KR100431503B1 - 자외선에 의한 피부세포 손상을 억제하는 프럭토스1,6-디포스페이트 및 그의 염을 함유한 화장료 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 프럭토스 1,6-디포스페이트(D-fructose 1,6-diphosphate) 및 그의 염을 함유한 화장물 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 화장료 조성물은 상기 프럭토스 1,6-디포스페이트를 함유하여, 우수한 피부 안전성 및 자외선에 의한 피부세포 손상 억제 기능을 제공한다.

Description

자외선에 의한 피부세포 손상을 억제하는 프럭토스 1,6-디포스페이트 및 그의 염을 함유한 화장료 조성물{Cosmetic composition containing a D-fructose 1,6-diphosphate inhibiting a skin cell injury by the ultraviolet}

본 발명은 자외선에 의한 피부 세포 손상을 억제하는 프럭토스 1,6- 디포스페이트(D-fructose 1,6-diphosphate) 및 그의 염을 함유한 화장료 조성물에 관한 것이다.

세포는 외부로부터 가해지는 자외선, 환경오염물질, 급격한 기온의 변화 등과 같은 세포손상 자극들로 세포내의 다양한 생화학적 변화를 유도하여 세포 손상 반응을 일으킨다. 또한, 세포 손상 반응 중 피부노화는 이런 외부의 자극들에 의해 유발된 산화적 손상 반응의 결과로 나타나는 피부의 생리학적 기능 변화에 부분적으로 기인된다고 알려져있다.

즉, 피부 세포의 세포막이 활성산소나 다른 라디칼에 의해 지속적으로 손상을 입게 되면 단백질이나 지질단백질(lipoprotein)의 가교(cross- linkage)가 증가하거나 분해가 되어, 과산화 지질의 양도 증가하게 된다. 따라서, 세포막의 투과성이 변화하여 세포 내의 이온 균형이 깨지게 되고, 이런 변화는 세포 내의 대사 찌꺼기의 배출을 막고, 이 대사 찌꺼기를 제독하는 세포의 기능을 또한 감소시키게 된다. 그리고, 세포 내의 칼륨 농도의 증가로 콜로이드 밀도가 증가하면, mRNA나 단백질의 합성이 방해를 받게 되어, 그 결과 세포 손상을 치유할 수 있는 능력은 더욱 떨어지게 된다.

이처럼 세포 수준의 변화가 지속되면, 피부 조직의 구조(tissue structure)가 규칙성을 잃게 되고, 동시에 개별 세포들은 상대적으로 커지면서, 전체 세포 수는 감소하게 된다. 또한, 진피(dermis)에 국소적인 상흔이 나타나고, 콜라겐 섬유(collagen fiber)나 탄력섬유(elastic fiber)의 감소로 진피 두께가 줄어든다. 콜라겐 섬유끼리의 가교도 증가하며 탄력섬유의 미세한 구조도 손상되어 전체적으로 피부의 탄력 저하가 나타난다. 즉, 외부 자극원에 의한 피부 세포의 산화적 손상은 궁극적으로 피부의 노화를 촉진시키게 된다.

이러한 산화적 세포 손상을 일으키는 물질들로는, 산화적 스트레스에 의해 발생하는 과산화수소(H₂O₂), 초과산화물 음이온(superoxide anion), 수산화라디칼 (hydroxy radical) 등이 있으며, 이러한 유해 활성 산소종들의 세포내 독성을 제거하기 위해 우리 신체는 글루타치온(glutathione), 초과산화물 불균등화 효소(superoxide dismutase;SOD)와 같은 내인성 항산화 시스템을 갖추고 있다. 그러나, 세포내 대사활동이 지나치게 증가하거나, 신체가 감염, 과도한 운동, 방사선 또는 화합물과 같은 외인성 스트레스에 노출되면 이러한 내인성 항산화 능력을 초과하게 되는 경우가 있으며, 이때 자유라디칼에 의한 세포 손상이 나타나게 된다. 그러므로, 피부 세포 자체의 내인성 항산화력을 증가시키는, 즉 세포의 생리적인 환원력을 증가시키는 물질은 자외선과 같은 자극으로부터 세포 손상을 억제할 수 있는 것이다. 그러므로, 종래에는 이러한 세포 손상을 억제하기 위해 라디칼 소거 효과가 탁월한 비타민C, 비타민E, 녹차카테킨(green tea catechin) 등의 항산화물질을 화장료에 보편적으로 사용하고 있다. 그러나 물리 화학적인 라디칼 소거에 의존하는 기존의 방법은, 제품에 적용할 경우 효력이 매우 빠르게 감소하는 등의 화학적 안정성면의 문제점이 있고, 고용량으로 사용할 경우 세포 스스로의 항산화 작용을 고려하지 않은 비특이적인 작용으로 피부 세포에 자극을 유발할 수 있다.

