CN109517031B

CN109517031B - 一种寡肽化合物及其制备方法和用途

Info

Publication number: CN109517031B
Application number: CN201811590770.0A
Authority: CN
Inventors: 王建武
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2018-12-21
Filing date: 2018-12-21
Publication date: 2022-01-25
Anticipated expiration: 2038-12-21
Also published as: CN109517031A

Abstract

本发明提供了以下结构式表示的一种寡肽化合物及其制备方法和用途，所述寡肽化合物具有改善微循环的作用，可有效提高抗缺氧能力，并对脑缺血性疾病具有显著的减缓和治疗的作用。

Description

一种寡肽化合物及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及医药品领域，具体涉及一种寡肽化合物及其制备方法，以及该寡肽化合物在制备改善微循环、抗缺血性脑血管病的药物或保健品的用途。

背景技术

急性缺血性脑损伤是指局部脑组织，包括神经细胞、胶质细胞以及联系纤维由于供血障碍发生的变形、坏死或一过性的功能丧失。其占脑血管病的80％左右，是临床常见病、多发病，死亡率与致残率均很高。

急性脑缺血是指血管壁病变或血流动力学异常所致脑部血液供应障碍，导致相应供血区脑组织坏死或软化，引起脑损害并造成一系列神经功能缺损的症候群。其主要发病原因为心脏病、高血压、脂代谢异常等疾病所致颈动脉粥样病变，病理机制为脑缺血区能量耗竭，神经元营养供给骤减，使脑组织能量代谢衰竭、脑细胞离子稳态失衡、兴奋性氨基酸中毒、自由基增加，从而导致脑细胞坏死、凋亡，形成半暗带。对此，快速恢复脑供血、积极改善脑病灶周围血液循环、抢救半暗带濒死神经元成为临床救治急性脑缺血、改善预后的关键。

缺血性脑血管病为临床常见病、多发病，其发病率高、死亡率高、致残率高，严重危害人类健康和生命。该病属祖国医学中的“中风”范畴。临床上缺血性脑血管病占整个脑卒中的70％～80％，脑血栓形成、脑栓塞等是造成脑梗死的直接原因。其中大脑中动脉闭塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)所致的局灶脑缺血最为常见。大脑中动脉梗死占脑梗死60％以上，是脑梗死的多发部位。

脑的正常生理活动有赖于良好的血液循环，在脑部病变尤其是脑血管病的发生、诊断与治疗中，脑血液循环的改变具有重要作用。因此，在缺血性脑血管病的治疗过程中，应注意改善脑的血液循环，重视其微循环水平的治疗，以更好地恢复脑细胞功能。

因此，需要开发出能够改善微循环，可有效提高缺血脑组织的血液供应，并可有效用于缺血性脑血管病的治疗的药物。

发明内容

[技术问题]

本发明一个目的是提供一种寡肽化合物或其盐，所述寡肽化合物具有改善微循环的作用，可以用于治疗缺血性脑血管病(如脑中风等)。

本发明再一目的是提供该寡肽化合物在制备用于改善微循环、抗缺血性脑血管病的药物中的用途或在制备用于改善微循环的保健品中的用途。

[技术方案]

本发明的一个方面提供了一种由以下结构式表示的寡肽化合物或其盐：

其中，根据本发明的寡肽化合物分子式为：C₁₇H₂₄N₆O₆，分子量为409Da。

在下文中，根据本发明的寡肽化合物可以简称为NPH。

所述寡肽化合物的盐为，例如，无机酸盐，如盐酸盐、硫酸盐、磷酸盐、硝酸盐等，有机酸盐，如乙酸盐、葡萄糖酸盐、苯甲酸盐、对甲苯磺酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐等；碱金属或碱土金属盐，例如钾盐、钠盐、镁盐、钙盐、铵盐等。

