CH650944A5

CH650944A5 - Verfahren zur herstellung eines gefriergetrockneten gemisches von potentiellen liposomen.

Info

Publication number: CH650944A5
Application number: CH5038/78A
Authority: CH
Inventors: John Raymond Evans; Francis James Thomas Fildes; Jean Elizabeth Oliver
Original assignee: Ici Ltd
Priority date: 1977-05-10
Filing date: 1978-05-09
Publication date: 1985-08-30
Also published as: US4370349A; DE2818655A1; CH652615A5; GB1575343A; DK156765B; AU514644B2; FI63856C; DK122388A; JPS6252724B2; DE2818655C2; SE440725B; IL61475A0; FI63856B; NZ186696A; BE866697A; SE453962B; FR2390159B1; CA1114758A; SE8201351L; NO780838L

Description

Gegenstand der Erfindung ist also ein Verfahren zur Herstellung eines gefriergetrockneten Gemischs von potentiellen Liposomen, welches dadurch ausgeführt wird, dass man mindestens eine biologisch aktive Verbindung der vorstehend definierten Art und gegebenenfalls mindestens ein Hilfsmittel in einem organischen Lösungsmittel mit einem Schmelzpunkt in der Nähe der Raumtemperatur auflöst und hierauf die Lösung gefriertrocknet, um ein gefriergetrocknetes Gemisch von potentiellen Liposomen herzustellen.

Beispiele für geeignete Phospholipide sind die natürlichen Lecithine, z.B. Eilecithin oder Sojabohnenlecithin, oder synthetische Lecithine, z.B. Dimyristoyl-phosphatidyl-cholin, Dipalmityl-phosphatidyl-cholin oder Distearoyl-phosphatidyl-cholin, oder ungesättigte synthetische Lecithine, wie z.B. Dioleyl-phosphatidyl-cholin oder Dilinoelyl-phosphatidyl-cholin. Es kann entweder ein einziges Phospholipid oder ein Gemisch von Phospholipiden verwendet werden.

Wie oben bereits angedeutet, kann die biologisch aktive Verbindung irgendeine Verbindung mit einer Eigenschaft von biologischem Interesse sein. So kann die Verbindung ein Medikament, ein Protein, ein Enzym, ein Hormon, ein Vitamin oder eine Markierungsverbindung sein. Es wird darauf hingewiesen, dass das erfmdungsgemässe Verfahren sich besonders im Falle von lipidlöslichen oder lipidgebundenen biologisch aktiven Verbindungen (welche einige wasserlösliche Verbindungen umfassen, wie z.B. gewisse Proteine) eignet. Das erwähnte Verfahren ist nicht so geeignet für wasserlösliche, nicht lipidgebundene biologisch aktive Verbindungen, da in diesen Fällen nur ein verhältnismässig kleiner Anteil der Verbindung bei der Dispergierung des gefriergetrockneten Gemischs wieder in die Liposome inkorporiert wird. Aber trotzdem kann dieser Nachteil hingenommen werden, wenn ein geeigneter Überschuss der wasserlöslichen biologisch aktiven Verbindung in das gefriergetrocknete Gemisch einverleibt wird. Wenn die Anwesenheit von freier biologisch aktiver Verbindung im äusseren wässrigen Medium von Nachteil ist, dann muss bei der Herstellung von Liposomen aus einem solchen Gemisch die freie Verbindung durch eines der oben erwähnten Verfahren entfernt werden. Somit hängt die Eignung des erfmdungsgemässen Verfahrens im Falle von wasserlöslichen, nicht lipidgebundenen biologisch aktiven Verbindungen von allen relevanten Tatsachen ab, wie z.B. (1) der Natur der Aktivität der Verbindung, (2) der Wirkungsstärke der Verbindung, (3) der Menge der Verbindung, die beim erfmdungsgemässen Verfahren in das Liposompräparat einverleibt wird, und (4) der Erwünschtheit von freier Verbindung im äusseren wässrigen Medium.

