FI79245B - Foerfarande foer framstaellning av unilammellara liposomer. - Google Patents

Description

79245

Menetelmä unilamellaaristen liposomien valmistamiseksi -Förfarande för framställning av unilammellara liposomer Tämän keksinnön kohteena on menetelmä unilamellaaristen liposomien valmistamiseksi vesipitoisessa faasissa.

Liposomeja on kuvattu kirjallisuudessa lukuisissa julkaisuissa. Niiden rakenne ja käyttö on monien tutkimusten kohteena. Tehdään ero unilamellaaristen liposomien, joissa on lipidien muodostama kaksoiskerros, ja multilamellaarisien liposomien välillä, joissa on useita lipidien muodostamia sipulimaisesti järjestettyjä kaksoiskerroksia.

Unilamellaarisila liposomeilla on kuulamainen kuori ja niiden läpimitta on esimerkiksi noin 200 - 50 000 Ä, mieluimmin noin 200 - 30 000 Ä. Kuulamainen kuori muodostuu lipidi-komponenttien, esim. amfipaattisten lipidien, esim. fosfoli-pidien, esim. fosfatidihapon, lesitiinin tai kefaliinin, ja mahdollisesti neutraalien lipidien esim. kolesterolin kak-soiskerroksesta. Tämä kaksoiskerros sulkee sisäänsä sisätilan, joka sisältää vesifaasin. Unilamellaarisia liposomeja kutsutaan myös "vesikkeleiksi".

Liposomien terapeuttinen käyttö erilaisten tehoaineiden kantaja-aineina on suuren mielenkiinnon kohteena. Niinpä on liposomeja ehdotettu käytettäviksi proteiinien, esim. vasta-aineiden tai entsyymien, hormoonien, vitamiinien tai geenien kantajina tai analyyttisiin tarkoituksiin, merkittyjen yhdisteiden kantajiksi. Esimerkkinä mainittakoon US-patentti-julkaisu 3,993,754, jonka kohteena on kemoterapeuttinen menetelmä kasvainsolujen käsittelemiseksi käyttäen liposomeja kantaj ina.

Kyseinen tehoaine kapseloidaan joko liposomien valmistuksen aikana tai jälkeenpäin diffuusiolla. Liposomien valmistus ja tehoaineen kapselointi voi tapahtua eri tavalla ja on kuvattu kokooma-artikkelissa Kaye, St. B., Cancer Treatment Reviews (1981) 8, 27-50. Muita menetelmiä liposomien valmistamiseksi tehoaineiden kapselointia varten on kuvattu 2 79245 julkaisussa Barenholz et ai., Biochemistry, Voi. 16, No. 12, 2806-2810, sekä DE-hakemusjulkaisuissa (DOS) 28 19 855, 29 02 672, 25 32 317 ja 28 42 608, US-patenttijulkaisuissa 4,053,585 ja eurooppalaisessa patenttihakemuksessa 36 676.

Lipidikomponentit, esim. fosfolipidit, esim. fosfatidi-happo, lesitiini tai kefaliini, ja mahdollisesti neutraalit lipidit, esim. kolesteroli, liuotetaan orgaaniseen liuotti-meen, esim. kloroformiin tai bentseeniin. Haihduttamisen jälkeen jää jäljelle ko. lipidikomponentin homogeeninen kerros, esim. kalvokerros. Sen jälkeen lipidikomponentit dis-pergoidaan vesipitoiseen faasiin, joka sisältää kyseistä tehoainetta, esim. ravistellen. Käsittelemällä sitten ultraäänellä muodostuu unilamellaarisia liposomeja, jotka kapseloivat sisäänsä tehoaineen.

Useiden aikaisemmin tunnettujen menetelmien mukaan saadaan vesipitoisia faaseja sekä unilamellaaristen liposomien seosten että myös multilamellaaristen liposomien kanssa, jolloin näiden liposomien rakenne ja koko on sattumanvarainen ja tuskin lainkaan säädettävissä, ja voi lisäksi vaihdella huomattavasti. Vesipitoisia faaseja, joissa on pääasiassa unilamellaarisia liposomeja, saadaan toistaiseksi vain käyttäen laiteteknisesti kalliita ja työläitä valmistusmenetelmiä, esim. ultraäänikäsittelyä, dialyysiä tai geelisuodatus-ta.

Esillä olevan keksinnön menetelmien mukaisesti voidaan valmistaa yksinkertaisella tavalla vesipitoisia faaseja, joissa on korkea - melkein kvantitatiivinen osamäärä unilamellaarisia liposomeja, jotka voivat sisältää pieniä unilamellaarisia liposomeja (KUL) joiden läpimitta on noin 200 -600 Ä, ja suuria unilamellaarisia liposomeja (GUL), joiden läpimitta on noin 600 - 3000 Ä. Keksinnön mukaisen menetelmän eräs erityinen etu on siinä, että saadaan suhteellisen yhtenäisen koon omaavia KUL- ja GUL-liposomeja ja KUL'in ja GUL'in määräsuhdetta disperssissä faasissa voidaan vaihdella. Sopivilla erotusmenetelmillä, esim. geelisuodatuksella tai ultrasuodatuskennolla, voidaan pienet unilamellaariset li 3 79245 liposomit erottaa suurista.

Tämä keksintö koskee menetelmää unilamellaaristen lipo-somien valmistamiseksi, joka on tunnettu siitä, että a) lipidi, jonka kaava on R, 0 R1"CH2-C-CH2_0_P-0R4 (A)

r2 OH

jossa Rj on vety, alkyyli, alkoksi tai asyylioksi, joissa on kussakin 10-20 C-atomia, R2 on vety, hydroksi tai C-L-C^-al-kyyli, R3 on vety tai C1-C4-alkyyli ja R4 on vety, Cj^-^-al-kyyli, C^-C^-alkyyli, joka on substituoitu karboksilla ja aminolla, jolloin aminoryhmä on a-asemassa karboksiryhmään nähden, CQ^-04-alkyyli, joka on substituoitu halogeenilla tai C2-C4-alkyyli, joka on substituoitu vapailla tai eetteröidyil-lä hydroksiryhmillä, jolloin kaksi eetteröityä hydroksiryh-mää voivat olla sitoutuneita keskenään bivalenttisella hii-livetytähteellä, tai 5-12 hiiliatomia sisältävä hiilihydraat-titähde, ja sopivan kaavan A mukaisen lisälipidin, jossa R1 ja r2 ovat asyylioksi, jossa on 10-20 C-atomia, R3 on vety ja R4 on tri-C1-C4-alkyyliammoniumilla substituoitu C2-C4-alkyyli tai 2-aminoetyyli, tai kaavan A mukaisen lipidin, jossa Rj ja r2 toisistaan riippumatta ovat alkyyli, alkoksi tai asyylioksi, joissa on 10-20 hiiliatomia, ja R3 ja R4 ovat vety ja mahdollisesti yhden mainituista kaavan A mukaisista lisälipideistä homogeeninen kerros dispergoidaan vesipitoiseen faasiin, jonka pH-arvo on suurempi kuin 9, tai b) kaavan A mukaisen lipidin, jossa R! on vety, alkyyli, alkoksi tai asyylioksi, joissa on kussakin 10-20 C-atomia, ja R2 on vety, hydroksi, tai C1-C4-alkyyli, R3 on vety ja R4 ammonioryhmällä substituoitu C2-C4-alkyyli ja mahdollisesti kohdassa a) mainitun kaavan A mukaisen lisälipidin tai kaavan A mukaisen lipidin, jossa Rj^ ja R2 ovat asyylioksi, jossa on 10-20 C-atomia, R3 on vety ja R4 on ammonio-C2-C4-al-kyyliammonioryhmällä substituoitu C2-C4-alkyyli, ja kohdassa 4 79245 a) mainitun, kaavan A mukaisen lisälipidin homogeeninen kerros dispergoidaan vesipitoiseen faasiin, jonka pH-arvo on alle n. 1 ja neutraloidaan vesipitoinen faasi ja haluttaessa rikastetaan saadut unilamellaariset liposomit ja/tai erotetaan ne.

Edellä ja jäljempänä käytetyt yleissanonnat tarkoittavat tämän keksinnön puitteissa mieluimmin seuraavaa:

Menetelmä a

Alkyyli R2 tai R3, jossa on 1-4 C-atomia, on esim. edullisesti metyyli, lisäksi etyyli, n-propyyli tai n-butyyli.

Alkyyli Rx tai R2 on mieluimmin n-dekyyli, n-undekyyli, n-dodekyyli (lauryyli), n-tridekyyli, n-tetradekyyli (myri-styyli), n-pentadekyyli, n-heksadekyyli (setyyli), n-okta-dekyyli (stearyyli) tai n-eikosyyli (arakinyyli), edelleen N-heptadekyyli tai n-nonadekyyli.

Alkoksi tai R2 on mieluimmin n-dekyylioksi, n-dodek-yylioksi (lauryylioksi), n-tetradekyylioksi (myristyyliok-si), n-heksadekyylioksi (setyylioksi), n-oktadekyylioksi (stearyylioksi) tai n-eikosyylioksi (arakinyylioksi), edelleen n-undekyylioksi, n-tridekyylioksi, n-pentadekyylioksi, n-heptadekyylioksi tai n-nonadekyylioksi.

Asyylioksi R^ tai R2 joissa on kummassakin 10-20 C-atomia on esimerkiksi alkanoyylioksi, aromaattisella rengas-systeemillä substituoitu alkanoyylioksi tai alkenoyylioksi.

Alkanoyylioksi R^ tai R2 on mieluimmin n-dekanoyylioksi, n-dodekanoyylioksi (lauroyylioksi), n-tetradekeanoyylioksi (myristoyylioksi), n-heksadekanoyylioksi, n-heksadekanoyy-lioksi (palmitoyylioksi), n-oktadekanoyylioksi (stearoyy-lioksi) tai n-eikosoyylioksi (arakinoyylioksi), edelleen n-undekanoyylioksi, n-tridekanoyylioksi, n-pentadekanoyyIloksi, n-heptadekanoyylioksi tai n-nonadekanoyylioksi.