所述寡肽化合物或其盐可以以溶剂化物的形式存在，如与水、甲醇、乙醇、丙酮、四氢呋喃、二甲亚砜、正己烷、环己烷、二氯甲烷、氯仿、乙醚等形成的溶剂化物。

此外，根据本发明的寡肽化合物可以在不改变其主体结构的前提下被小分子基团取代而形成具有相同或类似(甚至提高)的改善微循环功能的衍生物。例如，所述小分子基团包括：氘、-CN、卤素、羧基、羟基、烷氧基、芳氧基、胺基、醛基、羰基、酰胺基、羰氧基、氧羰基、磺酰基、磷酰基、偶氮基等。此外，所述小分子基团还可包括：取代或未取代的C1-20的烷基、取代或未取代的C2-20的烯基、取代或未取代的C2-20的炔基、取代或未取代的C3-20的环烷基、取代或未取代的C5-20的环烯基、取代或未取代的C5-20的环炔基、取代或未取代的C6-20的芳基、取代或未取代的C5-20的杂芳基、取代或未取代的C3-20的杂环烷基、取代或未取代的C3-20的杂环烯基、取代或未取代的C4-20的杂环炔基等，其中，所述取代基包括烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、杂环烷基、杂环烯基、杂环炔基、芳基、杂芳基、-CN、卤素、羧基、羟基、烷氧基、芳氧基、胺基、醛基、羰基、酰胺基、羰氧基、氧羰基、磺酰基、磷酰基、偶氮基等。本领域技术人员可以理解，上述衍生物也涵盖在本发明权利要求所要求保护的范围内。

本发明的另一个方面提供了上述寡肽化合物的制备方法，所述方法可包括以下步骤：

(1)预处理：采集新鲜鳄鱼血，室温静置直至其凝固，加入注射用水，粉碎，灭酶，然后冷却，离心，收集上清液；

(2)胃蛋白酶水解：将步骤(1)获得的上清液用稀盐酸调节pH，加入胃蛋白酶和氯化钙，进行水解；

(3)胰蛋白酶水解：加热将步骤(2)获得的胃蛋白酶水解液灭酶，冷却，用氢氧化钠溶液调节pH，加入胰蛋白酶，进行水解；

(4)制剂：加热将步骤(3)获得的胰蛋白酶水解液灭酶，冷却，离心，收集上清液，过滤；

(5)超滤：将步骤(4)获得的滤液进行超滤，收集分子量小于1000的部分，得到超滤酶解物，冷冻干燥，得到冻干粉末；以及

(6)分离提纯：将步骤(5)得到的冻干粉末加水溶解，采用制备色谱进行分离提纯，然后冷冻干燥，从而得到产物，即根据本发明的寡肽化合物。

根据本发明的一个实施方式，上述预处理步骤(1)中，优选地，所述注射用水的量为鳄鱼血的约1-10倍重量，优选约3-7倍重量，更优选约5倍重量。优选地，所述离心可在约8℃以下，优选在约6℃以下，更优选在约4℃以下进行，离心速度可为约1000r/min以上，优选约3000-13000r/min，更优选约7000r/min，以及离心时间可为约20分钟以上，优选约40分钟以上，例如约40-120分钟。

上述预处理步骤中，所述灭酶用于灭活血中的原酶，其可通过在约100℃以上的温度下加热约10分钟以上，优选约20-30分钟，更优选约20分钟实现。

根据本发明的一个实施方式，上述胃蛋白酶水解步骤中，优选地，所述稀盐酸的浓度为约1-3mol/L，优选约1mol/L。优选地，所述pH被调节至约约1-3，更优选为约2。优选地，所述水解的温度调节为约35-40℃，更优选约37℃。优选地，所述水解的持续时间为约1-6h，优选约1-4h，更优选约2h。

优选地，上述胃蛋白酶水解步骤中，基于上清液的总重，胃蛋白酶的添加量为约1-5wt％，优选3wt％，氯化钙添加量为约0.1wt％。

根据本发明的一个实施方式，上述胰蛋白酶水解步骤中，优选地，所述灭酶的过程可通过在约100℃以上的温度下加热约20-60分钟，优选约20-30分钟，更优选约20分钟实现。所述氢氧化钠溶液的浓度为约0.01-1mol/L，优选约0.1mol/L。优选地，所述pH被调节至约7-10，更优选为约7.5-8.5。优选地，所述水解的温度调节为约36-38℃，优选约36.5-37.5℃，更优选约37℃。优选地，所述水解的持续时间为约1-6h，优选约1-4h，更优选约2h。

