CH677114A5

CH677114A5 -

Info

Publication number: CH677114A5
Application number: CH1515/87A
Authority: CH
Inventors: Gianfranco Fedeli; Giuseppe Diamantini; Marisa Mantovani; Giuseppe Prino
Original assignee: Crinos Industria Farmaco
Priority date: 1986-04-17
Filing date: 1987-04-16
Publication date: 1991-04-15
Also published as: IL82251A0; US4985552A; IT8620117A0; CN87103688A; AU7288687A; EP0263155B1; IL82251A; ES2005168A6; AU612976B2; FR2597481A1; KR880701242A; WO1987006235A1; IT8620117A1; JP2581722B2; CN1018650B; AR242585A1; ATE66927T1; GR870602B; EP0263155A1; JPS63503067A

Description

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Descrizione

La presente invenzione riguarda un procedimento per la preparazione del polidesossiribonucleotide con la denominazione Defibrotide (DCI, liste 21, Chronique OMS 35,5 suppl. 4,1981) in forma chimicamente definita e riproducibile.

La sostanza denominata Defibrotide è definita come un sale sodico di frazioni nucleotidiche a basso peso molecolare ottenute per estrazione da organi animali come descrìtto nei brevetti USA no. 3 770 720 e 3 899 481. il Defibrotide è stato oggetto di molti ed approfonditi studi farmacologici e clinici che da un lato hanno consentito di accertare la sua bassissima tossicità (sia acuta, che subacuta e cronica), con gli evidenti vantaggi dal punto di vista delle possibili applicazioni terapeutiche, mentre dall'altro lato hanno messo in evidenza proprietà terapeutiche singolari e del tutto imprevedibili. Infatti, come descritto nel brevetto USA No. 3 829 567 il Defibrotide è dotato di attività fibrinolitica che lo rende idoneo come farmaco antitrombotico. Inoltre le sperimentazioni farmacologiche e cliniche (su pazienti volontari) hanno evidenziato le seguenti attività:

a) terapia delle arteriopatie periferiche (inventore: O.N. Ulutin; domanda di brevetto italiana No. 22 855 A/83del 12 settembre 1983);

b) trattamento di stati di insufficienza renale acuta (inventore: V. Bonomìni; domanda di brevetto italiana No. 22 856 A/83 del 12 settembre 1983);

c) trattamento di stati di ischemia acuta del miocardio (inventori: G. Prino, M. Mantovani, R. Nia-da; domanda di brevetto italiana No. 19 645 A/84 del 16 febbraio 1984).

La varietà ed importanza delle applicazioni terapeutiche sopra menzionate ha ovviamente concentrato l'attenzione e gli studi della Richiedente, titolare del brevetti e delle domande di brevetto sopra accennate, sut Defibrotide e sulla sua produzione industriale. In particolare tali ricerche hanno da un lato avuto di mira una produzione su scala industriale economicamente vantaggiosa e tecnicamente razionale e dall'altro lato la standardizzazione ed il controllo del prodotto industriale risultante. In altri termini i procedimenti formanti oggetto dei brevetti USA anzidetti sono quelli inizialmente ideati che hanno portato all'ottenimento delle frazioni nucleotidiche cui è stato attribuito il nome di Defibrotide.

Quando il risultato degli studi farmacologici e clinici ha posto in luce le proprietà estremamente interessanti e multiformi della sostanza inizialmente isolata, come è naturale ed evidente da un lato si è affrontato il problema della produzione su scala industriale e dall'altro si è approfondito lo studio delle caratteristiche chimiche e fisiche del Defibrotide in quanto strettamente connesse alla produzione ed alle sue esigenze.

E' stato così trovato e costituisce un primo aspetto della presente invenzione che il Defibrotide risponde interamente alle proprietà farmacologiche e terapeutiche sopra indicate ed è quindi particolarmente idoneo alle sopra citate applicazioni terapeutiche, se le frazioni nucleotidiche che lo compongono sono in accordo stechiometrico con la seguente formula polidesossiribonucleotidica di sequenza ran-dom

Pl-5, (dAP)l2-24, (dGp)tO-20, (dTp)l3-26, (dCp)io-2o dove

P = radicale fosforico dAp = monomero desossìadenilico dGp = monomero desossiguanilico dTp = monomero desossitimidilico dCp = monomero desossicitidilico.

Il Defibrotide, rispondente a questa formula, presenta inoltre le seguenti caratteristiche ehìmico-fisi-che:

- elettroforesi = omogenea con mobilità anodica;

- coefficiente di estinzione, a 260 ± 1 nm = 220 ±10;

- rapporto delle estinzioni, É230/E260= 0,45 ± 0,04;

- coefficiente di estinzione molare (riferito al fosforo), e(P) = 7.750 ± 500;

- potere rotatorio, [a] |°0 = 53® ± 6;

- ipercromicità reversibile, espressa in % in DNA nativo, h = 15 ±5.

