JPS63503067A - 化学的に定義された再現性のあるポリデオキシリボヌクレオチドを得る方法 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 化学的に定義された再現性のあるポリデオキシリボヌクレオチドを得る方法 本発明は、化学的に定義された再現可能な形態のポリデオキシリボヌクレオチド の製造に関する。

更に特定的には、本発明は、デフイブロチド（Ｄｅｆ　１ｂｒｏｔｉｄｅ）　［ Ｄ　ＣＩ、目録２１、世界保健機関年代記　３５、補遺５．４．１９８１　（Ｄ ＣＩ、　Ｌｉ５ｔｅ２１．　Ｃｈｒｏｎｉｑｕｅ　ＯＭＳ　３５．５５ｕｐｐ１ ．４．１９８１）］の名称で知られた物質の製造に関する。

デフィブロチドと名付けられた物質は、米国特許第３，７７０，７２０号及び第 ３，８９９，４８１号に開示されている如き動物器官からの抽出により得られた 低分子量ヌクレオチド画分のナトリウム塩として定義され、この開示は引照によ り本明細書に加入する。

デフィブロチドは、多数の１！１埋Ｔ的且つ臨床的ω佇ン１ミ題でま・・た。

これは、一方では、その非常に低い毒性（急性、亜急性及び慢性の）が評価され ることを可能とし、可能な治療学的使用の観点から自明な利点を伴っており、他 方では、デフイブロチドは顕著な且つ全く予測されない治療学的特性を示した。

実際問題として、米国特許第３，８９２，５６７号に記載の如く、デフィブロチ ドは、それを抗血栓症薬として有用ならしめる線維索溶解活性を持っている。こ の上記記載は引照により本明細書に加入する。更に、薬理学的及び臨床的実験研 究（志願者に対して行なわれた）は下記の活性を示した。

ａ）抹消動脈疾患（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ　ａｒｔｅｒｉｏｐａｔｌ＋ｉ＋＋ｓ ）の治＆［発明者ニオ−・エヌ・ウルチン（θ、　Ｎ、　ｔｌｌｔｉｎ）、米１ １特許出願ｔｊ＋６４９．０５５号、１９８４年９月１０日出願、］、 ｂ）急性腎不全（ａｃｕｔｅ　ｒｅｎａｌ　１ｎｓｕｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）　［ 発明者、ブイ・ボッミニ（Ｖ、　Ｂｏｎｏ＋＋１ｎｉ）、米国特許第４，６４９ ，１３４号、１９８７年３月１０日付与、］、 Ｃ）急性心筋虚血症（ｍｉｏｃａｒｄｉａｌ　ａｃｕｔｅ　１ｓｃｈｅ＋５ｉａ ）の処ｉ！［発明者、ジー・プリン、エム・マントバーニ、アール・ニアダ（Ｇ 、　Ｐｒ１ｎｏ、　Ｎ、　Ｈａｎｔｏｖａｎｉ、　Ｒ，Ｎ１ａｄａ、）、米国特 許出願第７０１．６９５号、１９８５年２月１４日出願］。

前記特許及び特許出願の開示は、それに開示された製薬学的組成物及び使用の教 示のために引照により本明細書に加入する。

前記した治療学的使用の多様性及び重要性によって、デフィブロチド及びその工 業的製造が注目の的となったことは明らかである。この研究は、−面では、経済 的に有利で且つ技術的に合理的な工業的規模で行なわれる製造を指向し、他方で は、得られる工業的製品デフィブロチドの標準化及び制御を指向する。

換言すれば、前記した米国特許の主８となっている方法は、名称デフィブロチド が与えられたヌクレオチド構造の入手に導く、最初に開発された方法であった。

薬理学的及び臨床的研究の結果が、最初に単離された物質の非常に興味深い且つ 多様な性質を示したとき、一つには工業的規模の製造の問題に直面しそして他方 ではこの物質デフィブロチドの化学的物理的性質の研究が綿密に考慮されたこと は当然であり且つ明らかである。その理由は、その化学的物理的性質はデフィブ ロチドの製造及びその要件に厳密に関連しているからである。

デフィブロチドは、それを形成するヌクレオチド画分が、ランダムな配列の下記 ポリデオキシリボヌクレオチドの式、Ｐ、−３、（ｄＡＰ）＋ｔ−ｚ＋、（ｄ　 Ｇ　Ｐ　）　＋　０−２１１、（ｄ　Ｔ　Ｐ　）　＋　５−ｔｓ、（ｄＣｐ）＋ 。−２゜、 式中、Ｐ−リン酸基、 ｄＡｐ−デオキシアデニルモノマー、 ｄＧｐ＝デオキシグアニルモノマー、 ｄＴｐ−デオキシチミジルモノマー、 ｄＣｐ−デオキシシチジルモノマー、である、に化学量論的に一致しているなら ば、前記した薬理学的及び治療学的性質を十分に達成し、それ故、前記した治療 学的使用に特に好適であることが見出だされ、そしてこれは本発明の第１の特徴 である。