Aromaattisella rengassysteemillä substituoitu alkanoyylioksi Rj^ tai R2 on esimerkiksi fenyyli-n-alkanoyylioksi, jossa fenyylitähde on alkanoyylioksitähteen ω-asemassa, esim. fenyyli-n-butyryylioksi, -n-pentanoyylioksi, n-heksanoyyli-oksi, -n-heptanoyylioksi, -n-oktanoyylioksi, -n-nonanoyyli-

II

s 79245 oksi, -n-dekanoyylioksi, -nundekanoyylioksi tai fenyyli-n-dodekanoyylioksi, 3- tai 4-, mieluimmin 4-alkyylifenyyli-n-alkanoyylioksi, jossa alkyylifenyylitähde on alkanoyylioksi-tähteen ω-asemassa, esim. 4-n-butyyli-, 4-n-pentyyli-, 4-n-heksyyli-, 4-n-oktyyli-, 4-n-dekyyli- tai 4-n-dodekyylife-nyyli-n-butyryylioksi, -n-pentanoyylioksi-, n-heksanoyyliok-si, -n-oktanoyylioksi, -n-dekanoyylioksi tai -n-dodekano-yylioksi, pyren-l-yyli-n-alkanoyylioksi, jossa pyreenitähde on alkanoyylioksitähteen ω-asemassa, esim. pyren-l-yyli-n-butyryylioksi, -n-pentanoyylioksi, -n-heksanoyylioksi, -n-oktanoyylioksi, -n-dekanoyylioksi tai pyren-l-yyli-dekanoyy-lioksi, tai 6- tai 8-alkyyli-pyren-l-yyli-n-alkanoyylioksi, jossa alkyyli-pyren-l-yylitähde on alkanoyylitähteen ω-asemassa esim. 6- tai 8-alempialkyyli-, esim. 6- tai 8-etyyli-pyren-l-yyli-n-butyryylioksi, -n-pentanoyylioksi, -n-heksanoyylioksi, -n-oktanoyylioksi, tai -n-dekanoyylioksi, tai 6-tai 8-n-butyylipyren-l-yyli-n-butyryylioksi, -n-pentanoyylioksi, -n-heksanoyylioksi, -n-oktanoyylioksi, n-dekanoyylioksi tai -n-dodekanoyylioksi, tai 6- tai 8-alkyylipyren-l-yyli-n-alkanoyylioksi, esim. 6- tai 8-n-dekyyli-, -n-dodek-yyli-, -n-tetradekyyli-, -n-heksadekyyli- tai 6- tai 8-n-oktadekyylipyren-l-yyli-n-butyryylioksi, -n-pentanoyylioksi, n-heksanoyylioksi, n-oktanoyylioksi, -n-dekanoyylioksi tai -n-dodekanoyylioksi.

Aromaattisella rengassysteemillä substituoitu alkanoyy-lioksi Rj tai R2 on mieluimmin 4-(4-n-dekyylifenyyli)-deka-noyyli, 4-(pyren-l-yyli)-butanoyyli, 6-(pyrenl-yyli)-heksa-noyyli, 8-(pyren-l-yyli)-oktanoyyli, 10(pyren-l-yyli)-okta-noyyli, 6-(6- tai 8-etyylipyren-lyyli)-oktanoyyli, 6-(6- tai 8-n-butyylipyren-l-yyli)heksanoyyli ja 10-(6- tai 8-n-okta-dekyylipyren-l-yyli)dekanoyyli.

Alkenoyylioksi tai R2 on mieluimmin 9-cis-dodekenyy-lioksi (lauroleoyylioksi), 9-cis-tetradekenoyylioksi (myris-toleoyylioksi), 9-cis-heksadekenoyylioksi (palmitoleinoyyli-oksi), 6-cis-oktadekenoyylioksi (petroselinoyylioksi), 6-trans-oktadekenoyylioksi (petroselaidinoyylioksi), 9-cis-ok- 6 79245 tadekenoyylioksi (oleoyylioksi), 9-trans-oktadekenoyylioksi (elaidinoyylioksi) tai 9-cis-eikosenoyyli (gadoleinoyyliok-si), edelleen 9-cis-12-trans-oktadienoyylioksi (linoloyyli), 9-transl2-trans-oktadekadienoyylioksi (linolaidinoyylioksi), 9-cis-12-cis-oktadienoyylioksi (linoleoyylioksi), 9-cis-ll-trans-13-trans-oktadekatrienoyylioksi (linolenoyylioksi), 9-, 11-, 13-, 15-oktadekatetraenoyylioksi (parinaroyyliok-si), 5-, 11-, 14-eikosatrienoyylioksi tai 5-, 8-, 11-, 14-eikosatetraenoyylioksi (arakidonoyylioksi).

Alempialkyyli R4, jossa on 1-4 C-atomia, on esim. metyyli, etyyli, isopropyyli, n-propyyli, isobutyyli tai n-butyy-li, ja se voi olla substituoitu karboksilla ja jolloin amino-ryhmä on cx-asemassa karboksyyliryhmään nähden, vapailla tai eetteröidyillä hydroksiryhmillä, jolloin kaksi eetteröityä hydroksiryhmää voivat olla sitoutuneet keskenään bivalentti-sella hiilivetytähteellä, esim. metyleenillä, etyleenillä, etylideenillä, 1,2-propyleenillä tai 2,2-propyleenillä, tai halogeenilla, esim. kloorilla tai bromilla.

Substituoitu alempialkyyli R4 on mieluimmin hydroksi-alempialkyyli, esim. 2-hydroksietyyli tai 2,3-dihydroksipro-pyyli, alempialkoksialempialkyyli, esim. metoksi- tai etok-simetyyli, 2-metoksietyyli tai 3-metoksi-n-propyyli, alempi-alkyleenidioksialempialkyyli, esim. 2,3-etyleeni-dioksipro-pyyli tai 2,3-(2,2-propyleeni)-dioksipropyyli, tai halogee-nialempialkyyli, esim. kloori tai bromimetyyli, 2-kloori-tai 2-bromietyyli, 2- tai 3-kloori- tai 2- tai 3-bromi-n-propyyli.

Hiilihydraattitähde R4 jossa on 5-12 C-atomia on esimerkiksi luonnollinen monosakkariditähde, joka on peräisin al-doosina tai ketoosina olevasta pentoosista tai heksoosista.

Aldoosina oleva pentoosi on esim. D-riboosi, D-arabinoo-si D-ksyloosi tai D-lyksoosi.

Ketoosina oleva pentoosi on esim. D-ribuloosi tai D-ksyluloosi.

Aldoosina oleva heksoosi on esim. D-alloosi, D-altroosi, D-glukoosi, D-mannoosi, D-galaktoosi tai D-taloosi.

li 7 79245

Ketoosina oleva heksoosi on D-psikoosi, D-fruktoosi, D-sorboosi tai D-tagatoosi.

Heksoosi on mieluimmin syklisessä muodossa, esim. pyra-noosina (aldoosi), esim. a- tai 8-D-glukopyranoosina, tai furanoosina, esim. a- tai β-D-fruktofuranoosina. Pyranosyy-litähde on mieluimmin esteröity 1- tai 6-asemissa ja furano-syylitähde 1- tai 5-asemassa olevissa hydroksiryhmissä fos-fatidyyliryhmällä.

Hiilihydraattitähde R4, jossa on 5-12 C-atomia, on lisäksi luonnollinen disakkariditähde esim. kahdesta heksoosista muodostunut disakkariditähde, joka on peräisin kahden aldoo-sin, esim. D-glukoosin tai D-galaktoosin kondensaatiosta, tai aldoosin, esim. D-glukoosin ja ketoosin, esim. fruktoosin kondensaatiosta. Kahdesta aldoosista muodostuneet disak-karidit, esim. laktoosit tai maltoosit ovat mieluimmin este-röidyt kyseisen pyranosyylitähteen 6-asemassa olevassa hydr-oksiryhmässä fosfatidyyliryhmällä. Aldoosista ja ketoosista muodostuneet disakkaridit ovat esim. sakkaroosit, ovat mieluimmin esteröidyt pyranosyylitähteen 6-asemassa tai furano-syylitähteen 1-asemassa olevassa hydroksiryhmässä fosfati-dyyliryhmällä.

Hiilihydraattitähde R4, jossa on 5-12 C-atomia, on lisäksi johdannaisen muodossa oleva mono- tai disakkariditähde, jolloin esimerkiksi aldehydiryhmä ja/tai yksi tai kaksi pääteasemassa olevaa hydroksiryhmää ovat hapetetut karboks-yyliryhmiksi, esim. D-glukoni-, D-glukaari- tai D-glukuroni-happotähde, jotka mieluimmin esiintyvät syklisinä laktoni-tähteinä. Johdannaisen muodossa olevassa mono- tai disakka-riditähteessä voivat myös aldehydi- tai ketoryhmät olla pelkistetyt hydroksiryhmiksi, esim. inosiitti, sorbiitti tai D-manniitti, tai hydroksiryhmät voivat olla korvatut vedyllä, esim. desoksisokerit, esim. 2-desoksi-D-riboosi, L-ramnoosi tai L-fukoosi tai korvatut aminoryhmillä esim. aminosokerit, esim. D-glukosamiini tai D-galaktosamiini.

Hiilihydraatti R4 voi myös olla lohkaisutuote, joka on saatu jonkin mainitun mono- tai disakkaridin reaktiolla vah- β 79245 van hapetusaineen, esim. perjodihapon kanssa.

Steroiditähde R4 on esimerkiksi sterolitähde, joka on esteröity fosfatidyyliryhmällä steroidirungon 3-asemassa olevan hydroksiryhmän kautta.

Sterolitähde on esimerkiksi lanosteroli, sitosterol!, koprostanoli, kolestanoli, glykokollihappo, ergosteroli tai stigmasteroli, mieluimmin kolesteroli.

Kun R4 tarkoittaa steroiditähdettä, ovat Rj^ ja R2 mieluimmin hydroksi ja R3 on vety.

Rasvahappo on esimerkiksi tyydytetty tai tyydyttämätön 4-26, mieluimmin 10-20 hiiliatomia sisältävä alifaattinen karboksyylihappo.

Tyydytetty alifaattinen karboksyylihappo on esimerkiksi suoraketjuinen 10-20 hiiliatomia sisältävä alifaattinen karboksyylihappo, esim. kapriinihappo (C-10), undekaanihappo (C-ll), lauriinihappo (C-12), tridekaanihappo (C-13), myris-tiinihappo (C-14), pentadekaanihappo (C-15), palmitiinihappo (C-16), margariinihappo (C-17), steariinihappo (C-18), nona-dekaanihappo (C-19) tai arakiinihappo (C-20).

Tyydytetty alifaattinen karboksyylihappo on esimerkiksi haaraketjuinen, 10-20 hiiliatomia sisältävä alifaattinen karboksyylihappo, esim. isomyristiinihappo (C-14), isopalmi-tiinihappo (C-16). isosteariinihappo (C-18).

