JP2581722B2

JP2581722B2 - 化学的に定義された再現性のあるポリデオキシリボヌクレオチドを得る方法

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Publication number: JP2581722B2
Application number: JP62502486A
Authority: JP
Inventors: フエデリ，ジヤンフランコ; デイアマンテイーニ，ジユゼツペ; マントバーニ，マリサ; プリノ，ジユゼツペ
Original assignee: KURINOSU IND FUARUMAKOBIOROJIKA SpA
Current assignee: KURINOSU IND FUARUMAKOBIOROJIKA SpA
Priority date: 1986-04-17
Filing date: 1987-04-10
Publication date: 1997-02-12
Anticipated expiration: 2012-02-12
Also published as: ES2005168A6; CN1018650B; GR870602B; FR2597481B1; EP0263155B1; CN87103688A; IL82251A; AR242585A1; JPS63503067A; FR2597481A1; IT1190313B; EP0263155A1; IL82251A0; KR880701242A; WO1987006235A1; DE3772697D1; ZA872755B; BE1002908A4; IT8620117A0; US4985552A

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、化学的に定義された再現可能な形態のポリ
デオキシリボヌクレオチドの製造に関する。

更に特定的には、本発明は、デフィブロチド（Defibr
otide）［DCI、目録21、世界保険機関年代記 35、補遺
5.4、1981（DCI,Liste21,Chronique OMS 35,5 suppl.4,
1981）］の名称で知られた物質の製造に関する。

デフィブロチドと名付けられた物質は、米国特許第3,
770,720号及び第3,899,481号に開示されている如き動物
器官からの抽出により得られた低分子量ヌクレオチド画
分のナトリウム塩として定義され、この開示は引照によ
り本明細書に加入する。

デフィブロチドは、多数の薬理学的且つ臨床的研究の
主題であった。これは、一方は、その非常に低い毒性
（急性、亜急性及び慢性の）が評価されることを可能と
し、可能な治療学的使用の観点からは自明な利点を伴っ
ており、他方では、デフィブロチドは顕著な且つ全く予
測されない治療学的特性を示した。実際問題として、米
国特許第3,892,567号に記載の如く、デフィブロチド
は、それを抗血栓症薬として有用ならしめる線維素溶解
活性を持っている。この上記記載は引照により本明細書
に加入する。更に、薬理学的及び臨床的実験研究（志願
者に対して行なわれた）は下記の活性を示した。

ａ）末梢動脈疾患（peripheral arteriopathies）の治
療［発明者：オー・エヌ・ウルチン（O.N.Ultin）、米
国特許出願第649,055号、1984年９月10日出願、］、ｂ）急性腎不全（acut renal insufficiency）［発明
者、ブイ・ボノミニ（V.Bonomini）、米国特許第4,649,
134号、1987年３月10日付与、］、ｃ）急性心筋虚血症（miocardial acute ischemia）の
処置［発明者、ジー・プリノ、エム・マントバーニ、ア
ール・ニアダ（G.Prino,M.Mantovani,R.Niada）、米国
特許出願第701,695号、1985年２月14日出願］。

前記特許及び特許出願の開示は、それに開示された製
薬学的組成物及び使用の教示のために引照により本明細
書に加入する。

前記した治療学的使用の多様性及び重要性によって、
デフィブロチド及びその工業的製造が注目の的となった
ことは明らかである。この研究は、一面では、経済的に
有利で且つ技術的に合理的な工業的規模で行なわれる製
造を指向し、他方では、得られる工業的製品デフィブロ
チドの標準化及び制御を指向する。

換言すれば、前記した米国特許の主題となっている方
法は、名称デフィブロチドが与えられたヌクレオチド構
造の入手に導く、最初に開発された方法であった。

薬理学的及び臨床的研究の結果が、最初に単離された
物椎の非常に興味深い且つ多様な性質を示したとき、一
つには工業的規模の製造の問題に直面しそして他方では
この物質デフィブロチドの化学的物理的性質の研究が綿
密に考慮されたことは当然であり且つ明らかである。そ
の理由は、その化学的物理的性質はデフィブロチドの製
造及びその要件に厳密に関連しているからである。

デフィブロチドは、それを形成するヌクレオチド画分
が、ランダムな配列の下記ポリデオキシリボヌクレオチ
ドの式、 P₁−_５、（dAp）₁₂−₂₄、（dGp）₁₀−₂₀、（dTp）₁₃
−₂₆、（dCp）₁₀−₂₀、式中、Ｐ＝リン酸基、 dAp＝デオキシアデニルモノマー、 dGp＝デオキシグアニルモノマー、 dTp＝デオキシチミジルモノマー、 dCp＝デオキシシチジルモノマー、である、に化学量論的に一致しているならば、前記した薬理学的
及び治療学的性質を十分に達成し、それ故、前記した治
療学的使用に特に好適であることが見出だされ、そして
これ本発明の第１の特徴である。