이에, 본 발명자들은 상기한 문제점을 해결하기 위하여 물리화학적인 라디칼 소거에 의존하지 않고 세포 손상 보호물질인 항산화제를 찾기 위해 수백 여종의 화합물들을 무작위로 선정하여 자외선에 의한 피부 세포 손상 억제기능을 연구한 결과, 프럭토스 1,6-디포스페이트가 우수한 피부세포 손상 억제 효과가 있음을 발견하였다.

더 나아가 본 발명자들의 폭넓은 연구의 결과로서, 조성물 총 중량에 대하여 0.0001~20 중량%의 양으로 프럭토스 1,6-디포스페이트 및 그의 염을 함유하는 경우 세포손상을 억제하고, 우수한 피부 안정성을 나타낼 수 있음을 발견하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 피부 세포 손상을 억제하는 물질을 발견하여 지속적으로 산화적 스트레스에 노출되는 피부 세포 손상을 억제하고, 피부 안정성이 우수한 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

도 1은 프럭토스 1,6-디포스페이트의 자외선(UV B 30mJ/㎠)에 의한 각질형성세포 손상 억제 효과를 보여주는 그래프이다.

도 2는 프럭토스 1,6-디포스페이트의 자외선에 의한 각질형성세포의 활성산화물(ROS)생성 억제 효과를 보여주는 그래프이다.

도 3은 자외선 조사 후 각질형성세포의 글루타치온(GSH)양의 변화를 보여주는 그래프이다.

도 4는 프럭토스 1,6-디포스페이트의 자외선에 의한 각질형성세포의 프로스파글란딘 생합성 억제 효과를 보여주는 그래프이다.

상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에 따른 세포손상 억제기능의 화장료 조성물은 프럭토스 1,6-디포스페이트 및 그의 염을 조성물 총 중량에 대하여 0.0001~20 중량%의 양으로 함유하는 것을 특징으로 한다.

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

본 발명의 피부세포 손상 억제용 조성물은 프럭토스 1,6-디포스페이트 및 그의 염을 유효성분으로 함유한다. 즉, 프럭토스 1,6-디포스페이트는 글루타치온 생성 촉진효과 및 시클로옥시게나제-2 효소의 활성 억제 효과를 가짐과 동시에, 피부 안전성이 우수한 화장료 조성물을 제공할 수 있다.

또한, 상기 프럭토스 1,6-디포스페이트는 염의 형태로도 사용될 수 있는 구체적인 예로는 나트륨염 및 칼륨염 등이 있다.

본 발명의 프럭토스 1,6-디포스페이트는 조성물 총 중량에 대하여 0.0001~20 중량%의 양을 함유하는 것이 바람직하며, 프럭토스 1,6-디포스페이트의 나트륨염 및 칼륨염도 0.0001~20 중량%으로 함유하는 것이 바람직하다.

본 발명의 프럭토스 1,6-디포스페이트 및 그의 염을 함유한 화장료 조성물은 피부에 적용할 수 있는 일반적인 제형으로 제형화될 수 있으며, 예를 들면 화장수, 크림, 로션, 스킨로션, 팩, 파운데이션 등과 같은 화장품뿐만 아니라 액상비누, 고형비누, 세안 폼(foam)과 같은 인체세정제 등으로 제형화될 수 있다. 이들 각 제형은 그 제형의 제제화에 따라 적절한 각종의 기제 및 첨가물을 함유할 수 있으며, 이들 성분의 종류와 양은 발명자에 의해 용이하게 선정될 수 있다.

