KR910004574B1 - 프럭토즈 1,6-디포스페이트를 함유하는 리포좀의 제조방법 - Google Patents

Abstract

내용 없음.

Description

프럭토즈 1,6-디포스페이트를 함유하는 리포좀의 제조방법

본 발명은 정상적으로는 세폭막을 통해 세포내에 도입될 수 없는 화합물인 프럭토즈 1,6-디포스페이트(FDP)를 세포내에 용이하게 도입시키기 위해, FDP를 함유하는 리포좀을 이용하는 치료제 조성물의 제조 방법에 관한 것이다.

이러한 방법으로 프럭토즈 1,6-디포스페이트는 세포에 직접 영향을 미칠 수 있으므로 가장 큰 치료 효과를 얻을 수 있다.

프럭토즈 1,6-디포스페이트(FDP)는 고대사성 상태 또는 약물중독 상태의 치료, 자궁 및 근육이완, 외상치료에 사용되는 화합물이다. 최근 연구에서 프럭토즈 1,6-디포스페이트는 세포막을 통해 세포내에 침투할 수 없는 것으로 확인되었다. 프럭토즈 1,6-디포스페이트의 치료효과는 막을 통한 이온의 이동을 변화시키는 능력에 기인하는 것이며, 이러한 방법으로 세포내의 신진대사에 영향을 미쳐 상술한 약학적 효과를 나타낼 수 있다. 상술한 화합물에 의한 작용효과를 증가시키기 위해 본 발명에서는 약제가 가장 큰 효과를 나타낼 수 있도록 프럭토즈 1,6-디포스페이트를 세포내에 직접 도입시키는 치료방법을 제공한다. 본 발명의 방법은 프럭토즈 1,6-디포스페이트 및 또는 그의 이성체를 함유하는 조성물에 있어서 리포좀을 이용하는데 그 목적이 있다.

일반적으로 리포좀은 다른 물질의 내부에 함유되어 있는 것과 마찬가지로 여러 가지 형태 및 크기의 지질 이중 층으로 구성되어 있다. 또한 원형질막 수포의 지방질의 일부가 용해 될 수 있다는 것이 알려져 있다. (참조 : G. Poste, D. Papahadjopoulos 생물학과 의학에 있어서 지방과 그 사용방법. page : 164-184, Am. N. Y. Acad. Sci. 1978 : M. Giomini. A. M. Giuliani, II Farmaco(Prat.) 34. 3-14, 1979).

현재 리포좀이 부패할 경우, 다른 물질이 이동하는 것과 마찬가지로 움직인다는 가설도 있다. 이러한 가설은 리포좀의 수성 부분에 함유되어 있는 분자들이 세포질 내로 들어 갈 수 있는 가능성을 나타내고 있다. 차후 실험에 의하여 이러한 가설은 명백히 입증되었다.

결론적으로 본 발명에 의한 치료방법은 하기와 같은 단계로 구성되어 있다 :

a) 리포좀 내에 활성약제를 함유시키는 단계, 그리고

b) 원형질막과 리포좀의 지방의 일부분과의 합과정을 사용함으로써 세포질내에 상기 활성약제를 도입시키는 단계.

본 발명은 또한 다음 단계들로 이루어지는 리포좀의 제조방법에 관한 것이다.

a) 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제된 포스포리피드로 구성된 리포좀을 제조하여, 이것을 유기용매에 용해시키고 프럭토즈 1,6-디포스페이트의 수용액과 함께 초음파로 처리하는 단계 ;

b) 세포막을 사용하여 한외여과하여 농축시키는 단계 ; 그리고

c) 결합되지 않는 프럭토즈 1,6-디포스페이트를 겔 여과에 의해 정제하는 단계.

수득된 생성물의 약리학적 유효성은 인체 혈액을 17℃에서 온도를 일정하게 유지하고 교반하면서 배양하여 적혈구에서의 ATP 레벨을 측정함으로써 평가된다. 이러한 파라메타는 결과적으로 그의 이성체도 프럭토즈 1,6-디포스페이트의 약리학적 효력 연구를 위하여 가장 유효한 것임을 나타내고 있다. 다음 실시예는 리포좀의 제조방법에 관해 구체적으로 설명하기 위해 제공되는 것이다.

[실시예 1]

무가공의 레시틴 5g(예 : 달걀)을 약 10ml의 클로로포름에 용해시키고, 실리카겔로 충전된 칼럼에 통과시킨 후, 클로로포름-메탄올 직선구배의 용출액으로 용출시킨다.

여기에서 포스파티딜콜린 3.5g을 함유하는 메탄올 용출분획(n-5)을 수득한다. 수득된 분획의 순도는, 클로로포름-메탄올-H₂O(65-35-5)를 용출제로 사용하여 박층 실리카겔 플레이트 크로마토그라피에 의하여 확인한다.

Rf=0.24

생성물 500mg을 질소 대기중, -20℃의 냉각기에서 보존한후 젖빛 유리마개가 있는 500ml의 용기내에서 에틸에테르 150ml에 용해시킨다.

