CN112940001A

CN112940001A - 一种苯酞异喹啉生物碱及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN112940001A
Application number: CN202110170535.3A
Authority: CN
Inventors: 张春磊; 曹征宇; 刘菊; 张心怡
Original assignee: China Pharmaceutical University
Current assignee: China Pharmaceutical University
Priority date: 2021-02-05
Filing date: 2021-02-05
Publication date: 2021-06-11

Abstract

本发明公开了一种苯酞异喹啉生物碱及其制备方法和应用，该苯酞异喹啉生物碱是从中药夏天无中提取分离得到的一种新的天然产物，命名为corydecumbine G，结构式如式(Ⅰ)所示。该苯酞异喹啉生物碱corydecumbine G是基于抑制神经元兴奋性开发的一个全新抑制剂，实验证明，苯酞异喹啉生物碱corydecumbine G能显著抑制神经元兴奋性，改善神经性疼痛，可作为先导化合物，用于制备抑制神经元兴奋性的药物及治疗神经性疼痛药物的研发。

Description

一种苯酞异喹啉生物碱及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及天然药物领域，具体公开了一种新的苯酞异喹啉生物碱及其制备方法和应用。

背景技术

神经性疼痛是一种常见的慢性疼痛，由外周或中枢神经系统的功能异常或结构损伤所致，主要表现为异常性疼痛、痛觉过敏和自发性疼痛，影响着全球7％～10％的人口，严重危害人类健康，因其持续时间长且反复发作给患者及其家庭带来了巨大痛苦。目前临床上治疗神经性疼痛的治疗用药为加巴喷丁等抗惊厥药物，但治疗效果有限，且常伴随各种不良反应。

神经性疼痛的发生和维持主要依赖于外周敏化和中枢敏化，当神经系统受到损害后，受损的神经元产生神经炎症，神经炎症通常表现为神经中的施万细胞、神经节中的卫星胶质细胞、脊髓中的星型胶质细胞和大脑中的少突细胞等胶质细胞的激活，进而介导炎性介质的产生、氧化应激反应以及离子通道的变化，引起神经元异常放电从而调控神经系统的疼痛敏感性。

中药夏天无为罂粟科紫堇属伏生紫堇(Corydalis decumbens(Thunb.)pers.)的干燥块茎，具有行气止痛，活血通络的功效。夏天无常用于治疗类风湿性关节炎、坐骨神经痛、腰椎间盘突出、颈椎病等神经炎症相关疾病。

发明内容

发明目的：本发明的第一目的是提供一种新的苯酞异喹啉生物碱corVdecumbineG，本发明的第二目的是提供苯酞异喹啉生物碱corVdecumbine G的制备方法，本发明的第三目的是提供苯酞异喹啉类生物碱corydecumbine G作为神经元兴奋性选择性抑制剂在制备抑制神经元兴奋性的药物中及制备治疗神经性疼痛药物中的应用。

发明人研究发现，从中药夏天无中分离得到的苯酞异喹啉生物碱corydecumbineG能够抑制神经元的兴奋性，可以改善神经性疼痛，抑制活性较强，且含量丰富，可作为先导化合物，用于神经性疼痛药物的研发。

技术方案：本发明所述的一种苯酞异喹啉类生物碱，该苯酞异喹啉类生物碱是从中药夏天无中提取分离得到新的天然产物，命名为corydecumbine G，苯酞异喹啉类生物碱结构式如式(I)所示：

本发明所述的苯酞异喹啉类生物碱corydecumbine G的制备方法，包括以下步骤：

(1)取干燥的夏天无根茎，用乙醇回流提取，减压回收乙醇得浸膏；

(2)将浸膏用适量的酒石酸溶液溶解，过滤，滤液用乙酸乙酯萃取，萃取分离后的水溶液用碳酸钠调pH，用三氯甲烷萃取至无生物碱反应，萃取分离后的水溶液再用正丁醇萃取，回收溶剂，分别得乙酸乙酯萃取物、三氯甲烷萃取物、正丁醇萃取物；