Beispiele für fakultative Hilfsstoffe sind (1) Substanzen, von denen dem Fachmann auf diesem Gebiet bekannt ist, dass sie eine negative Ladung liefern, wie z. B. Ei-Phosphat-idinsäure, Dipalmitoyl-phosphatidinsäure, Dicetylphosphat oder Rinderhirngangliosid, (2) Substanzen, von denen dem Fachmann auf diesem Gebiet bekannt ist, dass sie eine positive Ladung liefern, wie z.B. Stearylamin oder Stearylamin-

acetat, und (3) Substanzen, von denen dem Fachmann auf diesem Gebiet bekannt ist, dass sie die physikalischen Eigenschaften der Lipidbischichten in den Liposomen in erwünschter Weise beeinflussen, sie beispielsweise nach Bedarf flüssiger oder fester machen, wie z.B. Cholesterin.

Wie oben bereits angedeutet, besitzen geeignete Lösungsmittel die Eigenschaft, dass sie das oben erwähnte Gemisch von Bestandteilen auflösen. Das Lösungsmittel kann aus einer oder mehreren Substanzen bestehen. Die Lösungsmittel bleiben während des Gefriertrocknungsverfahrens fest, ohne dass Aussenkühlung erforderlich ist (Aussenkühlung wird natürlich zu Beginn des Verfahrens angewandt). Die Lösungsmittel haben nämlich einen Schmelzpunkt in der Nähe von Raumtemperatur. Beispiele für besonders bevorzugte Lösungsmittel sind t-Butanol, n-Butanol, Dioxan, Essigsäure, Pyridin oder Piperidin. Gegebenenfalls können eine oder mehrere Flüssigkeiten zusätzlich vorhanden sein, welche die Auflösung der Bestandteile unterstützen, wie z. B. Wasser oder Chloroform.

Gemäss der Erfindung wird ausserdem ein Verfahren zur Herstellung eines wässrigen Liposompräparates, das mindestens eine biologisch aktive Verbindung gemäss vorstehender Definition enthält, vorgeschlagen, welches dadurch ausgeführt wird, dass man ein gefriergetrocknetes Gemisch von potentiellen Liposomen, das nach dem weiter oben beschriebenen Verfahren erhalten wurde, in einem wässrigen Medium dispergiert.

Ein geeignetes wässriges Medium ist beispielsweise destilliertes Wasser, isotonische Kochsalzlösung oder eine sterile oder nicht-sterile Pufferlösung.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert:

Beispiel 1

59,6 mg Dipalmitoyl-phosphatidyl-cholin (in der Folge mit «DPPC» abgekürzt), 6,54 mg 3H-Cortisol-21-palmitat (in der Folge mit «3H-CP» abgekürzt) und 3,81 mg Stearyl-aminacetat wurden in 3 ml umdestilliertem t-Butanol bei 60 °C aufgelöst.

Die Lösung wurde in einen 250 ml fassenden Rundkolben eingebracht und als dünner Film dadurch gefroren, dass der Kolben in ein Gefriergemisch aus Methanol und Trockeneis eingetaucht und darin geschwenkt wurde. Das Lösungsmittel wurde dann unter Vakuum entfernt, wobei ein herkömmlicher Gefriertrockner verwendet wurde. Auf diese Weise wurde ein gefriergetrocknetes Gemisch von potentiellen Liposomen in Form eines Pulvers erhalten, das bis zum Gebrauch in verschlossenen Behältern gelagert werden konnte.