优选地，上述胰蛋白酶水解步骤中，基于胃蛋白酶水解液的总重，胰蛋白酶添加量为约1-5wt％，优选约2wt％。

根据本发明的一个实施方式，上述制剂步骤中，优选地，所述灭酶的过程可通过在约100℃以上的温度下加热约10-60分钟，优选约10-30分钟实现，更优选约20分钟实现。优选地，所述离心可以约1000r/min以上，优选约3000-13000r/min，更优选约7000r/min的速度进行约10-60分钟，优选约20-60分钟，更优选约30分钟。优选地，所述过滤的过程可以为先使用活性炭吸附，然后采用滤膜进行过滤，或者仅采用滤膜进行过滤，优选仅采用滤膜进行过滤，更优选采用0.45/0.22μm滤膜过滤。

根据本发明的一个实施方式，上述超滤步骤中，优选将上述滤液经300KDa、100KDa、30KDa、10KDa和1KDa的超滤膜逐级超滤。

优选地，上述超滤步骤中，所述冷冻干燥的过程为：将超滤酶解物在约-70℃下预冻约4h，再用冻干机于约-40℃下真空冷冻干燥约3天，即得冻干粉末。

根据本发明的一个实施方式，上述分离提纯步骤中，所述制备色谱的色谱条件为：色谱柱：C18柱，流动相：甲醇或乙腈水溶液，以及紫外检测波长：214nm。其中，所述流动相优选为1-50％乙腈水溶液，更优选1-10％乙腈水溶液，以及最优选3％乙腈水溶液。

此外，本发明的再一个方面提供了一种药物组合物，其包含选自根据本发明的寡肽化合物或其盐中的一种或多种，以及可选地，所述药物组合物还可以进一步包含药品辅料。

此外，本发明的还一个方面涉及根据本发明的寡肽化合物用于制备改善微循环、抗缺血性脑血管病(如脑中风、卒中等)的药物的用途或用于制备改善微循环保健品的用途。

[有益效果]

根据本发明的寡肽化合物可有效改善微循环，并对脑缺血性疾病具有显著的减缓和治疗的作用。

附图说明

图1为根据本发明的寡肽化合物的一级质谱检测图谱。

图2为根据本发明的寡肽化合物的LC-MS/MS串联质谱图。

图3为根据本发明的寡肽化合物的PRM法检测目标离子的质谱图。

图4a、4b和4c为根据本发明的寡肽化合物的质谱的二级图谱。

图5为根据本发明的寡肽化合物的核磁共振谱图。

具体实施方式

下文中，将参照以下实施例更详细地描述本发明。然而，这些实施例被列举来说明本发明，本发明的范围并不仅限于此。

1、寡肽化合物NPH的制备

<实施例1>

(1)预处理：将采集到的新鲜鳄鱼血室温静置直至其凝固，加入5倍重量的注射用水，采用搅拌机以10000r/min以上的速度将凝固后的鳄鱼血粉碎5分钟，以保证彻底粉碎。然后在100℃下水浴20min使原血中的蛋白质变性，室温冷却，再在4℃下以7000r/min离心60min，收集上清液。

(2)胃蛋白酶水解：将步骤(1)获得的上清液用1mol/L稀盐酸调节pH至2，然后将温度调节为37℃，胃蛋白酶酶添加量3％，0.1％氯化钙，水解2h；

(3)胰蛋白酶水解：将步骤(2)获得的胃蛋白酶水解液在100℃下水浴20min灭酶，冷却，用0.1mol/L氢氧化钠溶液调整pH至7.5-8.5，然后将温度为调节37℃，胰蛋白酶添加量2％，水解2h；