Tyydyttämätön, 10-20 hiiliatomia sisältävä alifaattinen karboksyylihappo sisältää mieluimmin tasaluvun hiiliatomeja ja enintään viisi kaksoissidosta ja on esimerkiksi myristo-leiinihappo (C-14), palmitoleiinihappo (C-16), palmitalei-diinihappo (C-16), petroseliinihappo (C-16), öljyhappo (C-18), elaidiinihappo (C-18), vakkeenihappo (C-18), linolihap-po (C-18), linolelaidiinihappo (C-18), linoleenihappo (C-18), cis-eikos-5-eenihappo (C-20), cis-ll-eikoseenihappo, 11,14-eikosadieenihappo, 11-, 14-, 17-eikosatrieenihappo, arakido-nihappo tai 5-, 8-, 11-, 14-, 17-eikosapentaeenihappo.

Kyseinen rasvahappo voi olla dissosioitumattomassa muo-·' dossa tai suolan, esim. alkalimetalli-, esim. natrium- tai kaliumsuolan muodossa.

Il 9 79245

Sopiva lisälipidi on esimerkiksi kaavan A mukainen lipidi, jossa Rj^ ja R2 toisistaan riippumatta ovat asyylioksi, jossa on 10-20 C-atomia, R3 on vety ja R4 on trialempialkyy-liammmoniolla, esim. trimetyyliammoniolla, substituoitu alem-pialkyyli, esim. 2-trimetyyliammonioetyyli (kolinyyli), tai 2-aminoetyyli.

Tällainen lisälipidi on esim. luonnollinen lesitiini, esim. muna-lesitiini, tai lesitiini soijapavuista, kun R4 tarkoittaa 2-trimetyyli-ammonioetyyliä, ja luonnollinen ke-faliini, esim. muna-kefaliini tai kefaliini soijapavuista, kun R4 tarkoittaa 2-aminoetyyliä.

Lisälipideinä ovat edullisia myös kaavan A mukaiset synteettiset lesitiinit, (R4 = 2-trimetyyliammonioetyyli) ja synteettiset kefaliinit (R4 = 2-aminoetyyli), jossa kaavassa Rj ja R2 tarkoittavat identtisiä asyylioksitähteitä, esim. lauroyylioksia, oleoyylioksia, linoyylioksia, linoleoyyliok-sia tai arakinoyylioksia, esim. dilauroyyli-, dimyristoyyli-, dipalmitoyyli-, distearoyyli-, diarakinoyyli-, dioleoyyli-, dilinoyyli-, dilinoleoyyli-, tai diarakinoyylilesitiiniä tai -kefaliinia, R^ ja R2 tarkoittavat erilaisia asyylioksitähteitä, esim. Rj^ tarkoittaa palmitoyylioksia ja R2 oleoyyli-;Y: oksia, esim. l-palmitoyyli-2-oleoyyli-lesitiini tai -kefa liini, ja R3 tarkoittaa vetyä.

Vesipitoinen dispersio sisältää edullisesti kaavan A mukaisen lipidin, jossa Rj on alkyyli, esim. n-dodekyyli (lau-ryyli), n-tridekyyli, n-tetradekyyli (myristyyli), n-penta-• dekyyli, n-heksadekyyli (setyyli), n-heptadekyyli tai n-ok- tadekyyli (stearyyli), alkoksi, esim. n-dodekyylioksi (lau-ryylioksi), n-tetradekyylioksi (myristyylioksi), n-heksade-kyylioksi (setyylioksi) tai n-oktadekyylioksi (stearyyliok-si), asyylioksi, esim. lauroyylioksi, myristoyylioksi, pal-mitoyylioksi tai stearoyylioksi, R2 on vety tai hydroksi, R3 on vety tai alempialkyyli, esim. metyyli, ja R4 on vety, alempialkyyli, esim. metyyli tai etyyli, tai alempialkyyli, joka on substituoitu karboksilla ja aminolla, esim. ω-amino-ω-karboksialempialkyyli, esim. 2-amino-2-karboksietyyli tai 10 79245 3-amino-3-karboksi-n-propyyli, hydroksialempialkyyli, esim. 2-hydroksietyyli tai 2,3-hydroksipropyyli, alempialkyleeni-dioksialempialkyyli, esim. 2,3-etyleenidioksipropyyli tai 2,3-(2,2-propyleeni)-dioksipropyyli, halogeenialempialkyyli, esim. 2-kloori- tai 2-bromietyyli, 5-12 C-atomia sisältävä hiilihydraattitähde, esim. inosiitti, ja kaavan A mukainen lisälipidi, jossa ja R2 tarkoittavat asyylioksia, esim. lauroyylioksia, myristoyylioksia, palmitoyylioksia tai stea-royylioksia, R3 tarkoittaa vetyä ja R4 2-trimetyyliammonio-etyyliä tai 2-aminoetyyliä. Vesipitoinen dispersio voi edullisesti sisältää myös kaavan A mukaisen lipidin, jossa Rx ja R2 ovat asyylioksi, esim. lauroyylioksi, myristoyylioksi, palmitoyylioksi tai stearoyylioksi, R3 on vety ja R4 on vety ja mahdollisesti kaavan A mukaisen lisälipidin, jossa Rj^ ja r2 ovat asyylioksi, esim. lauroyylioksi, myristoyylioksi, palmitoyylioksi tai stearoyylioksi, R3 on vety ja R4 on 2-trimetyyliammonioetyyli tai 2-aminoetyyli.

Ensisijassa sisältää vesipitoinen dispersio lysofosfati-dihapon, esim. luonnollisen lysofosfatidihapon, esim. muna-lysofosfatidihapon, tai synteettisen lysofosfatidihapon, esim. 1-lauroyyli-, 1-myristoyyli- tai l-palmitoyylilysofos-fatidihapon, lysofosfatidyyliseriinin, esim. luonnollisen lysofosfatidyyliseriinin, esim. lysofosfatidyyliseriinin naudan aivoista, tai synteettisen lysofosfatidyyliseriinin, esim. 1-myristoyyli- tai 1-palmitoyylilysofosfatidyyliserii-nin, lysofosfatidyyliglyserolin tai lysofosfatidyyli-inosi-tolin ja lisäksi lesitiinin,esim. luonnollisen lesitiinin, esim. munalesitiinin,tai lesitiinin, jossa on samanlaiset asyylioksiryhmät, esim. dimyristoyyli- tai dipalmitoyylile-sitiinin, lesitiinin, jossa on erilaiset asyylioksiryhmät, esim. l-palmitoyyli-2-oleoyylilesitiinin, tai lisäksi kefa-liinin, esim. luonnollisen kefaliinin, esim. muna-kefalii-nin, tai kefaliinin, jossa on erilaiset asyylioksiryhmät, esim. l-palmitoyyli-2-oleyylikefaliinin.

Ensisijaisesti voi vesipitoinen dispersio sisältää myös luonnollisen fosfatidihapon, esim. muna-fosfatidihapon, syn- 11 79245 teettisen fosfatidihapon, esim. dilauroyyli-, dimyristoyyli-, dipalmitoyyli- tai l-palmitoyyli-2-oleoyylifosfatidihapon, ja mahdollisesti lisäksi lesitiinin, esim. luonnollisen lesitiinin, esim. muna-lesitiinin, lesitiinin, jossa on samanlaiset asyylioksiryhmät, esim. dimyristoyyli- tai dipalmito-yylilesitiinin, tai lesitiinin, jossa on erilaiset asyylioksiryhmät, esim. l-palmitoyyli-2-oleoyylilesitiinin, tai ke-faliinin, esim. luonnollisen kefaliinin, esim. muna-kefalii-nin tai kefaliinin jossa on erilaiset asyylioksiryhmät, esim.

l-palmitoyyli-2-oleoyylikefaliinin, tai fosfatidyyliserii-nin, esim. luonnollisen fosfatidyyliseriinin, esim. fosfati-dyyliseriinin naudan aivoista, tai synteettisen fosfatidyyliseriinin, esim. dipalmitoyylifosfatidyyliseriinin, mono-glyseridin, esim. mono-oleiinin tai monomyristiinin, tai sterolin, esim. kolesterolin.

Unilamellaaristen liposomien valmistamiseksi valmistetaan ensin lipidikomponenttien homogeeninen kerros. Homogeenisen kerroksen valmistus voi tapahtua sinänsä tunnetulla tavalla ja on selitetty jälempänä seuraavassa kappaleessa "lipidikomponenttien homogeenisen kerroksen valmistus".

; Homogeeninen kerros dispergoidaan vesipitoiseen faasiin ja nostetaan sitten sellaisten vesipitoisten faasien pH-ar-von, johon on dispergoitu vain yksi lipidikomponentti, esim. Ίλ puhdas fosfatidihappo, arvoon noin 12, mieluimmin arvoon noin 9-11. Tämä tapahtuu esimerkiksi lisäämällä fysiologi-: sesti hyväksyttäviä, emäksisiä liuoksia, esim. laimennettua vesipitoista, noin 0,01- noin 0,2 N erityisesti noin 0,1N natriumhydroksidi- tai kaliumhydroksidiliuosta, samanaikaisesti tarkistamalla pH-arvo esim. täpläkokeella tai pH-mit-tarilla.

Erään edullisen suoritusmuodon mukaan dispergoidaan lipidikomponenttien homogeeninen kerros vesipitoisiin faasei-hin, joiden pH-arvo on suurempi kuin 9, esim. fysiologisesti hyväksyttäviin, emäksisiin liuoksiin, esim. laimennettuun vesipitoiseen, noin 0,01-0,2N, erityisesti 0,1N natriumhydroksidi- tai kaliumhydroksidiliuokseen. Yksi lipidikompo- i2 79245 nentti, esim. puhdas fosfatidihappo dispergoidaan vesipitoisiin faaseihin, joiden pH-arvo on enintään noin 12, mieluimmin noin 9-11.

Menetelmä b)

Kaavan A mukaisessa lipidissä, jossa R2 on vety, hydrok-si, 1-4 C-atomia sisältävä alempialkyyli ja on vety, al-kyyli, alkoksi tai asyylioksi, jossa on 10-20 C-atomia, R3 on vety ja R4 on ammonioryhmällä substituoitu alempialkyyli, tarkoittavat Rj^ ja R2 samaa kuin edellä menetelmän a) yhteydessä on mainittu.

Ammonioryhmällä substituoitu alempialkyyli R4 on esimerkiksi trialempialkyyliammonioryhmällä, esim. trimetyyli- tai trietyyliammoniolla substituotu alempialkyyli, esim. 2-tri-metyyli- tai 2-trietyyliammonioetyyli.

Kaavan A mukaisessa lipidissä, jossa R1 ja R2 ovat toisistaan riippumatta asyylioksi, jossa on 10-20 C-atomia, R3 tarkoittaa vetyä ja R4 ammonioalempialkyyliammonioryhmällä substituoitua alempialkyyliä, tarkoittavat ja R2 samaa kuin edellä on mainittu menetelmän a) yhteydessä.

