただちに還流した。還流の開始から１時間後に全ての動物にＬ−ＮＡＭＥの静脈内ボウラス（１０ｍｇ／ｋｇ）を投与した。Ｌ−ＮＡＭＥの注射後３０分で還流を終了した。
【００６６】
組成物によって誘引された圧の変更を、Ｌ−ＮＡＭＥ処置に続く３０分間隔での曲線下における面積（ＡＵＣ）として表わした。
【００６７】
実験モデルにおいて、動物は４つのグループ（各グループ６匹）に分け、それらの各々に１ｍｌ／ｋｇのボウラスを静脈内投与し、ただちに２ｍｌ／ｋｇ／ｈの還流をさせた。詳細は次のごとくである。
【００６８】
１．対照グループ（ＣＴＲ）：生理溶液１ｍｌ／ｋｇボウラス＋還流で２ｍｌ／ｋｇ／ｈ、
２．生理溶液中１０ｍｇ／ｍｌの濃度での分子量２８０００のポリデオキシリボヌクレオチドのボウラスで処置したグループ（１０ｍｇ／ｋｇの容量（ボウラス））＋還流で２０ｍｇ／ｋｇ／ｈ、
３．生理溶液中ポリデオキシリボヌクレオチドの濃度５ｍｇ／ｍｌで、本発明によるリポソーム−ポリデオキシリボヌクレオチド複合体のボウラスで処置したグループ（５ｍｇ／ｋｇの容量（ボウラス））＋還流で１０ｍｇ／ｋｇ／ｈ、
４．生理溶液中５ｍｇ／ｍｌのポリデオキシリボヌクレオチド濃度で、比較の実施例２によるリポソームポリデオキシリボヌクレオチド複合体のボウラスで処置したグループ（５ｍｇ／ｋｇの容量（ボウラス））＋還流で１０ｍｇ／ｋｇ／ｈ。
【００６９】
上記に言及したリポソーム複合体を含有する新たに作成した溶液のサンプルと、同じ溶液を暗所、２５℃で密閉容器中貯蔵した同じ溶液のサンプルとを使用して測定した薬理活性を表２に報告する。
【００７０】
【表２】
２つの製剤は０時点でほとんど同じ抗高血圧活性を有し、３０日後に従来技術による製剤の活性は対応する当初値に対して約７０％低下したことを示している。
さらにその製剤で処理した動物は明らかな痛みの兆候と顕著な呼吸困難を示した。
【００７２】
実施例６
実施例１によるリポソームポリデオキシリボヌクレオチド複合体とポリデオキシリボヌクレオチドがリポソーム内に含まれる複合体（比較の実施例２）との安定性の比較を、ラットにおけるポリデオキシリボヌクレオチドの抗血栓活性を評価することによって行った。すなわち新たに作られた上記複合体を含有する溶液のサンプルと、暗所、密閉容器中２５℃で３０日間保存した同じ溶液のサンプルとをラットに投与した。
【００７３】
詳細は次のごとくである。
【００７４】
１６時間絶食させた体重２００〜２３０ｇのエスディー系雄性ラットをウレタン（１．２５ｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）で麻酔した。動物の右頸動脈と左頸静脈を単離した。双極性電極（イタリア、ビアレセ カメリオ ウゴ バシレのレジョンプロジューシングデバイス３５０）を左動脈に配置し、０．５ｃｍ距離で感熱性プローブをポリグラフに結合した。製剤を投与するためにカテーテルを血管に挿入した。
【００７５】
１５分の安定下の後、頸動脈温度を電極による血管内皮損傷感応前５分から感応後６０まで連続的に記録した。これは容器の低下する温度と血流減少の相関によって内管腔トロンビン生成を直接測定するものである。血管内皮損傷は一連の５回の電気刺激で起こした。刺激は１分間隔で、損傷動脈で測定したインピーダンスが１０ｍＡであるように行った。インピーダンスはテスターで測定して刺激の最初の３０秒間、各動物で調整し、約３０Ｖの負荷電圧を印加した。
