NO168154B - Fremgangsmaate for fremstilling av unilamellaere liposomer - Google Patents

Abstract

Ny fremgangsmåte til fremstilling av unllamellare liposomer i vandig fase ved overfør-ing av en egnet lipidkomponent f. eks. fosfatidsyre i den ioniske form, idet man under-kaster llpiddispersjonen en pH-endring og etterfølgende nøytralisering. Dannelsen av de unllamellare liposomer foregår spontant, dvs. uten ekstra ytterligere energi-tilførsel. Ifølge fremgangsmåten oppnådde liposomer kan anvendes terapeutisk som bærer av virksomme stoffer av for-skjelligste typer.

Description

Oppfinnelsens gjenstand er en fremgangsmåte til fremstilling av unilamellære liposomer i vandig fase.

Liposomer er i litteraturen omtalt i tallrike publikasjoner. Deres oppbygning og deres anvendelse er gjenstand for mange undersøkelser. Man adskiller unilamellære liposomer med et dobbeltsjikt av lipider fra multilamellaere liposomer med flere dobbeltsjikt av lipider som er anordnet løkaktig.

Unilamellære liposomer har en kuleformet hylse og er eksempelvis en diameter fra 200 til 50.000 Å, fortrinnsvis 200 til 30.000 Å. Den kuleformede hylsen består av et dobbeltsjikt av lipidkomponenter, f.eks. amfipatiske lipider, f.eks. fosfolipider, f.eks. fosfatinsyre, lecitin eller kefalin, og eventuelt nøytrale lipider, f.eks. kolestrol. Dette dobbeltsjikt omslutter et indre rom som inneholder en vandig fase. Unilamellære liposomer betegnes også som "vesikel".

Det består stor interesse for den terapeutiske anvendelse av liposomer som bærere av virksomme stoffer av den forskjel-ligste type. Således er liposomer foreslått som bærere av proteiner, f.eks. antistoffer eller enzymer, hormoner, vitaminer, eller gener, eller til analytiske formål som bærere av markerte forbindelser. Som eksempel kan nevnes US-patent 3 993 754 som har til gjenstand en kjemoterapeutisk fremgangsmåte ved behandling av tumorceller under anvendelse av liposomer som bærere.

Det angjeldende virksomme stoff innkapsles enten ved dannelsen av liposomer eller etterpå ved diffusjon. Fremstillingen av liposomene og innkapslingen av det virksomme stoff kan foregå på forskjellig måte, og er omtalt i oversiktsartikkelen "Liposomes-Problems and promise as selective drug carriers" av Kaye, Sy. B. Cancer Treatment Reviews (1981) 8. 27-50. Ytterligere fremgangsmåter til fremstilling av liposomer ved innkapsling av virksomme stoffer er likeledes omtalt av Barenholz et al. i Biochemi-stry, bind 16, nr. 12, 2806-2810, samt i de tyske Offen-legungsschriften (DOS) 28 19 855, 29 02 672, 25 32 317 og 28 42 608, i US-patent 4 053 585 og i europeisk publikasjon 36 676.

Man oppløser eksempelvis lipidkomponenter, for eksempel fosfolipider, for eksempel fosfatidsyre, lecitin eller kefalin, og eventuelt nøytrale lipider, for eksempel kolestrol, i et organisk oppløsningsmiddel, for eksempel kloroform eller benzen. Etter inndampning blir det tilbake et homogent sjikt, for eksempel et filmsjikt av angjeldende lipidkomponenter. Man dispergerer deretter 1ipidkomponentene i en vandig fase som inneholder det angjeldende virksomme stoff, for eksempel ved rysting. Ved etterfølgende behandling med ultralyd danner det seg unilamellære liposomer som innkapsler det virksomme stoff.

Etter mange tidligere kjente fremgangsmåter får man vandige faser så vel med blandinger av unilamellære som også multilamellære liposomer, idet disse liposomers struktur og størrelse er tilfeldig eller knapt påvirkbar, og kan varieres. Vandige faser med overveiende mengde av unilamellære liposomer får man hittil bare med apparativt krevende og omstendelig fremstillingsfremgangsmåte, for eksempel ved ultralydbehandling, dialysering eller gelfiltrering.