Ammonioalempialkyyliammonioryhmällä substituoitu alempialkyyli on esimerkiksi 2-[N,N-dialempialkyyli-N-(2-Nl,N',N'-trialempialkyyliammonioetyyli)-ammonio]-etyyli, esim. 2-tN,N-dimetyyli-N-(2-N',N',N'-trimetyyliammonioetyyli)-ammo 1 nio]-etyyli.

I Sopiva lisälipidi on jokin edellä menetelmän a) yhtey- * dessä mainituista lisälipideistä.

Vesipitoinen dispersio sisältää edullisesti kaavan A mukaisen lipidin, jossa R1 on asyylioksi, esim. lauroyylioksi, myristoyylioksi, palmitoyylioksi tai steroyylioksi, R2 on hydroksi, R3 on vety ja R4 2-trimetyyliammonioetyyli, ja kaavan A mukaisen lisälipidin, jossa Rj^ ja R2 on asyylioksi, esim. lauroyylioksi, myristoyylioksi, palmitoyylioksi tai stearoyylioksi, R3 on vety ja R4 on 2-aminoetyyli tai 2-tri-metyyliammonioetyyli. Vesipitoinen dispersio voi myös sisältää edullisesti kaavan A mukaisen lipidin, jossa R1 ja R2 ovat asyylioksi, esim. lauroyylioksi, myristoyylioksi, pal-

II

i3 79245 mitoyylioksi tai stearoyyIloksi, Rg on vety ja R4 on 2-[N,N-dimetyyli-N-(2-N',N',N'-trimetyyliammonioetyyli)-ammonio]-etyyli ja mahdollisesti vielä kaavan A mukaisen lisälipidin, jossa R1 ja R2 on asyylioksi, esim. lauroyylioksi, myristo-yylioksi, palmitoyylioksi tai stearoyylioksi, R3 on vety ja R4 2-aminoetyyli tai 2-trimetyyliammonioetyyli.

Vesipitoinen dispersio sisältää ensisijassa lysofosfati-dyylikoliinia (lysolesitiiniä) ja luonnon lesitiiniä, esim. muna-lesitiiniä. Ensisijassa voi vesipitoinen dispersio sisältää myös fosfatidyyli-2-[N,N-dimetyyli-N-(2-N',N',Ν'-tri-metyyliammonioetyyli)-ammonio]-etyyli-kloridia ja mahdollisesti myös luonnon lesitiiniä, esim. muna-lesitiiniä.

Unilamellaaristen liposomien valmistamiseksi valmistetaan ensin lipidikomponenttien, esim. lysolesitiinin tai fosfatidyyli-2-[N,N-dimetyyli-N-(2-N',N',N'trimetyyliammonioetyyli )-ammonio]-etyylikloridin homogeeninen kerros.

Homogeenisen kerroksen valmistus voi tapahtua sinänsä tunnetulla tavalla ja on kuvattu jälempänä seuraavassa kappaleessa "Lipidikomponenttien homogeenisen kerroksen valmistus" .

Homogeeninen kerros dispergoidaan vesipitoiseen faasiin ja lasketaan sitten pH-arvoon noin 1 ja alle tämän samanaikaisesti tarkistaen pH-arvo, esim. täplänäytteellä tai pH-mittarilla. Tämä tapahtuu esimerkiksi lisäämällä fysiologisesti hyväksyttäviä happoja, esimerkiksi laimennettuja vesipitoisia mineraalihappoja, esim. laimennettua vesipitoista rikkihappoa, suolahappoa tai fosforihappoa.

Erään edullisen suoritusmuodon mukaan dispergoidaan lipidikomponenttien homogeeninen kerros vesipitoisiin faasei-hin, joiden pH-arvo on noin 1 tai alle tämän, esim. laimennettuihin vesipitoisiin mineraalihappoihin, esim. laimennettuun vesipitoiseen rikkihappoon, suolahappoon tai fosfori-happoon, samalla tarkistaen pH-arvo.

Jälkeenpäin on suoritettava vesipitoisten faasien neutralointi silloin kun vesipitoisen faasin pH-arvo on säädetty menetelmän a) mukaisesti arvoihin yli 9 tai menetelmän b) 79245 mukaisesti arvoihin alle 1. Tämä tapahtuu sen johdosta että vältyttäisiin heti pH-arvon laskemisen tai korottamisen jälkeen tehoaineen ja/tai liposomien tuhoutumiselta emäksisissä vast, happamissa olosuhteissa. Emäksiseksi tehty vesipitoinen faasi neutraloidaan sopivalla fysiologisesti hyväksyttävällä hapolla tai puskuriliuoksella, esim. fosfaattipuskuri-liuoksella, jonka pH-arvo on 7-8. Sopivia happoja ovat esimerkiksi edellä mainitut laimennetut vesipitoiset mineraali-hapot sekä heikot orgaaniset hapot, esim. muurahaishappo tai etikkahappo. Hapan vesipitoinen faasi neutraloidaan lisäämällä vesipitoisia emäksiä, esim. laimennettua vesipitoista natrium- tai kaliumhydroksidiliuosta. Neutralointi suoritetaan samanaikaisesti tarkistamalla pH-arvo.

Lipidit on dispergoitu vesipitoiseen faasiin jopa yli 70 %:n konsentraatioissa. Edullisena konsentraatioalueena pidetään noin l - noin 20 %.

Työskennellään tarkoituksenmukaisesti huoneen lämpötilassa tai korotetuissa lämpötiloissa, esim. aina noin 60 *C: seen saakka. Mikäli kapseloitavan tehoaineen herkkyys niin vaatii, suoritetaan menetelmä samalla jäähdyttäen ja mahdollisesti inerttikaasuatmosfäärissä, esim. typpiatmosfäärissä.

Sekä menetelmän a) että myös menetelmän b) mukaisesti tapahtuu unilamellaaristen liposomien muodostus spontaanisesti (spontaneous vesiculation), ts. ilman mitään ulkoapäin tuotua lisäenergiaa sekä suurella nopeudella.

;* Menetelmän a) ja b) mukaisesti saadut unilamellaariset liposomit ovat suhteellisen kauan stabiileja vesipitoisessa faasissa. Esimerkiksi sellaiset unilamellaariset liposomit, jotka koostuvat muna-fosfatidihaposta tai muna-fosfatidiha-posta ja muna-lesitiinistä, pysyvät varastoituina vesipitoisessa faasissa 4 °C:ssä stabiileina yli 14 vuorokautta. Kek-. sinnön mukaisesti valmistettavia unilamellaarisia liposomeja sisältävät vesipitoiset faasit voidaan tehdä varastointia kestäviksi eurooppalaisessa patenttihakemuksessa 0 065 292 selitetyn menetelmän mukaisesti.

Unilamellaaristen liposomien muodostus ja niiden pitoi-

II

is 79245 suus vesipitoisessa faasissa voidaan osoittaa sinänsä tunnetulla tavalla käyttäen erilaisia mittausmenetelmiä, esim. optisesti elektronimikroskoopissa, määrittämällä massa analyyttisessä ultrasentrifuugissa ja ennenkaikkea spektros-kooppisesti, esim. käyttäen ydinresonanssispektriä (^H, 13C ja 31P). Niinpä on esimerkiksi ydinresonanssispektrissä esiintyvä kapea signaali osoitus pienien unilamellaaristen liposomien muodostuksesta. Systeemissä muodostuneiden pienien unilamellaaristen liposomien osuus voidaan laskea signaalien intensiteetin perusteella. Niinpä on protoni-ydinre-sonanssispektrissä tyypillistä terävä metyleenisignaali kohdassa δ = 1,28 ppm ja terävä metyylisignaali kohdassa δ = 0,89 ppm pienille unilamellaarisille liposomeille, jotka on muodostettu fosfatidihaposta. Pienillä unilamellaarisilla liposomeilla, jotka muodostuvat fosfatidihaposta ja lesitiinistä, on myös metyleeni- ja metyylisignaali kohdissa δ = 1,28 ja 0,89 ppm ja lisäksi metyylisignaali kohdassa δ = 3,23 ppm joka kuuluu lesitiinin trimetyyliammonioryhmälle.

Muodostuneiden unilamellaaristen liposomien koko riippuu mm. lipidikomponenttien rakenteesta, lipidikomponenttien se-: :·; koitussuhteesta, näiden lipidikomponenttien konsentraatiosta vesipitoisessa faasissa ja kapseloitavan tehoaineen määrästä ja rakenteesta. Niinpä voidaan esimerkiksi vaihtelemalla lipidikomponenttien konsentraatiota valmistaa vesipitoisia faaseja, joissa on suuri määrä pieniä tai suuria unilamel-laarisia liposomeja. Pienien unilamellaaristen liposomien (KUL) osuutta voidaan nostaa esimerkiksi lisäämällä disper-siin faasiin muna-fosfatidihappoa. GUL-liposomien osuutta dispersissä faasissa voidaan nostaa myös lisäämällä suoloja, esim. NaCl tai KCl. Esimerkiksi fosfatidihaposta tai fosfatidihaposta ja lesitiinistä muodostuneen KUL-liposomin hal-;y. kaisija on noin 200-600 Ä. Tämän kokoisen KUL-liposomin si sältämä tilavuus on noin 0,5-1 litra moolia kohti käytettyä lipidikomponenttia.

KUL-liposomien ohella muodostuu myös suuria unilamellaa-risia liposomeja (GUL-halkaisija enintään 50 000 A). Nämä ie 79245 sulkevat sisäänsä suuremmat tilavuudet moolia kohti käytettyä lipidikomponenttia ja sopivat kapselointia varten suuremmilla saannoilla sekä tilaavievien aineiden, esim. virusten, bakteerien tai soluorganellien sisäänsulkemiseksi.

KUL-liposomien erottamiseksi GUL-liposomeista tapahtuu tavanomaisilla erotusmenetelmillä esim. geelisuodatuksella, esim. käyttäen Sepharose 4B kantaja-aineena, tai sedimentoi-malla GUL ultrasentrifuugissa nopeudella 160,000 x g. Useampituntisen, esim. 3-tuntisen sentrifugoinnin jälkeen laskeutuu tässä painovoimakentässä GUL, kun taas KUL pysyy disper-goituneena ja voidaan dekantoida pois. Moninkertaisen sentrifugoinnin jälkeen voidaan GUL erottaa täydellisesti KUL: ista.

Myös geelisuodattamalla voidaan kaikki vesipitoisessa faasissa läsnäolevat liposomit, joiden läpimitta on suurempi kuin 600 Ä, esim. GUL tai multilamellaariset liposomit sekä kapseloimattomat tehoaineet ja ylimääräiset, dispergoituneet lipidit erottaa ja näin saada vesipitoinen faasi, jonka KUL-fraktiolla on suhteellisen yhtenäinen koko.

