JP5142295B2 - ベシクル及びその製法 - Google Patents
ベシクル及びその製法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP5142295B2 JP5142295B2 JP2009113707A JP2009113707A JP5142295B2 JP 5142295 B2 JP5142295 B2 JP 5142295B2 JP 2009113707 A JP2009113707 A JP 2009113707A JP 2009113707 A JP2009113707 A JP 2009113707A JP 5142295 B2 JP5142295 B2 JP 5142295B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- vesicle
- nucleotide
- water
- lipid
- acid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Landscapes
- Manufacturing Of Micro-Capsules (AREA)
Description
ベシクルの調製法としては、いくつかの方法が知られているが(非特許文献1など)、従来のベシクルの調製法は、化学的・物理的に激しい条件で行われるのが一般的であり、その工程も複雑である。有機溶媒、超音波照射、加熱や電圧の印加、又は酸・アルカリ物質の使用は、ベシクルに内包させる物質(例えば、生理活性物質など)によってはその性質を著しく変化・損傷させるおそれがある。また、ベシクルに残存した化学物質が安定性に影響を及ぼしたり、毒性を示したりすることが問題となることから、実用化が困難となっている。さらには、ベシクルが得られるまでの工程が多くなると時間がかかるうえ、エネルギーの損失が大きくコストがかかる。その他、薄膜作成やマイクロチャネルが必要な工程を含む場合、ベシクルの大量生産には大面積の装置が必要となり実用化が困難であった。
本発明者らは、既に開発した、二価又は三価の炭化水素鎖の分子端にヌクレオチドを有するヌクレオチド脂質(特許文献1)を、本発明に利用した。
即ち、本発明は、下記一般式
R−Xn
(式中、nは2又は3を表し、Xは、それぞれ同じであっても異なってもよく、シチジル酸、ウリジル酸又はチミジル酸のいずれかのヌクレオチドを表し、Rは炭化水素鎖(nが2の場合には二価であり、nが3の場合には三価である。)を表し、該ヌクレオチドのリン酸部分で該炭化水素と結合する。)で表されるヌクレオチド脂質から成る膜が球殻状に閉じた小胞であって、内部に水、水溶性の成分の水溶液又は水に分散性の成分の分散液を含むベシクルである。
また本発明は、下記一般式
R−Xn
(式中、nは2又は3を表し、Xは、それぞれ同じであっても異なってもよく、シチジル酸、ウリジル酸又はチミジル酸のいずれかのヌクレオチドを表し、Rは炭化水素鎖(nが2の場合には二価であり、nが3の場合には三価である。)を表し、該ヌクレオチドのリン酸部分で該炭化水素と結合する。)で表されるヌクレオチド脂質を水、水溶性の成分の水溶液又は水に分散性の成分の分散液に分散させることから成るベシクルの製法である。
本発明で用いるヌクレオチド脂質は下記一般式で表される。
R−Xn
この式中、nは2又は3、好ましくは2を表す。
Xはシチジル酸、ウリジル酸又はチミジル酸のいずれかのヌクレオチドを表す。
このヌクレオチドは、それぞれ同じであっても異なってもよいが、好ましくは同じである。このヌクレオチドは、リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチド、好ましくはデオキシリボヌクレオチドであり、その2'、3'又は5'の位置、好ましくは3'又は5'の位置に1又は2以上のリン酸を含んでもよい。このヌクレオチド脂質の作製が容易であるという観点から、デオキシチミジンの3'位にモノリン酸が結合したものが好ましい。これらのヌクレオチドの構造は、下式(5'のみ例示する)で表わされる。
この炭化水素鎖の炭素数は12〜20が好ましく、18〜20がより好ましい。また、この炭化水素鎖としては末端に結合手を有するオリゴメチレン基、特に−(CH2)m−(mは好ましくは12〜20、より好ましくは18〜20である。)が好ましい。
このヌクレオチドは、そのリン酸部分で該炭化水素鎖と結合する。
また、上記ヌクレオチドは必ずしも1種類である必要はなく、2種以上を用いてもよい。更に、炭化水素鎖も同様に2種以上を用いてもよい。
ヌクレオチド脂質を水溶媒に分散させる。この水溶媒は水であってもよいが、水溶性の成分の水溶液、又は水に分散性の成分の分散液であってもよい。
水溶性成分としては、塩、金属塩、ミネラル、単糖類、水溶性ビタミン、アルコール、酸・塩基、アミノ酸、ペプチド、核酸塩基、食品機能性成分(カテキン、グルコシノレート)などが挙げられる。
水に分散性の成分としては、タンパク質、DNA、多糖類、脂質、農薬、色素、脂溶性ビタミン、香気成分などが挙げられる。
溶液の温度は通常0℃〜70℃であるが、好ましくは15℃〜25℃である。0℃より低いと溶液が凍結してベシクルが形成されず、70℃より高くてもベシクルが形成されない。
ヌクレオチド脂質を水溶媒に分散させるためには、単にヌクレオチド脂質と水溶媒とを混合すればよいが、混合後攪拌してもよい。この攪拌は、水溶液を手で軽く振るだけでもよいが、振とう機で振動を与えたり、超音波照射を行ったりしてもよい。攪拌の効率を上げるために、上記温度範囲内で加温してもよい。その後、混合液を静置しておくことが好ましい。