10 ml destilliertes Wasser wurden dem gefriergetrockneten Pulver zugegeben, und das resultierende Gemisch wurde auf einem Wasserbad auf ungefähr 70 °C erhitzt. Leichtes Schütteln des Kolbens hatte zur Folge, dass sich das Pulver dispergierte, wobei eine milchige Suspension entstand, von der bei mikroskopischer Untersuchung festgestellt wurde, dass sie Liposome enthielt. Duplikatproben von jeweils 50(il der Suspension wurden für Szintillationszählung entnommen, um vor einem Waschen den Steroidgehalt zu bestimmen. Der Rest der Suspension wurde mit destilliertem Wasser auf ein Volumen von 25 ml verdünnt und 30 min bei 120 000 g ultrazentrifugiert. Aus dem Liposompfropfen wurde mit destilliertem Wasser eine Dispersion mit einem Volumen von 10 ml hergestellt, und Duplikatproben von jeweils 50(j.l der gewaschenen Suspension wurden für Szintillationszählung entnommen. Ein Vergleich der Zählungen vor und nach dem Waschen zeigte, dass 90% des Steroids, das im gefriergetrockneten Pulver vorhanden war, in die gewaschenen Liposome einverleibt wurden.

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Beispiel 2

49 mg DPPC und 7 mg 3H-CP wurden in 5,05 ml umdestilliertem t-Butanol bei 60 °C aufgelöst. Duplikatproben von 5 (xl wurden für Szintillationszählung entnommen, und die verbleibende Lösung wurde unmittelbar auf der Wandung eines 250 ml-Rundkolbens gefroren, indem der Kolben in ein Gefriergemisch (Methanol/Trockeneis) eingetaucht wurde. Das t-Butanol wurde dann in einem herkömmlichen Gefriertrockner entfernt. Auf diese Weise wurde ein gefriergetrocknetes Gemisch von potentiellen Liposomen erhalten. Das Gemisch wurde dann von der Kolbenwandung abgeschabt, und drei "Proben von 10,11 bzw. 12,7 mg wurden in Phiolen eingewogen. 2,5 ml destilliertes Wasser wurden in eine jede Phiole eingebracht, und die Gemische wurden auf einem Wasserbad auf 50 °C erhitzt. Das Gemisch wurde dann zur Bildung von Liposomen durch heftiges Schütteln dispergiert. Duplikatproben von jeweils 50 |il von jedem Li-posompräparat wurden für Szintillationszählung entnommen. Die Liposompräparate wurden in trockene gewogene Ultrazentrifugenröhrchem eingebracht, mit 10 ml destilliertem Wasser verdünnt und 40 min bei 4 °C mit 120 000 g ul-trazentrifugiert. Die überstehenden Flüssigkeiten wurden von den Lipidpfropfen entfernt, und zwei der drei Pfropfen wurden in einem Vakuumofen bis zu einem Gewicht entsprechend 50 Gew.-% Wassergehalt getrocknet. Der dritte Pfropfen wurde wieder in 2,5 ml Wasser suspendiert, worauf Duplikatproben von jeweils 50 nl für Szintillationszählung entnommen wurden.

Die Radioaktivitätszählungen zeigten, dass nach der Di-spergierung der drei gefriergetrockneten Proben in Wasser 86+4% des ursprünglichen Steroids in den Dispersionen vorlagen. Der Radioaktivitätsverlust hatte seinen Grund im Verlust eines kleinen Anteils des Gemischs von potentiellen Liposomen während der Gefriertrocknung. Nachdem die dritte Probe gewaschen worden war, blieben 73% des gesamten Steroids mit Liposomen assoziiert.

Duplikatproben von 6 mg beider gefriergetrockneter Li-posompfropfen wurden dann in Probenhalter für Differenti-alabtastkalorimetrie (in der Folge mit «DSC» abgekürzt) eingewogen. Die DSC-Spektren der Gemische zwischen 0 und 50 °C wurden auf einem Perkin Elmer-Differentialab-tastkalorimeter ermittelt. Vergleichsproben für DSC wurden ebenfalls hergestellt, indem die gleichen Gewichte an DPPC und 3H-CP wie im ursprünglichen Gemisch gemischt wurden und hierauf 50 Gew.-% Wasser eingemischt wurden. Sie dienten als «liposomfreie» Vergleichsgemische. Die DSCSpektren dieser Vergleichsgemische wurden wie oben beschrieben gemessen.