이하 실시예 및 시험예를 들어 본 발명을 상세히 설명하지만, 본 발명이 이들 예로만 한정되는 것은 아니다.

본 실시예에서는 피부세포 손상으로서 자외선에 의한 것을 대상으로 하였으며, 본 실시예에서 사용된 프럭토스 1,6-디포스페이트(D-Fructose 1,6-diphosphate)는 미국 시그마사(St. Louis, MO, USA)에서 구입한 시약을 사용하였다.

[시험예 1] 프럭토스 1,6-디포스페이트의 자외선에 의한 세포 손상 억제 효과

사람의 표피 조직에서 분리한 각질형성세포(keratinocyte)를 96웰(well)형 세포배양 플레이트의 각 웰에 1×10⁴개씩 넣고 24시간 동안 부착하였다. 18시간 후, 배양액을 제거하고 각 웰에 50㎕의 인산완충염액(phosphate buffered saline, PBS)을 넣었다. 이 각질형성세포에 자외선 B(UV B) 램프(Model: F15T8, UV B 15W, Sankyo Dennki사, Japan)를 이용하여 자외선 30mJ/㎠를 조사한 후, PBS를 덜어내고 각 웰에 각질형성세포 배양액(keratinocyte growth media, Clonetics, BioWhittacker사, MD, USA) 200㎕를 첨가하였다.

여기에 프럭토스 1,6-디포스페이트를 1mM, 5mM, 10mM 및 20mM의 농도로 처리한 후, 16~20시간 동안 배양하였다. 일정 시간 경과 후, 배양 상층액을 적당량 취하여 세포 손상의 지표 효소인 젖산탈수소화효소(lactate dehydrogenase, LDH)의 양을 정량하였다. 배양 상층액 중의 LDH 양은 프로메가사(Madison, WI, USA)의 Cytotox 96 non-radioactive cytotoxicity assay 키트를 이용하여 측정하였으며, 그 결과를 하기 도 1에 나타내었다.

도 1에서 보는 바와 같이, 프럭토스 1,6-디포스페이트는 자외선에 의한 사람의 각질세포 손상에 따른 LDH의 증가를 20mM의 농도에서는 약 86.3%, 10mM에서는 약 64.7% 만큼 억제하였다. 이상에서, 프럭토스 1,6-디포스페이트는 자외선과 같은 외부 자극에 대해 피부 세포를 보호하는 효과가 있음을 확인하였다.

[시험예 2] 프럭토스 1,6-디포스페이트의 반응성 활성산화물(reactive oxygen species)생성 억제 효과

자외선에 의해 피부세포에서 증가하는 활성산소류에 대한 생성 억제 실험을 하기위해, 사람의 표피 조직에서 분리한 각질형성세포(keratinocyte)를 24웰형 세포배양 플레이트의 각 웰에 5×10⁴개씩 넣고 24시간 동안 부착하였다. 16시간 후,프럭토스 1,6-디포스페이트를 10mM 처리하고 다시 2시간 후, 배양액을 제거하고 각 집에 100㎕의 인산완충염액(PBS)을 넣었다. 이 각질형성세포에 자외선 B(UV B) 램프(Model: F15T8, UV B 15W, Sankyo Dennki사, Japan)를 이용하여 자외선 30mJ/㎠를 조사한 후, PBS를 덜어내고 각 웰에 각질형성세포 배양액 200㎕를 첨가하였다. 여기에 프럭토스 1,6-디포스페이트를 다시 처리하고 일정 시간대별로 자외선 자극에 의해 증가한 반응성 활성산화물(reactive oxygen species; ROS)의 양을 정량하였다. ROS의 양은 ROS에 의해 산화되는 디클로로플루오르신 디아세테이트 (dichlorofluorescin diacetate;DCF-DA)의 형광을 측정하는 Tan의 방법을 참고하여 정량하였으며(Tan et al., 1998, J. Cell Biol. Vol. 141, pp1423-1432), 그 결과를 하기 도 2에 나타내었다.

