SE459782B - Farmakologisk beredning av fruktos-1,6-difosfat och saett foer framstaellnilng daerav - Google Patents

Description

20 25 'JJ C) vi Ul åk. 459 782 Senare experiment har bekräftat riktígheten i dessa hypoteser, sasom klart framgnr av data som rapporteras i det följande.

Följaktligen hestar det terapeutiska förfarandet enligt upp- finningen av de följande stegen: a) inneslutning av lükemedclssubstansen i det inre av li- posomer; bl införande av nämnda substans i det inre av den cellulära cytoplasman, under utnyttjande av förfarandet för sammansmält- ning av lipiddelen av liposomerna med plasmamembranet.

Uppfinningen avser vidare ett sött att framställa lípo- somerna, vilket sätt består av följande steg: a) framställning av liposomer av den fosfolipidiska kompo- sitionen, renad genom pelarkromatografi, löst i ett organiskt lösningsmedel och behandlad med ultraljud i kontakt med en vattenlösning av fruktos-1,6-difosfat; b) membrankoncentreríng i en ultrafíltrcringscell; och c) rening medelst gelfiltrering av icke inneslutet fruktos- 1,6-difosfat.

Det är att märka, att i vad avser mängden av den omslut- na aktiva bestàndsdelen och i vad avser de erhållna partiklarna är ordningsföljden mellan de angivna stegen kritisk.

Denfarmakologíska verkan hos den sålunda erhållna formen har undersökts vid inkubering av människoblod vid l7°C under rörning under kontroll fråi tid till annan av stabiliteten och erytrocytnivâerna för ATP. Denna parameterlmr i praktiken hit- Om' tills visat sig vara den mera effektiva för undersökning av de farmakologíska effekterna hos fruktos isomerer. 1,0-difosfat än för dess För närmare förståelse ges här ett exempel, avseende framställningen av liposomerna.

Exemgel l 5 g rålecitín (t ex från ägg) löses i ca 10 ml kloroform och ledes genom en kolonn, fylld med silikagel. Elueringen ge- nomförcs med en kontinuerlig gradient av kloroform och metanol.

Den fraktion (n-5) som elueras med metanol uppsamlas, och innehaller 3,5 g fosfatidylkolin. Renheten hos denna fraktion bekräftas medelst tunnskiktskromatogrnfi (glasplattor med sili- kagol) vid elucring med Rx = n,2l. klorofnrm-metanol-vatten (OS-35-Sl.

SUN mg av denna produkt, löst E l3= wl vlyletvr förvaras 15 20 25 -1 ll 5 459 782 i frys vid-ZOOC under kvävgnsnrmosfär i en 500 ml behållare med slipnd propp. När en klur lösning erhnllits, tillsättes 150 ml kloroform och successivt SU ml lösning av fruktos-l,6-difosfut med halten I mg/ml och med ett pH av 7,4.

De angivna processernn utföres i kvävgasatmosfär för att undanröja riskerna för eventuelln,oönsknde oxidatíonsprodukter av lipiderna.

Den sålunda erhållna blandningen underkastas en behand- ling i ett ultrnljudhnd under en tid av IS minuter (med inläg- gande av en paus pá en minut var femte minut), varvid förhind- ras att temperaturen hos budet överstiger ISOC. På detta sätt erhålles en enda, beständig fas, vilken lämnas att stå under I timme.

De organiska lösningsmedlen nvdrives därefter långsamt under vakuum vid en temperatur av 45oC. Man erhåller först en gelatinös massa, vilken i det följande blir flytande genom den fullständiga elimíneringen av allt återstående lösningsmedel.

De på detta sätt erhållna, stora och unilamellära blâsorna filt- reras genom ett membran på 0,45 nm för att göra populationen av liposomer enhetlig (partikelstorlek ca 300 Å). När denna filtrering är avslutad,âterstår ca 45 ml suspension, vilken ut- sättes för ultraljudi_en filtreringsenhet från Amicon, med ett membran Diaflo YM 30 under kvävgastryck (Amicon och Diaflo ut- gör regestrerade varumärken). Denna förkoncentreringsprocess frigör ca 60-65 % av externt fruktos-1,6-dífosfat. Den återståen- de volymen (ca 20 ml) satsas i en kolonn, innehållande dextran- polymerer, kända i handeln under namnet "Sepharose 4 B"®, vilka först mättats med en suspension av standardliposomer.

Elueringen genomföres med en buffert tri-HCl-NuCl-0,1 M (pH = 7,5) med tillvaratagande av de första fraktionerna efter "dödvolymen" (i förväg bestämd med användning av dextranblåttl.