Ved fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen lar det seg på

enkel måte fremstille vandige faser med en høy, inntil kvantitativ, del av unilamellære liposomer, som kan inneholde små unilamellære liposomer (KUL) med en diameter på 200-600 Å og store unilamellære liposomer (GUL) med en diameter på 600-3.000 Å. En spesiell fordel ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen består i at man får KUL og GUL av relativ enhetlig størrelse og at man kan variere mengdeforholdet mellom KUL og GUL 1 den disperse fase. Ved hjelp av egnede skillemetoder, for eksempel gelfiltrering eller en ultrafil-

treringscelle, kan man adskille små fra store unilamellære 1iposomer.

Oppfinnelsen vedrører en fremgangsmåte til fremstilling av unilamellære liposomer, idet fremgangsmåten er karakterisert ved at man dispergerer

a) et lipid av formel

hvori m er 0 eller 1, en av restene R^ og R2 er hydrogen,

hydroksy eller C^-C^alkyl og den andre er alkyl, alkenyl, alkoksy eller alkenyloksy, hver inneholdende fra 10 til 20 karbonatomer, eller er acyloksy med fra 10 til 50 karbonatomer, R3 er hydrogen eller C^-C^-alkyl og R4 er hydrogen, C^-C4-alkyl, C^-C7~alkyl substituert med karboksy eller med sulfo, C^-Cy-alkyl substituert med karboksyl eller med amino, aminogruppen befinner seg i a-posisj onen til karboksylgruppen, C^-C^alkyl substituert med halogen, 0^-04-alkoksykarbonyl eller med C^-C4-alkansulfonyl, eller C2-C4-alkyl substituert med frie eller foretrede hydroksygrupper, hvor to foretrede hydroksygrupper kan være forbundet med hverandre gjennom metylen, etylen, etyliden, 1,2-propylen eller 2,2-propylen, eller en en karbohydratrest med fra 5 til 12 karbonatomer eller, dersom R^ og R2 er hydrogen eller hydroksy og R3 er hydrogen, er en steroidrest, og et ytterligere lipid av formel A, hvori m er 0 eller 1, hver av Ri og Rg er uavhengig av hverandre alkyl, alkenyl, alkoksy, hver med fra 10 til 20 karbonatomer, eller er acyloksy med fra 10 til 50 karbonatomer, R3 og R4 er hydrogen, og eventuelt et av de nevnte ytterligere lipidene av formel A, i en vandig fase som har en pH-verdi høyere enn 9, eller

b) et lipid av formel A, hvori m er 0 eller 1, en av restene Rj og R£ er hydrogen, hydroksy eller Ci-C4~alkyl, og den

andre er alkyl, alkenyl, alkoksy eller alkenyloksy, hver med fra 10 til 20 karbonatomer, eller er acyloksy med fra 10 til 50 karbonatomer, R3 er hydrogen, og R4 er C2~C4-alkyl som er substituert med en ammoniogruppe, og eventuelt et av de ytterligere lipidene av formel A som angitt under a);

eller

et lipid med formel A, hvori m er 0 eller 1, hver av R^ og R2 er uavhengig av hverandre alkyl, alkenyl eller alkenyloksy, hver med fra 10 til 20 karbonatomer, eller er acyloksy med fra 10 til 50 karbonatomer, R3 er hydrogen og R4 er C2-C4-alkyl som er substituert med en ammonio-C2-C4-alkyl-ammoniogruppe, og et av de ytterligere lipidene av formel A som angitt under a) dispergeres i en vandig fase som har en pH-verdi på ca. 1 eller lavere, og den vandige fasen nøytraliseres og, om ønsket, anrikes og/eller separeres de derved oppnådd unilamellære liposomene.

Fremgangsmåte a)

Cj-C4-alkyl Rj, R2 eller R3 er for eksempel metyl, videre etyl, n-propyl eller n-butyl.

Alkyl R} eller R2 er fortrinnsvis n-decyl, n-undecyl, n-dodecyl (lauryl), n-tridecyl, n-tetradecyl (myristyl), n-pentadecyl, n-heksadecyl (cetyl), n-oktadecyl (stearyl) eller n-eicosyl (arachinyl), videre n-heptadecyl eller n-nonadecyl.