(3)三氯甲烷萃取物经硅胶柱色谱分离，以三氯甲烷-甲醇系统梯度洗脱，经薄层色谱法检测后合并，得到六个馏分，Fr1～Fr6，Fr2经ODS柱色谱分离，以甲醇-水系统梯度洗脱，得到四个馏分，Fr2a～Fr2d，Fr2c经过Sephadex LH-20柱层析，以三氯甲烷-甲醇系统洗脱，由HPLC纯化，最终得到corydecumbine G。

进一步地，步骤(1)中，所述乙醇浓度为80％～100％，所述夏天无根茎与乙醇的固液比为1∶1～1∶5，减压的压力为-0.05～-0.1MPa。

进一步地，步骤(2)中，所述酒石酸溶液的浓度为1％～10％，所述pH为9～10。

进一步地，步骤(2)中，所述滤液与乙酸乙酯的体积比为1∶1～1∶5，所述三氯甲烷与滤液的体积比为1∶1～5∶1，正丁醇与滤液的体积比为1∶1～5∶1。

进一步地，步骤(3)中，所述三氯甲烷-甲醇系统梯度中三氯甲烷与甲醇体积比分别为100∶1、50∶1、30∶1、15∶1、10∶1、5∶1、2∶1，所述甲醇-水系统梯度中甲醇水溶液的浓度分别为20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％，所述三氯甲烷-甲醇系统中三氯甲烷：甲醇体积比为1∶1。其中，三氯甲烷与甲醇体积比为100∶1和50∶1时洗脱出的组分是Frl，三氯甲烷与甲醇体积比为30∶1时洗脱出的组分是Fr2，三氯甲烷与甲醇体积比为15∶1时洗脱出的组分是Fr3，三氯甲烷与甲醇体积比为10∶1时洗脱出的组分是Fr4，三氯甲烷与甲醇体积比为5∶1时洗脱出的组分是Fr5，三氯甲烷与甲醇体积比为2∶1时洗脱出的组分是Fr6。甲醇水溶液的浓度为20％和30％时洗脱出的组分是Fr2a，甲醇水溶液的浓度为40％和50％时洗脱出的组分是Fr2b，甲醇水溶液的浓度为60％和70％时洗脱出的组分是Fr2c，甲醇水溶液的浓度为80％、90％和100％时洗脱出的组分是Fr2d。

本发明所述的苯酞异喹啉生物碱corydecumbine G在制备抑制神经元兴奋性的药物中的应用。

本发明所述的苯酞异喹啉生物碱corydecumbine G在制备治疗神经性疼痛的药物中的应用。

进一步地，本发明利用原代小鼠大脑皮层神经元的自发钙振荡和4-Aminopyridine诱导的原代小鼠大脑皮层神经元癫痫样放电模型，发现所述的苯酞异喹啉生物碱corydecumbine G能抑制神经元的兴奋性。

进一步地，本发明利用坐骨神经结扎(CCI)诱导的神经性疼痛模型，发现所述的苯酞异喹啉生物碱corydecumbine G对CCI大鼠的坐骨神经形态和结构有保护和治疗作用。

有益效果：本发明是基于神经性疼痛开发的一个全新的神经元兴奋性抑制剂，苯酞异喹啉类生物碱corydecumbine G具有显著的抑制神经性疼痛活性，可作为先导化合物，用于制备抑制神经元兴奋性的药物及制备治疗神经性疼痛药物的研发。