도 2에서 프럭토스 1,6-디포스페이트는 자외선에 의해 피부 세포 손상을 일으키는 것으로 알려진 반응성 활성산화물(ROS)의 생성을 억제한다는 것을 알 수 있었다.

[시험예 3] 프럭토스 1,6-디포스페이트의 글루타치온(glutathione;GSH) 생성 촉진 효과

세포내의 환원력의 지표인 글루타치온(GSH)의 생성 촉진효과를 시험하기 위하여, 사람의 각질형성세포(keratinocyte)를 직경 10㎝의 원형 세포배양 플레이트에 5×10⁵개씩 넣고 24시간 동안 부착하였다. 18시간 후, 배양액을 제거하고 각 웰에 2㎖의 인산완충염액(PBS)을 넣었다. 이 각질형성세포에 자외선 B(UV B)램프(Model: F15T8, UV B 15W, Sankyo Dennki사, Japan)를 이용하여 자외선 30mJ/㎠를 조사한 후, PBS를 덜어내고 각 집에 각질형성세포 배양액을 5㎖를 첨가하였다. 여기에 프럭토스 1,6-디포스페이트를 다시 처리하고 일정 시간대별로 자외선 자극에 의해 변화하는 GSH의 양을 정량하였다. GSH 정량은 GSH가 5,5-dithiobis-2-nitrobenzoic acid에 의해 환원되면서 생성되는 5-thio-2-nitrobenzoate의 흡광도를 측정하는 원리의 Akerboom과 Sies의 방법에 따라 수행하였으며(Akerboom Sies, 1981, Methods Enzymol. Vol 77, pp373-382), 그 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3에서 보는 바와 같이, 프럭토스 1,6-디포스페이트에 의해 피부의 각질세포의 GSH 양이 증가함을 확인하였다. 피부 세포에서 GSH는 높은 환원력을 보유하고 있으므로 자외선에 의한 세포 손상이 유발되었을 때 발생하는 ROS 양을 줄일 수 있고, 도 2와 도 3의 결과로부터 프럭토스 1,6-디포스페이트가 피부 세포의 산화적 손상을 억제하는 물질임을 알 수 있었다.

[시험예 4] 프럭토스 1,6-디포스페이트의 시클로옥시게나제 (cyclooxygenase)-2 활성 억제를 통한 프로스타글란딘 E2 생합성 억제 효과

피부세포는 자외선과 같은 외부의 자극에 의해 시클로옥시게나제 (cyclooxygenase 또는 prostaglandin H2 synthetase; 이하 COX라 칭함)-2 효소가 대량으로 발현된다는 사실이 보고된 바 있다(Wilgus et al., 2000. Prostaglandins other Lipid Mediators, Vol.62, pp367-384). 따라서, 자외선에 의한 세포손상으로 세포막에 있는 아라키돈산을 프로스타글란딘으로 전환시키는 COX-2 효소활성 억제실험을 하기 위해 각질형성세포(keratinocyte)를 96집형 세포배양 플레이트의 각웰에 1×10⁴개씩 넣고 24시간 동안 부착하였다. 상기의 각질형성세포에 최종 농도가 500uM이 되도록 아스피린을 처리하여, 각질형성세포에 존재하는 프로스타글란딘 생합성 효소의 활성을 억제하였다. 아스피린 처리 2시간 후, 각질 형성 세포가 들어있는 각 웰을 인산 완충 용액(phosphate buffered saline, PBS)으로 2회 세척하고, 각 웰에 50㎕의 인산완충염액(PBS)을 첨가하였다. 이 각질형성세포에 자외선 B(UV B) 램프(Model: F15T8, UV B 15W, Sankyo Dennki사, Japan)를 이용하여 자외선 30mJ/㎠를 조사한 후, PBS를 덜어내고 각 웰에 각질형성세포 배양액 200㎕를 첨가하였다. 여기에 프럭토즈 1,6-디포스페이트를 20mM, 10mM 및 5mM의 농도로 처리한 후, 16~20시간 동안 배양하였다.