(4)制剂：将步骤(3)获得的胰蛋白酶水解液在100℃下水浴20min灭酶，冷却，再以7000r/min离心30min，收集上清液，采用0.45/0.22μm滤膜过滤，之后采用1K超滤管过滤，将获得的滤液冷冻干燥，得到冻干粉末；以及

(5)分离提纯：将步骤(4)得到的冻干粉末加水溶解，配置成1mg/mL的溶液，采用制备色谱进行分离提纯，其中色谱条件为：色谱柱：C18柱(Dubhe C18(250-20cm))，柱温为室温，流动相：3％乙腈，流速：20ml/min，以及紫外检测波长：214nm。然后冷冻干燥，从而得到根据本发明的寡肽化合物NPH。

2、寡肽化合物NPH的表征

2.1质谱分析

2.1.1主要仪器

毛细管高效液相色谱仪：型号Ultimate 3000，赛默飞世尔科技(Thermo FisherScientific)公司(美国)；

电喷雾-组合型离子阱Orbitrap质谱仪：型号Orbitrap Elite^TM Hybrid IonTrap-Orbitrap Mass Spectrometer，赛默飞世尔科技公司(美国)；

电喷雾-组合型离子阱Orbitrap质谱仪：型号Q Exactive^TM Hybrid Quadrupole-Orbitrap^TM Mass Spectrometer，赛默飞世尔科技公司(美国)。

2.1.2试剂耗材

乙腈(ACN)：质谱纯(≥99.9％)，费希尔化学(Fisher Chemical)公司；

甲酸(FA)：色谱纯(98.0％)，西格玛奥德里奇(Sigma-Aldrich)公司；

超纯水：质谱纯，费希尔化学公司。

2.1.3一级质谱检测

对实施例1的寡肽化合物NPH进行一级质谱检测，用于对样品中的肽段进行分子量的检测，色谱条件如下。

毛细管液相色谱条件：

预柱：300μm i.d.×5mm,填装有Acclaim PepMap RPLC C18,5μm,

分析柱：75μm i.d.×150mm,填装有Acclaim PepMap RPLC C18,3μm,

流动相A：0.1％甲酸，2％ACN；

流动相B：0.1％甲酸，80％ACN；

流速：300nL/min；

液相色谱梯度：56min；

时间	B相
		0	6％
5	9％
		50	50％
52	95％
		56	95％

质谱条件：

分辨率：70,000

AGC目标：3e6

最大IT：40ms

扫描范围：100to 1500m/z

结果说明

图1为根据本发明的寡肽化合物NPH的一级质谱检测图谱。其中可以看到，面积最大的峰即为样品中主要物质的峰。

2.1.4LC-MS/MS串联质谱检测

对实施例1的寡肽化合物NPH中一级质谱检测到的肽段进行了进一步的碎裂，并对打碎的二级碎片进行了检测，用于分析目标肽段的序列。色谱条件如下。

毛细管液相色谱条件：

预柱：300μm i.d.×5mm,填装有Acclaim PepMap RPLC C18,5μm,

分析柱：75μm i.d.×150mm,填装有Acclaim PepMap RPLC C18,3μm,

流动相A：0.1％甲酸，2％ACN；

流动相B：0.1％甲酸，80％ACN；

流速：300nL/min；

液相色谱梯度：78min；

时间	B相
		0	6％
8	9％
		24	14％
60	30％
		75	40％
78	95％

质谱条件：

1)一级质谱参数：

分辨率：70,000

AGC目标：3e6

最大IT：40ms

扫描范围：100to 1500m/z

2)二级质谱参数：

分辨率：75,000

AGC目标：1e5

最大IT：60ms

Top N：20

NCE/步阶(stepped)NCE：27

扫描范围：50至1500m/z

结果说明

图2为根据本发明的寡肽化合物NPH的LC-MS/MS串联质谱图，展示的是样品中所有物质二级碎裂后的质谱图。图4a、4b和4c为不同时刻检测到的目标肽段的二级质谱图，其中肽段NPH在二级质谱中理论上会产生如下表中的离子碎片：