この式に相当するデフィブロチドは、更に下記の化学
物理的性質を示す：電気泳動＝均一なアノード移動度（homogeneous anodic
moblity）、吸光係数 260±1nmにおける吸光比、E₂₃₀/E₂₆₀＝0.45±0.04、モル吸光係数（リンに関する） ε（Ｐ）＝7,750±50
0、施光能▲［α］^20゜ _D▼＝53゜±６、生の（native）DNAにおける％として示された可逆濃色
効果（reversible hyperchromicity）、ｈ＝15±５。

可逆濃色効果はポリデオキシリボヌクレオチドの固有
の光学的性質であり、そしてこれらのバイオポリマーの
溶液中での分子転位（molecular rearrangement）の能
力の目安である。

熱力学的状態の関数として、物質の分子は無秩序の且
つ自由な運動をする傾向があり、物質の溶液の温度が高
ければ高い程運動の速度は高い。簡単な可溶性物質
（塩、糖、ペプチド）の大部分においては、温度が減少
するにつれて、たとえ運動速度が減少するとしても、最
初の状態に比較して分子の転位は起こらない。バイオポ
リマーの場合には、ポリデオキシリボヌクレオチドと同
様に、分子は相互転位（mutual rearrangement）の傾向
がある。この性質は、初めの状態に比較した転位能力が
100％のオーダーであることができる二重らせんDNAにお
いて非常に顕著である。この能力の測定は、加熱され及
び冷却され又はアルカリ性にされ及びpH5に中和された
溶液の260nmにおける光学密度（O.D.）の変動の測定に
よりポリデオキシリボヌクレオチドに対して特定の方法
で行なわれる。

濃色効果の測定は下記式、により与えられ、これは、前述の観点から、として定義することもできる。

この方法においては、濃色効果ｈは、転位することが
できるポリヌクレオチドの分子のフラクションを示す。

二重らせんDNAの場合に既に述べた如く、百分率とし
て示されたこの値は、100％のオーダーであることがで
き、これに対してオリゴデオキシリボヌクレオチド（8,
000ダルトンより低い分子量）の場合には、この値は殆
どゼロである。

ポリデオキシリボヌクレオチドデフィブロチドが薬
理学的に活性であり且つ前記の治療学的使用に好適であ
るためには、ｈの最適値は薬15％の百分率に相当しなけ
ればならずそして10％より少ないｈの値は薬理学的活性
の劇的な減少を伴い、これに対して、20％より高いｈの
値は望ましくない副作用の危険を伴うことが見出だされ
た。

濃色効果のこれらの特徴的限界は、ポリデオキシリボ
ヌクレオチドデフィブロチドが一本鎖フィラメントで
ありそして、これは普通の条件及び編成条件の両方の条
件下に操作して、分子質量の有意な差が現れない拡散光
（diffused light）の下に行なわれた分子量の測定によ
つても確かめられる。

結果として、生のDNAにおいて示された約15％の分子
内転位（同じ分子内での核酸の対形成）の能力を持った
単一フィラメントバイオポリマーの構造を有する。

前記した如く、本発明の主要な特徴は、１つの製造バ
ッチから他の製造バッチにわたる生成物特性の実質的に
完全な均一性、得られた生成物のヒトの治療に対する完
全な有用性及び信頼性及び、明らかに工業的製造の観点
からの実施可能性及び便利さが同時に提供される、前記
した性質を有する電導性の製造方法にある。既に示した
とおり、米国特許第3,770,720号及び第3,899,481号に開
示された方法は、抽出及び核酸のプロトン性分解による
デオキシリボ核酸の部分分解より成る。このような方法
においては、デフィブロチドの収率は、相対的に低く、
生成物はしばしば分解生成物を伴う。実際問題として、
ポリデオキシリボヌクレオチドのプロトン性分解は、毒
性でありうる適度の量すらのアプリン酸が形成される危
険を伴って、多少顕著に脱プリン（depurination）を誘
発しうることが知られている。

かくして本発明の主要な目的は、これらの問題及び以
前の方法の欠点の本質的な解決である。

本発明のより特定の目的は、前記した化学的物理的性
質を有するデフィブロチドを得るための方法を提供する
ことである。

他の本発明の目的は、前記した特許において意図され
たウシの肺の他に、多数の出発天然物質の使用を可能と
するデフィブロチドの製造方法を提供することである。

驚くべきことに、より制御された凝集（aggregatio
n）の条件下に操作することによって、原料核酸を有利
に解重合することができ、それによって分解生成物の形
成を最小に減少させることができることが見出だされ
た。