このようにして得られるベシクルは、通常平均粒径が約20〜100nmである。このベシクルは水溶液中で長期に安定したベシクル構造を保つことができる。
また、得られたベシクルを凍結乾燥することもできる。凍結乾燥した状態で保存し、必要に応じて、再度水を添加することにより再水和させてベシクルを再生することもできる。
製造例1
ジクロロメタンに1,16−ヘキサデカンジカルボン酸2.2 g(7.0ミリモル)、塩化チオニル3.3 ml(28ミリモル)、N,N−ジメチルホルムアミド1滴を加え、還流下で2時間加熱した。反応後、減圧下で溶媒を完全に留去して得られた酸クロライドを、テトラヒドロフランに溶解した。次に、テトラヒドロフランに水素化リチウムアルミニウム0.5 g(13ミリモル)を加え、−50℃に保った。この溶液中に、先ほどの酸クロライド溶液をゆっくりと滴下した後、室温に戻し、還流下で3時間加熱した。その後24時間室温で撹拌し、酢酸エチル、続いて飽和硫酸ナトリウム水溶液を気泡が発生しなくなるまで加えた。次に反応溶液を減圧下で溶媒を留去し、得られた個体をクロロホルムに懸濁して濾過し、ろ液を減圧下で留去した。得られた個体をヘキサン/酢酸エチル=2/1の溶媒から再結晶し、白色の固体として1,18−オクタデカンジオール1.5gを得た(収率=73%)。
1H-NMR(重水中、25℃)δ(ppm) 1.1〜1.3, 1.5, 3.8, 2.2, 2.5, 3.7, 4.2, 4.7, 6.0, 6.2, 7.8
融点:143℃
薄層クロマトグラフィーのRf値=0.6(クロロホルム/メタノール/水=100/100/5)
本製造例では、アデニン脂質1,18−(オクタデカンジオキシ)ビス(3'−ホスファチジル−2'−デオキシアデノシン)(下式)を製造した。
生成したアデニン脂質の分析データを示す。
1H-NMR(DMSO-d6中、100℃)δ(ppm)1.2〜1.4, 1.6, 2.3, 2.5, 3.5, 3.8, 4.4, 6.3, 8.1, 8.2
融点:225℃(分解)
薄層クロマトグラフィーのRf値=0.5(クロロホルム/メタノール/水=100/100/5)
質量分析値(ESI-QMS、[M-H]-、C38H61N10O12P2として)計算値:911.40、実測値:911.61
本製造例では、グアニン脂質1,18−(オクタデカンジオキシ)ビス(3'−ホスファチジル−2'−デオキシグアノシン)を製造した。
製造例1で得た1,18−オクタデカンジオール0.11 g(0.4ミリモル)と1H−テトラゾール0.1 g(1.9ミリモル)をテトラヒドロフランに溶解し、N2−ジメチルホルムアミド−5'−O−ジメトキシトリチル−2'−デオキシグアノシン3'−O−[O−(2−シアノエチル)−N,N−ジイソプロピルホスホルアミダイト]0.6 g(0.8ミリモル)を加えた。28%アンモニア水溶液中での撹拌を、グアニン部位の脱保護のために、60℃に加熱し1時間行った以外は、製造例2のアデニン脂質と同様の操作を行った。1,18−(オクタデカンジオキシ)ビス(3'−ホスファチジル−2'−デオキシグアノシン)(グアニン脂質)0.2g(収率=46%)を黒色粉末として得た。
生成したグアニン脂質の分析データを示す。
1H-NMR(DMSO-d6中、100℃)δ(ppm)1.2〜1.4, 1.6, 2.3, 2.5, 3.5, 3.8, 4.0, 4.3, 5.9, 9.5
融点:230℃(分解)
薄層クロマトグラフィーのRf値=0.4(クロロホルム/メタノール/水=100/100/5)
質量分析値(ESI-QMS、[M-H]-、C38H61N10O14P2として)計算値:943.38、実測値:943.60
製造例1で得たシトシン脂質5 mg(5.8μmol)をサンプル容器に計り取り、バッファー水溶液(アプライドバイオシステムズ社、Tris−HCl 1mM、EDTA 0.1mM、pH=8.0)0.2 mlを加え、ボルテックスミキシング(20℃、ボルテックスジーニー2、1000rpm、5秒)を行い、ベシクル分散液を得た(シトシン脂質濃度2.9×10−2M)。
12mm角ガラスセル90°用(Malvern社製、PCS8501)にバッファー水溶液(成分は上記と同じ)1 mlを注入し、上記で得たベシクル分散液0.1 mlを加えて、ゼータサイザーナノZS(Malvern社製)を用いて、動的光散乱法により、ベシクル径の分布を測定した。
測定されたベシクル径の体積割合での分布を図1に示す。図1において、ベシクル分散液中で直径約30nmのベシクルが大部分を占めることがわかる。図1から平均粒子径は28nmである。
光学顕微鏡写真(図2)で多数の球状構造体が観察される。なお、光学顕微鏡観察では、生成したベシクルのうち可視光で観察できる大きさ(通常500nm以上)のもののみが観察されるため、動的光散乱による粒度分布測定結果とは一致しない。
一方、偏光顕微鏡写真(図3)で、円中に十字の像として現れるマルテーゼクロスのパターンが観察されたことから、図2中に観察される球状構造は脂質膜が積層しラメラ構造となっていることが示され、このことから、この球状構造体は、ベシクルと判断される。
(1)カルセイン(蛍光色素、同仁化学研究所社製)0.1mMを含む10mM Tris−HClバッファー中に、シトシン脂質加え、ボルテックスミキシング(サイエンティフィックインダストリーズ社製 ボルテックスジーニー2、1000rpm、5秒、20℃)を行い、カルセイン含有ベシクル水溶液を得た(シトシン脂質濃度2.9×10−2M)。