Das DSC-Spektrum von DPPC alleine besteht aus einer Hauptübergangsendotherme bei 41 °C und einer Vorüber-gangsendotherme bei 35 °C. Die Breite einer Linie in halber

Spitzenhöhe der Hauptendotherme beträgt annähernd 3 °C. Die oben beschriebenen Experimente zeigten, dass in den li-posomfreien Vergleichsgemischen beide Spitzen in den DSCSpektren der Gemische zu beobachten waren und die Linienbreite bei ungefähr 3 °C blieb. Dies zeigt vermutlich, dass in einfachen Gemischen (d.h. liposomfreien Gemischen) das Steroid das DSC-Spektrum des Lipids nicht verändert. Die Spektren der Duplikatliposompräparate zeigten nur einen Übergang (der Hauptendotherme), und die durchschnittliche Linienbreite dieser Präparate war 5,8 °C, was eine beträchtliche Verbreiterung im Vergleich zu den Vergleichsgemischen bedeutet. Diese Verbreiterang ergibt sich aus der molekularen Wechselwirkung des Lipids und des Steroids in den Liposomen, die durch das obige Verfahren hergestellt worden sind. Deshalb besteht kein Zweifel, dass die durch das obige Verfahren hergestellten Liposome das Steroid in den Liposomen enthielten.

Beispiel 3

Alle in diesem Beispiel beschriebenen Massnahmen wurden in einem sterilen Raum (sterilisiert mit Formaldehyd und dann gespült mit steriler Luft) ausgeführt, wobei die üblichen aseptischen Vorsichtsmassnahmen angewendet wurden. Der Gefriertrockner (Edwards Speedivac Centrifugai Freeze-dryer, Model 5PS) wurde mit Formaldehyd sterilisiert und dann mit steriler Luft gespült. Die weiteren verwendeten Apparate wurden entweder durch trockene Wärme oder in einem Autoklaven sterilisiert.

697,2 mg DPPC, 99,6 mg Dipalmitoyl-phosphatidinsäu-re und 99,6 mg Cortisol-21-palmitat wurden bei 60 °C in 60 ml umdestilliertem t-Butanol aufgelöst. Die heisse Lösung wurde unmittelbar darauf sterilisiert, indem sie durch ein 0,22|i-«MF-Millipore»-Filter (Millipore Corporation, Bedford, MA, USA), das auf der Temperatur von 50 °C gehalten worden war, hindurchgeführt wurde. Die heisse Lösung wurde 2mal auf diese Weise hindurchgeführt. Proben von 2 ml der sterilen Lösung wurden in 5 ml fassende sterile Multidosis-Phiolen eingebracht. Der Inhalt dieser Phiolen wurde unter Verwendung des oben erwähnten Gefriertrockners gefriergetrocknet, und jede Phiole wurde dann unter Verwendung eines sterilen Gummiverschlusses und einer metallenen Multidosis-Kappe verschlossen. Auf diese Weise wurden verschlossene Proben aus einem sterilen gefriergetrockneten Gemisch von potentiellen Liposomen erhalten.

Eine sterile 0,9%ige (G/V) wässrige Lösung von Natriumchlorid wurde in eine der oben erwähnten verschlossenen Phiolen eingeführt, worauf diese dann auf einem Wasserbad auf 50 °C erhitzt und heftig geschüttelt wurde. Auf diese Weise wurde ein steriles Liposompräparat erhalten, das sich für Verabreichung durch Injektion eignete.