Alkenyl R^ eller R2 er fortrinnsvis 9-cis-dodecenyl (lauro-leyl), 9-cis-tetradecenyl (myristoleyl), 9-cis-heksadecenyl (palmitoleinyl), 6-cls-oktadecenyl (petroselinyl), 6-trans-oktadecenyl (petroselaldinyl), 9-cis-oktadecenyl (oleyl), 9-trans-oktadecenyl (elaidinyl) eller 9-cis-eicosenyl (gadolei-nyl), videre 1-decenyl, 1-undecenyl, 1-dodecenyl, 1-tridece-nyl, 1-tetradecenyl, 1-pentadecenyl, 1-heksadecenyl, 1-heptadecenyl, 1-oktadecenyl, 9-bis-12-trans-oktadecadienyl

(linolyl)-9-trans-12-trans-oktadecadienyl (linolaidinyl), 9-cis-12-cis-oktadienyl (linoleyl), 9-cis-ll-trans-13-trans-oktadecatrienyl (p<->elostearinyl), 9-cis-12-cis-15-cis-oktadecatrienyl) (linolenyl), 9-, 11-, 13-, 15-oktadecatetra-enyl (parlnaryl), 1-nonadecenyl, 1-eicosenyl, 5-, 11-, 14-eicosatrienyl eller 5-, 8-, 11-, 14-elcosatetraenyl (arachi-donyl).

Alkoksy R^ eller R2 er fortrinnsvis n-decyloksy, n-dodecyk-loksy (lauryloksy), n-tetradecyloksy (myristyloksy), n-heksadecyloksy (cetyloksy), n-oktadecyloksy (stearyloksy) eller n-eikosyloksy (arachinyloksy), videre n-undecyloksy, n-tridecyloksy, n-pentadecyloksy, n-heptadecyloksy eller n-nonadecyloksy.

Alkenyloksy R-^ eller R2 er fortrinnsvis 9-cis-docecyloksy (lauroleyloksy), 9-cis-tetradecenyloksy (myristoleyloksy), 9-cis-heksadecenyloksy (palmitoleinyloksy), 6-cis-oktadecenyloksy (petroselinyloksy), 6-trans-oktadecenyloksy (petrose-laidinyloksy), 9-cis-oktadecenyloksy (oleyloksy), 9-trans-oktadecenyloksy (elaidinyloksy) eller 9-cis-eicosenyl (gadoleinyloksy), videre 1-decenyloksy, 1-undecenyloksy, 1-dodecenyloksy, 1-tridecenyloksy, 1-tetradecenyloksy, 1-pentadecenyloksy, 1-heksadecenyloksy, 1-heptadecenyloksy, 1-oktadecenyloksy, 9-cis-12-trans-oktadecadienyloksy (linolyl-oksy), 9-trans-12-trans-oktadecadienyloksy (linolaidinyl-oksy), 9-cis-12-cis-oktadienyloksy (linoleyloksy), 9-cis-ll-trans-13-trans-oktadecatrienyloksy (p<->eleostearinyloksy), 9-cis-12-cis-15-cis-oktadecatrienyloksy (1iolenyloksy)-9,11-,-13-, 15-oktadecatetraenyloksy (parinaryloksy), 1-nonadecenyl-oksy, 1-eikosenyloksy, 5-, 11-, 14-eicosatrienyloksy eller 5-, 8-, 11-, 14-eikosatetraenyloksy (arachidonyloksy).

Acyloksy R^ eller R2 med hver 10-50 C-atomer er eksempelvis alkanoyloksy, med et aromatisk ringsystem substituert alkanoyloksy eller alkenoyloksy.

Alkanoyloksy R^ eller R2 er fortrinnsvis n-decanoyloksy, n-dodecanoyloksy (lauroyloksy), -tetradecanoyloksy (myri-stoyloksy), n-heksadecanoyloksy, n-heksadecanoyloksy (palmltoyloksy), n-oktadecanoyloksy (stearoyloksy) eller n-eicosoyloksy (arachinoyloksy), videre n-undecanoyloksy, n-tridecanoyloksy, n-pentadecanoyloksy, n-heptadecanoyloksy eller n-nonadecanoyloksy.