附图说明

图1是不同浓度苯酞异喹啉生物碱corydecumbine G对大脑皮层神经元胞内钙浓度影响的时-效曲线。其中，Veh在300s加入了千分之一的二甲基亚砜(DMSO)表示空白组；4-AP在900s加入了10μM 4-氨基吡啶(4-Aminopyridine)表示对照组；1μM Cor G表示300s时加入1μM苯酞异喹啉生物碱corydecumbine G，900s时加入10μM 4-Aminopyridine；3μM CorG表示300s时加入3μM苯酞异喹啉生物碱corydecumbine G，900s时加入10μM 4-Aminopyridine；10μM Cor G表示300s时加入10μM苯酞异喹啉生物碱corydecumbine G，900s时加入10μM 4-Aminopyridine；20μM Cor G表示300s时加入20μM苯酞异喹啉生物碱corydecumbine G，900s时加入10μM 4-Aminopyridine；30μM Cor G表示300s时加入30μM苯酞异喹啉生物碱corydecumbine G，900s时加入10μM 4-Aminopyridine。

图2是苯酞异喹啉生物碱corydecumbine G对大脑皮层神经元钙振荡峰高和频率影响的浓-效关系曲线。其中，Amplitude组表示大脑皮层神经元钙振荡峰高的浓-效关系曲线；Frequency组表示大脑皮层神经元钙振荡峰频的浓-效关系曲线。

图3是苯酞异喹啉生物碱corydecumbine G对癫痫模型中大脑皮层神经元钙振荡峰高和频率影响的浓-效关系曲线。其中，SCO-amplitude组表示癫痫模型大脑皮层神经元钙振荡峰高的浓-效关系曲线；SCO-frequency组表示癫痫模型大脑皮层神经元钙振荡峰频的浓-效关系曲线。

图4是单次给药后各时间点各组大鼠患侧足底机械刺激疼痛阈值的变化和曲线下面积变化。

图5是单次给药后各时间点各组大鼠对侧足底机械刺激疼痛阈值的变化和曲线下面积变化。

图6是单次给药后各时间点各组大鼠患侧足底热刺激疼痛阈缩足潜伏期变化和曲线下面积变化。

图7是单次给药后各时间点各组大鼠对侧足底热刺激疼痛阈缩足潜伏期变化和曲线下面积变化。

图4～图7中，Sham+Veh表示假手术且不给药；CCI+Veh表示坐骨神经结扎且不给药；CCI+Cor G(2.5mg/kg)表示坐骨神经结扎且给药苯酞异喹啉生物碱corydecumbine G2.5mg/kg；CCI+Cor G(5mg/kg)表示坐骨神经结扎且给药苯酞异喹啉生物碱corydecumbineG 5mg/kg；CCI+Cor G(10mg/kg)表示坐骨神经结扎且给药苯酞异喹啉生物碱corydecumbine G 10mg/kg；CCI+Morphine(2mg/kg)表示坐骨神经结扎且给药吗啡(Morphine)2mg/kg。

注：n＝8；数据显示为Mean±SEM；与对照组比较，*p＜0.05；与对照组比较，**p＜0.01；与模型组比较，#p＜0.05；与模型组比较，##p＜0.01。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的技术方案作进一步说明。

本发明中，若非特指，所采用的试剂和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。

新的天然产物苯酞异喹啉生物碱corydecumbine G纯品是从中药夏天无中提取分离纯化得到的，通过核磁共振波谱仪、高分辨质谱仪、紫外光谱仪、红外光谱仪、自动旋光仪、圆二色谱仪确定其结构和立体构型。

在活体动物、离体神经组织存在着发生机制各不相同的自发性钙振荡，有些钙振荡依赖于外钙内流，有些依赖于胞内钙库的释放，有些二者并存，这些自发钙振荡在神经系统的发育、神经元突起的生长和迁移、网络连接模式的调节、突触可塑性等方面起重要作用。引起钙振荡的机制很复杂，但钙振荡的频率和峰高基本可以代表神经元的兴奋性。

大鼠坐骨神经结扎(CCI)模型是目前广泛使用的神经性疼痛模型，它与临床神经性疼痛具有高度相似性。临床上通常通过主观的不适程度描述来评价患者疼痛程度，而在大鼠CCI模型的疼痛研究中，采用纤毛机械刺激针刺激和热板仪热痛刺激，通过评估大鼠足底皮肤机械痛阈和热痛阈，对大鼠痛觉程度进行定量。