本発明に従う方法は、下記の工程により特徴付けられ
る：ａ）出発動物器官の粉砕及び高温タンパク質分解、ｂ）分解物（lysate）のろ過及び濃縮、ｃ）ホスフェートを沈澱させることができるカチオンの
塩を濃縮物に添加しそしてpHを4.5より高くない酸性値
に調節すること、ｄ）溶液中に存在する多糖画分を分離するために沈澱懸
濁液を一定容量下にろ過すること、ｅ）核酸を可溶化するために、得られる核酸の不溶性塩
の懸濁液にアルカリ金属の水溶性塩を添加し、そして置
換された不溶化カチオンを溶液から除去すること、ｆ）高度に重合したニックされた（highly polymerized
nicked）ポリデオキシリボヌクレオチドの形態にある
安定化凝集を開始するために少なくとも１モルの所定の
値に核酸の溶液のイオン強度（ion force）を調節しそ
して反応混合物の分光光度法による分析が最大可逆濃色
効果、即ち最大可能な凝集に達したことを示すまで同じ
溶液のpHを調節すること、ｇ）この溶液を凝集したポリデオキシリボヌクレオチド
の解重合温度まで加熱し、可逆濃色効果が生のDNAの百
分率で示して15±５の値に達するまで、可逆濃色効果の
変化の測定により解重合を制御すること、ｈ）冷却することにより解重合プロセスを停止させそし
て得られる二本鎖フィラメント断片における水素結合を
除去すること、ｉ）前の工程の得られる溶液を解重合工程の温度及びpH
より高い温度及びpHで加熱し、それにより水素結合が再
形成されるのを防止することによって、このような条件
にある得られる一本鎖フィラメント断片を安定化させる
こと、ｊ）高温ろ過しそして、依然として高温条件下に、場合
により濃縮を伴って、溶液中に存在する塩を除去するこ
と。

前記した方法の一つの工程をここで考察すると、使用
される動物器官は、哺乳動物の器官、組織及び細胞、特
にヒツジ、豚、ウマ及び畜牛の肺、腸、肝臓及び粘膜よ
り成る。

ヘパリン、タンパク質分解物及び器官抽出物の製造に
際して得られた残留母液は同様に有用である。他の出発
物質は、白血球又はその培養の残留物、精子（spermato
zoa）、精母細胞（spermatocytes）及び哺乳動物の胚細
胞（germinal cells）の如き細胞より成る。

タンパク質分解は、例えばパパイン、トリプシン等の
如きタンパク質分解控訴によって公知の方法で行なわれ
る。

タンパク質分解の条件及び期間は明らかにタンパク質
分解控訴の種類に依存しておりそして周知されており且
つ一般に10−90℃の範囲内で0.5−10時間である。

例えば、パパインによるタンパク質分解は一般に65℃
で４時間行なわれる。

ろ過及び濃縮の工程ｂをここで考察すると、濃縮は好
ましくは接線方向流れを持った膜で行なわれる。この方
法においては、実際問題として、得られるべき所望の分
子量の範囲を選ぶことが可能である。かくして膜ははっ
きりと定められたカットオフ（一般に50,000−100,00
0）で選ばれる。

得られる濃縮物を濃縮物中のホスフェートを沈澱させ
ることができるカチオンと混合する（工程ｃ）。例え
ば、Ca、Znのハロゲン化物、硫酸塩、炭酸水素塩、酢酸
塩の如きカチオンの塩を濃縮物に加えることができ、そ
の際pHは酸性値に調節される。

沈澱懸濁液は、多糖物質がろ液から消失するまで、水
を連続的に補給して容量を一定に保ちながら、接線方向
流れで0.45μ又はそれより小さい細孔寸法を持った膜を
通して一定容量で定容ろ過（透析ろ過）（diafiltratio
n）することによりろ過される。

核酸の不溶性塩の懸濁液に加えられた（工程ｅ）水溶
性塩は、ナトリウム又はカリウムの如きアルカリ金属の
ハロゲン化物又は酢酸塩の如き塩である。

得られる懸濁液には不溶化カチオン（Ca、Zn等の如
き）が残っており、これは、生理的食塩水溶液（saline
solution）を連続的に補給して容量を一定に保ちなが
ら、接線方向流れで、10,000より小さいカットオフを有
する膜を通して一定容量で容量ろ過することにより除去
されるのが好ましい。

この処理は、透過液中に不溶化カチオンがもはや存在
しなくなるまで続けられる。別法として、不溶化カチオ
ンは、工程ｄから生じる懸濁液に対して行なわれるイオ
ン交換によって除去される。