L'ipercromicità reversibile è una peculiare proprietà ottica dei polidesossiribonucleotidi" e misura fa capacità di questi biopolimeri di riordinare le proprie molecole in soluzione. In funzione dello stato termodinamico, le molecole di una sostanza tendono a muoversi in modo disordinato e libero e il movimento è tanto più veloce quanto più elevata è la temperatura della soluzione della sostanza. Nella maggior parte delle sostanze semplici solubili (sali, zuccheri, peptidi), con la diminuzione della temperatura, pur diminuendo la velocità del movimento, non si verifica un riordino delle molecole secondo le condizioni iniziali. Con i biopolimeri, simili ai polidesossiribonucleotidi, vi è la tendenza delle molecole a riordinarsi fra loro. Questa proprietà è molto evidente nel DNA a doppia elica, dove la capacità di riordino allo stato iniziale può essere dell'ordine 100%. La misura di questa capacità può essere fatta in modo specifico per i polidesossiribonucleotidi con misure delle variazioni di densità ottica (D.O.) a 260 nm di soluzioni riscaldate e raffreddate o alcalinizzate e neutralizzate a pH 5.

La misura dell'ipercromicità è data dalla seguente formula:

D.O. (a caldo o pH alcalino) -t D.O. (a X amb. ó pH neutro)

che può essere, per quanto detto, definita anche come:

D.O. (in fase disordinata) D.O. (in fase ordinata)

In questo modo l'ipercromicità h esprime la frazione delle molecole di polinucleotìde in grado di riordinarsi.

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Come sì è detto, col DNA a doppia elica questo dato, espresso in percentuale, può raggiungere il 100%, mentre con gli oligodesossiribonucleotidi (peso molecolare inferiore a 8000 dalton) questo valore è pressoché zero.

E' stato ora scoperto che il valore ottimale di h, perche il polidesossiribonucleotide Defibrotide sia farmacologicamente attivo e atto agli usi terapeutici suddetti, deve corrispondere ad una percentuale di circa il 15% e che valori di h inferiori al 10% riducono drasticamente l'attività farmacologica, mentre valori superiori di h al 20% comportano rischi di effetti collaterali indesiderati.

Questi limiti caratteristici di ipercromicità stanno ad indicare che il polidesossiribonucleotide Defibrotide è a singolo filamento (sìngle-strand) e ciò è confermato anche dalle misure di peso molecolare effettuate a luce diffusa, dove non si riscontrano significative differenze della massa molecolare, operando sia in condizioni normali che denaturanti. Pertanto il polidesossiribonucleotide Defibrotide ha la struttura di un biopolimero a sìngolo filamento con capacità di riordino intramolecolare (appaiamenti di basi nucleiche all'interno della stessa molecola) pari al 15% circa espresso in DNA nativo.

Come precedentemente menzionato uno degli aspetti principali della presente invenzione risiede nel procedimento per la preparazione di Defibrotide avente le caratteristiche sopra indicate assicurando al tempo stesso la sostanzialmente perfetta uniformità delle caratteristiche da un lotto di produzione all'altro, l'utilizzabilità ed affidabilità completa del prodotto ottenuto nella terapia umana e, naturalmente, la fattibilità e vantaggiosi sotto il profilo della produzione industriale.

Come già accennato il procedimento descritto nei brevetti USA Ni. 3 770 720 e 3 899 481 prevede l'estrazione e la parziale degradazione degli acidi desossiribonucleici mediante degradazione protonica degli acidi nucleici. In tale procedimento le rese di Defibrotide sono relativamente basse e il prodotto è spesso accompagnato da prodotti di degradazione. E' noto infatti che la degradazione protonica dei polidesossiribonucleotidi può indurre in modo più o meno marcato la depurinizzazione, con il pericolo che si formino quantitativi seppur modesti di acidi apurinici che possono risultare tossici.

Lo scopo principale della presente invenzione è appunto la sostanziale risoluzione dei problemi ed inconvenienti dei precedenti processi.

Uno scopo più specifico della presente invenzione è quello di fornire un procedimento per l'ottenimento di Defibrotide avente le caratteristiche chimiche e chimico-fìsiche sopra precisate.

Un ulteriore scopo della presente invenzione è inoltre quello di fornire un procedimento per la produzione di Defibrotide che consenta l'utilizzazione di una molteplicicità di fonti naturali di partenza, oltre al polmone previsto nei brevetti precedentemente individuati.

E' stato ora sorprendentemente scoperto che, operando in condizioni di aggregazione più controllate, acidi nucleici grezzi possono essere depolime-rizzati in modo vantaggioso, riducendo così al minimo la formazione di prodotti di degradazione.

Il procedimento secondo la presente invenzione si caratterizza pertanto per le seguenti operazioni:

a) macinazione e proteolisi a caldo dell'organo animale dipartenza;

b) filtrazione e concentrazione del lisato;

c) aggiunta al concentrato di un sale di un catione capace di precipitare i fosfati, e regolando il pH a valori acidi non superiori a pH 4,5;

d) filtrazione a volume costante della sospensione di precipitato, per separare la parte polisaccari-dica in soluzione;

e) aggiunta alla sospensione risultante di sali insolubili di acidi nucleici di un sale idrosolubile di un metallo alcalino per solubilizzare gli acidi nucleici, ed eliminazione dalla soluzione dei cationi insolubiliz-zanti, spostati;