实施例1

本实例用于说明苯酞异喹啉生物碱corydecumbine G的制备过程及其结构鉴定。

1、新的天然产物苯酞异喹啉生物碱corydecumbine G的提取分离纯化过程如下：

取干燥的夏天无根茎35Kg，用100L95％乙醇回流提取，减压回收乙醇得浸膏，减压的压力为-0.1MPa。

将浸膏用20L的3％的酒石酸溶液完全溶解，过滤除去不溶物，滤液用20L乙酸乙酯萃取后用Na₂CO₃调节PH等于9，用20L三氯甲烷萃取至加入碘化铋钾无沉淀生成，即无生物碱反应后，再用20L正丁醇萃取，回收溶剂分别得乙酸乙酯萃取物、三氯甲烷萃取物、正丁醇萃取物。

三氯甲烷萃取物经硅胶柱色谱分离，以三氯甲烷-甲醇系统梯度洗脱(三氯甲烷与甲醇体积比为100∶1、50∶1、30∶1、15∶1、10∶1、5∶1、2∶1)，经薄层色谱法检测后合并，得到六个馏分，Fr1～Fr6。其中，三氯甲烷与甲醇体积比为100∶1和50∶1时洗脱出的组分是Fr1，三氯甲烷与甲醇体积比为30∶1时洗脱出的组分是Fr2，三氯甲烷与甲醇体积比为15∶1时洗脱出的组分是Fr3，三氯甲烷与甲醇体积比为10∶1时洗脱出的组分是Fr4，三氯甲烷与甲醇体积比为5∶1时洗脱出的组分是Fr5，三氯甲烷与甲醇体积比为2∶1时洗脱出的组分是Fr6。Fr2经ODS柱色谱分离，以甲醇水溶液系统梯度洗脱(甲醇水溶液浓度为20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％)，得到四个馏分，Fr2a～Fr2d。其中，甲醇水溶液的浓度为20％和30％时洗脱出的组分是Fr2a，甲醇水溶液的浓度为40％和50％时洗脱出的组分是Fr2b，甲醇水溶液的浓度为60％和70％时洗脱出的组分是Fr2c，甲醇水溶液的浓度为80％、90％和100％时洗脱出的组分是Fr2d。Fr2c经过Sephadex LH-20柱层析，以三氯甲烷-甲醇系统洗脱(三氯甲烷与甲醇体积比为1∶1)，由HPLC纯化(通过使用Shimadzu LC-20AT型制备HPLC，色谱柱：Welch Xtimate-C18 column(250×10mm，5μm)，流动相为70％MeOH-H2O溶液，柱温为30℃，其他为室温，流速为2mL/min，进样100uL时取保留时间为33～34.5min时得到的样品)，最终得到新的天然产物苯酞异喹啉生物碱corydecumbine G。

2、新的天然产物苯酞异喹啉生物碱corydecumbine G的结构鉴定：

得到的苯酞异喹啉生物碱corydecumbine G为棕色粉末，采用高分辨质谱仪进行分析：高分辨质谱HR-ESIMS显示准分子离子峰[M+H]⁺m/z＝398.1590。

苯酞异喹啉生物碱corydecumbine G采用紫外光谱仪(UV)进行分析：UV(MeOH)λ_max(log ε)289(3.80)，240(3.82)nm。

苯酞异喹啉生物碱corydecumbine G采用红外光谱仪(IR)进行分析：IRv_max2972，2898，2793，1648，1503，1470，1381，1246cm^-1。

苯酞异喹啉生物碱corydecumbine G采用圆二色谱仪进行分析：ECD(MeOH)λ_max(Δε)202(+18.5)，211(-17.7)，228(+7.8)