배양 상층액에 생합성되어 축적된 프로스타글란딘 E2(PGE2)를 정량하여, 프럭토스 1,6-디포스페이트의 PGE2 억제 효과를 판단하였다. PGE2의 양은 효소면역분석법 (enzyme immunoassay)을 이용하여 정량화하였으며, 그 결과를 하기 도 4에 나타내었다.

하기 도 4에서 보는 바와 같이, 프럭토스 1,6-디포스페이트는 자외선에 의해 COX-2 효소로부터 생합성되는 PGE2의 양을 감소시켰다는 것을 알 수 있다. 자외선(UV B영역) 자극은 일반적으로 피부의 혈류량 및 혈관 투과성을 높이는 염증반응을 유도하여 그 결과, 부종(edema) 및 홍반(erythema)을 일으키고, 서서히 중성과립구(neutrophil)과 같은 세포들이 진피층의 자극부위로 이동하는 동시에 PGE2가 증가하여 면역세포를 염증 부위로 끌어들이는 염증 인자들을 증가시킨다(T.A.Wilgus et al., Topical application of a selective cyclooxygenase inhibitor suppresses UVB mediated cutaneous inflammation, Prostaglandins other lipid mediators 62, 367-384, 2000). 이는 프럭토스 1,6-디포스페이트가 자외선에 의한 염증 매개 인자의 증가를 감소시키는 항염증 효과가 있음을 증명하는 것이다.

[시험예 5] 동물수준에서의 피부 자극 정도 실험

프럭토스 1,6-디포스페이트의 피부 자극 정도를 살펴보기 위해 토끼를 이용하여 피부 자극 유발 여부를 하기의 방법으로 실험하였다. 물과 고형 사료를 자유롭게 섭취시키고 환경에 적응시킨 토끼(2~2.5㎏의 웅성 뉴질랜드 흰 토끼)를 시험에 사용하였다. 등 부위의 털을 깍은 후 약 1.5㎝×1.5㎝ 정도의 크기에 시료 및 대조물질을 도포하였다. 토끼 1마리당 도포할 수 있는 부위는 8~10부위로 하며 시험물질을 동물 투여 부위에 1일 2회, 6시간 간격으로 도포하고, 적용부위를 공기 중에 노출시켰다. 적용부위는 다음 도포 직전에 1일 2회 관찰하였으며, 홍반과 가피 형성, 부종 형성 등의 자극성 유무를 관찰하여, 그 정도를 하기 표 1에 나타낸 판정 기준에 따라 평가하였다. 그 결과를 하기 표 2에 나타내었으며, 표 2에 나타낸 자극 지수는 일반적으로 많이 이용되는 Draize의 일차자극지수(Primary Irritation Index)의 산출 방법에 따라 시행한 결과를 나타낸 것으로서(Draize, J.H., Appraisal of the safety of chemical in foods, drugs and cosmetics. The staff of the division of pharmacology, Food and Drug Education and Welfare, Pub. 1959), 프럭토스 1,6-디포스페이트가 다른 화장료에 비해 자극이 없음을 증명하기 위해 비교물질로 화장료에 많이 사용되는 항산화물질인 비타민C를 사용하였다.

피부 자극의 정도	평점
1) 홍반과 가피형성홍반이 없음아주 경도의 홍반(육안으로 겨우 식별할 정도)명료한 홍반중등도에서 강한 홍반심홍색의 강한 홍반과 가피 형성	01234
2)부종형성부종 없음매우 가벼운 부종(육안으로 겨우 식별할 정도)명료한 부종(주위와 명료한 구분이 됨)중등도의 부종(1㎜정도 부어 올랐을 경우)강한 부종(1㎜ 이상 부어오르고 노출 부위 밖에까지 확장된 상태)	01234
* 피부 일차 자극 지수(Primary irritation index, P.I.I.)=(홍반 평점과 부종 평점의 합의 평균치)/4

	피부 일차 자극 지수(0~4)
비교군(비타민C 20% 수용액)	2.5
프럭토스 1,6-디포스페이트 20% 수용액	1.0
수용액	0.7

상기 표 2에서 알 수 있는 바와 같이, 프럭토스 1,6-디포스페이트는 기존의 항산화 물질인 비타민C와 비교했을 때 피부 자극이 없음을 알 수 있다.