离子类型	氨基酸组成	m/z
			y1	H<sup>+</sup>	456.0767
y2	PH<sup>+</sup>	253.1295
			b1	N<sup>+</sup>	157.0608
b2	NP<sup>+</sup>	254.1135

2.1.5PRM法目标离子检测

选取了目标母离子m/z 409.18以及817.36(分子量小于1000的肽段)进行检测。色谱条件如下。

毛细管液相色谱条件：

预柱：300μm i.d.×5mm,填装有Acclaim PepMap RPLC C18,5μm,

分析柱：75μm i.d.×150mm,填装有Acclaim PepMap RPLC C18,3μm,

流动相A：0.1％甲酸，2％ACN；

流动相B：0.1％甲酸，80％ACN；

流速：300nL/min；

液相色谱梯度：78min；

质谱条件：

PRM模式进行质谱数据采集，采集母离子列表如下：

Mass[m/z]	CS[z]	极性	(N)CE	(N)CE类型
					409.18	1	正	27	NCE
817.36	2	正	27	NCE

图3为根据本发明的寡肽化合物的PRM法检测目标离子的质谱图，其中所有的峰均为m/z 409.18以及817.36这2个目标母离子的峰。

2.2核磁共振波谱分析

对实施例1的寡肽化合物NPH进行¹H NMR分析。

2.2.1主要仪器

核磁共振波谱仪：型号AC-P400(400MHz)，布鲁克(Bruker)公司(德国)。

2.2.2试剂耗材

氘代二甲亚砜：NMR级(≥99.8％)，西格玛奥德里奇公司

测试结果如图5所示，其中峰位归属如下：

¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)δ(ppm)0.84(2H，s)，0.85(2H，d)，1.01(2H，m)，1.06(2H，d)，1.46(1H，s)，1.57(1H，s)，2.00(3H，dd)，5.33(2H，s)，6.65(1H，s)，6.93(1H，t)，7.03(1H，t)，7.12(1H，s)，7.21(1H，d)，7.30(2H，d)，7.53(1H，d)，10.71(1H，s)。其中，化学位移为3.34的K峰和化学位移为2.50的M峰为氘代DMSO的溶剂峰。

根据图1-5的结构分析，确定寡肽化合物NPH的结构如下：

其分子式为：C₁₇H₂₄N₆O₆，分子量为409Da。

3、寡肽化合物的药效学研究

试剂

0.9％(g/mL)氯化钠注射液：石家庄四药有限公司；

丁苯酞氯化钠注射液：规格100mL，内含丁苯酞25mg和氯化钠0.9g，石药集团恩必普有限公司；

红四氮唑(TTC)：分析纯(96％)，阿拉丁；

吐温-20：化学纯，天津市百世化工有限公司；

碱性品红：化学纯(99.0％)，天津市百世化工有限公司；

苦味酸：分析纯(99.8％)，广州化学试剂厂；

磷酸二氢钠：分析纯，广州化学试剂厂、天津市永大化学试剂有限公司；

磷酸氢二钠：分析纯，天津市永大化学试剂有限公司；

氨基甲酸乙酯：化学纯，国药集团化学试剂有限公司；

仪器

HH-6数显恒温水浴锅：江苏省金坛市金祥龙电子有限公司；

BS-600L电子天平：上海友声衡器有限公司；

PHS25C型酸度计：杭州奥利龙仪器有限公司。

实验动物

SD大鼠，雄性，体重250-350克，SPF级，由长沙市天勤生物技术有限公司提供。

实验内容

在局灶性脑缺血模型的建立实验研究中，因栓塞法建立的模型与临床脑缺血病理过程较为贴切，不需开颅，制作简单，成功率高，术后感染少，结果稳定，且可根据实验需要控制脑缺血及再灌注时间，故设计采用栓塞法建立模型，观察根据本发明的NPH对局灶脑缺血模型大鼠的治疗作用。