苯酞异喹啉生物碱corydecumbine G采用自动旋光仪进行分析：旋光度为

(c 0.4，CHCl₃)。

苯酞异喹啉生物碱corydecumbine G采用核磁共振波谱仪进行分析：¹H-NMR谱(CDCl₃，500MHz)芳香区给出四个芳香苯环的质子信号，δ_H6.27(1H，s)，6.56(1H，s)，6.73(1H，d，J＝8.0Hz)，6.32(1H，d，J＝8.0Hz)。δ_H6.02(1H，d，J＝1.5Hz)，5.97(1H，d，J＝1.5Hz)，5.88(1H，d，J＝1.5Hz)，5.86(1H，d，J＝1.5Hz)为两个亚甲二氧基的质子特征信号。δ_H5.55(1H，d，J＝3.0Hz)，3.80(1H，d，J＝3.0Hz)是苯酞异喹啉类生物碱两个特征的质子信号。δ_H2.57(3H，s)为一个氮甲基质子信号，δ_H2.46(1H，m)、2.62(1H，m)、2.67(1H，m)、3.10(1H，m)为四个饱和质子信号，δ_H3.66(1H，m)，3.61(1H，m)，1.22(3H，t，J＝7.0Hz)为乙氧基的五个质子信号。¹³C-NMR谱(CDCl₃，125MHz)共给出22个碳信号，δ_C103.8为一个缩醛的特征碳信号，δ_C101.8和100.7为两个亚甲二氧基的碳信号，δ_C44.7为一个连N的甲基碳信号，δ_C49.3为一个连N的亚甲基碳信号，δ_C67.8为一个连N的次甲基碳信号，δ_C26.8为一个亚甲基碳信号，δ_C87.2为一个连O的次甲基碳信号，δ_C62.7和15.4为乙氧基的碳信号。δ_C108.2～148.1之间有12个芳香碳信号，分别为108.2、108.3、109.4、114.9、120.6、126.4、130.2、136.5、142.0、145.5、146.3、148.1。

通过上述数据分析，确定苯酞异喹啉生物碱corydecumbine G分子式为C₂₂H₂₃NO₆，不饱和度为12。

实施例2

本实施例用于说明本发明提供的天然产物苯酞异喹啉生物碱corydecumbine G对大脑皮层神经元兴奋性的抑制作用。

1、大脑皮层原代神经元的分离与培养：

取怀孕15～16天的C57BL/6孕鼠，断头处死，75％乙醇中浸泡10min左右消毒，在生物安全柜中打开母鼠腹腔，取出胎鼠。将胎鼠的全脑取出，在解剖显微镜下剥除脑膜和非皮层部位，得到大脑皮层，胰蛋白酶37℃消化25min。在含有Soybean Trypsin Inhibitor和DNase I的解剖缓冲液将皮层吹散为单细胞悬液，取细胞悬液离心(1000rpm/5min)，用Neuron Plating Media重悬。将细胞悬液接种于预先包被PLL(左旋多聚赖氨酸)的96孔黑底板中，密度为1.5×10⁵个细胞/孔/150μL。将细胞板放入37℃、5％CO₂的培养箱中，30h后加入10μmol/L的ARA-C(阿糖胞苷)10μL。等到第5天和第7天用神经元换液培养基半量换液，培养至第8天进行实验。

2、原代皮层细胞自发钙振荡检测：

将培养至第8天的原代大脑皮层神经元用于检测天然产物苯酞异喹啉生物碱corydecumbine G对胞内钙浓度的影响。设置FLIPR Tetra检测系统，激发波长470～495nm，检测波长515～575nm，每1s读一个点。分两次加药，在读板300s后，第一次加入浓度为终浓度(1μM，3μM，10μM，20μM和30μM)的8×corydecumbine G溶液25μL，继续读板至900s，第二次加入浓度为终浓度(10μM)的8×4-Aminopyridine溶液25μL，继续读板至1500s。观察胞内Ca²⁺水平变化。