【００７６】
頸動脈温度を電気刺激直前（基本値）および刺激後一定の間隔（５、１０、１５、３０、４５および６０分）で測定した。
【００７７】
各グループは１０〜１２のラットで形成した。
【００７８】
全ての処置は、電気刺激の開始５分前に静脈内ボウラスを投与して行った。
【００７９】
グループは次のごとくであった。
１．動物を上記のごとく操作し、モニターしたが電気刺激に付さなかった対照グループＳＨＡＭ、
２．生理溶液（１．５ｍｌ／ｋｇ、ｉ．ｖ．）で処置した対照グループ、
３．リポソーム−ポリデオキシリボヌクレオチド複合体（実施例１）で処置したグループ：ポリデオキシリボヌクレオチド濃度が５ｍｇ／ｍｌに等しい量で複合体を含有する生理溶液、投与量７．５ｍｇ／ｋｇ、
４．A. Gursoyら（上記参照）によるリポソーム−ポリデオキシリボヌクレオチド複合体で処置したグループ：ポリデオキシリボヌクレオチド濃度が５ｍｇ／ｍｌに等しい量で複合体を含有する生理溶液、投与量７．５ｍｇ／ｋｇ。
【００８０】
活性は上記２つの複合体の溶液を作成した時点と、暗所、２５℃でその溶液を３０日間放置した後に測定した。結果を表３に報告する。
【００８１】
【表３】
表から明らかなように０時点における２つの製剤の抗血栓活性は実質的に比較しえるものであるが、３０日後の従来技術による製剤の活性は対応する当初値に比較して約７０％低下していることがわかる。
【００８３】
実施例７
本発明に使用したリポソームを含有し、単回投与用の医薬製剤は次のとおりである。
【００８４】
凍結乾燥リポソームを含有する３ｍｌの滅菌培養：
−ホスフォリポン９０ １００ｍｇ
−ＤＩＤＡＢ １０ｍｇ
−α−トコフェロール ０．１ｍｇ
−サッカロース １ｇ
使用前に注射用の水１ｍｌを添加する。次いで１ｍｌのディスポーザブル滅菌シリンジ中であらかじめ作られた次の滅菌溶液に滅菌状態で上記の溶液を添加する。
【００８５】
−ポリデオキシリボヌクレオチド（実施例１参照） １０ｍｇ
−クエン酸３ナトリウム２水溶物 ２．５ｍｇ
−注射用水と保存剤、加えて１ｍｌ
【００８６】
実施例８ 全治療サイクルに使用すべき即席医薬製剤
凍結乾燥リポソームを含有する３０ｍｌ滅菌ビン
−ホスフォリポン９０ １ｇ
−ＤＩＤＡＢ １００ｍｇ
−α−トコフェロール １ｍｇ
−サッカロース １０ｇ
使用前にビン中に１０ｍｌの注射用水を添加する。そこで得られるエマルジョンに、１５ｍｌのビンまたは１０ｍｌのディスポーザブルの予め作られたシリンジ中に含有させた次の滅菌容器を添加する。
【００８７】
−ポリデオキシリボヌクレオチド（実施例１参照） １００ｍｇ
−クエン酸３ナトリウム２水和物 ２５ｍｇ
−注射用水と保存剤、加えて１０ｍｌ
上記製剤は５日間の継続する治療に２０ｇ／容量を提供する。
Claims (19)
- リン脂質から構成されるカチオン性リポソームと、核酸の脱ポリマー化によって得ることができる１５０００〜３００００Ｄａの分子量を有するポリデオキシリボヌクレオチドとで形成され、ポリデオキシリボヌクレオチドがリポソームの外表面に存在し、リポソーム量とポリデオキシリボヌクレオチドとの間の重量比が１０：２〜１０：０.１である複合体を含む医薬製剤。
- 抗炎症活性を有する請求項１に記載の医薬製剤。