(2)このカルセイン含有ベシクル水溶液40μlを、2mlの10mM Tris−HClバッファーに添加し、蛍光分光光度計(島津製作所製 RF−5300PC、励起波長490nm、蛍光波長520nm)を用いて20℃で蛍光強度を測定した。この時の蛍光強度をFtとする。
(3)次に、10mM CoCl2水溶液を60μl添加し、同様に蛍光を測定した。Co2+はカルセイン(蛍光色素)を消光させる効果を持つため、CoCl2の添加により、溶液中に存在するカルセインのみを消光させ、ベシクル内部に封入されたカルセインのみが発光することになる。この時の蛍光強度をFinとする。
(4)さらに、10%HCl水溶液2μlを添加して、同様に蛍光を測定した。HCl水溶液の添加によりベシクルは破壊されるため、ベシクル内部に封入されていたカルセインが溶液中に漏出し、Co2+と結合して消光する。この時の蛍光強度をFqとする。
このことは、溶液中の色素を内側に取り込んだベシクルが生成していることを示している。
また、下式から求めた保持効率(ベシクルに取り込まれた色素の割合)は6.45%であった。
保持効率%=(Fin−Fq×r)/(Ft−Fq×r)
r=1.35(体積変化による補正値)
実施例1と同様に、ガラスセルにバッファー水溶液1mlを注入し、実施例1で得たベシクル分散液1μlを注入し、シトシン脂質濃度を2.9×10−5Mとしてベシクル径の分布を測定した。
測定されたベシクル径の体積割合での分布を図5に示す。図5から平均粒子径は28nmである。
濃度が低くなると、粒径分布が広くなっている。粒径60nmと4μmを分布の中心とするベシクルが形成されているが、粒径20nm以下の粒子については、その大きさから内水相をもたないミセルと考えられる。したがって、濃度が低くなるにつれて、粒径分布が広くなるとともにベシクルでない粒子(20nm未満のもの)が生成していることを示している。
実施例1で得たベシクル分散液を20℃で1か月静置し、光学顕微鏡による観察を行った。この光学顕微鏡写真を図6に示す。図2(実施例1)と比べても、ベシクルが少なくとも一か月安定に構造を保っていることを示している。
なお、2週間経過後のベシクル分散液について、実施例2と同様にして蛍光強度を測定した。蛍光強度を図7に示す。ベシクル内の色素の蛍光が観測されていることから、長期保存後も本発明のベシクルがその内部に内容物を安定に保持していることを示している。
製造例2,3で合成したアデニン脂質1,18−(オクタデカンジオキシ)ビス(3'−ホスファチジル−2'−デオキシアデノシン)、グアニン脂質1,18−(オクタデカンジオキシ)ビス(3'−ホスファチジル−2'−デオキシグアノシン)を用いてシトシン脂質と同様の操作で水分散液を調製したところ、沈殿を生じ、ベシクルの生成は認められなかった(結果は示さない。)。
この理由として、ヌクレオチド脂質分子の分子端のヌクレオチドが、アデニル酸又はグアニル酸の場合には、これらのヌクレオチドが会合して、ヌクレオチド脂質分子が直線状に繋がり、ベシクルを形成することができないためと考えられる。ちなみに、ヌクレオシドのスタッキングの会合定数は、グアノシン:2.9M−1、アデノシン:4.7〜7.5M−1、シチジン:0.87M−1、チミジン:0.61M−1、ウリジン:0.91M−1(核酸構造、W.ゼンガー著、シュプリンガーフェアラーク東京、1984年)であり、グアノシンとアデノシンの会合定数は他のヌクレオシドよりも高く、アデニル酸とグアニル酸の会合を示唆している。
実施例1で得られたベシクル分散液0.5μlをスライドガラス上に取り、カバーガラスで覆ったのち、スライドガラスとカバーガラスの境界をマニキュアでシールした。これをホットプレート(メトラー・トレド社製、FP900サーモシステム)に置き、80℃で光学顕微鏡観察を行った。ベシクル様の球状構造は観察されなかった(結果は示さない。)。
Claims (8)
- 下記一般式
R−Xn
(式中、nは2又は3を表し、Xは、それぞれ同じであっても異なってもよく、シチジル酸、ウリジル酸又はチミジル酸のいずれかのヌクレオチドを表し、Rは炭化水素鎖(nが2の場合には二価であり、nが3の場合には三価である。)を表し、該ヌクレオチドのリン酸部分で該炭化水素と結合する。)で表されるヌクレオチド脂質から成る膜が球殻状に閉じた小胞であって、内部に水、水溶性の成分の水溶液又は水に分散性の成分の分散液を含むベシクル。 - 前記ヌクレオチド脂質が、下記一般式
R−X2
(式中、Xは同じデオキシリボヌクレオチドを表し、Rは上記で定義したとおりである。)で表される請求項1のベシクル。 - 前記ヌクレオチドXがモノリン酸であり、前記Rの炭素数が12〜20である請求項1又は2に記載のベシクル。
- 平均直径が20〜100nmである請求項1〜3のいずれか一項に記載のベシクル。
- 下記一般式
R−Xn
(式中、nは2又は3を表し、Xは、それぞれ同じであっても異なってもよく、シチジル酸、ウリジル酸又はチミジル酸のいずれかのヌクレオチドを表し、Rは炭化水素鎖(nが2の場合には二価であり、nが3の場合には三価である。)を表し、該ヌクレオチドのリン酸部分で該炭化水素と結合する。)で表されるヌクレオチド脂質を、0〜70℃で、水、水溶性の成分の水溶液又は水に分散性の成分の分散液に溶解又は分散させることから成るベシクルの製法。 - 前記分散させることが、混合し、攪拌し、及び静置することから成る請求項5に記載の製法。
- 前記ヌクレオチド脂質が、下記一般式
R−X2