この式に相当するデフィブロチドは、更に下記の化学物理的性質を示す：電気泳 動＝均一なアノード移動度（ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ　ａｎｏｄｉｃ　輸ｏｂｉ ｌｉｔｙ）、吸光比、ＥＩ３゜／Ｅ２ｇ。＝０．４５±０．０４、モル吸光係数 （リンに関する）　ε（Ｐ）＝７，７５０±５００、生の（ｎａｔｉｖｅ）　Ｄ ＮＡにおける％として示された可逆濃色効果（ｒｅ％’ｅｒｓｉｂｌｅ　ｈｙｐ ｅｒｃｈｒｏｍｉｃｉｔｙ）、　ｈ＝１５±５゜可逆酒色効果はポリデオキシリ ボヌクレオチドの固有の光学的性質であり、そしてこれらのバイオポリマーの溶 液中での分子転位（＋＊ｏｌｅｃｕｌａｒｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ）の能力 の目安である。

熱力学的状態の関数として、物質の分子は無秩序の且つ自由な運動をする傾向が あり、物質の溶液の温度が高ければ高い程運動の速度は高い。

簡単な可溶性物質（塩、糖、ペプチド）の大部分においては、温度が減少するに つれて、たとえ運動速度が減少するとしても、最初の状態に比較して分子の転位 は起こらない。バイオポリマーの場合には、ポリデオキシリボヌクレオチドと同 様に、分子は相互転位（ｍｕｔｕａｌ　ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ）の傾向が ある。この性質は、初めの状態に比較した転位能力が１００％のオーダーである ことができる二重らせんＤＮＡにおいて非常に顕著である。この能力の測定は、 加熱され及び冷却され又はアルカリ性にされ及びｐＨ５に中和された溶液の２６ ０ｎｍにおける光学密度（０，Ｄ、）の変動の測定によりポリデオキシリボヌク レオチドに対して特定の方法で行なわれる。

濃色効果の測定は下記式、 ０、Ｄ、（室温又は中性ＰＨでの） により与えられ、これは、前述の観点から、として定義することもできる。

この方法においては、濃色効果りは、転位することができるポリヌクレオチドの 分子のフラクションを示す。

二重らせんＤＮＡの場合に既に述べた如く、百分率として示されたこの値は、１ ００％のオーダーであることができ、これに対してオリゴデオキシリボヌクレオ チド（８，０００ダルトンより低い分子量）の場合には、この値は殆どゼロであ る。

ポリデオキシリボヌクレオチド　デフィプロチドが薬理学的に活性であり且つ前 記の治療学的使用に好適であるためには、ｈのｉ＆辿値は約は薬理学的活性の劇 的な減少を伴い、これに対して、２０％より高いｈの値は望ましくない副作用の 危険を伴うことが見出だされた。

濃色効果のこれらの特徴的限界は、ポリデオキシリボヌクレオチドデフィブロチ ドが一重鎖フィラメントでありそして、これはせ通の条件及び変性条件の両方の 条件下に操作して、分子質量の有意な差が現れない拡散光（ｄｉｆｆｕｓｅｄ　 ｌｉｇｈｔ）の下に行なわれた分子量の測定によっても確かめられる。

結果として、生のＤＮＡにおいて示された約１５％の分子内転位（同じ分子内で の核酸の対形成）の能力を持った羊−フィラメントバイオポリマーの構造を有す る。

前記した如く、本発明の主要な特徴は、１つの製造バッチから他の製造バッチに わたる生成物特性の実質的に完全な均・−性、得られた生成物のヒトの治療に対 する完全な有用性及び信頼性及び、明らかに工業的製造の観点からの実施可能性 及び便利さが同時に提供される、前記した性質を有するデフィブロチドの製造方 法にある。既に示したとおり、米国特許第３，７７０．’？２０号及び第３，８ ９９．４８１号に開示された方法は、抽出及びｊｔＪｉのプロトン性分解による デオキシリボ核酸の部分分解より成る。このような方法においては、デフィプロ チドの収率は、相対的に低く、生成物はしばしば分解生成物を伴う、実際問題と して、ポリデオキシリボヌクレオチドのプロトン性分解は、毒性でありうる適度 の景すらのアブリン酸が形成される危険を伴って、多少顕著に脱プリン（ｄｅｐ ｕｒｉｎａｔｉｏｎ）を誘発しうろことが知られている。

かくして本発明の主要な目的は、これらの問題及び以前の方法の欠点の本質的な 解決である。

本発明のより特定の目的は、前記した化学的物理的性質を有するデフィブロチド を得るための方法を提供することである。

他の本発明の目的は、前記した特許において意図されたウシの肺の他に、多数の 出発天然物質の使用を可能とするデフィブロチドの製造方法を提供することであ る。

驚くべきことに、より制御されたＸｉ（ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ）の条件下に操 作することによって、原料核酸を有利に解重合することができ、それによって分 解生成物の形成を軽小に減少させることができることが見出だされた。