1、实验动物和分组

SD大鼠按体重序随机分为假手术组(阴性对照组)、脑缺血模型组(空白对照组)、低剂量NPH组、中剂量NPH组、高剂量NPH组和阳性对照组(丁苯酞氯化钠注射液对照组)，每组20只。其中，假手术组只分离但不结扎颈动脉，脑缺血模型组正常进行手术，假手术组和脑缺血模型组给予同体积0.9％氯化钠注射液(1ml/100g大鼠体重)。

2、剂量设计

低剂量NPH组：NPH水溶液，40μg/ml(1ml/100g大鼠体重)；

中剂量NPH组：NPH水溶液，80μg/ml(1ml/100g大鼠体重)；

高剂量NPH组：NPH水溶液，120μg/ml(1ml/100g大鼠体重)。

假手术组：给予同体积的0.9％(g/mL)氯化钠注射液(1ml/100g大鼠体重)；

脑缺血模型组：0.9％(g/mL)氯化钠注射液(1ml/100g大鼠体重)；

阳性对照组：丁苯酞氯化钠注射液(1ml/100g大鼠体重)。

NPH组、阳性对照组、脑缺模型组和假手术组给药体积均为1mL/100g。

实验各组均为每日单次给药，全部药量在60s左右匀速给完。实验最后一天给药各组均为两次给药：手术前1小时给药一次以及手术后立即给药一次，全部药量在60s左右匀速给完。给药途径均为尾静脉注射给药。

3、线栓的制备

取单丝尼龙钓鱼线，长约50mm，距一端约22mm处用记号笔作标记，且将这一端稍加热，使其成光滑球形，在显微镜下观察，筛选出前端光滑钝圆，直径约为0.22～0.26mm的线栓。

4、脑缺血再灌注损伤模型的制备

大鼠术前禁食12小时，试验开始时按各组相应剂量给药1小时后，将大鼠用100mg/mL氨基甲酸乙酯溶液1ml/100g(给药浓度100mg/mL)腹腔注射麻醉，并进行永久栓塞性局灶脑缺血模型的制备手术(手术需提前12小时禁食)。模型的制备参照Zea Longa等改良的线栓法，具体操作步骤如下：

腹腔注射100mg/mL氨基甲酸乙酯溶液1ml/100g麻醉大鼠，仰卧固定于手术台上，常规备皮消毒，颈正中切口约2cm长。钝性分离，暴露右侧的颈总动脉(common carotidartery，CCA)和迷走神经，再逐步依次分离暴露CCA分叉部，颈外动脉(externalcarotidartery，ECA)，颈内动脉(internal carotid artery，ICA)，分离ICA至近颅底，并找出ICA颅外段的唯一分支翼腭动脉(pterygopalatine artery，PPA)，在ECA的近心端设置活结，结扎ECA远心端，以个微动脉夹分别夹闭ICA，并在CCA处打一活结，切断ECA，注意尽可能靠近远心端，送入栓线至CCA分叉处，然后翻转方向使ECA与ICA尽量成为平角，以利于栓线通过，松开夹闭ICA的微动脉夹，将栓线向内上方缓慢推进。如果栓线进入PPA，一般插入长度在10mm左右就遇到明显阻力，这时可退出一些栓线，并用微动脉夹临时夹闭PPA适当调整栓线插入方向，插入长度为17～20mm(从CCA分叉处计算)，微遇阻力时即停止插入，ECA和钓鱼线结扎，松开夹闭CCA的微动脉夹，缝合皮肤，将栓线尾部略露出皮肤1cm并用缝线略作固定。

上述过程一般10至15分钟，手术完成后立即再以相同剂量给药1次，术后让大鼠自然清醒，并用手术灯对其进行取暖照射，防止大鼠因夜间体温过低意外死亡。

假手术组ICA不插线栓，仅分离血管。脑缺血模型组大鼠仅手术，不进行给药。

5、检测指标及方法

神经行为学评分

造模24小时后进行神经功能评分，评分标准为：大鼠神经损伤严重缺损评分(Neurological Severity Scores，NSS)