Med et aromatisk ringsystem substituert alkanoyloksy Rj eller R2 er eksempelvis fenyl-n-alkanoyloksy, hvori fenylresten befinner seg i co-stilling av alkanoylresten, for eksempel fenyl-n-butyryloksy, -n-pentanoyloksy, -n-heksanoyloksy,

-n-heptanoyloksy, -n-oktanoyloksy, -n-nonanoyloksy, -n-decanoyloksy, -n-undecanoyloksy eller fenyl-n-dodecanoyloksy, 3- eller 4-, fortrinnsvis 4-alkylfenyl-n-alkanoyloksy, hvori alkylfenylresten befinner seg i u-stilling av alkanoyloksyresten, for eksempel 4-n-butyl-, 4-n-pentyl-, 4-n-heksyl-, 4-n-oktyl, 4-n-decyl- eller 4-n-dodecylfenyl-n-butyryloksy, -n-pentanoyloksy-, n-heksanoyloksy, -n-oktanoyloksy, -n-decanoyloksy eller -n-dodecanoyloksy, pyren-l-yl-n-alkanoyloksy, hvori pyrenresten befinner seg i o)-stilling av alkanoyloksyresten, for eksempel pyren-l-yl-n-butyryloksy, -n-pentanoyloksy, -n-heksanoyloksy, -n-oktanoyloksy, -n-decanoyloksy eller pyren-l-yl-decanoyloksy, eller 6- eller 8-alkylpyren-l-yl-n-alkanoyloksy, hvori alkylpyren-l-ylresten befinner seg i w-stilling av alkanoyloksyresten, for eksempel 6- eller 8-laverealkyl-, for eksempel 6- eller 8-etylpyren-l-yl-n-butyryloksy, -n-pentanoyloksy, -n-heksanoyloksy, -n-oktanoyloksy, -n-decanoyloksy eller -n-decanoyloksy, eller 6-eller 8-n-butylpyren-l-yl-n-butyryloksy, -n-pentanoyloksy, -n-heksanoyloksy, -n-oktanoyloksy, n-decanoyloksy eller -n-dodekanoyloksy, eller 6- eller 8-alkylpyren-l-yl-n-alkanoyloksy, for eksempel 6- eller 8-n-decyl-, -n-dodecyl-, -n-tetradecyl, -n-heksadecyl! eller 6- eller 8-n-oktadecylpyren-1-yl-n-butyryloksy-, -n-pentanoyloksy, -n-heksanoyloksy, -n-oktanoyloksy, -n-decanoyloksy eller -n-dodecanoyloksy.

Med et aromatisk ringsystem substituert alkanoyloksy Rj eller R2 er fortrinnsvis4-(4-n-decylfenyl)-decanoyl, 4-(pyren-l-yl)-butanoyl, 6-(pyren-l-yl)-heksanoyl, 8-(pyren-l-yl)-oktanoyl, 10-(pyren-l-yl)-oktanoyl, 6-(6- eller 8-etylpyren-l-yl)-oktanoyl, 6-(6- eller 8-n-butylpyren-l-yl )-heksanoyl og 10-(6- eller 8-n-oktadecylpyren-l-yl)-decanoyl.

Alkenoyloksy R^ eller R2 er fortrinnsvis 9-cis-dodecynyloksy (lauroleyloksy) 9-cis-tetradecenoyloksy (myristoleoyloksy), 9-cis-heksadecenoyloksy (palmitoleinoyloksy), 6-cis-oktadecenoyloksy (petroselinoyloksy), 6-trans-oktadecenoyloksy (petroselaidinoyloksy), 9-cis-oktadecenoyloksy (oleoyloksy), 9-trans-oktadecenoyloksy (elaidinoyloksy) eller 9-cis-eicosenoyl (gadoleinoyloksy), videre 9-cis-12-trans-ok-tadienoyloksy (linoloyl), 9-trans-12-trans-oktadecadienoyl-oksy (1inolaidinoyloksy), 9-cis-12-cis-oktadienoyloksy (linoleoyloksy) 9-cis-ll-trans-13-trans-oktadecatrienoyloksy (parinaroyloksy), 5-, 11-, 14-eicosatrienoyloksy eller 5-,

8-, 11-, 14-eicosatetraenoyloksy (arachidonoyloksy).