原料核酸の溶液は、好ましくはアルカリ金属の水溶性
塩の添加により少なくとも１モル、好ましくは３モルの
イオン強度になるように必要に応じて調節され、そして
溶液のpHは、実験に基づく測定に従って系の最大可逆濃
色効果に相当するpH値に達するまで調節される。このよ
うなpHは普通は４乃至５である。

この工程において、原料核酸は安定化凝集を受けて光
度に重合したニックされたポリデオキシリボヌクレオチ
ドを形成する。

工程ａ−ｃは、その温度範囲を10℃乃至90℃とするこ
とができるけれども、好適には室温で行うことができ
る。

安定化凝集の工程（工程ｆ）の後、高度に重合したニ
ックされたポリデオキシリボヌクレオチドの解重合は、
その解重合温度を60℃乃至90℃とすることができるけれ
ども、好ましくは約70−75℃の温度に加熱することによ
って行なわれ、解重合は可逆効果の変化の測定により監
視される。

得られる二本鎖フィラメント断片中の残存水素結合の
除去は、好ましくは15℃乃至30℃のより低い温度に冷却
することによつて解重合が停止されると、７より高いp
H、好ましくは８又はそれより高いpHとなるように反応
物（reaction mass）をアルカリ化することによって行
なわれる。

最後に、一本鎖フィラメント断片の安定性は、工程ｈ
で得られた溶液を解重合温度より少なくとも５℃高い温
度、一般には65℃乃至100℃に加熱することによつて得
られる。

添付図面は、器官から抽出されそしてタンパク質分解
を受けた原料核酸の種々の工程における変性を略図で且
つ慣用の表現で示す。

明白に観察されうるとおり、多少対が解かれ、らせん
が解かれそして略記号SMにより示された短い脱プリンさ
れた（depurinated）長さの形成を伴って部分的に分解
されたポリメクレオチドアセンブリーとして想像するこ
とができる出発物質が、高いイオン強度、好ましくは３
モルのアルカリ金属の水溶性塩を有してそして十分にプ
ロトン和されている生理的食塩水溶液に溶解されると、
出発物質を形成する分子は、溶媒媒体から利用すること
ができる水素結合により、塩基対形成のシャルガフ（Ch
argaff）の規則に従って知られているとおり、凝集する
傾向がある。ポリヌクレオチド鎖は部分的に不完全であ
るので、偶発的な対形成（casual pairing）が起こり、
光度に重合した二本鎖フィラメントポリヌクレオチドの
形成に導き、このフィラメントは、図面において略記号
AS（凝集した系）により表された構造の親水性境界に沿
って与えられた配列の切れ目（“ニック”）により偶発
的に遮断されている。

図面においては、はっ水性区域（IR）及び負の電荷を
持つ親水性区域（IF）が示されている。

その点で、適当に調節された熱エネルギーを供給する
と、二本鎖フィラメントの切り目のみのレベルで広くゆ
きわたって破断（fracture）が引き起こされ、それによ
り、或る規則性を持った二本鎖フィラメント断片（図に
おいてDSFとして示された）が生成される。

断片化の程度は種々の化学的物理的パラメータの制御
により監視され、主な１つは系の可逆濃色効果指数であ
る（既に定義したとおり）。

可逆濃色効果がデフィプロチドを特徴付ける値、（15
±５）に達するときに行なわれる水素イオンの除去は、
核酸塩基が対形成するための水素結合を除去せしめ、か
くして所望の特徴的構造を持ったポリデオキシリボヌク
レオチドのモノフィラメントが生成する。

一本鎖フィラメントの自由な状態は構造において安定
化され、この一本鎖フィラメントは、左記に行なわれた
凝集条件下の解重合に使用された温度より高いレベルの
温度でpH8±0.2で更に溶液を加熱すると、デフィブロチ
ドを特徴付ける約15％の可逆濃色効果を有することも見
出だされた。

系において誘発された運動エネルギーは、目的のポリ
デオキシリボヌクレオチド画分を単離することを含むこ
の方法のその後の段階で起こるかも知れない凝集が起こ
るのを防止する。

このようにして安定化したポリデオキシリボヌクレオ
チドのフィラメント（図においてSSDで示された）のみ
が所望のデフィブロチド構造を特徴付ける化学的性質を
すべて保持している。