如图1所示，Veh空白组和4-Ap对照组，没有加入苯酞异喹啉生物碱corydecumbineG，大脑皮层神经元钙振荡的峰高和峰频都较高。图中1μM Cor G是在300s加入1μM苯酞异喹啉生物碱corydecumbine G，900s时加入10μM 4-Aminopyridine时，大脑皮层神经元钙振荡的峰高和峰频稍有下降，但仍较高，表明此剂量对抑制大脑皮层钙振荡效果不明显。而图中3μM Cor G、10μM Cor G、20μM Cor G、30μM Cor G在300s时分别加入3μM，10μM，20μM和30μM苯酞异喹啉生物碱corydecumbine G后，300s～900s时大脑皮层神经元钙振荡的峰高和峰频均显著降低；在900s分别均加入10μM4-Aminopyridine后，3μM Cor G大脑皮层神经元钙振荡的峰高和峰频虽有增高，但与与4-Ap对照组相比，大脑皮层神经元钙振荡的峰高和峰频仍然低一些。10μM Cor G、20μM Cor G、30μM Cor G在900s～1500s时大脑皮层神经元钙振荡的峰高和峰频虽有增高，但与4-Ap对照组相比，大脑皮层神经元钙振荡的峰高和峰频仍然处于很低水平。结果表明，高浓度的苯酞异喹啉生物碱corydecumbine G可以有效抑制大脑皮层神经元的自发钙振荡和4-Aminopyridine诱导的原代小鼠大脑皮层神经元癫痫样放电。

如图2所示，Amplitude中显示苯酞异喹啉生物碱corydecumbine G可以降低大脑皮层神经元钙震荡峰高，其IC₅₀为3.658μm；Frequency中显示苯酞异喹啉生物碱corydecumbine G可以降低大脑皮层神经元钙震荡峰频，其IC₅₀为3.071μm。

如图3所示，SCO-amplitude中显示苯酞异喹啉生物碱corydecumbine G可以降低癫痫模型中大脑皮层神经元钙震荡峰高，其IC₅₀为4.755μm；SCO-frequency中显示苯酞异喹啉生物碱corydecumbine G可以降低癫痫模型中大脑皮层神经元钙震荡峰频，其IC₅₀为8.931μm。

上述结果表明，苯酞异喹啉生物碱corydecumbine G对皮层神经元的兴奋性有较好的抑制作用。

实施例3

本实施例用于说明本发明提供的天然产物苯酞异喹啉生物碱corydecumbine G可以恢复CCI大鼠机械痛和热痛过敏程度。

1、建立坐骨神经慢性压迫模型及动物分组

将大鼠腹腔注射1％戊巴比妥钠麻醉(6mL/kg)，取俯卧位，刮净并切开左侧大腿皮肤，钝性分离股二头肌，暴露出坐骨神经干，用4-0铬制羊肠线结扎坐骨神经干4圈，每圈间距1mm，结扎坐骨神经至其外膜轻微凹陷(可见后小腿肌肉轻度颤动)。复位坐骨神经，缝合皮肤，并肌注青霉素钠(20万U)防止大鼠手术感染(即左侧为患侧ipsi，右侧为对侧contra)。Sham组大鼠暴露但不结扎坐骨神经干，其余同上。设对照组(Sham组、CCI组)、药物治疗组(腹腔注射低、中、高剂量苯酞异喹啉生物碱corydecumbine G组和吗啡阳性药组)。

2、腹腔注射给药处理

腹腔注射时，左手拇指和食指先抓住大鼠肩部并向大鼠头部推动至耳侧抓紧防止大鼠头部乱动，手掌夹紧大鼠背部皮并翻转过来暴露大鼠腹部。大鼠腹腔注射选点在右下腹，沿腿的角度让针穿透腹膜。注射后，撤回注射器，然后将大鼠放回笼子里。CCI模型建立后17天，按照组别给予药物治疗组大鼠低中高剂量苯酞异喹啉生物碱corydecumbine G(2.5、5、10mg/kg)以及2mg/Kg吗啡；而Sham组和CCI组腹腔注射等量含有1％DMSO和10％Tween-80的生理盐水1μL/Kg作为对照。