R4 er eksempelvis hydrogen, C^-C4-alkyl, for eksempel metyl, etyl, isopropyl, n-propyl, isobutyl eller n-butyl, C1-C7-alkyl substituert med karboksy eller sulfo, Cj-Cy-alkyl substituert med karboksy og amino, hvorved aminogruppen befinner seg i a-stilling til karboksygruppen, C1-C4-alkoksykarbonyl eller C^-C4-alkansulfonyl eller C2-C4~alkyl substituert med frie eller foretrede hydroksygrupper, hvorved to foretrede hydroksygrupper kan være forbundet med hverandre gjennom metylen, etylen, etyliden, 1,2-propylen eller 2,2-propylen.

Cj-Cy-alkyl substituert med karboksy eller sulfo som R4 er fortrinnsvis karboksymetyl, 2-karboksyetyl eller 3-karboksy-n-propyl. C^-C7-alkyl substituert med karboksy og amino, hvori aminogruppen befinner seg i a-stilling til karboksygruppen er eksempelvis 2-amino-2-karboksyetyl eller 3-amino-3-karboksy-n-propyl.

Ci-C4-alkyl substituert med halogen er eksempelvis klor-eller brommetyl, 2-klor- eller 2-brometyl eller 2- eller 3-klor- eller 2- eller 3-brom-n-propyl.

C2~C4-alkyl substituert med frie eller foretrede hydroksygrupper, hvorved to forestrede hydroksygrupper kan være forbundet med hverandre gjennom metylen, etylen, etyliden, 1,2-propylen eller 2,2-propylen er eksempelvis 2,2-(2,2-propylen )-dioksypropyl eller 2,3-etylendioksypropyl.

En karbohydratrest R4 med 5-12 C-atomer er eksempelvis en naturlig monosakkaridrest som avleder seg fra en som aldose eller ketose foreliggende pentose eller heksose.

En som aldose foreliggende pentose er for eksempel D-ribose, D-arabinose, D-xylose eller D-lyksose.

En som ketose foreliggende pentose er for eksempel D-ribulose eller D-xylulose.

En som aldose foreliggende heksose er for eksempel D-allose, D-altrose, D-glukose, D-mannose, D-galaktose eller D-talose.

Et som keton foreliggende heksose er for eksempel D-psikose, D-fruktose, D-sorbose eller D-tagatose.

En heksose foreligger fortrinnsvis i cyklisk form, for eksempel som pyranose (aldose), for eksempel a- eller e-D-glukopyranose eller som furanose, for eksempel a- eller P-D-fruktofuranose. Pyranosylresten er fortrinnsvis forestret med de i 1- eller 6-stilling og furanosylresten med i 1-eller 5-stilling befinnende hydroksygruppe med fosfatidyl-gruppe.

En kullhydratrest R4 med 5-12 C-atomer er videre en naturlig disakkaridrest, for eksempel en av to heksoser dannet disakkaridrest, som eksempelvis danner seg ved kondensasjon av to aldoser, for eksempel D-glukose eller D-galaktose eller en aldose, for eksempel D-glukose med en ketose, for eksempel fruktose. Av to aldoser dannede dlsakkarider, for eksempel laktose eller maltose, er fortrinnsvis forestret over den 1 6-stilllng angjeldende pyrasonylrester befinnende hydroksygruppe med fosfaditldylgrupen. Av en aldose og en ketose dannet dlsakkarider, for eksempel sakkarose, er fortrinnsvis over den i 6-stilling av pyranosylresten eller over den i 1-stilling av furanosylresten befinnende hydroksygruppe med fosfatidylgruppen.