本発明に従う方法は、下記の工程により特徴付けられる：ａ）出発動物器官の粉 砕及び高温タンパク質分解、ｂ）分解物（ｌｙｓａｔｅ）のろ過及び濃縮、Ｃ） ホスフェートを沈澱させることができるカチオンの塩を濃ｌｉｉ物に添加しそし てｐＨを４，５より高くない酸性値に調節する。二と、ｄ）溶液中に存在する多 糖画分を分離するために沈澱懸濁液を一定容量下にろ過すること、 ｅ）核酸を可溶化するために、得られる核酸の不溶性塩の懸濁液にアルカリ金属 の水溶性塩を添加し、そして置換された不溶化カチオンを溶液から除去すること 、 ｆ）高度に重合したニックされた（ｈｉＦＩｈｌｙ　ｐｏｌｙｓｅｒｉｚｅｄ　 ｎ１ｃｋｅｄ）ポリデオキシリボヌクレオチドの形態にある安定化凝集を開始す るために少なくとも１モルの所定の値に核酸の溶液のイオン強度（ｉｏｎ　ｆｏ ｒｃｅ）を調節しそして反応混合物の分光光度法による分析が最大可逆濃色効果 、即ち最大可能な凝集に達したことを示すまで同じ溶液のｐ　Ｈを調節すること 、 ｇ）この溶液を凝集したポリデオキシリボヌクレオチドの解重合温度まで加熱し 、可逆濃色効果が生のＤＮＡの百分率で示して１５±５の値に達するまで、可逆 酒色効果の変化の測定により解重合をｆｆ＋ＩＩ’Ｊすること、ｈ）冷却するこ とにより解重合プロセスを停止させそして得られる二本鎖フィラメント断片にお ける水素結合を除去すること、ｉ）前の工程の得られる溶液を解重合工程の温度 及びＰＨより高い温度及びｐＨで加熱し、それにより水素結合が再形成されるの を防止することによって、このような条件にある得られる一重鎖フィラメント断 片を安定化させること、 ｊ）高温ろ過しそして、依然として高温条件下に、場合により濃縮を伴って、溶 液中に存在する塩を除去すること。

前記した方法の一つの工程をここで考察すると、使用される動物器官は、哺乳動 物の器官、組織及び細胞、特にヒツジ、豚、ウマ及び余生の肺、腸、肝臓及び粘 膜より成る。

ヘパリン、タンパク質分解物及び器官抽出物の製造に際して得られた残留母液は 同様に有用である。他の出発物質は、白血球又はその培養の残留物、精子（ｓｐ ｅｒｍａＬｏｚｏａ）、精母細胞（ｓｐｅｒｍａｔｏｃｙｔｅｓ）及び哺乳動物 の胚細胞＜ｇｅｒ＋ａｉｏａｌ　ｃｅｌｌｓ）の如き細胞より成る。

タンパク質分解は、例えばパパイン、トリプシン等の如きタンパク質分解酵素に よって公知の方法で行なわれる。

タンパク質分解の条件及び期間は明らかにタンパク質分解酵素の種類に依存して おりそして周知されており且つ一般に１０−９０℃の範囲内で０．５−１０時間 である。

例えば、パパインによるタンパク質分解は一般に６５℃で４時開行なわれる。

ろ過及び濃縮の工程すをここで考察すると、濃縮は好ましくは接線方向流れを持 った膜で行なわれる。この方法においては、実際問題として、得られるべき所望 の分子量の範囲を選ぶことが可能である。かくして膜ははっきりと定められたカ ットオフ（−最に５０，０００−１００，０００）で選ばれる。

得られるｆｉｇ物を濃縮物中のホスフェートを沈澱させることができるカチオン と混合する（工程ｃ）、Ｍえば、Ｃａ−Ｚｎのハロゲン化物、硫酸塩、炭酸水素 塩、＃酸塩の如きカチオンの塩を濃縮物に加えることができ、その際ｐＨは酸性 値に調節される。

沈澱懸濁液は、多糖物質がろ准から消失するまで、水を連続的に補給して容量を 一定に保ちながら、接線方向流れで０．４５μ又はそれより小さい細孔寸法を持 った膜を通して一定容量で定容ろ過〈透析ろ過）（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ）することによりろ過される。

核酸の不溶性塩の懸濁液に加えられた（工程ｅ）水溶性塩は、ナトリウム又はカ リウムの如きアルカリ金属のハロゲン化物又は酢酸塩の如き塩である。

得られる懸濁液には不溶化カチオン（Ｃａ、Ｚｎ等の如き）が残っており、これ は、生理的食塩水溶液（ｓａｌｉｎｅ　５ｏｌｕｔｉｏｎ）を連続的に補給して 容量を一定に保ちながら、接線方向流れで、１０，０００より小さＬ・カットオ フを有する膜を通して一定容量で定容ろ過することにより除−４なされるのが好 ましい。

この処理は、透過液中に不溶化カチオンがもはや存在しなくなるまで続けられる 。別法として、不溶化カチオンは、工程ｄから生じる懸濁液に対して行なわれる イオン交換によって除去される。

原料核酸の溶液は、好ましくはアルカリ金属の水溶性塩の添加により少なくとも １モル、好ましくは３モルのイオン強度になるように必要に応じて調節され、そ して溶液のｐＨは、実験に基づく測定に従って系の鰻大町逆濃色効果に相当する ｐ　Ｈ値に達するまで調節される。このようなＰＨは普通は４乃至５である。