Keksinnön mukaisesti saatavat liposomit (KUL ja GUL) ovat sopivia kantajasysteemejä, joita voidaan käyttää vesipitoisessa faasissa lipofiilisten aineiden, esim. rasvaliukoisten väriaineiden liuottamiseksi, hydrolyysille herkkien aineiden, esim. prostaglandiinien stabiloimiseksi, tuholaisten torjunta-aineiden sisäänsulkemiseksi, esim. diklorfossin vaikutusprofiilin muuttamiseksi, ravintoaineiden lisäaineiden sisäänsulkemiseksi, esim. vitamiinien tai väriaineiden absorptiokäyttäytymisen muuttamiseksi, tai kapseloitujen tehoaineiden, entsyymien, vasta-aineiden, hormoonien, geenien, virusten, vitamiinien tai soluorganellien sisällyttämiseksi soluviljelmän soluihin.

Vesipitoiset faasit, jotka sisältävät keksinnön mukaisesti saatavia liposomeja niihin kapseloituine tehoaineineen, ovat annostussysteemejä, jotka, mahdollisesti liposo-mien konsentroinnin ja eristämisen jälkeen, esim. ultrasent-rifugoimalla, sopivat terapeuttisiin tarkoituksiin oraalista

II

i7 79245 (p.o.), parenteraalista (i.v., i.m. tai i.p.) tai topikaa-lista annostusta varten.

Oraalisessa annostuksessa voivat liposomiperustaiset an-nostussysteemit suojata tehoaineen, esimerkiksi insuliinin, joka on pysymätön ruoansulatustiehyeissä tai parantaa sen resorptiota. Oraalista annostusta varten voidaan liposomi-pitoinen vesipitoinen faasi sekoittaa farmaseuttisesti hyväksyttävien laimennusaineiden tai kantaja-aineiden tai tavanomaisten lisäaineiden, esim. väriaineiden tai makuaineiden kanssa ja antaa siirappina tai kapseleiden muodossa.

Parenteraalisessa annostuksessa voivat liposomiperustaiset annostussysteemit esimerkiksi pidentää esim. desferriok-samiinin, vertaa Guilmette R.A. et ai., Life Sei. 22 (4) 313-320, 1978 tai gentamysiinin, katso Scheld W.M. et ai., Clin. Res. 26, No. 1, 59 A, 1978, oloaikaa organismissa. Lisäksi pidennetään kapseloitujen kelaatinmuodostajien esim. EDTA:n (etyleenidiamiinitetraetikkahapon) oloaikaa organismissa, jolloin raskasmetallit voidaan kelatiinin muodostuksella poistaa erityisesti maksasta, pernasta tai munuaisista, vrt. Rahmann et ai., Science, Voi. 180, 300-302, 1973 ja J. Lab. elin. Med. 640-647, 1974. Liposomiperustaisilla an-.·. nostussysteemeillä voidaan tehoaineita rikastaa sydänlihak seen, vrt. Landesmann et ai., Science Voi. 198, 737-738, 1977 . Anti-inflammatoorisesti vaikuttavia aineita, esim. kortisoli, vrt. Nature 271, no. 5643, 372-73, 1978 tai pro-; teaasi-inhibiittoreita, vrt. Anal. Biochem. 89, no. 2, 400- 07, 1978, voidaan rikastaa nivelnesteisiin sekä sytostaatti-sia aineita kasvainkudokseen, vrt. kokooma-artikkeli Kaye St. B., Cancer Treatment Reviews 8, 27-50, 1981 sekä muita siinä mainittuja kirjallisuusviitteitä. Monet syöpäterapias-sa käytetyt kemoterapeuttiset aineet ovat vähemmän toksisia ja paremmin siedettäviä kun ne annetaan kapseloituja liposo-meihin, esim. liposomikapseloitu aktinomysiini D, vrt. Rahmann et ai., Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine 146, 1173-1176, 1974, metotreksaatti, vrt. Lesermann L.D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 77, No. 7, ie 79245 4089-93, 1980, vinblastiini, daunomysiini tai sytosiini-arabinosidi, vrt. Mflhlensiepen et al., Cancer Res. 41, No.

5, 1602-07, 1981. Liposomeja voidaan käyttää tehoaineiden, esim. entsyymien, peptidihormonien, geenien tai virusten viemiseksi solusytoplasmaan elävissä organismeissa, esim. asparaginaasin sisäänviemiseksi, vrt. kokooma-artikkeli Fin-kelstein M. ja Weissmann, G., J. Lipid Research, Voi., 19, 1978, 289-303 amyloglukosidaasin, vrt. Gregoriadis G. ja Ry-man B.E., Eur. J. Biochem.. 24 (1972), 485-491 tai neuromi-nidaasin sisäänviemiseksi, vrt. Gregoriadis et ai., Biochem. J. (1974) 140, 232-330, spesifisten tunnistamismolekyylien, esim. monoklonaalisten vasta-aineiden kiinnittämiseksi, määrätietoista sisällyttämistä varten määrättyihin kohdesolui-hin, vrt. Leserman et ai., Nature 293 (5829), 226-228, 1981, immuunistimulaatiota varten adjuvanssina rokotettaessa, esim. Leishmania-tautia vastaan, vrt. New R.R.C. et ai., Nature 272 (5648) 55-56, 1978, tai tehoaineiden indusoitua vapautumista varten signaalien avulla, kuten lämpötilan korotuksella, esim. tulehtuneessa kudoksessa, tai pH-arvon muutoksiin. Parenteraalista annostusta varten voidaan konsentroidut tai eristetyt liposomit suspendoida sopivaan kantajanesteeseen, esimerkiksi steriiliin tislattuun veteen tai fysiologiseen keittosuolaliuokseen.

Llpidikomponenttlen homogeenisen kerroksen valmistus

Lipidikomponenttien homogeenisen kerroksen valmistus voi tapahtua sinänsä tunnetulla tavalla. Esimerkiksi liuotetaan ensin kaavan A mukainen lipidi tai lipidiseos, esim. puhdasta muna-fosfatidihappoa tai muna-fosfatidihapon ja muna-lesitiinin seos, mahdollisesti lisäten lipoftilistä tehoainetta, esim. proteiinia, joka liposomien muodostuksessa sulje-taan sisään lipidikerrokseen, orgaaniseen liuottimeen. Pois-- tamalla orgaaninen liuotin, tarkoituksenmukaisesti tyhjössä tai puhaltamalla pois inerttikaasussa, esim. typessä, valmistetaan lipidikomponenttien homogeeninen kerros.

Kysymykseen tulevan liuottimen valinta riippuu kyseisten lipidikomponenttien liukoisuudesta siihen. Sopivia liuotti- 11 19 79245 mia ovat esimerkiksi substituoimattomat tai substituoidut, esim. halogenoidut, alifaattiset, sykloalifaattiset, aromaattiset tai aromaattis-alifaattiset hiilivedyt, esim. bentsee-ni, tolueeni, metyleenikloridi tai kloroformi, alkoholit, esim. metanoli tai etanoli, alempialkaanikarboksyylihappoes-terit, esim. etikkahappoetyyliesteri, eetterit, esim. dietyy-lieetteri, dioksaani tai tetrahydrofuraani, tai näiden liuo-tinten seokset.

Tämän keksinnön selityksessä mainitut lipidit ovat tunnettuja tai mikäli ne ovat uusia ne voidaan valmistaa sinänsä tunnetulla tavalla standardiseoksessa Knight C.G. Liposomes, Elvier 1981, luvussa 3 esitettyjen ohjeiden mukaisesti. Kaikki mainitut lipidit voivat esiintyä vesipitoisessa dispersiossa optisesti aktiivisina johdannaisina tai rasemaat-teina. Seuraavat esimerkit havainnollistavat keksintöä sitä mitenkään rajoittamatta. Lämpötilat on annettu Celsius-asteina ja sekoitussuhteet tarkoittavat tilavuussuhteita.

Esimerkki 1: a) l g muna-fosfatidihappoa liuotetaan 20 ml:aan kloro-formi/metanoli-seosta (2:1) ja tämä liuos haihdutetaan tyh-. jössä pyörivässä haihduttimessa. Kalvomainen jäännös disper- goidaan 20 ml:aan tislattua vettä ravistelemalla 5 minuuttia, jolloin pH asettuu arvoon noin 3. Unilamellaaristen liposo-mien valmistamiseksi dispersiin faasiin lisätään sitten huo-neen lämpötilassa samalla tarkistamalla pH-mittarilla niin : paljon 0,1N natriumhydroksidi-liuosta kunnes pH nousee ar- :Λ: voon li. vesipitoisen faasin pH-arvo lasketaan sen jälkeen lisäämällä 0,IN HC1 arvosta 11 arvoon noin 7. Saadaan heikosti opalisoiva vesipitoinen faasi.

Muodostuneet unilamellaariset liposomit voidaan tehdä näkyviksi elektronimikroskoopissa. Liposomidispersiolle suo-ritetaan ensin tavanomaiset jäähdytys-rikkomismenetelmät (freeze-fracture). On olemassa pääasiassa kaksi unilamellaa-risten liposomien "populaatiota", jotka eroavat toisistaan keskimääräisen kokonsa suhteen: 1. Pienet unilamellaariset liposomit (KUL) joiden halkaisija 20 79245 on noin 200-600 A ja 2. Suuret unilamellaariset liposomit (GUL), joiden halkaisija on noin 1,000-10,000 A.

KUL-liposomit ovat tunnistettavissa protoni-NMR-spekt-rissä signaalien δ = 1,28 (metyleeni) ja δ = 0,89 ppm (metyyli) avulla. KUL-liposomien saanto voidaan arvioida signaalien intensiteeteistä ja se on noin 56 %.

b) Esimerkin la) mukaisesti liuotetaan neljä kertaa kulloinkin 10 mg muna-fosfatidihappoa neljä kertaa kulloinkin 0,2 ml:aan kloroformi/metanoli-seosta (2:1) ja haihdutetaan nämä liuokset tyhjössä. Kalvomainen jäännös dispergoidaan kulloinkin 1 ml:aan tislattua vettä hämmentämällä 5 minuuttia. Unilamellaaristen liposomien valmistamiseksi lisätään sen jälkeen kulloiseen yksittäiseen dispersiin faasiin samalla tarkistamalla pH-mittarilla niin paljon 0,1N natrium-hydroksidiliuosta kunnes saadaan pH-loppuarvo joka on 6, 8, 11,3 ja 11,6. KUL-saanto on nousevan pH-arvon mukaisesti kullekin näytteelle 5, 24, 57 ja 60 %.