3、机械性缩足反射阈值测定

将大鼠置于四周透明，底部为金属网格的行为学测定架中，适应环境20～30min，直至探觅行为停止后开始测量。机械痛阈的行为学测定采用经典的纤毛机械刺激针(vonFrey hairs)，从铁丝网下面垂直刺激双足底中央，垂直向大鼠足底刺激直至其弯曲成S形，当大鼠出现缩足或舔足动作时读取刺激针上所显示的数据，每次刺激足底持续时间不超过5s。动物模型鉴定于术后10天起，若机械性缩足反射阈值小于4g，则判断模型成功，否则予以剔除。

如图4所示，可以看出，对照组Sham+Veh组大鼠患侧足底机械刺激疼痛阈值保持在较高水平，属于正常状态；对照组CCI+Veh组大鼠患侧足底机械刺激疼痛阈值手术后逐渐降至最低，并保持在较低水平，属于病理状态；药物治疗组(低剂量苯酞异喹啉生物碱corydecumbine G组CCI+Cor G(2.5mg/kg)、中剂量苯酞异喹啉生物碱corydecumbine G组CCI+Cor G(5mg/kg)、高剂量苯酞异喹啉生物碱corydecumbine G组CCI+Cor G(10mg/kg)和吗啡阳性药组CCI+Morphine(2mg/kg))大鼠患侧足底机械刺激疼痛阈值在手术后给药前(即0h之前)逐渐降至最低，给药后药物治疗组中各组大鼠患侧足底机械刺激疼痛阈值于2h上调开始，持续时间能达到6～8h。表明吗啡和苯酞异喹啉生物碱corydecumbine G能够改善坐骨神经结扎诱导的机械痛。对照组Sham+Veh组曲线下面积最高，属于正常状态；对照组CCI+Veh组曲线下面积最低，属于病理状态；药物治疗组中吗啡阳性药组CCI+Morphine(2mg/kg)高于病理状态，低于正常状态，说明有治疗效果；低剂量苯酞异喹啉生物碱corydecumbine G组CCI+Cor G(2.5mg/kg)与CCI+Veh组曲线下面积持平，说明此剂量药效不明显；药物治疗组中其他给药组(中剂量苯酞异喹啉生物碱corydecumbine G组CCI+CorG(5mg/kg)和高剂量苯酞异喹啉生物碱corydecumbine G组CCI+Cor G(10mg/kg))曲线下面积高于病理状态，低于正常状态，说明有治疗效果，且随给药量增加而增加，表明机械痛镇痛作用与剂量呈正相关。

如图5所示，单次给药后各时间点各组大鼠对侧足底机械刺激疼痛阈值及曲线下面积都与对照组Sham+Veh组和CCI+Veh组类似，保持较高状态，变化不明显，属于正常状态。

4、热缩爪潜伏期测定

将大鼠置于底板为玻璃板(厚度为2mm)的方形透明塑料笼中，适应环境15min；辐射热源为高强度卤素灯泡，置于玻璃板下方。将加热板对准后爪掌面正中，启动加热灯，大鼠移开后爪后，仪器显示的时间为热缩爪潜伏期。每只鼠测痛3次，每次间隔3min，取平均值。为避免大鼠后爪热灼伤，设定当潜伏期达30s时仪器自动关闭热源。