この工程において、原料核酸は安定化凝集を受けて高度に重合したニックされた ポリデオキシリボヌクレオチドを形成する。

工程ａ−Ｃは、その温度範囲を１０℃乃至９０℃とすることができるけれども、 好適には室温で行うことができる。

安定化ａ集の工程（工程で）の後、高度に重合したニックされたポリデオキシリ ボヌクレオチドの解重合は、その解重合温度を６０℃乃至９０℃とすることがで きるけれども、好ましくは約７０−７５℃の温度に加熱することによって行なわ れ、解重合は可逆漁色効果の変化の測定により監視される。

得られる二本鎖フィラメント断片中の残存水素結合の除去は、好ましくは１５℃ 乃至３０℃のより低い温度に冷却することによって解重合が停止されると、７よ り高いｐＨ２好ましくは８又はそれより高いｐＨとなるように反応物（ｒｅａｃ ｔｉｏｎ　ｍａｓｓ）をアルカリ化することによって行なわれる。

最後に、一本鎖フィラメント断片の安定性は、工程りで得られた溶液を解重合温 度より少なくとも５℃高い温度、−ｍには６５℃乃至１００℃に加熱することに よって得られる。

添付図面は、器官から抽出されそしてタンパク質分解を受けた原料核酸の種々の 工程における変性を略図で且つ慣用の表現で示す。

明白に観察されうるとおり、多少対が解かれ、らせんが解かれそして略記号ＳＭ により示された短い脱プリンされた（ｄｅｐｕｒｉｎａｔｅｄ）長さの形成を伴 って部分的に分解されたポリヌクレオチドアセンブリーとして想像することがで きる出発物質が、高いイオン強度、好ましくは３モルのアルカリ金属の水溶性塩 を有しそして十分にプロトン和されている生理的食塩水溶液に溶解されると、出 発物質を形成する分子は、溶媒媒体から利用することができる水素結合により、 塩基対形成のシャルガフ（Ｃｈａ「ｇａｆｆ）の規則に従って知られているとお り、凝集する傾向がある。ポリヌクレオチド鎖は部分的に不完全であるので、偶 発的な対形成（ｃａｓｕａｌｐａｉｒｉｎｇ）が起こり、高度に重合した二本鎖 フィラメントポリヌクレオチドの形成に導き、このフィラメントは、図面におい て略記号ＡＳ（凝集した系）により表された構造の親水性境界に沿って与えられ た配列のＵＪれ目（“ニック”）により偶発的に遮断されている。

図面において、はり水性区域（ＩＲ）及び負の電荷を持つ親水性区域（ＩＰ）が 示されている。

その点で、適当に調節された熱エネルギーを供給すると、二本鎖フィラメントの 切れ目のみのレベルで広くゆきわたって破断（ｆｒａｃｔｕｒｅ）が引き起こさ れ、それにより、成る規則性を持った二本鎖フィラメント断片（図↓こおいてＤ ＳＦとして示された）が生成される。

断片化の程度は種々の化学的物理的パラメータの制御により監視され、主な１つ は系の可逆濃色効果指数である（既に定義したとおり）。

可逆濃色効果がデフイブロチドを特徴付ける値、（１５土５〉に達するときに行 なわれる水素イオンの除去は、核酸塩基が対形成するた植。

水素結合を除去せしめ、かくして所望の特徴的構造を持ったポリデオキシリボヌ クレオチドのモノフィラメントが生成する。

一本鎖フィラメントの自由な状態は構造において安定化され、この一本鎖フィラ メントは、先に行なわれた凝集条件下の解重合に使用された温度より高いレベル の温度でｐＨ８±０．２で更に溶液を加熱すると、デフィブロチドを特徴付ける 約１５％の可逆漁色効果を有することも見出だされた。

系において誘発された運動エネルギーは、目的のポリデオキシリボヌクレオチド 自分を単離することを含むこの方法のその後の段階で起こるかも知れない凝集が 起こるのを防止する。

このようにして安定化したポリデオキシリボヌクレオチドのフィラメント（図に おいてＳＳＤで示された）のみが所望のデフイブロチドｙＩ造を特徴付ける化学 的性質をすべて保持している。

この方法で捏作することによって、脱プリンの程度は最小に減少しそしてプリン 塩基とピリミジン塩基との比は０．９５％より小さいことは希である。

本発明に従う方法によって、デフイブロチドの化学的及び薬理学的性質を示す標 準化されたポリデオキシリボヌクレオチドを得ることが可能であることを最後に 指摘したい、この研究の過程において、ウシの肺の他に他のソースからも所望の 性質を持ったポリデオキシリボヌクレオチドを得ることが可能であることが既に 述べたとおり見出だされた。驚くべきことに、前記した基準に従って操作するこ とによって、豚の肺及び畜牛又は豚の両者の腸、肝臓及び胸腺の如き他のソース からも、デフイブロチドの特性を持ったポリデオキシリボヌクレオチドを得るこ とが可能であることが今回見出だされた。この可能性は非常に重要である。その 理由は、生成物デフィブロチドの予測される治療学的消費の点から、出発ソース を広げることが必要になると思われるからである。出発物質として、ヘパリン製 造、抽出及びタンパク質加水分解物の母液を使用することができることは特に有 利である。何故ならば、これらの物質は非常に豊富でありそして今日まで殆ど使 用されておらず、その廃棄は深刻な汚染の原因でもあるからである。