(式中、Xは同じデオキシリボヌクレオチドを表し、Rは上記で定義したとおりである。)で表される請求項5又は6に記載の製法。 - 前記ヌクレオチドXがモノリン酸であり、前記Rの炭素数が12〜20である請求項5〜7のいずれか一項に記載の製法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2009113707A JP5142295B2 (ja) | 2009-05-08 | 2009-05-08 | ベシクル及びその製法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2009113707A JP5142295B2 (ja) | 2009-05-08 | 2009-05-08 | ベシクル及びその製法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2010260011A JP2010260011A (ja) | 2010-11-18 |
JP5142295B2 true JP5142295B2 (ja) | 2013-02-13 |
Family
ID=43358561
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2009113707A Expired - Fee Related JP5142295B2 (ja) | 2009-05-08 | 2009-05-08 | ベシクル及びその製法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP5142295B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN114699997B (zh) * | 2022-03-28 | 2022-11-25 | 山东大学 | 一种具有高抗盐性的碱基@囊泡复合体及其制备方法 |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
ES2251134T3 (es) * | 1999-06-08 | 2006-04-16 | Gentium S.P.A. | Uso de complejos entre liposomas cationicos y polidesoxirribonucleotidos como medicamentos. |
JP3660282B2 (ja) * | 2001-08-20 | 2005-06-15 | 独立行政法人科学技術振興機構 | ハイドロゲル化剤 |
-
2009
- 2009-05-08 JP JP2009113707A patent/JP5142295B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2010260011A (ja) | 2010-11-18 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Bui et al. | Versatile RNA tetra-U helix linking motif as a toolkit for nucleic acid nanotechnology | |
Gibard et al. | Phosphorylation, oligomerization and self-assembly in water under potential prebiotic conditions | |
Baillet et al. | Lipid and nucleic acid chemistries: combining the best of both worlds to construct advanced biomaterials | |
Rosemeyer | Nucleolipids: natural occurrence, synthesis, molecular recognition, and supramolecular assemblies as potential precursors of life and bioorganic materials | |
CN108368028A (zh) | 用于递送核酸的新型脂质和脂质纳米颗粒制剂 | |
Bhattacharya et al. | Vesicle and tubular microstructure formation from synthetic sugar-linked amphiphiles. Evidence of vesicle formation from single-chain amphiphiles bearing a disaccharide headgroup | |
Simeone et al. | Design, Synthesis and Characterisation of Guanosine‐Based Amphiphiles | |
Alies et al. | Cytidine-and guanosine-based nucleotide–lipids | |
Bunge et al. | Lipid Membranes Carrying Lipophilic Cholesterol-Based Oligonucleotides Characterization and Application on Layer-by-Layer Coated Particles | |
US11357865B2 (en) | Compositions containing nucleic acid nanoparticles with modular functionality | |