この方法で操作することによつて、脱プリンの程度は
最小に減少しそしてプリン塩基とピリミジン塩基との比
は0.95％より小さいことは希である。

本発明に従う方法によって、デフィブロチドの化学的
及び薬理学的性質を示す標準化されたポリデオキシリボ
ヌクレオチドを得ることが可能であることを最後に指摘
したい。この研究の過程において、ウシの肺の他に他の
ソースからも所望の性質を持ったポリデオキシリボヌク
レオチドを得ることが可能であることが既に述べたとお
り見出だされた。驚くべきことに、前記した標準に従っ
て操作することによって、豚の肺及び畜牛又は豚の両者
の腸、肝臓及び胸線の如き他のソースからも、デフィブ
ロチドの特性を持ったポリデオキシリボヌクレオチドを
得ることが可能であることが今回見出だされた。この可
能性は非常に重要である。その理由は、生成物デフィブ
ロチドの予測される治療学的消費の点から、出発ソース
を広げることが必要になると思われるからである。出発
物質として、ヘパリン製造、抽出及びタンパク質加水分
解の母液を使用することができることは特に有利であ
る。何故ならば、これらの物質は非常に豊富でありそし
て今日まで殆ど使用されておらず、その廃棄は深刻な汚
染の原因でもあるからである。

本発明の他の利点はデフィブロチド抽出ソースを広げ
る可能性によってのみならず、副生物からデフィブロチ
ドを回収する可能性にもよっており、かくして、ヘパリ
ン及びタンパク質分解物を製造する方法の如き他の方法
をより経済的ぬすると共に、これらの他の方法の残留
物、実際にはこの残留物は核酸であるが、に富んだホス
フェートから生じる汚染のような汚染の原因を更に減少
させる。

下記の実施例は、請求の範囲に記載された方法をいか
に実施するかを非限定的に説明する。

実施例１冷凍したウシの肺100kgを亜硫酸塩で活性化された粗
製パパイン200mgを含有する飲料水50リットルに分散さ
せた。分散駅のpHを希塩酸で5.8に調節し、次いで塊を6
5℃に加熱してタンパク質分解を行った。４時間の後、
この塊を15分間加熱沸騰させることによりタンパク質分
解を停止した。分散液中の固体を除去するプレスフィル
ターによるろ過の後、タンパク質分解物のろ過した溶液
を、50,000のカットオフを有する管状膜ロミコン（Romi
con）での接線方向流れでろ過することにより25リット
ルの容量に濃縮した。約8UI/mlのヘパリン活性を持った
透過液をヘパリン及びアミノ三の回収に使用することが
できる。

濃縮物を無水塩化カルシウム150gで処理し、溶液をpH
3に調節して核酸部分を沈澱させ、残りの多糖部分は溶
液に残る。

0.01塩化カルシウムの溶液の添加により濃縮物の容量
を一定に保ちながら、懸濁液を0.45ミクロンの多孔度の
管状膜ロミコンを通して接線方向流れにより定容ろ過す
る。濃縮物が塩化セチルピリジニウムと多糖との反応を
もはや生じなくなるまで定容ろ過を続けた。

定容ろ過透過液を多糖の回収に使用し、コンドロイチ
ン硫酸とヘパリンとから成る混合物約50grを生成した。

核酸の不溶性カルシウム塩を含有する定容ろ過濃縮物
の懸濁液を3M塩化ナトリウム25と混合した。混合物を
10,000のカットオフを有する膜ロミコンを通して接線方
向流れで定容ろ過し、濃縮物の容量を、透過液がシュウ
酸アンモニウムとカルシウムとの反応をもはや生じなく
なるまで塩化ナトリウムの３モル溶液の添加により一定
に保ち、このようにして、カルシウムイオンとナトリウ
ムイオンの交換が起こってすべての核酸をナトリウム形
に転化した。

次いで濃縮物を、7.5の容量が得られるまで、同じ
膜での接線方向流れによるろ過により更に濃縮した。こ
の濃縮物は、３モルの生理的食塩水中に原料隠さのナト
リウム塩約３％（分光光度法により評価）を含有してお
り、これは出発器官重量の0.22％に相当する。

この溶液を、溶液の試料の再アルカリ化による濃色効
果（hyperchromicity）の分光光度法による測定が吸収
の最大デルタ（maximum delta of absorption）を示さ
なくなるまで、3M塩酸を添加することによって最大淡色
効果（hypochromicity）の点に調節した。吸収の最大デ
ルタは、pHが4.25に達したときの生のDNAの38％に等し
いことが見出だされ、かくしてこの系の最大淡色効果の
点に相当し、従って溶液中のホリデオキシリボヌクレオ
チド酸の最大の凝集及び塩基の対形成の状態に相当す
る。

このような条件が確立されると、溶液を75℃まで加熱
して解重合を開始する。

15分間隔で、溶液の試料に対するる濃色効果の測定を
行って解重合の進行を監視した。６回の測定の後、カー
テシアン系の縦座標で報告されたデータは、４時間の時
間の横座標での外挿を可能として、天然DNAの19％の濃
色効果を有するポリデオキシリボヌクレオチドを得た。

結果として、４時間の後、凝集条件下の解重合は、解
重合した塊を30℃の温度に冷却しそしてそれを３モルの
水酸化ナトリウムでアルカリ性（pH8）とすることによ
り停止させた。