Esimerkki 2: a) l g muna-fosfatidihappoa liuotetaan 20 ml:aan kloro-formi/metanoli-seosta (2:1) ja tämä liuos haihdutetaan tyhjössä. Kalvomainen jäännös dispergoidaan 50 ml:aan 0,01N natriumhydroksidiliuosta samalla ravistellen, jolloin pH-arvoksi saadaan noin 12. Vesipitoisen dispersion pH-arvo lasketaan sen jälkeen lisäämällä 0,1N suolahappoa arvoon noin 7-8. KUL-saanto on noin 100 %.

b) Esimerkkiä 2a) vastaavasti liuotetaan neljä kertaa kulloinkin 10 mg muna-fosfatidihappoa neljä kertaa kulloinkin 0,2 ml kloroformi/metanoli-seosta (2:1) ja nämä liuokset haihdutetaan tyhjössä. Kukin näyte dispergoidaan niin suu- j‘; reen määrään 0,01N natriumhydroksidiliuosta ja tislattuun veteen samalla ravistellen että saadaan pH-arvot noin 7,3, 8,0, 9,4 ja 10,0. KUL-saanto on nousevaa pH-arvoa vastaavasti kullekin näytteelle 33, 46, 65 ja 81 %.

li 21 79245

Esimerkki 3: 0,1 g dilauroyylifosfatidihappoa liuotetaan 5 ml:aan kloroformi/metanoli-seosta (2:1) ja haihdutetaan tämä liuos tyhjössä. Kalvomainen jäännös dispergoidaan 50 ml:aan 0,01N natriumhydroksidiliuosta samalla ravistellen, jolloin asettuu pH-arvo noin 12. Vesipitoisen dispersion pH-arvo lasketaan sen jälkeen lisäämällä 0,1N suolahappoa arvoon noin 7-8. KUL-saanto (noin 300 - 800 Ä) on 73 %.

Esimerkki 4: a) 3 mg muna-fosfatidihappoa ja 7 mg muna-lesitiiniä liuotetaan 0,5 ml:aan kloroformi/metanoli-seosta (2:1) ja tämä liuos haihdutetaan tyhjössä. Kalvomainen jäännös dispergoidaan 1 ml:aan tislattua vettä samalla ravistellen 5 minuuttia huoneen lämpötilassa, jolloin pH asettuu arvoon noin 3. Unilamellaaristen liposomien valmistamiseksi lisätään sen jälkeen huoneen lämpötilassa samalla tarkkailemalla pH-mit-tarilla niin paljon 0,1 natriumhydroksidia kunnes pH nousee arvoon noin 11,2. Lisäämällä fosfaattipuskuriliuosta saatetaan sen jälkeen vesipitoisen faasin pH arvoon noin 7. Saadaan heikosti opalisoiva vesipitoinen faasi. Unilamellaaris-ten liposomien muodostus on tunnistettavissa NMR-spektrissä signaaleilla δ = 1,28 (metyleeni), 6 = 0,89 (metyyli) ja δ = 3,23 (N-CHg). Elektronimikroskooppisessa kuvassa on tunnistettavissa pääasiassa kaksi unilamellaaristen liposomien "populaatiota", jotka eroavat toisistaan keskimääräisen kokonsa perusteella: 1. KUL jonka halkaisija on noin 200 - 800 Ä ja 2. GUL jonka halkaisija on noin 1000 - 10,000 A.

KUL-saanto on 45 %.

b) Esimerkkiä 4a) vastaavasti liuotetaan kaksi kertaa :T: kulloinkin 3 mg muna-fosfatidihappoa ja 7 mg muna-lesitiiniä kaksi kertaa kulloinkin 0,5 ml:aan kloroformi-metanoli-seos-ta (2:1) ja haihdutetaan nämä liuokset tyhjössä. Kalvomainen * jäännös dispergoidaan kulloinkin 1,0 ml:aan tislattua vettä samalla ravistellen 5 minuuttia. Unilamellaaristen liposomien valmistamiseksi lisätään sen jälkeen kuhunkin yksittäi- 22 79245 seen faasiin samalla tarkkailemalla pH-mittarilla niin paljon 0,IN natriumhydroksidiliuosta samalla ravistellen kunnes saavutetaan loppuarvo 8,6 ja 10. KUL-saanto on kasvavaa pH-arvoa vastaavasti 22 ja 35 %.

c) Esimerkkiä 4a) vastaavasti liuotetaan erisuuria määriä muna-fosfatidihappoa ja muna-lesitiiniä sisältävät näytteet kulloinkin 0,5 ml:aan kloroformi/metanoli-seosta (2:1) ja haihdutetaan nämä liuokset tyhjössä. Kalvomainen jäännös dispergoidaan kulloinkin 1,0 ml:aan tislattua vettä ravistelemalla 5 minuuttia. Unilamellaaristen liposomien valmistamiseksi lisätään sen jälkeen kuhunkin yksittäiseen faasiin tarkkailemalla pH-mittarilla niin paljon 0,1N natriumhydroksidiliuosta samalla ravistellen kunnes pH-arvoksi saadaan noin 11,2.

KUL-saanto on kullekin näytteelle kasvavaa muna-fosfati-dihappopitoisuutta vastaavasti: %-muna- fosfatldihappoa 6 10 14 20 25 30 33 50 48 60 %-KUL 5 9 14 17 19 20 27 39 41 50

Esimerkki 5: a) 0,3 g:aan muna-fosfatidihappoa ja 0,7 g:aan muna-lesitiiniä liuotetaan 10 ml:aan kloroformi/metanoli-seosta (2:1) ja tämä liuos haihdutetaan tyhjössä. Tämä jäännös dispergoidaan 10 ml:aan 0,01N natriumhydroksidi-liuosta samalla ravistellen, jolloin asettuu pH-arvo noin 12. Vesipitoisen dispersion pH-arvo lasketaan sen jälkeen lisäämällä 0,1N suolahappoa arvoon noin 7-8. KUL-saanto on noin 30 %.

b) Esimerkkiä 5a) vastaavasti liuotetaan erisuuruisia määriä muna-fosfatidiliuosta ja muna-lesitiiniä (yhteensä 10 mg lipidiä) sisältävät näytteet kulloinkin 0,5 ml:aan kloroformi/metanoli-seosta (2:1) ja tämä liuos haihdutetaan tyhjössä. Kalvomaiset jäännökset dispergoidaan kulloinkin 1 ml: aan 0,01N natriumhydroksidiliuosta samalla ravistellen, jolloin asettuu pH-arvo noin 12. Vesipitoisen dispersion pH-arvo lasketaan arvoon noin 7-8. KUL-saanto on kullekin näytteelle kasvavaa muna-fosfatidihappopitoisuutta vastaavasti: 23 79245 %-muna-fosfati- dihappoa_10 20 25 30 40 50 60 80 %-KUL 14 22 31 42 45 50 78 95

Esimerkki 6: a) 0,7 g:aan muna-lesitiiniä, 0,3 g fosfatidyyliseriiniä naudanaivoista ja 2 g muna-fosfatidihappoa liuotetaan 20 ml: aan kloroformi/metanoli-seosta (2:1) ja tämä liuos haihdutetaan tyhjössä pyörivässä haihduttimessa. Kalvomainen jäännös dispergoidaan 100 ml:aan 0,01 N natriumhydroksidiliuosta ravistelemalla 5 minuuttia huoneen lämpötilassa, jolloin asettuu pH-arvo noin 12. Lisäämällä IN suolahappoa saatetaan vesipitoisen faasin pH arvoon noin 7. Saadaan heikosti opali-soiva vesipitoinen faasi.

Unilamellaaristen liposomien muodostus voidaan osoittaa esimerkkiä la) vastaavasti spektroskooppisesti, esim. NMR-spektrissä, tai käyttäen elektronimikroskooppia. Elektronimikroskooppisessa kuvassa tunnistetaan GUL ja KUL.

b) Esimerkkiä 6a) vastaavasti liuotetaan näytteet, jotka sisältävät eri määriä muna-fosfatidihappoa, mutta samat määrät muna-lesitiiniä ja fosfatidyyliseriiniä (yhteensä 10 mg lipidiä), kulloinkin 0,5 ml:aan kloroformi/metanoli-seosta (2:1) ja nämä liuokset haihdutetaan tyhjössä. Jäännös dispergoidaan kulloinkin 1,0 ml:aan 0,01N natriumhydroksidiliuosta samalla ravistellen, jolloin asettuu pH-arvo noin 12. Vesipitoisen dispersion pH-arvo lasketaan sen jälkeen lisäämällä 0,IN suolahappoa arvoon noin 7-8. KUL-saanto on kullekin näytteelle kasvavaa muna-fosfatidihappopitoisuutta vastaavasti : %-muna-fosfatidlhappoa_9 10 26 33 34 40 60_ %-KUL 14 18 26 36 47 43 64

Esimerkki 7: a) 1 g asolektiiniä (pääasiassa lesitiinistä, kefalii-nista, fosfatidyyliseriinistä ja fosfatidyyli-inosiitista koostuva fosfolipidiseos) ja 0,2 g muna-fosfatidihappoa liuotetaan 20 ml:aan kloroformi/metanoli-seosta (2:1) ja tämä liuos haihdutetaan tyhjössä. Kalvomainen jäännös dispergoi- 24 7 9 2 4 5 daan 100 ml:aan Ο,ΟΙΝ natriumhydroksidlliuosta ravistellen 5 minuuttia huoneen lämpötilassa jolloin asettuu pH-arvo noin 12. Lisäämällä IN suolahappoa säädetään vesipitoisen faasin pH arvoon noin 7. Saadaan heikosti opalisoiva vesipitoinen faasi.

Unilamellaaristen liposomien muodostus voidaan osoittaa esimerkkejä la) vastaavasti spektroskooppisesti esim. NMR-spektrissä tai elektronimikroskoopissa. Elektronimikroskooppisessa kuvassa voidaan tunnistaa GUL ja KUL.

b) Esimerkkiä 6a) vastaavasti liuotetaan näytteet, jotka sisältävät eri määrät muna-fosfatidihappoa, mutta samat määrät asolektiiniä (yhteensä 10 mg lipidiä), kulloinkin 0,5 ml kloroformi/metanoli-seosta (2:1) ja nämä liuokset haihdutetaan tyhjössä. Jäännös dispergoidaan kulloinkin 1 ml:aan Ο,ΟΙΝ natriumhydroksidlliuosta samalla ravistellen, jolloin asettuu pH-arvo noin 12. Vesipitoisen dispersion pH säädetään sen jälkeen lisäämällä 0,1N suolahappoa arvoon noin 7-8. KUL-saanto on kullekin näytteelle kasvavaa muna-fosfa-tidihappopitoisuutta vastaavasti: %-muna-fosfatidlhappoa_17 37 50 %-KUL 24 69 65

Esimerkki 8: a) 0,1 g:aan muna-lesitiinin ja kolesterolin seosta (moolisuhde 1:1) ja 0,1 g muna-fosfatidihappoa liuotetaan 10 ml:aan kloroformi/metanoli-seosta (2:1) ja nämä liuokset haihdutetaan tyhjössä. Kalvomainen jäännös dispergoidaan 10 ml:aan 0,1N natriumhydroksidlliuosta ravistelemalla 5 minuuttia huoneen lämpötilassa jolloin asettuu pH-arvo noin 12. Lisäämällä IN suolahappoa säädetään vesipitoisen faasin pH arvoon noin 7. Saadaan heikosti opalisoiva vesipitoinen faasi.