f) regolazione della forza ionica della soluzione di acidi nucleici ad un valore prestabilito almeno 1 molare per iniziare l'aggregazione stabilizzante degli stessi nella forma di polidesossiribonucleotidi altamente polimerizzati a tacche (nicked) e regolazione del pH della soluzione stessa fino al momento in cui l'analisi spettrofotometrica della miscela di reazione indica che è stata raggiunta la massima ipercromicità reversibile cioè la massima aggregazione possibile;

g) riscaldamento di questa soluzione fino alla temperatura di depolimerizzazione del polidesossiribonucleotide aggregato, e controllo della depolimerizzazione mediante misura di variazione di ipercromicità reversibile fino a che questa raggiunge il valore espresso in % di DNA nativo del 15 ±5;

h) interruzione per raffreddamento del processo di depolimerizzazione e rimozione dei ponti idrogeno nei frammenti a doppio filamento;

i) stabilizzazione dei frammenti a filamento singolo risultati in tale condizione mediante riscaldamento della soluzione risultante dallo stadio precedente a temperatura e pH superiori a quelli dello stadio di depolimerizzazione, impedendo che i ponti idrogeno si riformino;

j) filtrazione a caldo ed eliminazione sempre a caldo dei sali presenti in soluzione ed eventuale concentrazione.

Prendendo ora in considerazione i singoli stadi del procedimento sopra definito, gli organi animali utilizzati comprendono organi, tessuti e cellule di mammiferi, in particolare polmone, intestino, fegato e mucose di bovini, ovini, suini ed equini. Del pari utilizzabili sono le acque madri residue ottenute nella produzione di eparine, lisati proteici ed estratti d'organo. Un'ulteriore materiale di partenza è costituito da cellule, come ad esempio globuli bianchi o residui delle loro colture, spermatozoi, spermatociti e cellule germinali di mammiferi.

La proteolisi viene effettuata in modo di per sè noto con un enzima proteolitico, come ad esempio papaina, tripsina, ecc.

Le condizioni e la durata della proteolisi dipendono ovviamente dal tipo di enzima proteolitico e sono ben note esse sono generalmente comprese negli intervalli di 10—90°C e 0,5-10 ore. Ad esempio con la

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papaina la proteolisi viene generalmente condotta per 4 ore a 65°C.

Passando a considerare la fase (b) di filtrazione e quella di concentrazione quest'ultima viene preferibilmente effettuata su membrana a flusso tangenziale. In tal modo, infatti è possibile selezionare un intervallo di peso molecolare desiderato. La membrana viene scelta pertanto con un ben determinato «cut-off» (generalmente50-100 000).

Il concentrato risultante viene addizionato (stadio c) con un catione capace di precipitare i fosfati, nel concentrato stesso. Un sale del catione come ad esempio, alogenuri, solfati, bicarbonati, acetati di Ca, Zn, o simili possono essere aggiunti al concentrato regolando il pH a valori acidi.

La sospensione di precipitato viene filtrata mediante drafiltrazione a volume costante (fase d) per membrana avente una dimensione di pori di 0,45 p. o meno con flusso tangenziale e con rimbocco continuo dì acqua per mantenere il volume costante fino a scomparsa delle sostanze potisaccaridiche dal filtrato.

Il sale idrosolubile, addizionato (in fase e) alla sospensione di sali insolubili di acidi nucleici, è un sale come alogenuro od acetato di un metallo alcalino, come sodio o potassio. Nella sospensione risultante rimane il catione insolubilizzante (come Ca, Zn, ecc.) che viene eliminato preferibilmente per diafiltrazione a volume costante per membrana avente un cut-off inferiore a 10 000 con flusso tangenziale e rimbocco continuo di soluzione salina per mantenere il volume costante. Questo trattamento continuato fino a quando nel permeato non compare più il catione insolubilizzante. Alternativamente il catione insolubilizzante viene eliminato per scambio ionico operato sulla sospensione risultante dalla fase d.

La soluzione di acidi nucleici grezzi viene regolata se necessario ad una forza ionica almeno 1 molare e preferibilmente 3 molare, preferibilmente per aggiunta di sale idrosolubile di un metallo alcalino ed il pH della soluzione viene regolato fino a raggiungere il valore al quale secondo le misure sperimentali corrisponde la massima ipercromicità reversibile del sistema. Tale pH è normalmente compreso tra 4 e 5.

Gli stadi a-c possono concomitantemente essere condotti a temperature ambiente, anche se la temperatura può variare tra 10 e 90°C.

In questa fase gli acidi nucleici grezzi hanno subito un'aggregazione stabilizzante a formare polidesossiribonucleotidi altamente polimerizzati a tacche (nicked), Nella fase f, la depolimerizzazione dei poli-dessosirobonucleotidì altamente polimerizzati a tacche avviene per riscaldamento a una temperatura che è preferibilmente di circa 7Q-75°C, sebbene la temperatura di depolimerizzazione possa variare tra 60 e 90°C, monitorando la depolimerizzazione con misure di variazione di ipercromicità reversibile. La rimozione dei restanti ponti idrogeno nei frammenti a doppio filamento, risultanti una volta interrotta la depolimerizzazione per raffreddamento, a temperatura più bassa, preferibilmente da 15 a 309C, viene effettuata per alcalinizzazlone della massa di reazione ad un a pH superiore a 7, preferibilmente ad un pH di 8 o più.