本発明の他の利点はデフイブロチド抽出ソースを広げる可能性によってのみなら ず、副生物からデフイブロチドを回収する可能性にもよっており、かくして、ヘ パリン及びタンパク質分解物を製造する方法の如き他の方法をより経済的にする と共に、これらの他の方法の残留物、実際にはこの残留物は核酸であるが、に富 んだホスフェートから生じる汚染のような汚染の原因を更に減少させる６下記の 実施例は、請求の範囲に記載された方法をいかに実施するかを非限定的に説明す る。

実施例　１ 冷凍したウシの肺１００ｋｇを亜硫酸塩で活性化された粗製パパイン２００ｍｇ を含有する飲料水５０リツトルに分散させた。分散液のｐＨを希塩酸で５．８に Ｗｋ’５し、次いで塊を６５℃に加熱してタンパク質分解を行った。４時間の後 、この塊を１５分間加熱沸騰させることによりタンパク質分解を停止した。分散 液中の固体を除去するプレスフィルターによるろ過の後、タンパク質分解物のろ 過した溶液を、５０．０００のカットオフを有する管状膜ロミコン（Ｒｏｍｉｃ ｏｎ）での接線方向流れでろ過することにより２５リツトルの容量に濃縮した。

約８ＵＩ／ｒｒ＋４のヘパリン活性を持った透過液をヘパリン及びアミノ酸の回 収に使用することができる。

？１縮物を無水塩化カルシウム１５０ｇで処理し、溶液をｐＨ３に調節して核酸 部分を沈澱させ、残りの多糖部分は溶液に残る。

０．０１塩化カルシウムの溶液の添加により濃ｆｉ物の容量を一定に保ちながら 、Ｆ？Ａ？ｖｉ液を０．４５ミクロンの多孔度の管状膜ロミコンを通して接線方 向流れにより定容ろ過する。濃縮物が塩化セチルピリジニウムと多糖との反応を もはや生じなくなるまで定容ろ過を続けた。

定容ろ過通過液を多糖の回収に使用し、コンドロイチン硫酸とヘパリンとから成 る混合物的５０ｇｒを生成した。

核酸の不溶性カルシウム塩を含有する定容ろ過濃縮物の懸濁液を３Ｍ塩化ナトリ ウム２５Ｚと混合した。混合物を１０．０００のカットオフを有する膜ロミコン を通して接線方向流れで定容ろ過し、濃縮物の容量を、透過液がシュウ酸アンモ ニウムとカルシウムとの反応をもはや生じなくなるまで塩化ナトリウムの３モル 溶液の添加により一定に保ち、このようにして、カルシウムイオンとナトリウム イオンの交換が起こってすべての核酸をナトリウム形に転化した。

次いで濃ＩＭ物を、７．５ｅの容ｉが得られるまで、同じ膜での接線方向流れに よるろ過により更に濃縮した。このｆＡｌｉｌ物は、３モルの生理的食塩水中に 原料核酸のナトリウム塩約３％く分光光度法により評価）を含有しており、これ は出発器官重置の０．２２％に相当する。

この溶液を、溶液の試料の再アルカリ化による濃色効果（ｈｙｐｅｒｃｈｒｏ＋ ｍ１ｃｉｔｙ）の分光光度法による測定が吸収の最大デルタ（ａ＋ａｘｉｍｕ＋ ａ　ｄｅｌｔａ　ｏｆａｂｓｏｒｐｔ　１ｏｎ）を示さなくなるまで、３Ｍ塩酸 を添加することによって最大淡色効果（ｈｙｐｏｅｈｒｏｍｉｃｉｔｙ）の点に 調節した。吸収の最大デルタは、ｐＨが４．２５に達したとき生のＤＮＡの３８ ％に等しいことが見出だされ、かくしてこの系の最大淡色効果の点に相当し、従 って溶液中のポリデオキシリボヌクレオチド酸の最大の凝集及び塩基の対形成の 状態に相当する。

このような条件が確立されると、溶液を７５℃まで加熱して解重合を開始する。

１５分間隔で、溶液の試料に対するる濃色効果の測定を行って解重合の進行を監 視した。６回の測定の後、カーテシアン系のｌ！Ｉ座標で報告されたデータは、 ４時間の時間の横座標での外挿を−ｉＪ能として、天然ＤＮＡの１９％の濃色効 果を有するポリデオキシリボヌクレオチドを得た。

結果として、４時間の後、凝集条件下の解重合は、解重合した塊を３０℃の温度 に冷却しそし°（それを３モルの水酸化ナトリウムでアルカリ性（ｐＨ８）とす ることにより停止させた。

ポリヌクレオチドの構造を安定化させるために温度を３０分１間８５℃まで上昇 させ、然る後溶液を高温ろ過しそして透析と６５００ｍｆの容量となるように前 述の接線方向流れでの濃縮に付した。