Unilamellaaristen liposomien muodostus voidaan osoittaa esimerkkiä la) vastaavasti spektroskooppisesti, esim. NMR-spektrissä tai elektronimikroskoopissa. Elektronimikroskooppisessa kuvassa voidaan tunnistaa GUL ja KUL.

b) Esimerkkiä 8a) vastaavasti liuotetaan näytteet, jotka 25 7 9 2 4 5 sisältävät eri määrät muna-fosfatidihappoa mutta samat määrät muna-lesitiiniä ja kolesterolia (yhteensä 10 mg lipidiä) kulloinkin 0,5 ml kloroformi/metanoli-seosta (2:1) ja nämä liuokset haihdutetaan tyhjössä. Jäännös dispergoidaan kulloinkin 1,0 ml:aan 0,01N natriumhydroksidiliuosta samalla ravistellen,jolloin asettuu pH-arvo noin 12. Vesipitoisen dispersion pH säädetään sen jälkeen lisäämällä 0,1N suolahappoa arvoon noin 7-8. KUL-saanto on kullekin näytteelle kasvavaa muna-fosfatidihappopitoisuutta vastaavasti: %-muna-fosfatidihappoa_10 30 50 80_ %-KUL 4 10 20 50

Esimerkki 9: 0,5 g muna-fosfatidihappoa ja 0,5 g dimyristoyylilesi-tiiniä liuotetaan 10 ml:aan kloroformi/metanoli-seosta (2:1) ja tämä liuos haihdutetaan tyhjössä. Kalvomainen jäännös dispergoidaan 50 ml:aan 0,01N natriumhydroksidiliuosta samalla ravistellen, jolloin asettuu pH-arvo noin 12. Vesipitoisen dispersion pH lasketaan sen jälkeen lisäämällä 0,1N suolahappoa arvoon noin 7-8. KUL-saanto on 36 %.

Esimerkki 10:

Esimerkkiä 9 vastaavasti valmistetaan liposomiseoksia, jotka koostuvat 0,5 g:sta muna-fosfatidihappoa ja kulloinkin 0,5 g:sta dipalmitoyylilesitiiniä tai distearoyylilesitiiniä. KUL-saanto on 10 %.

Esimerkki 11:

Esimerkkiä 9 vastaavasti valmistetaan liposomiseos, joka koostuu 0,5 g:sta dipalmitoyylifosfatidihappoa ja 0,5 g:sta munalesitiiniä. KUL-saanto on 10 %.

Esimerkki 12: 5 mg lysolesitiiniä ja 5 mg muna-lesitiiniä liuotetaan l ml:aan kloroformi/metanoli-seosta (2:1) ja tämä liuos haihdutetaan tyhjössä. Kalvomainen jäännös dispergoidaan l ml:aan tislattua vettä ravistelemalla 5 minuuttia, jolloin asettuu pH-arvo noin 5-7. Unilamellaaristen liposomien valmistamiseksi lisätään sitten vesipitoiseen dispersioon huoneen lämpötilassa pH-mittarilla tarkkailemalla niin paljon 0,1N suo- 26 79245 lahappoa kunnes vesipitoisen faasin pH on laskenut arvoon 0,5. Lisäämällä 0,IN natriumhydroksidiliuosta korotetaan pH sen jälkeen arvoon 7.

Unilamellaaristen liposomien muodostus voidaan esimerkkiä la) vastaavasti osoittaa spektroskooppisesti, esim. NMR-spektrissä, tai elektronimikroskoopissa. Elektronimikros-kooppisesssa kuvassa voidaan tunnistaa KUL ja GUL. KUL-saan-to on 50 %.

Esimerkki 13:

Esimerkkiä 12 vastaavati valmistetaan liposomiseos, joka koostuu 5 mg:sta fosfatidyyli-2-[N,N-dimetyyli-N(2-N',N',N'-trimetyyliammonioetyyli)-ammonio]-etyylikloridia, jonka valmistus on kuvattu teoksessa Knight C.G., Liposomes, Elsevier 1981, luku 3, ja 5 mg:sta muna-lesitiiniä.

Unilamellaaristen liposomien muodostus voidaan osoittaa esimerkkejä la) vastaavasti spektroskooppisesti, esim. NMR-spektrissä, tai elektronimikroskoopissa. Elektronimikroskooppisessa kuvassa voidaan tunnistaa KUL, jonka halkaisija on 250 Aja GUL, jonka halkaisija on noin 600 - >10.000 A. KUL-saanto on 50 %.

Esimerkki 14: a) 0,5 g mono-oleiinla (9-cis-oktadekenoyyliglyserolia) ja 0,5 g muna-fosfatidihappoa liuotetaan 20 ml:aan klorofor-mi/metanoli-seosta (2:1) ja tämä liuos haihdutetaan tyhjössä. Kalvomainen jäännös dispergoidaan 100 ml:aan 0,01N natriumhydroksidiliuosta ravistelemalla 5 minuuttia huoneen lämpötilassa, jolloin asettuu pH-arvo noin 12. Lisäämällä IN suolahappoa säädetään vesipitoisen faasin pH arvoon noin 7. Saadaan heikosti opalisoiva vesipitoinen faasi.

Unilamellaaristen liposomien muodostus voidaan osoittaa esimerkkiä la) vastaavasti spektroskooppisesti, esim. NMR-spektrissä tai elektronimikroskoopissa. Elektronimikroskooppisessa kuvassa voidaan tunnistaa GUL ja KUL.

b) Esimerkkiä 14a) vastaavasti liuotetaan näytteet, jotka sisältävät erisuuruisia määriä muna-fosfatidihappoa ja mono-oleiinia (kokonaislipidimäärä = 10 mg) kulloinkin 0,5 27 79245 ml:aan kloroformi/metanoli-seosta (2:1) ja haihdutetaan nämä liuokset tyhjössä. Jäännökset dispergoidaan kulloinkin 1 ml:aan 0,01N natriumhydroksidiliuosta samalla ravistellen jolloin asettuu pH-arvo noin 12. Vesipitoisen dispersion pH lasketaan sen jälkeen lisäämällä 0,1N suolahappoa arvoon noin 7-8. KUL-saanto on kullekin näytteelle kasvavaa muna-fosfatidihappopitoisuutta vastaavasti: %-muna-fosfatidihappoa_20 30 50 80 %-KUL 10 17 26 45

Esimerkki 15:

Esimerkkiä 14a) vastaavasti liuotetaan näytteet, jotka sisältävät erisuuruiset määrät muna-fosfatidihappoa ja mono-myristiiniä (kokonaislipidimäärä: 10 mg) kulloinkin 0,5 ml: aan kloroformi/metanoli-seosta (2:1) ja haihdutetaan nämä liuokset tyhjössä. Jäännös dispergoidaan kulloinkin 1 ml:aan 0,01N natriumhydroksidiliuosta samalla ravistellen, jolloin asettuu pH-arvo noin 12. Vesipitoisen dispersion pH lasketaan sen jälkeen lisäämällä 0,1N suolahappoa arvoon noin 7-8. KUL-saanto on kullekin näytteelle kasvavaa muna-fosfatidi-happopitoisuutta vastaavasti: %-muna-fosfatidihappoa_30 50 80 %-KUL 9 18 38

Esimerkki 16: a) Esimerkkiä la) ja Ib) vastaavasti valmistetaan lipo- somiseos, joka koostuu muna-fosfatidihaposta, jolloin saadaan KUL-saanto joka on 66 %. GUL-osamäärän nostamiseksi li-posomiseoksessa lisätään dispersiin faasiin, joka sisältää vastavalmistettuja unilamellaarisia liposomeja, 0,5 molaa-rista keittosuolaliuosta. Natriumkloridi-konsentraation lisääntyessä dispersissä faasissa laskee KUL-osuus: rNaCllmoollna/1 0 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,75 0,95 %-KUL 66 64 50 40 30 23 15 11 b) GUL-osamäärän nostamiseksi liposomiseoksessa lisätään dispersiin faasiin, joka sisältää vastavalmistettuja unilamellaarisia liposomeja puhtaasta muna-fosfatidihaposta, 0,5 molaarista kaliumkloridiliuosta. Kaliumkloridikonsentraation kasvaessa dispersissä faasissa laskee KUL-osuus: 2β 79245 Γ KC11 mool lna/1_0 0,2 0,4 0,5 0,63 %-KUL 66 63 50 50 36

Esimerkki 17:

Esimerkkejä 1-16 vastaavasti voidaan valmistaa unilamel-laarisia liposomeja myristiinihaposta ja muna-lesitiinistä, myristiinihaposta ja muna-kefaliinista, öljyhaposta ja muna-lesitiinistä, öljyhaposta ja muna-kefaliinista, dimyristoyy-lifosfatidihaposta ja dimyristoyylilesitiinistä, dipalmito-yylifosfatidihaposta ja l-palmitoyyli-2-oleoyylilesitiinis-tä, l-palmitoyyli-2oleoyylifosfatidihaposta ja dipalmitoyy-lilesitiinistä, l-palmitoyyli-2-oleoyylifosfatidihaposta ja l-palmitoyyli-2-oleoyylilesitinistä, muna-lysofosfatidiha-posta ja muna-lesitiinistä, 1-myristoyylilysofosfatidiha-posta ja l-palmitoyyli-2-oleoyylilesitiinistä, 1-palmitoyy-lilysofosfatidihaposta ja l-palmitoyyli-2-oleoyylilesitii-nistä, lysofosfatidyyliseriinistä naudan aivoista ja muna-lesitiinistä, 1-palmitoyyli-lysofosfatidyyliseriinistä, 1-palmitoyyli-2-oleoyylilesitiinistä ja lysofosfatidyyliseriinistä naudan aivoista ja muna-kefaliinista.