Infine la stabilizzazione dei frammenti a filamento singolo viene ottenuta per riscaldamento della soluzione ottenuta nella fase h a temperatura di almeno 5°C superiore a la temperatura di depolimerizzazione, e generalmente ad una temperatura da 65 a 100°C.

Nel disegno allegato sono mostrate schematicamente e con rappresentazione convenzionale le modificazioni nelle diverse fast degli acidi nucleici grezzi così come estratti da organi e sottoposti a digestione proteolitica.

Come si può osservare chiaramente, quando il materiale di partenza, immaginabile come un insieme polinucleotidico più o meno disappaiato, despìraliz-zato e parzialmente degradato con formazione di brevi tratti depurinati, indicato con la sigla SM, viene disciolto in soluzione salina ad alta forza ionica e sufficientemente protonata, preferibilmente 3 molare, di un sale idrosolubile di un metallo alcalino, le molecole che compongono il materiale di partenza tendono ad aggregarsi come è noto secondo la regola di Chargaff dell'appaiamento delle basi, grazie ai ponti idrogeno resi disponibili dal mezzo solvente. Poiché le catene dinucleotidiche sono parzialmente incomplete, si determina un appaiamento casuale, che conduce alla formazione di pollnucleotìdì altamente polimerizzati a doppio filamento, i cui filamenti sono interrotti casualmente da discontinuità nelle sequenze ( «nicks») disposte lungo i margini idrofili-ci della struttura rappresentata con la sigla AS (sistema aggregato) nel disegno.

Nel disegno sono anche evidenziate le aree idrorepellenti (IR) e quelle (IF) idrofile dotate di carica negativa.

A questo punto l'immissione di energìa termica opportunamente graduata provoca una frattura, prevalentemente a livello delle sole discontinuità del doppio filamento, per cui si producono dei frammenti a doppio filamento di una certa regolarità (indicato con DSF nella figura).

Il livello di frammentazione viene monitorato attraverso il controllo di vari parametri chimico-fisici, di cui il principale è l'indice di ipercromicità reversìbile del sistema (come già definito).

La rimozione degli idrogenioni, praticata nel momento stesso in cui l'ipercromicità reversibile ha raggiunto il valore che caratterizza il Defibrotide, (15 ± 5) toglie i ponti idrogeno che appaiano le basì nucleiche, liberando così i frammenti in mono-filamenti polidesossiribonucleotìdici con la struttura caratteristica desiderata.

E' stato anche scoperto che questa condizione di libertà dei singoli filamenti viene stabilizzata nella struttura a filamento singolo col 15% circa dì ipercromicità reversibile, che caratterizza il Defibrotide, quando si riscalda ulteriormente la soluzione a pH 8 ± 0,2 ad un livèllo di temperatura superiore alla temperatura impiegata nella depolimerizzazione in condizioni aggreganti avvenuta precedentemente.

L'energia cinetica indotta nel sistema impedisce le riaggregazioni, che possono verificarsi nelle fasi successive del processo che comportano l'isolamento della frazione polidesossiribonucleotidica di interesse.

Solo i filamenti polidesossiribonucleotidici così

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stabilizzati (indicati con SSD in figura) mantengono tutte le caratteristiche chimiche che caratterizzano la struttura desiderata del Defibrotide.

Operando in questo modo, si riduce al minimo il grado dì depurinizzazione ed il rapporto basi purini-che/basi pirimidiniche raramente scende al di sotto dello 0,95%.

Rimane infine da sottolineare come con il procedimento secondo la presente invenzione sia possìbile ottenere polidesossiribonucleotidi standardizzati che presentano le caratteristiche chimiche e farmacologiche del Defibrotide.

Nel corso di queste ricerche si è trovato come già accennato che era possibile ottenere polidesossiribonucleotidi con le caratteristiche desiderate anche da altre fonti oltre al polmone bovino. E' stato così sorprendentemente scoperto che, operando con i criteri sopra indicati, è possibile ottenere polidesossiribonucleotidi con le stesse caratteristiche del Defibrotide anche da altre fonti quali il polmone suino e l'intestino, il fegato, il timo sia bovini che suini. Questa possibilità è molto importante perchè, in previsione di notevoli consumi terapeutici del Defibrotide prodotto, appare necessario ampliare le fonti di reperimento. E' particolarmente vantaggioso poter usare anche le acque madri della lavorazione di eparina, estratti e idrolisati proteici, come materiali di partenza, poiché questi materiali sono molto abbondanti e attualmente scarsamente utilizzati e la cui discarica è anche grave fonte di inquinamento.

Un altro vantaggio della presente invenzione è quindi non solo possibilità di ampliare le fonti di reperimento del Defibrotide, ma anche il recupero di sottoprodotti, rendendo più economiche altre lavorazioni, quali i processi per la produzione dell'eparina e di lisati proteici e riducendo inoltre le cause di inquinamento come quello dato dai residui ricchi di fosfati di queste altre lavorazioni residui, che, per l'appunto, sono di origine nucleica.

Gli esempi che seguono illustrano in modo non limitativo come si può realizzare il procedimento rivendicato.

ESEMPI01

kg 100 di polmone bovino congelato sono stati macinati e dispersi in 50I di acqua potabile contenente 200 g di papaina grezza, attivata con solfiti.