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PATENTANSPRÜCHE

1. Verfahren zur Herstellung eines gefriergetrockneten Gemisches von potentiellen Liposomen, dadurch gekennzeichnet, dass man mindestens ein Phospholipid und mindestens eine biologisch aktive Verbindung in einem organischen Lösungsmittel mit einem Schmelzpunkt in der Nähe der Raumtemperatur auflöst und hierauf die so erhaltene Lösung gefriertrocknet, um ein gefriergetrocknetes Gemisch von potentiellen Liposomen herzustellen.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man auch mindestens einen Hil fsstoff in dem organischen Lösungsmittel auflöst.
3. Gefriergetrocknetes Gemisch von potentiellen Liposomen, hergestellt nach dem Verfahren nach Anspruch 1.
4. Gefriergetrocknetes Gemisch nach Anspruch 3, hergestellt nach dem Verfahren nach Anspruch 2.
5. Verfahren zur Herstellung eines wässrigen Liposomen-präparates, das mindestens eine biologisch aktive Verbindung enthält, dadurch gekennzeichnet, dass man ein gefriergetrocknetes Gemisch nach Anspruch 3 in einem wässrigen Medium dispergiert.
6. Verfahren nach Anspruch 5 zur Herstellung eines wässrigen Liposomenpräparates, das mindestens eine biologisch aktive Verbindung und mindestens einen Hilfsstoff enthält, dadurch gekennzeichnet, dass man ein gefriergetrocknetes Gemisch nach Anspruch 4 in einem wässrigen Medium dispergiert.

Liposome sind in der Literatur vielfach beschrieben, und ihre Struktur ist allgemein bekannt. Üblicherweise besitzen sie eine zwiebelartige multilamellare Struktur aus einer Vielzahl von Phospholipid-Bischichten, die voneinander durch ein wässriges Material getrennt seind. Eine andere bekannte Liposomtype besteht aus einer einzigen Phospholipid-Bischicht, die ein wässriges Material einschliesst; diese unila-mellaren Formen werden manchmal als «Vesikel» bezeichnet. In den letzten Jahren ergab sich ein wachsendes Interesse an der Verwendung von Liposomen als Träger für Verbindungen, die wegen der einen oder anderen biologischen Eigenschaft von Interesse sind, wie z.B. Medikamente, Proteine, Enzyme, Hormone, Vitamine und Markierungsverbindungen. Es wird daraufhingewiesen, dass für diese breite Gruppe von biologisch interessierenden Verbindungen, die Medikamente (menschliche und Veterinäre) umfasst, aber nicht darauf beschränkt ist, in dieser Beschreibung die Bezeichnung «biologisch aktive Verbindungen» verwendet wird.

Die Einkapselung von biologisch aktiven Verbindungen in Liposome kann auf verschiedenen Wegen erreicht werden. Bei dem Verfahren, das am üblichsten ist, wird ein Phospho-lipidfilm (mit oder ohne einem geladenen Lipid) durch Eindampfen einer Lösung in einem organischen Lösungsmittel, wie z.B. Chloroform, hergestellt und anschliessend in einem geeigneten wässrigen Medium dispergiert. Im Falle von li-pidlöslichen biologisch aktiven Verbindungen, d.s. also solche, die sich mit den Lipidschichten und nicht mit der wässrigen Phase der Liposome assoziieren, wird die Verbindung üblicherweise als Film zusammen mit einem Phospholipid unter Verwendung eines üblichen organischen Lösungsmittels gegossen. Im Falle von wasserlöslichen biologisch aktiven Verbindungen wird die Verbindung üblicherweise in Liposome durch Dispergieren eines gegossenen Phospholipid-films mit einer wässrigen Lösung der Verbindung eingekapselt. Die eingekapselte Verbindung wird dann von der freien

Verbindung durch Zentrifugieren, Chromatografie oder ein anderes geeignetes Verfahren abgetrennt. In dem Fall, dass die biologisch aktiven Verbindungen, welche sich mit der Li-pidphase von Liposomen assoziieren, in einer Menge vorliegen, die unter der maximalen Lipidlöslichkeit oder unter der maximalen Menge, die durch das Lipid gebunden werden kann, liegt, enthalten Liposome, die durch das obige Verfahren hergestellt worden sind, üblicherweise den grössten Teil der Verbindung in den Lipid-Bischichten gebunden, weshalb die Abtrennung der freien Verbindung nicht so kristisch ist wie im Falle von wasserlöslichen biologisch aktiven Verbindungen, die sich nicht an das Lipid binden.

Das oben erwähnte Verfahren eignet sich nicht für die Anwendung im technischen Massstab. Ausserdem besitzen wässrige Liposomdispersionen nur eine beschränkte Stabilität, weshalb ihre Lagerfähigkeit beschränkt ist. Darüber hinaus können Liposome Aggregate bilden und als Sediment ausfallen. Zwar können solche Sedimente üblicherweise wieder dispergiert werden, jedoch kann die Struktur und die Grössenverteilung der ursprünglichen Dispersion verändert werden. Die Aggregation und Sedimentation kann durch die Einverleibung von geladenen Lipiden in die Liposome verringert werden, aber dies garantiert keine zufriedenstellende Lagerfahigkeit. Der Verlust der biologisch aktiven Verbindung aus den Liposomen in das äussere wässrige Medium ist ein weiterer Faktor, der die Anwendungsmöglichkeit dieser Präparate als praktische Dosierungsformen beschränkt. Dies gilt insbesondere für niedrigmolekulare wasserlösliche Verbindungen, jedoch können auch lipidlösliche Verbindungen teilweise in das äussere wässrige Medium gehen, bis ein Gleichgewicht erreicht ist. Wenn der Gehalt an Verbindung klein ist und/oder wenn das Volumen des äusseren wässrigen Mediums gross ist, dann kann dieser Verlust einen beträchtlichen Anteil des Gesamtgehalts der biologisch aktiven Verbindung in den Liposomen ausmachen.

Alle diese Faktoren beschränken die Verwendung von Liposomen als praktische Träger für biologisch aktive Verbindungen, insbesondere in der medikamentösen Therapie. Eine Lösung könnte darin liegen, den Film aus Lipid und biologisch aktiver Verbindung herzustellen und zu lagern und dann bei Bedarf erst kurz vor der Anwendung unter Bildung von Liposomen zu dispergieren. Jedoch macht die Herstellung und Lagerung eines Films in einer Einheitsdosis ernsthafte praktische Schwierigkeiten, weshalb diese Idee keine praktische Lösung der oben aufgeführten Probleme liefert. Die vorliegende Erfindung befasst sich nunmehr mit einem Verfahren, das eine praktische Lösung ergibt. Kurz gesagt, das Verfahren besteht darin, dass man (1) die nötigen Substanzen in einem geeigneten Lösungsmittel auflöst, die Lösung einer Gefriertrocknung unterwirft, das gefriergetrocknete Gemisch lagert und bei Bedarf (2) in einem geeigneten wässrigen Medium, z.B. isotonischer Kochsalzlösung, dispergiert, um ein wässriges Liposompräparat herzustellen.

Jedes geeignete herkömmliche Gefriertrocknungsverfahren kann bei der Ausführung des erfindungsgemässen Verfahrens angewandt werden. Der Kürze wegen wird in der Folge der Ausdruck «gefriergetrocknete Gemische von potentiellen Liposomen» für die gefriergetrockneten Gemische verwendet, die gemäss der Erfindung erhältlich sind und die bei Dispergierung in einem geeigneten wässrigen Medium die gewünschten Liposompräparate liefern. Unerwarteterweise wurde festgestellt, dass Liposome gebildet werden, die denjenigen ähnlich sind, die durch das bekannte Filmdisper-gierungsverfahren erhalten werden, wenn man das gefriergetrocknete Gemisch von potentiellen Liposomen wieder in einem geeigneten wässrigen Medium dispergiert. Im Falle einer lipidlöslichen oder lipidgebundenen biologisch aktiven Verbindung wird diese Verbindung weitgehend wieder in die

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Liposome inkorporiert. Andererseits ist das erfindungsge-mässe Verfahren, wie weiter unten erörtert, nicht so für solche wasserlösliche biologisch aktive Verbindungen geeignet, die sich nicht an das Lipid binden. Die gefriergetrockneten Gemische dispergieren sich leicht, wenn sie mit einem wässrigen Medium geschüttelt werden, und es scheint, dass sie zu Liposompräparaten führen, die eine engere Grössenvertei-lung aufweisen als entsprechende Präparate, die durch Dispergieren eines gegossenen Films erhalten werden. Dies kann hinsichtlich der Reproduzierbarkeit des Effekts der Li-posompräparate von Vorteil sein.