0分：神经功能正常；

1分：轻度神经功能缺损(提尾时左前肢屈曲)；

2分：中度神经功能缺损(行走时向左侧转圈)；

3分：中度神经功能缺损(向左侧倾斜)；

4分：无自发行走，意识减退。

在预实验之前进行模型操作训练。对空白大鼠进行模型制备，模型成功的标志是大鼠评分2分以上，提尾时左前肢内收屈曲，爬行时向左侧倾倒或按逆时针方向转圈，不成功者予以剔除。记录模型成功率。

大鼠脑缺血模型的制备

各组尾静脉注射给药，每日1次，连续5天。

于末次给药60分钟后制作大鼠脑缺血模型：将大鼠称重，用10％氨基甲酸乙酯水溶液(1mL/100g)麻醉后，使其仰卧并固定于手术台上。从正中切开颈部皮肤，分离肌肉，找到左侧颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉；用0号线结扎颈总动脉和颈外动脉，以动脉夹夹闭颈内动脉，用眼科剪在颈总动脉上剪一小口。将线头沾蜡凝固后的碳素渔线插入头端，顺势进入颈内动脉后松开动脉夹，由颈总动脉沿颈内动脉缓慢插入直径0.206mm的碳素渔线，线插入深度约为20mm，途中避开翼腭动脉分支，由颈内动脉直至颅内大脑中动脉，最后将切口进行常规缝合。造模后立即给药1次。

参照KuIuz神经缺陷五级评分标准，以2分为模型成功的标志，于术后动物苏醒时立即观察动物的行为和运动功能状况，手术24小时后对仍存活的动物再观察一次，并得出相应评分。

最后将大鼠断头取脑，；将脑冰冻20分钟，冠状切片(片厚约2mm)，置于1％的TTC染液(0.2mol/L磷酸盐缓冲液(pH为7.4)配制)中，37℃下染色30分钟。将切片染色的脑组织拍照，计算脑梗死体积。正常组织呈红色，梗死组织呈白色，拍照，分析每只大鼠的脑梗死面积占脑片总面积的百分比(％)。因为每块切片厚度相同，且体积＝面积*厚度，所以脑梗死面积的变化可以反映体积的变化。

统计分析

对各组行为学评分进行t检验分析。两组间进行独立样本成组t检验。

结果评价

各组大鼠神经症状评分的比较

与假手术组相比，模型组大鼠神经症状学评分显著性增高(P<0.01)；说明造模是成功的；与模型组相比，各剂量组大鼠神经症状学评分显著性降低，其差值经统计学处理，有显著性意义(P<0.05)，说明有治疗作用。

表1各组动物神经症状学评分(χ±s)

模型组梗死面积为(24.13±9.54)％，可使梗死面积明显减小至(3.15±2.80)％，其差值经统计学处理，有显著性意义(P<0.05)。与模型组相比，各给药组梗死发生率明显降低，说明药物治疗作用确切(如表2所示)。

表2各组动物梗死体积占总体积的百分比(％)(χ±s)

与模型组相比，各给药组梗死发生率明显降低，说明药物治疗作用确切。

由此可见，不同剂量的NPH对局灶脑缺血模型大鼠均有确切的治疗作用。

最后，尚需注意的是，以上列举的仅是本发明的具体实施例。但是显然本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为属于本发明的保护范围。

Claims

1.一种以下结构式表示的寡肽化合物或其盐：

2.一种权利要求1所述的寡肽化合物的制备方法，所述方法包括以下步骤：

(6)分离提纯：将步骤(5)得到的冻干粉末加水溶解，采用制备色谱进行分离提纯，然后冷冻干燥，从而得到产物。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其中，所述预处理步骤中，

所述注射用水的量为鳄鱼血的1-10倍重量，

所述离心在8℃以下进行，离心速度为3000-13000r/min，离心时间为20分钟以上，

所述灭酶通过在100℃以上加热10分钟以上。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其中，所述预处理步骤中，