Il pH della dispersione è stato regolato a 5,8 con acido cloridrico diluito, quindi si è scaldata la massa a 65°C per effettuare la proteolisi. Dopo 4 ore si è interrotta la proteolisi scaldando la massa all'ebollizione per 15 minuti. Dopo filtrazione per filtro pressa, dove il solido presente nella dispersione è stato eliminato, la soluzione filtrata di proteolisato è stata concentrata ad un volume di 25 I, filtrando a flusso tangenziale su membrana tubolare Romicon con cut-off di 50 000.

Il permeato, che presentava un'attività eparinica pari a circa 8 Ul/ml, poteva essere impiegato nel recupero di eparina ed aminoacidi.

Il concentrato (retenato) è stato trattato con 150 g di calcio cloruro anidro, regolando la soluzione a pH 3 per provocare la precipitazione della quota nucleica, mentre la parte polisaccaridica rimanente resta in soluzione.

La sospensione è stata diafiltrata a flusso tangenziale per membrana tubolare ROMICON da 0,45 micron di porosità, mantenendo costante il volume del retenato con aggiunte di una soluzione di calco cloruro allo 0,01%. La diafiltrazione è stata continuata fino a quando il retenato non dava più reazione dei polisaccaridi con ceti! piridinio cloruro.

II permeato della diafiltrazione è stato utilizzato per il recupero di polisaccaridi, ottenendo circa 50 g di una miscela costituita da condroitin solfati ed eparina.

La sospensione di retenato, di diafiltrazione contenente i sali di calcio insolubili degli acidi nucleici, è stata addizionata di 25 I di sodio cloruro 3M. La miscela è stata diafiltrata a flusso tangenziale per membrana ROMICON con cut-off da 10 000, mantenendo costante il volume del retenato con aggiunte di soluzione 3 molare di sodio cloruro, fino a quando il liquido permeato non ha più dato la reazione del calcio con ossalato di ammonio; in questo modo si è realizzato lo scambio tra ioni calcio e sodio per ottenere tutti gli acidi nucleici in forma sodica.

Il retenato è stato quindi ulteriormente concentrato mediante filtrazione a flusso tangenziale sulla stessa membrana fino ad ottenere un volume di 7,51. Questo concentrato conteneva circa il 3% (valutazione spettrofotometrica) di sali sodici degli acidi nucleici grezzi, pari allo 0,22% del peso dell'organo lavorato, in soluzione salina 3 molare.

Questa soluzione è stata portata al punto di massima ipocromicità aggiungendo aliquote di acido cloridrico 3M fino a quando le misure spettrofotometriche di ipercromicità per rialcalinizzazione di campioni di soluzione non presentavano un delta massimo di assorbimento; questo è risultato pari a 38% di DNA nativo quando il pH era arrivato a 4,25, che corrispondeva quindi al punto di massima ipocromicità del sistema e quindi al massimo stato di aggregazione e appaiamento delle basi degli acidi polidesos-siribonucleotidici in soluzione.

Instaurata questa condizione, è stata riscaldata la soluzione fino a 75°C per iniziare la depolimerizzazione. Ad intervalli di 15 minuti sono state effettuate misure di ipercromicità su campioni della soluzione per monitorare il progredire della depolimerizzazione. Dopo 6 determinazioni, i dati posti sulle originate di un sistema di assi cartesiani hanno permesso di estrapolare, sulle ascisse, un tempo di 4 ore per ottenere polidesossiribonucleotidi con una ipercromicità pari al 19% di DNA nativo.

Pertanto dopo 4 ore è stato interrotto il processo di depolimerizzazione in condizioni aggreganti, raffreddando la massa depolimerizzata ad una temperatura di 30°C e alcalinizzandola (pH) 8 con sodio idrato 3 molare. La temperatura è stata nuovamente innalzata fino a 85°C per 30 minuti al fine di stabilizzare struttura dei polinucleotidi, e quindi la soluzione a caldo è stata filtrata e sottoposta a dialisi e concentrazione a flusso tangenziale come sopra fino ad un volume di 6500 mi.

Il prodotto formatosi è stato precipitato con alcool dalla soluzione concentrata.

Dopo disidratazione con alcool ed essiccazione

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sotto vuoto a 60PC, si sono ottenuti 126 g di prodotto con le seguenti caratteristiche analitiche: P = 8,40%, G = 8,60%

d = 34,10%, C = 6,15%

A = 8,90%, T= 9,20%

P/(A+G+C+T) mol. = 1,07 purine/pirimidine mol. = 0,96 estinzione molare riferita a P e(P) = 7.800 coefficiente di estinzione = 230

potere rotatorio [a] ^°° = 57°

ipercromicità reversibile (in DNA nativo) h = 18%

I dati sopra riportati conducono stechiometricamente alla seguente formula nucleotidica:

Pg, (dAp)t2, (dGp)io, (dCp)io, (dTp)«

ESEMPIO 2

kg 1000 di polmone di suino sono stati lavorati operando come descritto nell'esempio 1, ottenendo 700 g di Defibrotide con le seguente caratteristiche: P = 8,50%, G = 8,90%

d = 36,20%, C = 6,80%

A = 9,30%, T = 10,20%

P/(A+G+C+T) mol. = 1,02 purine/pirimidine mol. == 0,90 [a] 20° = + 53" h = 16% e(P) = 7,750

P, (dAp)i2, (dGp)io, (dCp)io (dTp)n

ESEMPIO 3

1000 litri di acque madri provenienti dalla lavorazione di eparina da mucosa intestinale bovina sono state concentrate per membrana a flusso tangenziale a 55 litri. Gli acidi nucleici sono stati precipitati con zinco cloruro come descritto nel brevetto USA 3 770 720. Dopo decantazione e lavaggio per separare i polisaccaridi, il precipitato è stato sospeso in acqua e convertito in sale sodico mediante trattamento con la resina scambiatrice di ioni IR 120 in forma Na+.