得られる生成物を濃縮した溶液からアルコーノ囚こより沈澱させた。

アルコールで脱水しそして真空下に６０℃で乾燥した後下記の分析特性を持った 生成物１２６ｇが得られた。

Ｐ＝８．４０％　Ｇ＝８．６０％ ｄ＝３４．１０％　Ｃ＝６．１５％ Ａ＝８．９０％　Ｔ＝９．２０％ Ｐ／（Ａ十〇＋Ｃ＋Ｔ）モル比＝１．０７ブリン／ピリミジンモル比＝０．９６ Ｐεと呼ぶモル吸光度　（Ｐ）＝７，８００濃色効果（生のＤＮＡの）ｈ＝１８ ％ 上記のデータは、化学量論的に下記の分子式に導く。

Ｐｌ、（ｄＡＰ）＋２、（ｄＧｐ）、。、（ｄＣｐ）＋。、（ｄＴＰ）＋３実施 例　２ 豚の肺１０００ｋｇを実施例１に記載の如くして処理して、下記の性質を有する デフイブロチドア００ｇを生成した。

Ｐ＝８．５０％　Ｇ工８．９０％ ｄ＝３６．２０％　Ｃ工６，８０％ Ａ＝９．３０％　Ｔ＝１０．２０％ Ｐ／（Ａ＋Ｇ＋Ｃ＋Ｔ）モｌし比＝１．０２プリン／ピリミジンモル比＝０．９ ０ 上記のデータは、化学量論的には下記の分子式に導く。

Ｐ、（ｄＡＰ）＋２、（ｄＧＰ）＋ｏ、（ｄＣｐ）＋。、（ｄＴＰ）＋＊実施例 　３ ウシ腸粘膜からのヘパリンの製造より生じる母液１０００１２を接線方向流れ膜 により５５ｅの８浸に濃縮した。

核酸を米国特許第３，７７０，７２０号に記載の如くして塩化亜鉛により沈澱さ せた。多糖を分離するためのデカンテーション及び洗浄の後、沈澱を水に懸濁さ せそしてイオン交換樹脂Ｎａ＋形の］、Ｒ１２０による処理によってナトリウム 塩に転化した。

溶出液に含まれた核酸のナトリウム塩は、等８董の酢酸塩緩衝剤の５モル溶液（ ｐＨ３，９）を加えることによって凝集させ、かくしてｐＨ４，１の最終混合物 を得、これをこの系の虹大町道酒色効果（ｍａｘｉｍｕｍｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ 　ｈｙｐｅｒｃｈｒｏｍｉｃｉｔｙ）の測定のために使用した。

混合物を７０℃に加熱し、その温度に保持し、可逆濃色効果指数を１５分毎に監 視した。４時間の後、この指数はｈ＝１８％に達した。溶液を２５℃に冷却し、 次いで５Ｎ水酸化ナトリウムによりｐＨ７，８に調節し、次いで８５℃に３０分 間加熱した。ろ過の後、生成物１．０容Ｉが、１．５容量のエタノールを加える ことにより沈澱した。その什沈澱を洗浄しそしてエタノールで脱水し、然る後６ ０℃で真空下にＵ　ｒｚした。

生成物６３０ｇが得られ、下記の化学的性質を持っていた。

Ｐ＝８．７３％　Ｇ＝８．５％ ｄ＝３６．４０％　Ｃ＝６．９％ Ａ＝９．６０％　Ｔ＝９．７％ Ｐ／（Ａ＋Ｇ十Ｃ十Ｔ）モル比２０．４プリン／ピリミジンモル比＝０．９２ これは下記のヌクレオチドの式に相当する。

Ｐ２、（ｄＡＰ）＋３、（ｄＧｐ）ｔｏ、（ｄＴＰ）＋４、ｃａｅｐ）目実施例 　４ 米国特許第３，７７０，７２０号の開示に従ってウシの肺から得らｔ′また核酸 のナトリウム塩３０ｋｇをｐＨ４，５の３Ｍ酢酸塩緩衝液５００１に溶解して、 系の最大可逆濃色効果を有する溶液を形成した。

このようにして得られた溶液をろ過し、次いで７５℃に加熱した。

１５分間隔で試料を可逆濃色効果指数の決定のために採取し、濃色効果データを カーテシアン系の縦座標に記録し、横座標には試料を採取した時間を記録した。

３回又は４回の測定で見出だされたデータに基づいて、系の濃色効果が生のＤＮ Ａにおいて示された１５％の値に達するのに必要な時開を外挿し、その時間加熱 を続けた。

得られる物質（＋＊ａｓｓ　）を５Ｎ水酸化ナトリウムによりｐＨ８に調節しそ して８０℃に６０分間加熱して、デフイブロチドの特性を示しているポリデオキ シリボヌクレオチド構造を安定化させた。

ｉ後に溶液をろ過しそして実施例３に記載の如くして乾燥した。約１５ｋｇの生 成物が得られた。この実施例に記載のとおりに製造された生成物の性質は下記の とおりであった。

Ｐ＝８．８３％　Ｇ＝８．４％ ｄ＝３７．８０％　Ｃ＝７．００％ Ａ＝９．９０％　Ｔ＝９．８５％ Ｐ／（Ａ＋Ｇ＋Ｃ＋Ｔ）モル比＝１．０６プリン／ピリミジンモル比＝０．９５ ε　（Ｐ）＝７．７５０、［αコ　＋＋５４°　ｈ＝１７％得られるヌクレオチ ドの式は下記のとおりであった。