Esimerkki 18: 2 mg hydrokortisoni-21-palmitaattia, 40 g muna-lesitiiniä ja 20 mg muna-fosfatidihappoa liuotetaan 5 mitään tert.-butanolia, steriilisuodatetaan 0,2 /um-suodattimen läpi, täytetään 25 mitään pienpulloon, jäähdytetään upottamalla pullo kuivajää/etanoli-kylmäseokseen ja lyofilisoidaan. Muodostuneeseen vaahtoon lisätään 5 ml steriiliä tislattua vettä ja dispergoidaan ravistelemalla 10 minuuttia. Lisäämällä 0,1N steriilisuodatettua natriumhydroksidia pH säädetään arvoon 10,5 ja annetaan seistä minuutin ajan. Sen jälkeen lisätään 0,5 ml 10-kertaista konsentraattia fosfaattipuskuroidusta isotonisesta keittosuolaliuoksesta, jonka pH on 7,4 (PBS in-jektiotarkoituksia varten). Näin saatu unilamellaaristen li-posomien dispersio sopii injektiota varten tulehduksellises-ti muuttuneisiin nivelkapseleisiin.

Il 29 79245

Esimerkki 19: 0,1 mg N-asetyylimuramyyli-L-alanyyli-D-isoglutamyyyli-L-alanyyli-2-(1',2'-dipalmitoyyli-sn-glysero-3'-fosforyyli)-etyyliamidia, 7 mg kromatograafisesti puhdistettua lesitiiniä kanan munanvalkuaisesta ja 3 mg muna-fosfatidihappoa liuotetaan 2 ml:aan kloroformi/metanoli-seosta (2:1) ja haihdutetaan tyhjössä. Jäljelle jää kirkas lipidikalvo. Tämä kalvo dispergoidaan lisäämällä 2 ml steriiliä tislattua vettä ravistellen ja lisätään tippa 0,1 %:sta tymoliftaleiini-liuosta. Dispersioon lisätään 0,1N natriumhydroksidia värin-muutokseen asti, jolloin tapahtuu unilamellaaristen liposo-mien spontaaninen muodostus. Heti sen jälkeen puskuroidaan lisäämällä 0,2 ml 10-kertaista konsentraattia fosfaattipus-kuroidusta isotonisesta keittosuolaliuoksesta (PBS injektio-tarkoituksia varten) pH-arvoon 7,4.

Muodostunut dispersio sopii suoraan alveolääristen mak-rofagien aktivoimiseksi soluviljelmissä tai in vivo-rotassa. Esimerkki 20: 0,15 g N-asetyylimuramyyli-L-alanyyli-D-isoglutamyyli-L-alanyyli-2-(1^21-dipalmitoyyli-sn-glysero-3'-fosforyyli)-etyyliamidia, 27 g muna-lesitiiniä jossa on 97 % fosfatidyy-likoliinia ja 3 g muna-fosfatidihappoa liuotetaan seokseen, jossa on 200 ml kloroformia ja 20 ml metanolia, lisätään 200 ml tert.-butanolia ja tiivistetään 180 ml:aan. Liuos sterii-lisuodatetaan 0,2 /um-suodattimella, jäähdytetään nopeasti etanoli/kuivajää-seoksessa ja jäähdytyskuivataan sen jälkeen. Jauhamalla hienonnettu lyofilisaatti lisätään 300 ml: aan steriilisti valmistettua 0,01N natriumhydroksidiliuosta samalla voimakkaasti hämmentäen. Kun on saatu täydellinen dispersio neutraloidaan vesifaasi lisäämällä 0,1N HC1. Saatu opalisoiva dispersio täytetään hämmennettyyn ultrasuodatus-kennoon (Amicon®), joka ultrasuodattimen asemesta on varustettu suorahuokoisesta suodattimesta polkarbonaatista (Nucelopore®), jonka huokosläpimitta on 0,1 /um ja pestään hiukkasvapaaksi ja suodatetaan käyttäen pientä ylipainetta ja lisäämällä jatkuvasti steriilisuodatettua Dulbecco-pusku- 30 7 9 2 4 5 riliuosta (pH 7,4 ilman Ca ja Mg) että tilavuus kennossa ei laske alle 300 ml. Kun 3 litraa suodosta on valunut läpi on kaikki KUL erotettu ja päällä oleva GUL-dispersio voidaan täyttää ampulleihin ja käyttää käsittelykokeisiin.

Esimerkki 21: 15 mg N-asetyylimuramyyli-L-alanyyli-D-isoglutamyyli-L-alanyyli-2-(1',2'-dipalmitoyyli-sn-glysero-3'-fosforyyli)-etyyliamidia, 0,6 g puhdasta muna-lesitiiniä ja 2,4 g muna-fosfatidihappoa liuotetaan seokseen, jossa on 20 ml kloroformia ja 2 ml metanolia, steriilisuodatetaan 0,2 /um-suo-dattimen läpi ja haihdutetaan 500 ml:n pyörökolvissa joka on pesty partikkelivapaaksi, käyttäen steriilisuodatin-ilman-poistolla varustettua pyörivää haihdutinta siten, että lipi-diseos kuivuu pullon seinämille mahdollisimman tasaiseksi kalvoksi. Jäännöksen kuivaamisen jälkeen yli yön suurtyhjös-sä lisätään 30 ml steriilisesti valmistettua 0,01N natrium-hydroksidiliuosta, kolvi suljetaan ja ravistellaan 5 minuuttia. Muodostunut opalisoiva vesipitoinen faasi säädetään pH-arvoon 7,4 lisäämällä steriilistä 0,1N suolahappoa. Täytetään hämmennettyyn suodatinkennoon (kokonaistilavuus 100 ml) esimerkin 18 mukaisesti, minkä jälkeen suodatetaan lisäämällä steriiliä, hiukkasvapaata suodatettua vettä niin kauan kunnes on kerätty 500 ml suodosta. Tämä suodos syötetään hämmennettyyn suodatuskennoon, joka on varustettu ultrasuo-dattimella, esim. Amicon U 10®, jatkuvasti ja väkevöidään 30 ml:n tilavuuteen. Konsentroitu dispersio sisältää pieniä unilamellaarisia liposomeja ja ne voidaan täyttää ampulleihin fosfaattipuskurin konsentraatin lisäämisen jälkeen, Dul-becco, (pH 7,4 ilman Ca ja Mg) ja käyttää käsittelykokeisiin.

Il

Claims (2)

31 79245

1. Menetelmä unilamellaaristen liposomien valmistamiseksi, tunnettu siitä, että a) lipidin, jonka kaava on R, O I J II Rl-CH2"?~CH2~°~?-OR4 (A) r2 OH jossa on vety, alkyyli, alkoksi tai asyylioksi, joissa on kussakin 10-20 C-atomia, R2 on vety, hydroksi tai C^-C^-al-kyyli, R3 on vety tai C1-C4-alkyyli ja R4 on vety, C^-C^-al-kyyli, C1-C4-alkyyli, joka on substituoitu karboksilla ja aminolla, jolloin aminoryhmä on a-asemassa karboksiryhmään nähden, C^-C^-alkyyli, joka on substituoitu halogeenilla tai C2-C4-alkyyli, joka on substituoitu vapailla tai eetteröidyil-lä hydroksiryhmillä, jolloin kaksi eetteröityä hydroksiryh-mää voivat olla sitoutuneita keskenään bivalenttisella hii-livetytähteellä, tai 5-12 hiiliatomia sisältävä hiilihydraat-titähde, ja sopivan kaavan A mukaisen lisälipidin, jossa R^ ja R2 ovat asyylioksi, jossa on 10-20 C-atomia, R3 on vety ja R4 on tri-C1-C4-alkyyliammoniumilla substituoitu C2-C4-alkyyli tai 2-aminoetyyli, tai kaavan A mukaisen lipidin, jossa R-j^ ja R2 toisistaan riippumatta ovat alkyyli, alkoksi tai asyylioksi, joissa on 10-20 hiiliatomia, ja R3 ja R4 ovat vety ja mahdollisesti yhden mainituista kaavan A mukaisista lisälipideistä homogeeninen kerros dispergoidaan vesipitoiseen faasiin, jonka pH-arvo on suurempi kuin 9, tai b) kaavan A mukaisen lipidin, jossa R^^ on vety, alkyyli, alkoksi tai asyylioksi, joissa on kussakin 10-20 C-atomia, ja R2 on vety, hydroksi, tai C1-C4-alkyyli, R3 on vety ja R4 ammonioryhmällä substituoitu C2-C4-alkyyli ja mahdollisesti kohdassa a) mainitun kaavan A mukaisen lisälipidin tai kaavan A mukaisen lipidin, jossa Rj^ ja R2 ovat asyylioksi, jossa on 10-20 C-atomia, R3 on vety ja R4 on ammonio-C2-C4-al- 32 79245 kyyliammonioryhmällä substituoitu C2~C4-alkyyli, ja kohdassa a) mainitun, kaavan A mukaisen lisälipidin homogeeninen kerros dispergoidaan vesipitoiseen faasiin, jonka pH-arvo on alle n. 1 ja neutraloidaan vesipitoinen faasi ja haluttaessa rikastetaan saadut unilamellaariset liposomit ja/tai erotetaan ne.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että vesipitoinen dispersio sisältää kaavan A mukaisen lipidin, jossa R-j^ on C10-C2o"alkyyli' Cl0-C20“alkolc” si, C10-C20-asyylioksi, R2 on vety tai hydroksi, R3 on vety tai metyyli, ja R4 on vety, C1-C4-alkyyli, 2-amino-2-karbok-sietyyli tai 3-amino-3-karboksi-n-propyyli, 2-hydroksietyy-li, 2,3-hydroksipropyyli, 2,3-etyleenidioksipropyyli, 2,3-(2,2-propyleeni)-di-oksipropyyli, halogeeni-C2-C4-alkyyli, tai 5-12 C-atomia sisältävä hiilihydraattitähde, ja kaavan A mukaisen lisälipidin, jossa ja R2 on C1Q-C2o~asyylio^si» R3 on vety ja R4 on 2-trimetyyli-ammonioetyyli tai 2-amino-etyyli. l. Förfarande för framställning av unilamellara liposo-mer, kännetecknat därav, att a) man dispergerar ett homogent skikt av en lipid med for-meln Ri 0 I J il R1_CH2_C_CH2_0~P_0R4 (A) r2 OH i vilken R1 är väte, alkyl, alkoxi eller acyloxi var och en med 10-20 C-atomer, R2 är väte, hydroxi eller C1-C4-alkyl, R3 är väte eller C1-C4-alkyl och R4 är väte, C^-C^-alkyl, C^-C^-alkyl som är substituerad med karboxi och amino, var-vid aminogruppen är i α-ställningen i förhällande tili kar- II