I sali sodici degli acidi nucleici contenuti nell'eluato sono stati aggregati aggiungendo un volume uguale di una soluzione 5M di tampone acetato pH (3,9) ottenendo così una miscela finale avente pH 4,1 al quale si è misurata la massima ipercromicità reversibile dal sistema. La miscela è stata scaldata a 70°C, e mantenuta a questa temperatura monitorando ogni 15 minuti l'indice di ipercromicità reversibile.

Dopo quattro ore l'indice aveva raggiunto un valore h = 18%. La soluzione è stata raffreddata a 25°C e quindi regolata a pH 7,8 con sodio idrato 5N e infine scaldata a 85°C per 30 minuti. Dopo filtrazione è stato precipitato il prodotto aggiungendo 1,5 volumi di etanolo. Il precipitato è stato successivamente lavato e disidratato con etanolo, quindi essiccato sotto vuoto a 60°C.

Sono stati ottenuti 630 g di prodotto con le seguenti caratteristiche chimiche:

P = 8,73%, G = 8,5%

d = 36,40%, C = 6,9%

A = 9,60%, T = 9,7%

P/(A+G+C+T) mol. = 0,4 purine/pirimidine mol. = 0,92 e(P) = 7.580 [a] |0° = 51«, h = 15%

a cui corrisponde una formula nucleotidica: P2, (dAp)i3, (dGp)io, (dJp)i4, (dCp)ii

ESEMPIO 4

kg 30 di sali sodici di acidi nucleici ottenuti da polmone bovino, secondò le indicazioni riportate nel brevetto USA 3 770 720, sono stati sciolti in 500 I di tampone acetato 3M a pH 4,5 per formare una soluzione avente la massima ipercromicità reversìbile del sistema. La soluzione così ottenuta filtrata e quindi scaldata a 75°C. Ad intervalli di 15 minuti, si prelevavano dei campioni per la determinazione dell'indice di ipercromicità reversibile, si registravano i dati sulle ordinate di un sistema di assi cartesiani, dove sulle ascisse venivano riportati ì tempi dì prelievo dei campioni. In base ai dati riscontrati su 3 o 4 determinazioni, è stato estrapolato il tempo necessario perchè l'ipercromicità h del sistema raggiungesse il valore di 15%, espresso in DNA nativo, continuando il riscaldamento per questo tempo.

La massa risulante è stata regolata a pH 8 con sodio idrato 5N e scaldata a 80°C per 60 minuti per stabilizzare la struttura polidesossiribonucleotidi-ca, che è caratteristica del Defibrotide.

Al termine ia soluzione è stata filtrata ed essiccata come descritto nell'esempio 3.

Sono stati ottenuti così circa 15 kg di prodotto. Le caratteristiche del lotto preparato come descritto in questo esempio sono le seguenti:

P = 8,83%, G = 8,40%

d = 37,80%, C = 7,00%

A = 9,90%, T = 9,85%

P/(A+G+C+T) mol. = 1,06 purine/pirimidine mol» = 0,95 e(P) = 7.750 [a] 20° = + 54°, h = 17%

La formula nucleotidica risultante è:

P, (dAp)i3, (dGp)ti, (dTpJu, (dGp)i2

ESEMPIO 5

Una variante dell'esempio 4 è stata quella di effettuare, durante la depolimerizzazione una sottrazione al sistema del prodotto che man mano depoli-merizzava, mediante permeatone su membrana a flusso tangenziale con taglio molecolare da 100 000; ciò con l'intento di evitare ulteriori degradazioni delie strutture polidesossiribonucleotidiche, che potevano già avere la struttura del Defibrotide, migliorando così le rese, in effetti, operando nelle stesse condizioni dell'esempio 4, ma con questa modificazione, da kg 30 di sali sodici di acidi nucleici si sono ottenuti kg 16,5 di prodotto con caratteristiche corrispondenti a quelle dell'esempio 4.