ポリヌクレオチドの構造を安定化させるために温度を
30分間85℃まで上昇させ、然る後溶液を高温ろ過しそし
て透析と6500mlの容量となるように前述の接線方向流れ
での濃縮に付した。

得られる生成物を濃縮した溶液からアルコールにより
沈澱させた。

アルコールで脱水しそして真空下に60℃で乾燥した後
下記の分析特性を持った生成物126gが得られた（なお、
ｄはデオキシリボースを表わす）。

Ｐ＝ 8.40％Ｇ＝8.60％ｄ＝34.10％Ｃ＝6.15％Ａ＝ 8.90％Ｔ＝9.20％ P/（Ａ＋Ｇ＋Ｃ＋Ｔ）モル比＝1.07 プリン／ピリミジンモル比＝0.96 Ｐεと呼ぶモル吸光度（Ｐ）＝7,800 旋光能▲［α］^20゜ _D▼＝＋57゜濃色効果（生のDNAの）ｈ＝18％上記のデータは、化学量論的に下記の分子式に導く。

P₃、（dAp）₁₂、（dGp）₁₀、（dCp）₁₀、（dTp）₁₃ 実施例２豚の肺1000kgを実施例１に記載の如くして処理して、
下記の性質を有するデフィブロチド700gを生成した。

Ｐ＝ 8.50％Ｇ＝ 8.90％ｄ＝36.20％Ｃ＝ 6.80％Ａ＝ 9.30％Ｔ＝10.20％ P/（Ａ＋Ｇ＋Ｃ＋Ｔ）モル比＝1.02 プリン／ピリミジンモル比＝0.90 ▲［α］^20゜ _D▼＝＋53゜ｈ＝16％ ε（Ｐ）＝7,750 上記のデータは、化学量論的に下記の分子式に導く。

Ｐ、（dAp）₁₂、（dGp）₁₀、（dCp）₁₀、（dTp）₁₄ 実施例３ウシ腸粘膜からのヘパリンの製造より生ずる母液1000
を接線方向流れ膜により55の容量に濃縮した。

核酸を米国特許第3,770,720号に記載の如くして塩化
亜鉛により沈澱させた。多糖を分離するためのデカンテ
ーション及び洗浄の後、沈澱を水に懸濁させそしてイオ
ン交換樹脂Na⁺形のIR120による処理によってナトリウム
塩に転化した。

溶出液に含まれた核酸のナトリウム塩は、等容量の酢
酸塩緩衝剤の５モル溶液（pH3.9）を加えることによっ
て凝集させ、かくしてpH4.1の最終混合物を得、これを
この系の最大可逆濃色効果（maximum reversible hyper
chromicity）の測定のために使用した。

混合物を70℃に加熱し、その温度に保持し、可逆濃色
効果指数を15分毎に監視した。４時間の後、この指数は
ｈ＝18％に達した。溶液を25℃に冷却し、次いで5N水酸
化ナトリウムによりpH7.8に調節し、次いで85℃に30分
間加熱した。ろ過の後、生成物1.0容量が、1.5容量のエ
タノールを加えることにより沈澱した。その後に沈澱を
洗浄しそしてエタノールで脱水し、然る後60℃で真空下
に乾燥した。

生成物630gが得られ、下記の化学的性質を持ってい
た。

Ｐ＝ 8.73％Ｇ＝8.5％ｄ＝36.40％Ｃ＝6.9％Ａ＝ 9.60％Ｔ＝9.7％ P/（Ａ＋Ｇ＋Ｃ＋Ｔ）モル比＝0.4 プリン／ピリミジンモル比＝0.92 ε（Ｐ）＝7.580 ▲［α］^20゜ _D▼＝＋51゜ｈ＝15％これは下記のヌクレオチドの式に相当する。

P₂、（dAp）₁₃、（dGp）₁₀、（dTp）₁₄、（dCp）₁₁ 実施例４米国特許第3,770,720号の開示に従ってウシの肺から
得られた核酸のナトリウム塩30kgをpH4.5の3M酢酸塩緩
衝液500に溶解して、系の最大可逆濃色効果を有する
溶液を形成した。

このようにして得られた溶液をろ過し、次いで75℃に
加熱した。15分間隔で試料を可逆濃色効果指数の決定の
ために採取し、濃色効果データをカーテシアン系の縦座
標に記録し、横座標には試料を採取した時間を記録し
た。

３回又は４回の測定で見出だされたデータに基づい
て、系の濃色効果が生のDNAにおいて示された15％の値
に達するのに必要な時間を外挿し、その時間加熱を続け
た。

得られる物質（mass）を5N水酸化ナトリウムによりpH
8に調節しそして80℃に60分間加熱して、デフィブロチ
ドの特性を示しているポリデオキシリボヌクレオチド構
造を安定化させた。