JP5913094B2 (ja) | 複数区画を有する機能性両親媒性分子又は巨大分子製剤 | |
Pavlova et al. | Amphiphilic “like-a-brush” oligonucleotide conjugates with three dodecyl chains: Self-assembly features of novel scaffold compounds for nucleic acids delivery | |
R Kore et al. | Click chemistry based functionalizations of nucleoside, nucleotide and nucleic acids | |
JP5142295B2 (ja) | ベシクル及びその製法 | |
CN107867677A (zh) | 一维磷酸钙纳米/微米材料及其制备方法和应用 | |
Lee et al. | L-DNA linear duplex: An efficient drug delivery carrier with a simple structure | |
Andrzejewska et al. | The study of complexation between dicationic surfactants and the DNA duplex using structural and spectroscopic methods | |
CN110124047B (zh) | 一种dna纳米机器人载药体系的制备方法以及由此得到的dna纳米机器人载药体系 | |
Latxague et al. | Glycosyl-nucleolipids as new bioinspired amphiphiles | |
CN101111306B (zh) | 经脱水缩合反应可发生相转移的分子集合体及其相转移方法 | |
KR20050072620A (ko) | 수화젤레이터로 사용되는 2'-데옥시우리딘 유도체 | |
Patwa et al. | Tuning molecular interactions in lipid-oligonucleotides assemblies via locked nucleic acid (LNA)-based lipids | |
Li et al. | Contrasting topological effect of PEG-containing amphiphiles to natural lipids on stability of vesicles | |
Prasad et al. | ATP-Assisted Protocellular Membrane Formation with Ethanolamine-Based Amphiphiles | |
Hosamani et al. | Membrane protein crystallization in micelles conjugated by nucleoside base-pairing: A different concept |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20120426 |
|
A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20121009 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20121105 |
|
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20121115 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20151130 Year of fee payment: 3 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 5142295 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
S533 | Written request for registration of change of name |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313533 |
|
S533 | Written request for registration of change of name |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313533 |
|
S533 | Written request for registration of change of name |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313533 |
|
R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
RD02 | Notification of acceptance of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R3D02 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |