SE454049B - Sett att framstella en frystorkad potentiell liposomblandning - Google Patents

Description

HO 454 049 » delar, dvs. sådana som förekommer tillsammans med lipidskikten snarare än med den vattenhaltiga liposomfasen, formas föreningen vanligen som en film tillsammans med en fosfolipid med användning av ett vanligt organiskt lösningsmedel. I fråga om vattenlöslíga biologiskt aktiva föreningar inkapslas föreningen vanligen i li- posomerna genom att man dispergerar en formad fosfolipidfílm med en vattenlösning av föreningen. Den inkapslade föreningen av- skiljes därefter från den fria föreningen genom centrifugering, kromatografi eller någon annan lämplig metod. Beträffande bio- logiskt aktiva beståndsdelar, som förekommer tillsammans med li- posomernas lipidfas, innehåller liposomer, som framställts enligt ovanstående förfarande, vanligtvis största delen av föreningen bunden i de lipida dubbelskikten, och avskiljning av den fria föreningen är inte så kritisk som vid förekomsten av vattenlös- liga biologiskt aktiva beståndsdelar, som icke bindas till lipi- den.

Det ovan nämnda förfaríngssättet lämpar sig inte att användas i stor skala. Dessutom har vattenhaltiga liposomdispersioner en- dast begränsad stabilitet och lagringstiden är därför begränsad.

Vidare kan liposomerna bilda aggregat och falla ut som sediment. Även om sedimenten vanligen kan dispergeras på nytt, så kan den ursprungliga dispersionens struktur och storleksfördelning för- ändras. Man kan reducera aggregation och sedimentering genom att införa laddade lipider i liposomerna, men detta utgör inte någon garanti för tillfredsställande lagringstid. Förlust av den biologiskt aktiva föreningen från liposomerna till det om- givande vattenhaltiga mediet utgör en annan faktor, som begränsar möjligheten för preparaten som praktisk doseringsform. Detta är särskilt allvarligt för vattenlöslíga föreningar med låg molekyl- vikt, men även lipidlösliga föreningar kan fördelas till det om- givande vattenhaltiga mediet tills ett jämviktsförhållande upp- nåtts. givande vattenhaltiga mediet föreligger i stor mängd kan förlus- Om föreningen föreligger i ringa mängd och/eller det om- ten utgöra en betydande proportion av det totala innehållet av den biologiskt aktiva föreningen i liposomerna.

Samtliga dessa faktorer begränsar användningen av liposomer som praktiska bärare av biologiskt aktiva föreningar, särskilt inom läkemedelsterapin. En lösning kan vara att framställa och lag- NO _ lipider. 454 049 ' \,fl| ra filmen med lípíd och biologiskt aktiv förening och därefter dispergera filmen för bildning av liposomer allt efter behov omedelbart före användningen. Framställning av film i enhets- doser och lagring uppvisar emellertid stora praktiska svårighe- ter och detta förslag utgör inte någon praktisk lösning av de ovan angivna problemen.

Föreliggande uppfinning hänför sig till ett förfarande, som fak- tiskt utgör en praktisk lösning. Förfarandet kännetecknas i korthet av att man 1) framställer en vattenhaltig liposomkompo- sition på känt sätt och därefter frystorkar kompositionen, var- efter den bildade frystorkade blandningen lagras och vid behov 2) díspergeras i ett lämpligt vattenhaltigt medium för att åstad- komma ett vattenhaltigt liposompreparat.

Man kan använda vilken frystorkningsmetod som helst vid utföran- det av uppfinningen. Som förkortning kommer nedan uttrycket "frystorkade, potentiella liposomblandningar" att användas för de frystorkade blandningar (liposomföregångare) som man framstäl- ler enligt föreliggande uppfinning och som, då de dispergeras i ett lämpligt vattenhaltigt medium, ger de önskade liposombered- ningarna. Då en frystorkad blandning av potentiella liposomer enligt uppfinningen dispergeras på nytt i ett lämpligt vatten- haltigt medium, t.ex. en isotonisk saltlösning, bildas oväntat liposomer, som liknar sådana som framställts medelst det kända filmdispersionsförfarandet. Beträffande en lipidlöslig eller lipidbunden biologiskt aktiv förening inkorporeras denna åter i liposomerna i stor omfattning. Å andra sidan, såsom förklaras nedan, är sättet enligt uppfinningen inte så lämpligt för de vattenlösliga biologiskt aktiva föreningar, som icke bindes till De frystorkade blandningarna dispergerar lätt, då de omskakas med ett vattenhaltigt medium och det tycks, som om de leder till liposomberedningar med en snävare storleksfördelning än motsvarande preparat, som framställts genom dispergering av en formad film. Detta kan vara fördelaktigt med tanke på repro- ducerbarheten av liposompreparatens effekt.

Enligt uppfinningen åstadkommas ett sätt att framställa en frys- torkad potentiell liposomblandning, kännetecknat av att man på vilket som helst känt sätt framställer en vattenhaltig liposom- H0 . egenskap. 454 049 komposition innehållande vatten, minst en liposombildande amfi- patisk lipid, minst en biologiskt aktiv förening och eventuellt minst ett hjälpmedel och därefter frystorkar den vattenhaltiga liposomkompositionen för framställning av en frystorkad, poten- tiell liposomblandning.

Denna vattenhaltiga liposomkomposition kan exempelvis framställas medelst ovan nämnda filmdispersionsförfarande.

Vilken känd amfípatisk lipid som helst, som man vet är lämplig för framställning av liposomer på känt sätt kan användas vid ut- Sålunda kan en mångfald lipider användas enligt uppfinningen, men man föredrager sådana, övandet av sättet enligt uppfinningen. som är icke-immunogena och biologiskt nedbrytbara. Exempel på lämpliga lipider utgör fosfolipiderna, t.ex. naturliga lecitiner, som lecitin från ägg eller från sojabönor, eller syntetiska leci- tiner, t.ex. mättade syntetiska lecitiner, som dímyristoy1-fos- fatidylkolin, dipalmitoyl-fosfatidylkolin eller distearoyl-fosfa- tidylkolin, eller omättade syntetiska lecítiner, som exempelvis díoleyl-fosfatidylkolin eller dilinoleyl-fosfatidylkolin.' Man kan använda antingen en enstaka fosfolipid eller en blandning av fosfolipider.

Som ovan nämnts kan den biologiskt aktiva föreningen utgöras av vilken förening som helst, som uppvisar en biologiskt intressant Sålunda kan föreningen utgöras av ett läkemedel, pro- tein, enzym, hormon, vitamin eller en märkförening. Det inses härvid att förfarandet enligt uppfinningen är särskilt värde- fullt med avseende på lipidlösliga eller lipidbundna biologiskt aktiva föreningar (som inkluderar vissa vattenlösliga föreningar, t.ex. vissa proteiner). Förfarandet är icke så lämpligt för vattenlösliga, icke lipidbundna biologiskt aktiva föreningar, eftersom i dylika fall endast en relativt ringa fraktion av föreningen på nytt inkorporeras i liposomerna vid dispergering av den frystorkade blandningen. Icke desto mindre är denna olä- genhet godtagbar under förutsättning att ett lämpligt överskott av den vattenlösliga biologiskt aktiva föreningen inkorporeras i den frystorkade blandningen. Då liposomer framställes från en dylik blandning måste den fria föreningen, om närvaro av en fri biologiskt aktiv förening i det yttre vattenhaltiga mediet är ........",,.,..,.,..,-.... . _. ....,, -- -~.-...._.... e n. n. ......- ...han-ung HO _. 454 049 till nacel, avlägsnas genom någon av de ovan angivna metoderna.

Om sättet enligt uppfinningen är lämpligt med avseende på en vat- tenlöslig, icke lipidbunden, biologiskt aktiv förening beror så- lunda på samtliga relevanta omständigheter, inkluderande 1) be- skaffenheten av föreningens verkan, 2) föreningens styrka, 3) den mängd av föreningen, som inkorporerats i liposombered- ningen och U) önskvärdheten att den fria föreningen förekommer i det yttre vattenhaltiga mediet eller ej.

Eventuella hjälpmedel inkluderar ett ämne, som åstadkommer en negativ laddning, t.ex. fosfatidsyra från ägg, dipalmitoyl-fos- fatidsyra, dicetylfosfat eller gangliosid från hjärna av nöt- kreatur, eller ett ämne, som åstadkommer positiv laddning, t.ex. stearylamin eller stearylaminacetat, eller ett ämne, som påver- kar de fysikaliska egenskaperna i de lipida dubbelskikten i lipo- somerna på ett önskvärt sätt genom att t.ex. överföra dem till en mer flytande eller mer fast form allt efter önskan. t.ex. kolesterol.

Som lösningsmedel vid framställning av den vattennaltiga lipo- somberedningen kan man använda ett eller flera ämnen. Föredrag- na lösningsmedel förblir i fast form under frystorkningsförfa- randet. Särskilt föredragna föreningar har en smältpunkt, som ligger nära rumstemperatur, t.ex. t-butanol, n-butanol, dioxan, ättiksyra, pyridin eller piperidin. Eventuellt kan dessutom även en eller flera andra vätskor, som medverkar till att be- ståndsdelarna löses, t.ex. vatten eller kloroform, vara närva- rande.

Exempel på lämpliga vattenhaltiga medier är destillerat vatten, isotonisk saltlösning eller en steril eller icke steril buf- fertlösning.

Användningen av de medelst sättet enligt uppfinningen framställ- da frystorkade, potentiella liposomblandningarna för framställ- ning av vattenhaltiga liposomberedningar beskrives i den samti- diga svenska patentansökan' Uppfinníngen skall i det följande belysas närmare med hjälp av följande exempel utan att dock vara begränsad till dessa. 50 H0 454 049 6 Exempel 1 Lecitin från ägg (16,1 mg), fosfatinsyra från ägg (2 mg) och 3H-kortísol-21-palmitat (härefter benämnt3H-CP, 1,66 mg) löstes i kloroform (5 ml), varefter lösningen hälldes i en 250 ml rund- kolv. Lösningsmedlet avlägsnades vid rumstemperatur genom rota- tion av kolven och inblåsning av en ström av torrt kväve i den.

Härvid erhöll man en lipidfilm, som därefter dispergerade i rumstemperatur i vatten (5 ml), varvid man erhöll ett liposompre- parat. Dubbla prover (50 pl) togs för scintillationsräkning. återstoden av liposomberedningen späddes till 25 ml med destille- rat vatten i ett ultracentrifugrör och ultracentrifugerades vid 120 000 g 30 minuter. liposomproppen, varefter man dispergerade proppen i destillerat vatten (5 ml). Två prover (50 pl) togs från denna dispersion, och inkorporeringen av steroider bestämdes genom scintillations- Den överliggande vätskan avlägsnades från räkning. Återstoden av liposomdispersionen frystes ned med en blandning av metanol och koldioxid i fast form, varefter lös- ningsmedlet avlägsnades med en kommersiell frystorkningsanord- ning. Härvid erhöll man en frystorkad, potentiell liposombland- ning.

Den frystorkade blandningen lagrades 5 dagar, varefter man till- satte 0,9 %-ig (vikt/volym) saltlösning (5 ml). Liposomer bil- dades då man försiktigt skakade blandningen i en kolv vid rums- temperatur. Undersökning i mikroskop bekräftade närvaron av liposomer. Två dagar senare tvättades liposomerna två gånger med 0,9 %-ig (vikt/volym) saltlösning på samma sätt som ovan, men med saltlösning i stället för vatten. Liposomernas innehåll av steroider fastställdes genom scintillationsräkning. Vid jäm- förelse av dispersionernas radioaktivitet före och efter frystork- ningen framgick, att 72 % av steroiden i det tvättade preparatet före frystorkningen kvarblev i de tvättade liposomerna, som bil- dades efter frystorkningen.

Exempel 2 Dipalmitoyl-fosfatidylkolin (härefter benämnt DPPC, 29,8 mg) och BH-CP (5,52 mg) löstes i kloroform (5 ml) och anbringades som en tunn film på väggarna av en 250 ml rundkolv genom avdunstning av lösningsmedlet vid rumstemperatur med en ström torrt kväve. Des- tillerat vatten (10 ml) sattes därefter till kolven, varefter blandningen uppvärmdes till 7000 på ett Vattenbad_ Liposomer bil_ HO 7 454 049 dades genom att man skakade om den varma blandningen på en bänk- Två prover (50 pl) av den bildade disper- sionen uttogs för scintillationsräkning. Återstoden av disper- sionen tvättades två gånger genom utspädning till 25 ml med destillerat vatten och ultracentrifugering vid 120 000 g under -vibrationsblandare. minuter. Den tvättade liposomproppen dispergerades på nytt i destillerat vatten (10 ml), varefter tvâ prover (50 pl) uttogs för scintillationsräkning. Denna dispersion (5 ml) frystes ned i en blandning av metanol och koldioxid i fast form, varefter lösningsmedlet avlägsnades i vakuum med en kommersiell frystork- ningsanordning. Härvid erhöll man en frystorkad, potentiell liposomblandning, som lagrades tills man behövde den.

EEELBELL - Lecitin från ägg (15 mg), kolesterol (2,09 mg) och dicetylfosfat (1,55 mg) löstes i kloroform (5 ml) och anbríngades som en tunn film på väggarna av ett provrör, 1251-angiotensin II (0,1 mg) löst i 3,3 millimolar fosfatbuffert (pH T,U, 1 ml) sattes till provröret. Lipiden dispergerades i det vattenhaltiga mediet med en bänk-vibrationsblandare för bildning av liposomer. Lipo- somdispersionen tvättades två gånger genom att man spådde ut den till 26 ml med 3,3 millimolar fosfatbuffertlösning (pH 7,U) och därefter tvättade liposomproppen dispergerades på nytt i 3,3 millimolar fosfatbuffertlösning (pH 7,fl, 5 ml). H ml av liposomdispersionen infördes i ett provrör, frystes med en blandning av metanol och Man erhöll härvid en ultracentrifugerade den vid 120 000 g 1 timme. Den koldioxid i fast form och frystorkades. frystorkad, potentiell liposomblandning.

Den i detta exempel och i följande exempel H använda 3,3 millime- lar fosfatbuffertlösningen (pH 7,U) framställdes genom att man löste kaliumdivätefosfat ( 0,895 g) och dinatriumvätefosfatdi- hydrat (U,765 g) i destillerat vatten och därefter spådde lös- ningen till 1 liter med destillerat vatten. §xempel_fl Lecitin från ägg (15 mg), kolesterol (2,09 mg) och dicetylfosfat (1,55 mg) löstes i kloroform (5 ml) och anbringades i en tunn film på väggen av ett provrör. BH-Inulin (5 mg) löst i 3,3 millimolar fosfatbuffertlösning (pH 7,4, 1 ml) sattes till prov- röret. Lipiden dispergerades i inulinlösning med en bänk-vib- 454 049 rationsblandare för bildning av liposomer. Liposomdispersionen tvättades två gånger genom utspädning till 26 ml med 3,3 milli- molar fosfatbuffertlösning (pl-I 7,14) följt av ultracentrifugering vid 120 000 g 1 timme. Den tvättade líposomproppen dispergera- des på nytt i 3,3 millimolar fosfatbuffertlösning,(pH 7,H, 2,1 ml). 2 ml av liposomdispersionen frystes (metanol-fast koldi- oxid-blandning) och frystorkades i ett provrör. Man erhöll här- vid en frystorkad, potentiell liposomblandning.

Claims (7)

10 15 20 25 30 35 454 049 Patentkrav

1. Sätt att framställa en frystorkad, potentiell liposombland- ning, k ä n n e t e c k n a t av att man på vilket som helst känt sätt framställer en vattenhaltig liposomkomposition inne- hållande vatten, minst en liposombildande amfipatisk lipid, minst en biologiskt aktiv förening och eventuellt minst ett hjälpmedel, och därefter frystorkar den vattenhaltiga liposom- kompositionen för framställning av en frystorkad, potentiell liposomblandning.

2. Sätt enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a t av att den vat- tenhaltiga liposomkompositionen framställes genom filmdisper- sionsmetoden.

3. Sätt enligt krav 1 eller 2, k ä n n e t e c k n a t av att lipiden utgöres av en fosfolipid.

4. U. Sätt enligt krav 3, k ä n n e t e c k n a t av att fosfo- lipiden är ett naturligt eller syntetiskt lecitin.

5. Sätt enligt något eller några av kraven 1-H, k ä n n e - t e c k n a t av att den biologiskt aktiva föreningen utgöres av en lipid-löslig eller lipid-bunden förening.

6. Sätt enligt något eller några av kraven 1-5, k ä n n e - t e c k n a t av att den biologiskt aktiva föreningen är ett läkemedel.

7. Sätt enligt något eller några av kraven 1-6, k ä n n e ~ t e c k n a t av att man använder ett hjälpmedel, som utgöres av antingen ett ämne som åstadkommer en negativ laddning eller ett ämne som åstadkommer en positiv laddning. B. Sätt enligt något eller några av kraven 1-7, k ä n n e - t e c k n a t av att man använder kolesterol som hjälpmedel.