Den erhållna volymen av liposomer underkastas en slutlig kon- centrering i en ultrafiltreringscell Amicon med ett membran Diaflo YM 30 under kvävgastryck. En suspension erhålles, vilken per ml av det hela innehåller l,3-1,5 mg fruktos-1,6-difosfat, och som är fri från icke omhöljt läkemedel utanför blàsornn.

De sålunda erhnllnn lipesomernn, innehållande fruktos- l,o-difosfnt, hnr experimentellt undersüktsin vitro i jämförel- se med nnnlogn doser nx icke inneslntet_lükemedvl och med en unnlog mängd nr liposomvl, innehnllnndt H,U 1 Nufil, snsum he- (II 20 459 782 l H skrives i det följande: Éšempci 2 2,25 ml männískoblod försättes med 0,25 ml liposomcr, innehållande och sättes för inkubering framställda som beskrivits i det föregående, 1,35 mg/ml av fruktos 1,6-difosfat, i ett termostatbad vid 37°C under kontinuerlig omrörning. Sam- tidigt inkuberas tvâ andra prover på vardera 2,25 ml människo- blod (från samma individ), innehållande 0,25 ml lösning av fruktos-1,6-difosfat (1,35 mg/ml), resp. 0,25 ml liposomer, innehållande 0,9 % NaCl.

Efter inkubering under olika tidpunkter. tabell 1: Tabell 1 sökes erytrocytvärdena för ATP vid De erhållna resultaten angives i följande 160' Fruktos-1,6-difosfat i i 40' i liposomer I 5550 Y/ml 664 Y/ml Fritt fruktos-1,6-difosfat Åssz Y/mi 601 v/m1 ; Liposomer som sådana š524 Y/ml 532 Y/ml I š I Not. Grundvärdet för ATP är 530 Y/ml.

Varje grundvärde utgör medelvärdet av ett flertal (6) observationer. En undersökning av dessa resultat visar, att fruktos 1,6-difosfat som transporteras i liposomerna påverkar erytrocytmetabolismen på ett sätt som klart skiljer sig från fruktos-1,6-difosfat som icke inneslutits i liposomerna och visar därigenom möjligheten för en sammansmältning av liposo- merna med cellmembranet, med en därav följande frigöring av det omslutna läkemdlet i cellen.

För att bekräfta dessa hypoteser har ínkuberingsförsöket upprepats med människoblod och med användning av líposomer, vil- ka framställts medelst det angivna sättet och omslutande märkt fruktos-1,6-difosfat (C14). Ett genomfört parallellförsök med en analog mängd av fritt, likaledes märkt fruktos~1,6-difosfat har visat att det fruktos f,6-dífosfat som transporter posomcrna är as i li- i stånd att genomträngn erytrocytmembranet. I det följande angivcs den andel av Fruktos 1,6 -difosfat (transpor- tcrnd i liposomcrnu) som intrñngt i cellen vid olika tider i förhållande till fritt fruktos l,n-difosfatä | ÉFruktos-1,6-difosfat i íliposomer ~ % í cellen :Fritt fruktos-1,6-difosfut - 'å i cellen

Claims (5)

459 782 k Patentkrav

1. Farmakologisk beredning av fruktos-1,6-difosfat och/eller dess isomerer som verksam förening, t e c k n a d därav, k ä n n e - att den verksamma föreningen är inför- livad i det inre av liposomer.

2. Sätt att framställa en farmakologisk beredning av fruktos-1,8-difosfat och/eller dess isomerer införlivade i liposomer, k ä n n e t e c k n a t därav, att följande proceesteg genomföras: a) en fosfolipidkomponent renas medelst kromatografi, och den renade produkten löses i ett organiskt lösningsmedel; b) den erhållna lösningen blandas med en vattenlösning av fruktos-1,6-difosfat, och den erhållna blandningen behandlas med ultraljud, tills en stabil emulsion erhålles; c) det organiska lösningsmedlet avdrives under vakuum, icke införlivat fruktos-1,6 och -difosfat avlägsnas medelst gel- filtrering, och d) den under c) erhållna produkten membrankoncentreras i en ultrafiltreringscell.

3. Sätt enligt krav 2, k ä n n e t e c k n a t därav, att den under b) använda vattenlösningen av fruktos~1,6-difos- fat har en halt av ca img/ml och ett pH av ca 7,4.

4. Sätt enligt krav 2 eller 3, k ä n n e t e c k n a t att blandningen under b) behandlas med ultraljud under 15 minuter, med pauser pà 1 minut var 5:e minut, retur, som icke överstiger 15°C. därav, vid en tempe-

5. Sätt enligt nagot av krav 2-4, k ä n n e t e c k - n a t därav, att vakuumavdrivningen under c) genomföras vid en temperatur av högst 4S°C.