所述注射用水的量为鳄鱼血的3-7倍重量，

所述离心在6℃以下进行，离心速度为3000-13000r/min，离心时间为40分钟以上，

所述灭酶通过加热20-30分钟实现。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其中，所述预处理步骤中，

所述注射用水的量为鳄鱼血的5倍重量，

所述离心在4℃以下进行，离心速度为7000r/min，

所述灭酶通过加热20分钟实现。

6.根据权利要求2所述的制备方法，其中，所述胃蛋白酶水解步骤中，

所述稀盐酸的浓度为1mol/L，

所述pH被调节至1-3，

所述水解的温度为35-40℃，所述水解的持续时间为1-6h，

基于上清液的总重，所述胃蛋白酶酶添加量为1-5wt％，氯化钙添加量为0.1wt％。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其中，所述胃蛋白酶水解步骤中，

所述pH被调节至2，

所述水解的温度为37℃，所述水解的持续时间为1-4h，

基于上清液的总重，所述胃蛋白酶酶添加量为3wt％。

8.根据权利要求2所述的制备方法，其中，所述胰蛋白酶水解步骤中，

所述灭酶的过程通过在100℃以上的温度下加热20-60分钟，

所述氢氧化钠溶液的浓度为0.01-1mol/L，

所述pH被调节至7-10，

所述水解的温度调节为36-38℃，所述水解的持续时间为1-6h，以及

基于胃蛋白酶水解液的总重，胰蛋白酶添加量为1-5wt％。

9.根据权利要求8所述的制备方法，其中，所述胰蛋白酶水解步骤中，

所述灭酶的过程通过加热20-30分钟实现，

所述氢氧化钠溶液的浓度为0.1mol/L，

所述pH被调节至7.5-8.5，

所述水解的温度调节为36.5-37.5℃，所述水解的持续时间为1-4h，以及

基于胃蛋白酶水解液的总重，胰蛋白酶添加量为2wt％。

10.根据权利要求9所述的制备方法，其中，所述胰蛋白酶水解步骤中，

所述灭酶的过程通过在100℃以上的温度下加热20分钟实现，

所述水解的温度调节为37℃，所述水解的持续时间为2h。

11.根据权利要求2所述的制备方法，其中，所述制剂步骤中，

所述灭酶的过程通过在100℃以上的温度下加热10-60分钟，

所述离心以3000-13000r/min的速度进行10-60分钟，

所述过滤的过程为先使用活性炭吸附，然后采用滤膜进行过滤，或者仅采用滤膜进行过滤。

12.根据权利要求11所述的制备方法，其中，所述制剂步骤中，

所述灭酶的过程通过加热10-30分钟实现，

所述离心以7000r/min的速度进行30-60分钟，

所述过滤的过程采用滤膜进行过滤。

13.根据权利要求12所述的制备方法，其中，所述制剂步骤中，

所述灭酶的过程通过加热20分钟实现，

所述离心进行30分钟，

所述过滤的过程采用0.45/0.22μm滤膜过滤。

14.根据权利要求2所述的制备方法，其中，所述超滤步骤中，采用将滤液经300KDa、100KDa、30KDa、10KDa和1KDa的超滤膜逐级超滤；和/或

冷冻干燥的过程为：将超滤酶解物在-70℃下预冻4h，再用冻干机于-40℃下真空冷冻干燥3天。

15.根据权利要求2所述的制备方法，其中，所述分离提纯步骤中，所述制备色谱的色谱条件为：

色谱柱：C18柱，

紫外检测波长：214nm，以及

流动相：1-10％乙腈水溶液。

16.根据权利要求15所述的制备方法，其中，所述流动相为3％乙腈水溶液。

17.一种药物组合物，其包含选自权利要求1所述的寡肽化合物和其盐中的一种或多种，以及可选的药品辅料。

18.权利要求1所述的寡肽化合物或其盐用于制备改善微循环、抗缺血性脑血管病的药物或用于制备改善微循环的保健品的用途。