Ｐ、（ｄＡｐ）＋＋、（ｄＧＰ）＋＋、（ｄＴＰａ＋４、（ｄＣＰ）＋２実施例 　５ 解重合の間、１００．０００の分子カットオフ（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｕｔ− ｏｆｆ）を有する接線方向流れ膜に対するパーミェーションによって、解重合さ 、、′）た生成物を系から除去するように実施例４を修正した。この除去は、７ −フイプロチドの構造を既に有しているかも知れないポリデオキシリボヌクレオ チド構造の更なる分解を回避するためになされた。かくして収率が改良された。

事実、この修正を伴って実施ｆＩＡ４と同じ条件下に核酸のナトリウム塩３０ｋ ｇから操作することによって、実施例４の性質に相当する性質を持った生成Ｔｈ １．６．５ｋｇが得られた。

ＳＦ 国除調査報告 ＡｈＪＮＥＸ　Ｔｏ　ｎミＩＮＴＥＲ）ＩＡτｒＯＮＡＬ　５ＥＡ３ＣＨＲＥ： ’ＯＲＴ　ＱＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．少なくとも実質的に多糖とタンパク質を含まない原料核酸の溶液からポリデ オキシリボヌクレオチドデフィブロチドを製造する方法において、 （１）必要に応じて前記溶液を少なくとも１モルの所定のイオン強度に調節し、 そして最大可逆濃色効果に達するまで前記溶液のｐＨを調節することによつて核 酸の凝集を安定化させることにより高度に重合したニックされたポリデオキシリ ボヌクレオチドを形成し、（２）得られる溶液を前記ポリデオキシリボヌクレオ チドの解重合温度に加熱しそして下記可逆濃色効果に達するまでこの溶液を解重 合温度に保つことによって、生のＤＮＡにおける百分率として測定して、前記溶 液の可逆濃色効果がｈ＝１５±５となるまで前記ポリデオキシリボヌクレオチド を解重合し、 （３）然る後解重合反応を停止し、解重合した溶液中の二本鎖フィラメント断片 における水素結合を除去して、一本鎖フィラメントポリデオキシリボヌクレオチ ド断片を形成し、 （４）然る後、得られる溶液を解重合反応の温度及びｐＨよりも高い温度及びｐ Ｈで加熱して水素結合の再形成を防止することによって、前記の得られるポリデ オキシリボヌクレオチドの一本鎖フィラメント断片を安定化させることを特徴と する方法。 ２．前記原料核酸の溶液が器官組織及び哺乳動物細胞から得られる請求の範囲第 １項記載の方法。 ３．前記原料核酸の不溶性塩の懸濁液にアルカリ金属の水溶性塩を添加して核酸 を可溶化し、得られる不溶化カチオンの懸濁液から除去することができ、水溶性 塩の添加は、少なくとも１モルの原料核酸の生理的食塩水溶液が得られるまで続 けることによって、工程１を行う請求の範囲第１項記載の方法。 ４．原料核酸の生理的食塩水溶液が少なくとも３モルになるまで水溶性塩添加を 続ける請求の範囲第３項記載の方法。 ５．アルカリ金属の水溶性塩がハロゲン化物及び酢酸塩から成る群より選ばれる 請求の範囲第３項記載の方法。 ６．前記塩がナトリウム塩である請求の範囲第５項記載の方法。 ７．前記塩が塩化ナトリウムの３モル溶液である請求の範囲第６項記載の方法。 ８．生理的食塩水溶液を連続的に補給しながら、接線方向流れ膜を通して一定の 容量で定容ろ過することによって、不溶化カチオンの除去を行う請求の範囲第３ 項記載の方法。 ９．前記膜が１００，０００より高くないカットオフを有する請求の範囲第１項 記載の方法。 １０．工程１のｐＨ調節を、所定のイオン強度の生理的食塩水溶液を得るのに使 用した可溶化塩のアニオンに相当する酸によって行う請求の範囲第１項記載の方 法。 １１．前記酸が塩化水素酸である請求の範囲第１０項記数の方法。 １２．溶液が３−５のｐＨに相当する水素イオン温度を有するまで、塩化水素酸 を添加する請求範囲第１１項記載の方法。 １３．工程２の解重合反応を約７０℃乃至約７５℃の温度で加熱することによっ て行う請求の範囲第１項記載の方法。 １４．生のＤＮＡに於ける百分率として示された、可逆濃色効果の値が１５土５ となるまで可逆濃色効果を測定することによって、解重合を制御する請求の範囲 第１３項記載の方法。 １５．溶液を冷却することによって、工程３において解重合を停止させる請求の 範囲第１項記載の方法。 １６．溶液ｐＨを７より高い値に調節することによって、工程３の二本鎖フィラ メント断片の水素結合の除去を行う請求の範囲第１項記載の方法。 １７．溶液を８より高いｐＨに至らしめる請求の範囲第１６項記載の方法。 １８．ｐＨをアルカリ金属水酸化物の添加により調節する請求の範囲第１６項記 載の方法。 １９．アルカリ金属水酸化物が水酸化ナトリウムである請求の範囲第１８項記載 の方法。 ２０．工程３から得られた溶液を、一本鎖断片を安定化させるために、解重合温 度より少なくとも５℃高い温度に加熱する請求の範囲第１項記載の方法。 ２１．加熱工程を少なくとも３０分間行う請求の範囲第２０項記載の方法。 ２２．安定化加熱工程４から得られた溶液を、高温ろ過し、次いで、溶液中に存 在する塩を、依然として高温状態にある間に除去する請求の範囲第１項記載の方 法。 ２３．前記塩を除去した後の溶液を濃縮する請求の範囲第２２項記載の方法。 ２４．高温ろ過工程からのろ液を、接線方向流れ膜を通して透析に付す請求の範 囲第２２項記載の方法。 ２５．工程１を、系の最大可逆濃色効果に相当する所望の最終ｐＨを得るような モル濃度を有する酢酸塩緩衝液で行う請求の範囲第１項記載の方法。 ２６．一本鎖断片を加熱する安定化から得られる溶液をろ過しそして最終生成物 をアルコール性溶媒の添加により沈澱させる請求の範囲第２５項記載の方法。 ２７．前記溶媒がエタノールである請求の範囲第１項記載の方法。 ２８．粉砕、高温タンパク質分解消化、ろ過及び溶解物の濃縮、続いて、ホスフ ェートを沈澱させることができるカチオンの塩の添加及び沈澱懸濁液の一定容量 でのろ過により、原料核酸の前記生埋的食塩水溶液を調製する請求の範囲第１項 記載の方法。 ２９．タンパク質分解溶解物のろ過を、接線方向流れ膜で行う請求の範囲第２８ 項記載の方法。 ３０．前記膜が５０，０００−１００，０００のカットオフを有するように選ば れる請求の範囲第２９項記載の方法。 ３１．一定容量ろ過を、接線方向流れ膜及び連続的補給水添加により行う請求の 範囲第２８項記載の方法。 ３２．前記膜が０．４５μより大きくない細孔寸法を有する請求の範囲第３１項 記載の方法。 ３３．出発物質が、ヒツジ、豚、ウマ及び畜牛の肺、腸、肝臓及び粘膜から成る 群より選ばれる請求の範囲第２８項記載の方法。 ３４．出発物質が、白血球又はその培養の残留物、精子、精母細胞及び哺乳動物 の胚細胞から成る群より選ばれる請求の範囲第２８項記載の方法。 ３５．出発物質が、ヘパリン、タンパク質分解物又は器官抽出物を得る方法にお ける動物の器官又は組織の処理から生じる母液である請求の範囲第２８項記載の 方法。 ３６．ランダムな配列の下記式、 Ｐ１−５、（ｄＡｐ）１２−２４、（ｄＧｐ）１０−２０、（ｄＴｐ）１３−２ ６、（ｄＣＰ）１０−２０、 式中、Ｐ＝リン酸基、 ｄＡｐ＝デオキシアデニルモノマー、 ｄＧｐ＝デオキシグアニルモノマー、 ｄＴｐ＝デオキシチミジルモノマー、 ｄＣｐ＝デオキシシチジルモノマー、である、に相当し、更に下記の化学物理的 性質、電気泳動＝均一なアノード移動度、 吸光係数　２６０土１ｎｍにおけるＥ１ｃｍ＝２２０士１０、吸光比、Ｅ２３０ ／Ｅ２６０＝０．４５±０．０４、モル吸光係数（リンについて）；ε（Ｐ）＝ ７．７５０±５００、旋光能［ａ］２０°＝＋５３′±６、 生のＤＮＡにおける％として示された可逆濃色効果、ｈ＝１５±５、を示す、デ フィブロチドとして知られたポリデオキシリボヌクレオチド。 ３７．少なくとも実質的に多糖とタンパク質を含まない原料核酸の溶液からデフ イブロチドを製造する方法において、（１）必要に応じて前記溶液を少なくとも １モルの所定のイオン強度に調節しそして最大可逆濃色効果に達するまでこの溶 液のｐＨを調節することによって、原料核酸の安定化凝集により高度に重合した ニックされたポリデオキシリボヌクレオチドを形成し、（２）然る後、得られる 溶液を前記ポリデオキシリボヌクレオチドの解重合温度に加熟し、該解重合温度 は約６０℃乃至約９０℃とし、そして可逆濃色効果が下記の値に達するまで前記 溶液を解重合温度に保つことによって、生のＤＮＡにおける百分率として測定し て、前記溶液の可逆濃色効果がｈ＝１５±５となるまで前記ポリデオキシリボヌ クレオチドを解整合し、 （３）然る後溶液を１５℃乃至３０℃の温度に冷却することにより解重合を停止 し、そして溶液のｐＨを７より高い値に調節することによって、解重合した溶液 中の二本鎖フィラメント断片における水素結合を除去して、一本鎖フィラメント のポリデオキシリボヌクレオチド断片を形成し、 （４）然る後、得られる溶液を、解重合反応のｐＨよりも少なくとも０．２高い 高いｐＨで、解重合反応の温度よりも少なくとも５℃高い温度に加熱し、それに より水素結合の再形成を防止することによって、前記の得られるポリデオキシリ ボヌクレオチドの一本鎖フィラメント断片を安定化させることを特徴とする方法 。