最後に溶液をろ過しそして実施例３に記載の如くして
乾燥した。約15kgの生成物が得られた。この実施例に記
載のとおりに製造された生成物の性質は下記のとおりで
あった。

Ｐ＝ 8.83％Ｇ＝8.4 ％ｄ＝37.80％Ｃ＝7.00％Ａ＝ 9.90％Ｔ＝9.85％ P/（Ａ＋Ｇ＋Ｃ＋Ｔ）モル比＝1.06 プリン／ピリミジンモル比＝0.95 ε（Ｐ）＝7.750、▲［α］^20゜ _D▼＝＋54゜ｈ＝17％得られるヌクレオチドの式は下記のとおりであった。

Ｐ、（dAp）₁₃、（dGp）₁₁、（dTp）₁₄、（dCp）₁₂ 実施例５解重合の間、100,000の分子カットオフ（molecular c
ut−off）を有する接線方向流れ膜に対するパーミエー
ションによって、解重合された生成物を系から除去する
ように実施例４を修正した。この除去は、デフィブロチ
ドの構造を既に有しているかも知れないポリデオキシリ
ボヌクレオチド構造の更なる分解を回避するためになさ
れた。かくして収率が改良された。

事実、この修正を伴って実施例４と同じ条件下に核酸
のナトリウム塩30kgから操作することによって、実施例
４の性質に相当する性質を持った生成物16.5kgが得られ
た。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者マントバーニ，マリサイタリー国（コモ）・アイ‐ビラグアルデイア・ビアバレシーナ94 (72)発明者プリノ，ジユゼツペイタリー国アイ‐20100ミラノ・ビアカラツチオロ92