Claims

Rivendicazioni

1. Procedimento per l'ottenimento del polidesossiribonucleotide, Defibrotide, a partire da una solu-

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zione salina di acidi nucleici grezzi detta soluzione essendo almeno sostanzialmente esente da polisaccaridi e proteine, caratterizzato dalle operazioni di:

(a) formazione di polidesossiribonucleotidi altamente polimerizzati a tacche mediante aggregazione stabilizzante degli acidi nucleici grezzi regolando se necessario, la soluzione ad una forza ionica prestabilita almeno 1 molare e regolando il pH fino a quando è stata raggiunta la massima ipercromicità reversibile;

(b) depolimerizzazione dei polidesossiribonucleotidi fino a quando la ipercromicità reversibile indica della soluzione ha raggiunto il valore, espresso in percento in DNA nativo, h = 15 ± 5, mediante riscaldamento della soluzione risultante ad una temperatura di depolimerizzazione per il detto polidesossiribonucleotide e mantenimento della soluzione alla temperatura di depolimerizzazione fino a che è stato raggiunto detto valore di ipercromicità reversibile;

(c) successivo arresto della reazione di depolimerizzazione e rimozione dei ponti idrogeno in ogni frammento a doppio filamento nella soluzione de-polimerizzata per formare frammenti polidesossi-ribonucleotidici a singolo filamento;

(d) successiva stabilizzazione dei frammenti risultanti a filamento singolo dei polidesossiribonucleotidi mediante riscaldamento della soluzione risultante a temperatura e pH superiori a quelli di depolimerizzazione per impedire che si riformino ponti idrogeno.

2. Procedimento secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che detta soluzione di acidi nucleici grezzi, viene ottenuta da organi, tessuti e cellule di mammiferi.

3. Procedimento secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che détta operazione (a) viene effettuata aggiungendo ad una sospensione di sali insolubili di detti acidi nucleici grezzi un sale idrosolubile di un metallo alcalino per solubilizzare gii acidi nucleici ed eliminando dalla soluzione il catione insolubilizzante, l'aggiunta dei sale idrosolubile di metallo alcalino essendo effettuata, fino ad ottenere una soluzione salina almeno 1 molare di acidi nucleici grezzi.

4. Procedimento secondo la rivendicazione 3, caratterizzato dal fatto che detta aggiunta di sale idrosolubile viene continuata fino a che detta soluzione salina di acidi nucleici grezzi è almeno 3 molare.

5. Procedimento secondo la rivendicazione 3, caratterizzato dal fatto che detto saie idrosolubile di metallo alcalino è scelto nel gruppo comprendente alogenuri ed acetati.

6. Procedimento secondo la rivendicazione 5, caratterizzato dal fatto che detto sale è cloruro di sodio.

7. Procedimento secondo la rivendicazione 6, caratterizzato dal fatto che detto sale è una soluzione di cloruro di sodio 3 molare.

8. Procedimento secondo la rivendicazione 3, caratterizzato dal fatto che l'eliminazione del catione insolubilizzante viene effettuata mediante diafiltrazione a volume costante attraverso una membrana con flusso tangenziale, con rimbocco continuo di soluzione salina.

9. Procedimento secondo la rivendicazione 8, caratterizzato dal fatto che detta membrana ha un «cut off» di non più di 100 000.

10. Procedimento secondo le rivendicazioni 1 e 2, caratterizzato dal fatto che la regolazione del pH di cui all'operazione (a) viene effettuata con l'acido corrispondente all'anione del sale solubilizzante utilizzato per l'ottenimento di detta soluzione salina di forza ionica prestabilita.

11. Procedimento secondo la rivendicazione 10, caratterizzato dal fatto che detto acido è acido cloridrico.

12. Procedimento secondo la rivendicazione 11, caratterizzato dal fatto che detto acido cloridrico viene aggiunto fino a quando la soluzione ha una concentrazione idrogenionica corrispondente ad un pH di 3-5.

13. Procedimento secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che detta reazione di depolimerizzazione viene effettuata per riscaldamento a temperatura di circa 70-75°C.

14. Procedimento secondo la rivendicazione 13, caratterizzato dal fatto che la depolimerizzazione viene controllata misurando il valore di ipercromicità reversibile fino quando questo si riduce a 15 ± 5, espresso come percento in DNA nativo.

15. Procedimento secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che l'arresto della depolimerizzazione viene effettuato per raffreddamento della soluzione,

16. Procedimento secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che detta rimozione dei ponti idrogeno nei frammenti a doppio filamento viene effettuata regolando il pH della soluzione a un valore superiore a 7.

17. Procedimento secondo la rivendicazione 16, caratterizzato dal fatto che la soluzione viene portata a pH superiore ad 8.

18. Procedimento secondo la rivendicazione 16, caratterizzato dal fatto che il pH viene regolato per aggiunta di un idrato di metallo alcalino.

19. Procedimento secondo la rivendicazione 18, caratterizzato dal fatto che detto idrato di metallo alcalino è idrossido di sodio.

20. Procedimento secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che la soluzione ottenuta dall'operazione (c) viene riscaldata a temperatura superiore di almeno 5°C a quella della reazione di depolimerizzazione allo scopo di stabilizzare i frammenti a filamento singolo.

21. Procedimento secondo la rivendicazione 20, caratterizzato dal fatto che il riscaldamento viene effettuato per almeno 30 minuti.

22. Procedimento secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che la soluzione risultante dal riscaldamento stabilizzante dell'operazione (d) viene filtrata a caldo, e quindi si eliminano sempre a caldo i sali presenti in soluzione.

23. Procedimento secondo la rivendicazione 22, caratterizzato dal fatto che la soluzione dopo la rimozione dei detti sali viene eventualmente concentrata.

24. Procedimento secondo la rivendicazione 22, caratterizzato dal fatto che il filtrato di detto stadio di filtrazione a caldo viene sottoposto a dialisi attra5

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verso una membrana a flusso tangenziale.