수득된 투명한 용액에 클로로포름 150ml 및 계속해서 프럭토즈 1,6-디포스페이트의 용액(1mg/ml의 농도로)을 pH=7.4에서 첨가한다.

상기 언급한 조작은 생성물의 제조과정중, 원치않는 우발적인 지질의 산화작용의 가능성을 방지하기 위해 질소 대기하에서 수행한다.

이렇게 하여 수득된 혼합물을 수욕중에서 (1분씩 총괄 5분의 휴지기) 15분 동안 초음파로 처리하며, 이때 수욕온도는 15℃ 이하로 내려가지 않도록 하여야 한다.

이와같이 수득된 커다란 수포는 리포좀군(입도는 대략 300Å)을 균일하게 하기 위하여 0.45μm의 막을 통하여 여과한다. 이렇게 여과가 끝나면 대략 질소의 압력하에 YM 30 Diaflo 막으로 이루어진 Amicon의 여과용 장치속에서 초음파에 순응하는 45ml의 현탁액이 남게 된다(Amicon과 Diaflo는 등록된 상표이다).

본 예비 농축 실험에 의하여 대략 60-65%의 프럭토즈 1,6-디포스페이트가 유리된다.

잔유용액(대략 20ml)을 표준 리포좀의 현탁액으로 충전한, "세파로스 4B"(등록된 상포)란 명칭으로 통상적으로 알려진 덱스트란의 이량체를 함유하고 있는 칼럼에 충전시킨다.

진공량(덱스트란 블루를 이용하여 미리 측정함) 다음에 tri-HCl- NaCl-0.1M(pH=7.5) 완충용액을 이용하여 용출되는 최초의 분획을 수집한다.

수득된 리포좀 분획은 질소의 압력하에서 Diaflo YM 30 막과 함께 Amicon 한외여과장치 속에서 최종 농도로 농축시킨다.

1ml당 프럭토즈 1,6-디포스페이트 1.3 내지 1.5mg을 함유하는 현탁액을 수득하는데, 이것은 수포의 외면에 포함하고 있지 않은 약제로부터 얻은 것이다.

이와같이 수득된 프럭토즈 1,6-디포스페이트를 함유하고 있는 리포좀은 후술하는 바와같이 유사한 양의 약제를 함유하지 않은 것과, NaCl을 0.9% 함유하고 있는 유사한 양의 리포좀과 시험관내에서 비교하였다.

[실시예 2]

인체 혈액 2.25ml에 프럭토즈 1,6-디포스페이트 1.35mg/ml을 함유하는 리포좀 0.25ml을 첨가하여 계속 교반하면서 37℃로 조절된 정온수욕기 속에 넣고 배양한다.

인체 혈액의 다른 2개의 샘플을 동시에 배양하면 각 2.25ml 마다 프럭토즈 1,6-디포스페이트(1.35mg/ml)의 용액 0.25ml과 NaCl을 0.9% 함유하고 있는 리포좀 0.25ml을 함유한다. 배양후 적혈구에서의 ATP양을 여러 시점에서 측정하여, 다음 표에 그 결과를 기술하였다.

[도표 1]

주 : ATP의 기본치는 530γ/ml 이다.

각 기본치는 다수의(6) 결과를 평균한 것이다. 상기 표의 결과를 분석해 볼 때 리포좀중에 함유되지 않은 프럭토즈 1,6-디포스페이트와는 완전히 다르게, 피로좀의 작용하에 적혈구내에 도입된 프럭토즈 1,6-디포스페이트는 적혈구의 신진대사에 영향을 미친다. 이것은 약제가 함유되어 있는 세포중에서 연속적으로 유리되면서, 세포질 막과 리포좀의 융합이 가능하다는 것을 입증해 주고 있다. 이러한 가설을 입증하기 위하여 상술한 방법에 의하여 제조된 프럭토즈 1,6-디포스페이트(C¹⁴표시가 된)를 함유하는 리포좀을 이용하여 인체 혈액의 배양실험을 반복한다. 유리된 프럭토즈 1,6-디포스페이트와 유사한 양을 비교하여 수행할 시험에서는 리포좀중에 함유된 프럭토즈 1,6-디포스페이트만이 적혈구 막을 통과할 수 있다는 것을 증명하여 주고 있다. 유리된 프럭토즈 1,6-디포스페이트에 대한 세포중에 도이된 리포좀 속에 함유된 프럭토즈 1,6-디포스페이트의 양의 백분율을 구한다.

Claims (1)

1. 칼럼 크로마토그라피에 의해 정제된 포스포리피드로 이루어진 성분을 제조하여, 이것을 유기용매에 용해 시키고 프럭토즈 1,6-디포스페이트의 수용액과 함께 초음파로 처리하는 단계 ; 세포막을 사용하여 한외 여과에 의하여 농축시키는 단계 ; 그리고 결합되지 않은 프럭토즈 1,6-디포스페이트를 겔 여과에 의해 정제하여 최종적으로 농축시키는 단계로 이루어지는 것을 특징으로 하는, 프럭토즈 1,6-디포스페이트를 함유하는 리포좀을 제조하는 방법.