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】少なくとも実質的に多糖とタンパク質を含
まない原料核酸の溶液からポリデオキシリボヌクレオチ
ドデフィブロチドを製造する方法において、（１）必要に応じて前記溶液を少なくとも１モルの所定
のイオン強度に調節し、そして最大可逆濃色効果に達す
るまで前記溶液をpHを調節することによって核酸の凝集
を安定化させることにより高度に重合したニックされた
ポリデオキシリボヌクレオチドを形成し、（２）得られる溶液を前記ポリデオキシリボヌクレオチ
ドの解重合温度に加熱しそして下記可逆濃色効果に達す
るまでこの溶液を解重合温度に保つことによって、生の
DNAにおける百分率として測定して、前記溶液の可逆濃
色効果がｈ＝15±５となるまで前記ポリデオキシリボヌ
クレオチドを解重合し、（３）然る後解重合反応を停止し、解重合した溶液中の
二本鎖フィラメント断片における水素結合を除去して、
一本鎖フィラメントポリデオキシリボヌクレオチド断片
を形成し、（４）然る後、得られる溶液を解重合反応の温度及びpH
よりも高い温度及びpHで加熱して水素結合の再形成を防
止することによって、前記の得られるポリデオキシリボ
ヌクレオチドの一本鎖フィラメント断片を安定化させる
ことを特徴とする方法。
【請求項２】前記原料核酸の溶液が器官組織及び哺乳動
物細胞から得られる請求の範囲第１項記載の方法。
【請求項３】前記原料核酸の不溶性塩の懸濁液にアルカ
リ金属の水溶性塩を添加して核酸を可溶化し、得られる
不溶化カチオンの懸濁液から除去することができ、水溶
性塩の添加は、少なくとも１モルの原料核酸の生理的食
塩水溶液が得られるまで続けることによって工程１を行
う請求の範囲第１項記載の方法。
【請求項４】原料核酸の生理的食塩水溶液が少なくとも
３モルになるまで水溶性塩添加を続ける請求の範囲第３
項記載の方法。
【請求項５】アルカリ金属の水溶性塩がハロゲン化物及
び酢酸塩から成る群より選ばれる請求の範囲第３項記載
の方法。
【請求項６】前記塩がナトリウム塩である請求の範囲第
５項記載の方法。
【請求項７】前記塩が塩化ナトリウムの３モル溶液であ
る請求の範囲第６項記載の方法。
【請求項８】生理的食塩水溶液を連続的に補給しなが
ら、接線方向流れ膜を通して一定の容量で定容ろ過する
ことによって、不溶化カチオンの除去を行う請求の範囲
第３項記載の方法。
【請求項９】前記膜が100,000より高くないカットオフ
を有する請求の範囲第１項記載の方法。
【請求項１０】工程１のpH調節を、所定のイオン強度を
生理的食塩水溶液を得るのに使用した可溶化塩のアニオ
ンに相当する酸によって行う請求の範囲第１項記載の方
法。
【請求項１１】前記酸が塩化水素酸である請求の範囲第
10項記載の方法。
【請求項１２】溶液が３−５のpHに相当する水素イオン
濃度を有するまで、塩化水素酸を添加する請求範囲第11
項記載の方法。
【請求項１３】工程２の解重合反応を約70℃乃至75℃の
温度で加熱することによって行う請求の範囲第１項記載
の方法。
【請求項１４】生のDNAに於ける百分率として示され
た、可逆濃色効果の値が15±５となるまで可逆濃色効果
を測定することによって、解重合を制御する請求の範囲
第13項記載の方法。
【請求項１５】溶液を冷却することによって、工程３に
おいて解従業を停止させる請求の範囲第１項記載の方
法。
【請求項１６】溶液pHを７より高い値に調節することに
よって、工程３の二本鎖フィラメント断片の水素結合の
除去を行う請求の範囲第１項記載の方法。
【請求項１７】溶液を８より高いpHに至らしめる請求の
範囲第16項記載の方法。
【請求項１８】pHをアルカリ金属水酸化物の添加により
調節する請求の範囲第16項記載の方法。
【請求項１９】アルカリ金属水酸化物が水酸化ナトリウ
ムである請求の範囲第18項記載の方法。
【請求項２０】工程３から得られた溶液を、一本鎖断片
を安定化させるために、解重合温度より少なくとも５℃
高い温度に加熱する請求の範囲第１項記載の方法。
【請求項２１】加熱工程を少なくとも30分間行う請求の
範囲第20項記載の方法。
【請求項２２】安定化加熱工程４から得られた溶液を、
高温ろ過し、次いで、溶液中に存在する塩を、依然とし
て高温状態にある間に除去する請求の範囲第１項記載の
方法。
【請求項２３】前記塩を除去した後の溶液を濃縮する請
求の範囲第22項記載の方法。
【請求項２４】高温ろ過工程からのろ液を、接線方向流
れ膜を通して透析に付す請求の範囲第22項記載の方法。
【請求項２５】工程１を、系の最大可逆濃色効果に相当
する所望の最終pHを得るようなモル濃度を有する酢酸塩
緩衝液で行う請求の範囲第１項記載の方法。
【請求項２６】一本鎖断片を加熱する安定化から得られ
る溶液をろ過しそして最終精製物をアルコール性溶媒の
添加により沈澱させる請求の範囲第25項記載の方法。
【請求項２７】前記溶媒がエタノールである請求の範囲
第１項記載の方法。
【請求項２８】粉砕、高温タンパク質分解消化、ろ過及
び溶解物の濃縮、続いて、核酸を沈澱させることができ
るカチオンの塩の添加及び沈澱懸濁液の一定容量でのろ
過により、原料核酸の前記生理的食塩水溶液を調製する
請求の範囲第１項記載の方法。
【請求項２９】タンパク質分解溶解物のろ過を、接線方
向流れ膜で行う請求の範囲第28項記載の方法。
【請求項３０】前記膜が50,000−100,000のカットオフ
を有するように選ばれる請求の範囲第29項記載の方法。
【請求項３１】一定容量ろ過を、接線方向流れ膜及び連
続的補給水添加により行う請求の範囲第28項記載の方
法。
【請求項３２】前記膜が0.45μより大きくない細孔寸法
を有する請求の範囲第31孔記載の方法。
【請求項３３】出発物質が、ヒツジ、豚、ウマ及び畜牛
の肺、腸、肝臓及び粘膜から成る群より選ばれる請求の
範囲第28項記載の方法。
【請求項３４】出発物質が、白血球又はその培養の残留
物、精子、精母細胞及び哺乳動物の胚細胞から成る群よ
り選ばれる請求の範囲第28項記載の方法。
【請求項３５】出発物質が、ヘパリン、タンパク質分解
物又は器官抽出物を得る方法における動物の器官又は組
織の処理から生じる母液である請求の範囲第28項記載の
方法。
【請求項３６】ランダムな配列の下記式、 P_1-5、（dAp）_12-24、（dGp）_10-20、（dTp）_13-26、
（dCp）_10-20、式中、Ｐ＝リン酸基、 dAp＝デオキシアデニルモノマー、 dGp＝デオキシグアニルモノマー、 dTp＝デオキシチミジルモノマー、 dCp＝デオキシシチジルモノマー、である、に相当し、更に下記の化学物理性質、電気泳動＝均一なアノード移動度、吸光係数 260±1nmにおける吸光比、E₂₃₀/E₂₆₀＝0.45±0.04、モル吸光係数（リンについて）；ε（Ｐ）＝7.750±50
0、施光能▲［α］^20゜ _D▼＝53゜±６、生のDNAにおける％として示された可逆濃色効果、ｈ＝1
5±５、を示すデフイブロチドとして知られたポリデオ
キシリボヌクレオチド。