如图6所示，可以看出，对照组Sham+Veh组大鼠患侧足底热刺激缩足时间保持在较高水平，属于正常状态；对照组CCI+Veh组大鼠患侧足底热刺激缩足时间在手术后降至最低，并保持在较低水平，属于病理状态；药物治疗组(低剂量苯酞异喹啉生物碱corydecumbine G组CCI+Cor G(2.5mg/kg)、中剂量苯酞异喹啉生物碱corydecumbine G组CCI+Cor G(5mg/kg)、高剂量苯酞异喹啉生物碱corydecumbine G组CCI+Cor G(10mg/kg)和吗啡阳性药组CCI+Morphine(2mg/kg))大鼠患侧足底热刺激缩足时间在手术后给药前(即0h之前)逐渐降至最低，给药后各组大鼠患侧足底热刺激缩足时间于2h上调开始，持续时间能达到6～8h。表明吗啡和苯酞异喹啉生物碱corydecumbine G能够改善坐骨神经结扎诱导的热痛痛敏。对照组Sham+Veh组曲线下面积最高，属于正常状态；对照组CCI+Veh组曲线下面积最低，属于病理状态；吗啡阳性药组CCI+Morphine(2mg/kg)高于病理状态，低于正常状态，说明有治疗效果；低剂量苯酞异喹啉生物碱corydecumbine G组CCI+Cor G(2.5mg/kg)与中剂量苯酞异喹啉生物碱corydecumbine G组CCI+Cor G(5mg/kg)曲线下面积相近，但高于病理状态CCI+Veh组，说明这两种剂量有效，但差别不明显；高剂量苯酞异喹啉生物碱corydecumbine G组Cor G+Cor G(10mg/kg)曲线下面积高于低剂量苯酞异喹啉生物碱corydecumbine G组CCI+Cor G(2.5mg/kg)与中剂量苯酞异喹啉生物碱corydecumbine G组CCI+Cor G(5mg/kg)，且曲线下面积随给药量增加而增加，表明镇痛作用与剂量呈正相关。

如图7所示，单次给药后各时间点各组大鼠对侧足底热刺激疼痛阈及曲线下面积都与对照组Sham+Veh组和CCI+Veh组类似，都保持较高状态，变化不明显，属于正常状态。

由上述可知，苯酞异喹啉生物碱corydecumbine G显著增加CCI大鼠患侧足底的机械刺激域值和热刺激缩足时间，表明神经性疼痛症状减轻。机械刺激域值和热刺激缩足时间于2h开始上调，持续时间能达到6～8h，且镇痛作用与剂量呈正相关，表明苯酞异喹啉生物碱corydecumbine G的镇痛作用具有剂量依赖性。结果表明，单次腹腔注射苯酞异喹啉生物碱corydecumbine G能够剂量依赖性地改善CCI诱导的机械痛和热痛痛敏。

Claims

1.一种苯酞异喹啉类生物碱，其特征在于，所述苯酞异喹啉类生物碱结构式如式(I)所示：

2.权利要求1所述的苯酞异喹啉类生物碱制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(3)三氯甲烷萃取物经硅胶柱色谱分离，以三氯甲烷-甲醇系统梯度洗脱，经薄层色谱法检测后合并，得到六个馏分，Fr1～Fr6，Fr2经ODS柱色谱分离，以甲醇-水系统梯度洗脱，得到四个馏分，Fr2a～Fr2d，Fr2c经过Sephadex LH-20柱层析，以三氯甲烷-甲醇系统洗脱，由HPLC纯化，最终得到苯酞异喹啉类生物碱corydecumbine G。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述乙醇浓度为80％～100％，所述夏天无根茎与乙醇的固液比为1:1～1:5，减压的压力为-0.05～-0.1MPa。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述酒石酸溶液的浓度为1％～10％，所述pH为9～10。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述滤液与乙酸乙酯的体积比为1:1～1:5，所述三氯甲烷与滤液的体积比为1:1～5:1，所述正丁醇与滤液的体积比为1:1～5:1。

6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述三氯甲烷-甲醇系统梯度中三氯甲烷与甲醇体积比分别为100:1、50:1、30:1、,15：1、10:1、5:1、2:1，所述甲醇-水系统梯度中甲醇水溶液的浓度分别为20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％，所述三氯甲烷-甲醇系统中三氯甲烷：甲醇体积比为1:1。

7.权利要求1所述的苯酞异喹啉生物碱在制备抑制神经元兴奋性的药物中的应用。

8.权利要求1所述的苯酞异喹啉生物碱在制备治疗神经性疼痛的药物中的应用。