[시험예 6] 프럭토스 1,6-디포스페이트의 자외선에 의한 피부 홍반 억제 효 과

실험 시점에서 한달 이전부터 비스테로이드성 항염증제 및 기타 스테로이드 제제를 복용한 경력이 없는 건강한 자원자를 대상으로 프럭토스 1,6-디포스페이트의 자외선(UV B)에 의한 홍반 유발 억제 효과를 Kaidbey와 Kurban의 방법에 따라 평가하였다(Kaidbey Kurban, 1976, J. Invest. Dermatol., Vol 66 pp153-156). 건강한 12명의 남자를 대상으로 피검자의 윗팔뚝 부위에 직경 1.5㎝의 구멍 6개가 뚫린 불투명 테이프를 부착한 뒤, 각 피검자의 최소 홍반량(Minimal ErythemaDose)의 2배 정도의 자외선(UV B)을 SE lamp(파장 290∼320㎚, Toshiba)로 조사하여 홍반을 유도하였다. 각 실험 제형들은 하기 표 3의 비교예 및 실시예의 처방에 따라 제조하여, 자외선을 조사하기 1시간 전 및 자외선 조사 직후에 도포하였다. 그 결과를 하기 표 4에 나타내었으며, 표 4에 나타난 홍반 지수는 상기 표 1에 나타낸 판정 기준에 따라 자외선 조사 후 6시간 후 및 24시간 후에 평가하였다.

성분	함량(중량%)
	대조군	실시예	비교예
프럭토스 1,6-디포스페이트	-	1.00	-
비타민C	-	-	5.00
밀납	4.00	4.00	4.00
폴리솔베이트	1.50	1.50	1.50
솔비탄세스퀴올레이트	0.70	0.70	0.70
유동파라핀	5.00	5.00	5.00
카프릴릭/카프릭트리글리세라이드	5.00	5.00	5.00
글리세린	3.00	3.00	3.00
부틸렌글리콜	3.00	3.00	3.00
프로필렌글리콜	3.00	3.00	3.00
카르복시비닐폴리머	0.10	0.10	0.10
트리에탄올아민	0.20	0.20	0.20
방부제	적량	적량	적량
색소	적량	적량	적량
향료	적량	적량	적량
정제수	to 100	to 100	to 100

프럭토스 1,6-디포스페이트의 자외선에 의한 피부 홍반 억제 효과

실험군	홍반지수 (2MED)
	6시간	24시간
대조군	1.7	2.2
실시예	0.9	1.6
비교예	1.6	2.4

상기 표 4에서 알 수 있는 바와 같이, 프럭토스 1,6-디포스페이트를 함유한 화장료는 자외선에 의한 홍반 유발을 억제함을 알 수 있었다. 즉, 프럭토스 1,6-디포스페이트를 함유한 화장료는 자외선에 의한 피부 세포 손상을 억제함으로써 피부기능의 항산화성을 유지하는데 기여함을 알 수 있었다.

이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명의 화장료 조성물은 프럭토스 1,6-디포스페이트 및 그의 염을 함유하여 피부에 자극을 주지 않고, 자외선과 같은 외부자극에 의한 피부세포 손상을 억제시키는 효과가 우수하다. 그러므로, 프럭토스 1,6-디포스페이트는 본 발명에서 밝혀낸 바와 같이 피부 세포의 자체 환원력을 높이는 내인성 항산화 물질 역할을 수행하는 화장품 원료로 사용할 수 있다.

Claims (5)

1. 삭제
2. 삭제
3. 삭제
4. 프럭토스 1,6-디포스페이트 또는 그 염을 함유하여 시클로옥시게나제-2의 활성을 억제시킴으로써 프로스타글란딘류의 염증 매개인자의 농도를 감소시킴을 특징으로 하는 항염증용 화장료 조성물.
5. 프럭토스 1,6-디포스페이트 또는 그 염을 함유함을 특징으로 하는 피부 홍반 억제용 화장료 조성물.