25. Procedimento secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che detta operazione (a) viene realizzata con tampone acetato di molarità tale da ottenere il pH finale desiderato corrispondente alla massima ipercromicità reversibile del sistema.

26. Procedimento secondo la rivendicazione 25, caratterizzato dal fatto che la soluzione risultante dal riscaldamento stabilizzante dei frammenti a filamento singolo viene filtrata e il prodotto finale precipitato per aggiunta dì un solvente alcoolico.

27. Procedimento secondo la rivendicazione 26, caratterizzato dal fatto che detto solvente alcoolico è etanolo.

28. Procedimento secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che detta soluzione salina di acidi nucleici grezzi viene pregarata mediante macinazione, digestione proteolitica a caldo, filtrazione e concentrazione del Usato, seguita dall'aggiunta di un sale di un catione capace di precipitare i fosfati e filtrazione a volume costante della sospensione di precipitato.

29. Procedimento secondo la rivendicazione 28, caratterizzato dal fatto che la filtrazione del lisato proteolitico viene effettuata su membrana a flusso tangenziale.

3Q. Procedimento secondo la rivendicazione 29, caratterizzato dal fatto che detta membrana è scelta con un cut-off di 50 000-100 000.

31. Procedimento secondo la rivendicazione 28, caratterizzato dal fatto che la filtrazione a volume costante viene effettuata con membrana a flusso tangenziale e rimbocco contìnuo di acqua.

32. Procedimento secondo la rivendicazione 31, caratterizzato dal fatto che detta membrana ha una dimensione di fori dì non più di 0,45 n.

33. Procedimento secondo la rivendicazione 28, caratterizzato dal fatto che il materiale di partenza è scelto nel gruppo comprendente polmone, intestino, fegato e mucose di ovini, suini, equini e bovini.

34» Procedimento secondo la rivendicazione 28, caratterizzato dal fatto che il materiale di partenza è scelto nel gruppo comprendente globuli bianchi o residui delle loro colture, spermatozoi, spermatociti o cellule germinali di mammiferi.

35. Procedimento secondo la rivendicazione 28, caratterizzato dal fatto che il materiale di partenza è un'acqua madre proveniente dalla lavorazione di organi o tessuti animali in un processo per l'ottenimento di eparine, lisati proteici ed estratti di organo.

36. Procedimento secondo la rivendicazione 1 da una soluzione di acidi nucleici grezzi che è almeno sostanzialmente esente da polisaccaridi e proteine, caratterizzata dal fatto di:

(a) formare polidesossiribonucleotidi altamente polimerizzati a tacche mediante aggregazione stabilizzante di acidi nucleici grezzi, regolando se necessario la soluzione di acidi nucleici grezzi ad una forza ionica prestabilita almeno 1 molare, e regolando il pH di detta soluzione fino a che è stata raggiunta la massima ipercromicità reversibile;

(b) successivamente depolimerizzare i polidesossiribonucleotidi fino a che l'ipercromicità reversibile della soluzione ha un valore h= 15 ± 5, misurato come percentuale in DNA nativo, mediante riscaldamento della soluzione risultante ad una temperatura di depolimerizzazione per il detto po-lidesossiribonucleodite, detta temperatura di depolimerizzazione essendo compresa tra circa 60°C e circa 90°C, e mantenimento delia soluzione ad una temperatura di depolimerizzazione fino a che è stato raggiunto detto valore di ipercromicità, reversibilità;

(c) successivamente arrestare la reazione di depolimerizzazione mediante raffreddamento della soluzione ad una temperatura da 15 a 30aG, e rimuovere i ponti idrogeno in ogni frammento a doppio filamento nella soluzione depolimerizzata per formare frammenti polidesossiribonucleotidlci a singolo filamento regolando il pH della soluzione ad una valore maggiore di 7, e

(d) successivamente stabilizzare i frammenti risultanti a filamento singolo dei polidesossiribonucleotidi mediante riscaldamento della soluzione ri-sulante ad una temperatura che è di almeno 5°G superiore alla temperatura della reazione di depolimerizzazione ad un Ph che è di almeno 0,2 maggiori del Ph della reazione di depolimerizzazione, impedendo di conseguenza la riformazione di ponti idrogeno.

37. Polidesossiribonucleotide noto come Defibrotide, ottenuto secondo il procedimento di una delle rivendicazioni 1 à 36, rispondente alla seguente formula di sequenza random:

P1-5, (dAp)i2-24, (dGp)io-20, (dTp)i3-26, (dCp)io-20, dove

P = radicale fosforico dAp = monomero desossiadenilico dGp = monomero desossiguanilico dTp = monomero desossîtimîdilîco dCp = monomero desossicitidilico,

e presentante inoltre le seguenti caratteristiche chimico-fisiche:

- elettroforesi = omogenea con mobilità anodica;

- coefficiente di estinzione, a 260 ± 1 nm == 220

±10;

- rapporto delle estinzioni, E230/E260 = 0,45 ± 0,04;

- coefficiente di estinzione molare (riferito al fosforo), e(P) = 7.750 ± 500;

- potere rotatorio, [a] ^°° 53° ± 6;

- ipercromicità reversibile, espressa in percento di DNA nativo, h = 15 ±5.

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