- 抗血栓活性を有する請求項１に記載の医薬製剤。
- 抗高血圧活性を有する請求項１に記載の医薬製剤。
- 治療に血管内皮プロスタサイクリンの持続放出を要する疾病の治療用の請求項１に記載の医薬製剤。
- ポリデオキシリボヌクレオチドがデフィブロチドである請求項１〜５のいずれか１つに記載の医薬製剤。
- １またはそれ以上の抗酸化剤が添加された請求項１〜６のいずれか１つに記載の医薬製剤。
- 抗酸化剤がα−トコフェロールである請求項７に記載の医薬製剤。
- １以上のモノもしくはジ置換アミノ基を含有するカチオン性界面活性剤または炭素数８〜２２の１以上の脂肪族酸を含有する１以上の４級アンモニウム基を含有するカチオン性界面活性剤が存在する請求項１〜８のいずれか１つに記載の医薬製剤。
- カチオン性界面活性剤が炭素数１８の脂肪族鎖を含有する４級アンモニウム基を含有する請求項９に記載の医薬製剤。
- リポソーム脂質の全量とカチオン性界面活性剤とのモル比が１０：０.０５〜１０：３の範囲である請求項１〜１０に記載の医薬製剤。
- リポソーム脂質の全量とカチオン性界面活性剤とのモル比が１０：１である請求項１１に記載の医薬製剤。
- リポソーム中のリン脂質がホスファチジルコリンまたはホスファチジルエタノールアミンおよび第２の異なる脂質を含み、ホスファチジルコリンまたはホスファチジルエタノールアミン：第２の脂質：カチオン性界面活性剤のモル比が９：１：０.０５〜７：３：３である請求項１１または１２に記載の医薬製剤。
- ホスファチジルコリンまたはホスファチジルエタノールアミン：第２の脂質：カチオン性界面活性剤のモル比が８：２：１である請求項１３に記載の医薬製剤。
- リポソーム量と活性物質との重量比が１０：１である請求項１〜１４のいずれか１つに記載の医薬製剤。
- 複合体が、次の工程；
ａ．脂質、カチオン性界面活性剤および抗酸化剤を溶解した極性または非極性有機相４部と水１部とを混合し、得られた２相系を０℃で５〜２０分間音波処理に付し、次いで有機相を減圧下、室温で蒸発させてエマルジョンを形成することによるリポソームを作成する工程；
ｂ．そのエマルジョンを１００〜６００ｎｍの孔直径を有するポリカーボネート膜に少なくとも３回通過させる工程；
ｃ．凍結乾燥助剤の量が脂質に対して少なくとも７倍過剰である凍結乾燥助剤水溶液を添加した後、エマルジョンを凍結乾燥する工程；
ｄ．凍結乾燥物を含有する容器にポリデオキシリボヌクレオチドの希釈滅菌等張水溶液を滅菌環境下かつ撹拌下に添加するか、または凍結乾燥リポソームを含有する容器に滅菌等張液を添加し、得られたエマルジョンをポリデオキシリボヌクレオチド含有溶液と滅菌環境下で混合することによる医薬用のエマルジョンを作成する工程
からなる方法で得ることができる請求項１〜１５のいずれか１つに記載の医薬製剤。 - 工程ｂにおいて、そのエマルジョンを４００ｎｍの孔直径を有するポリカーボネート膜に少なくとも３回通過させる請求項１６に記載の医薬製剤。
- 工程ｃにおいて、凍結乾燥助剤の量が脂質に対して１０〜１５倍過剰である凍結乾燥助剤水溶液を添加した後、エマルジョンを凍結乾燥する請求項１６または１７に記載の医薬製剤。
- 非経口投与用の請求項１〜１８のいずれか１つに記載の医薬製剤。
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