En kullhydratrest R4 med 5-12 C-atomer er videre en derivatisert mono- eller disakkaridrest hvori eksempelvis aldehyd-gruppen og/eller en eller to endeplasserte hydroksylgrupper er oksydert til karboksylgruppen, for eksempel en D-glukon-, D-glukar- eller D-glukoronsyrerest, som fortrinnsvis foreligger som cykliske laktonrester. Likeledes kan i en derivatisert mono- eller disakkaridrest aldehyd- eller ketogruppene være redusert til hydroksygruppen, for eksempel inosit, sorbit eller D-mannit, eller hydroksygruppen er erstattet med hydrogen, for eksempel desoksysukker, for eksempel 2-desoksy-D-ribose, L-ramnose eller L-fukose, eller med aminogrupper, for eksempel aminosukker, for eksempel D-glukosamin eller D-galaktosamin.

Et karbohydrat R4 kan eventuelt være et ved omsetning av et av de nevnte mono- eller dlsakkarider med sterkt oksyda-sjonsmiddel, for eksempel perjodsyre danent spaltprodukt.

En steroidrest R4 er eksempelvis en sterinrest, som er forestret over de i 3-stilling av steroid befinnende hydroksygruppe med fosfatidylgruppen.

En sterinrest er eksempelvis lanosterin, sitosterin, koprostanol, cholestanol, glykolsyre, ergosterin eller stigmasterin, fortrinnsvis cholestrol.

Når R4 betyr en steroidrest, er R^ og R2 fortrinnsvis hydroksy og R3 er hydrogen.

En fettsyre er eksempelvis en mettet eller umettet alifatisk karboksylsyre med 4 til 26, fortrinnsvis 10 til 20 karbonatomer .

En mettet alifatisk karboksylsyre er eksempelvis en rett-linjet alifatisk karboksylsyre med 10 til 20 karbonatomer, for eksempel kaprinsyre (C-10), undecansyre (C-ll), laurin-syre (C-12), tridecansyre (C-13), myristinsyre (C-14), pentadecansyre (C-15), palmitinsyre (C-16), margarinsyre

(C-17), stearinsyre (C-18), nonadecansyre (C-19) eller arachinsyre (C-20).

En mettet alifatisk karboksylsyre er eksempelvis en forgrenet alifatisk karboksylsyre med 10 til 12 karbonatomer, for eksempel isomyristinsyre (C-14), isopalmitinsyre (C-16), isostearlnsyre (C-18).v

En umettet alifatisk karboksylsyre med 10-20 karbonatomer har eksempelvis et likt antall karbonatomer og inntil 5 dob-beltbindinger og er eksempelvis myristoleirisyre (C-14), palmitoleinsyre (C-16), palmitaleidinsyre (C-16), petroselin-syre (C-16), oljesyre (C-18), elaidinsyre (C-18), vaksensyre (C-18), linolsyre (C-18), linolelaidinsyre (C-18), linolen-syre (C-18), cis-eicos-5-ensyre (C-20), cis-ll-eicosensyre, 11,14-eicosadiensyre, 11-, 14-, 17-eicosatriensyre, arachi-donsyre eller 5-, 8-, 11-, 14-, 17-eicosapentaensyre.

Den angjeldende fettsyre kan foreligge i udissosiert form eller i form av et salt, for eksempel som alkalimetall-, for eksempel natrium- eller kaliumsalt.

Et egnet ekstra lipid er eksempelvis et lipid med formel A hvori m er 0 eller 1, Rj og R2 uavhengig av hverandre alkyl, alkenyl, alkoksy eller alkenyloksy med hver 10-20 C-atomer eller acyloksy med 10-50 C-atomer, R3 betyr hydrogen og R4 betyr hydrogen eller laverealkyl med hver 1-7 C-atomer, en kullhydratrest med 5-12 C-atomer, eller en steroidrest.

Ri, R2 og R3 har de videre ovenfor nevnte betydninger. R4 er dessuten med tri-Ci-C4-alkylammonio for eksempel trimetyl-ammonio, substituert C^-C4-alkyl for eksempel 2-trimetylammonioetyl (cholinyl).

Et egnet ekstra lipid er fortrinnsvis et lipid med formel A, hvori Rj og R2 betyr acyloksy, R3 betyr hydrogen, og R4 betyr 2-trimetylammonioetyl eller 2-aminoetyl.

Et slikt ekstra lipid er for eksempel et naturlig lecitin, for eksempel egge-lecitin eller lecitin fra sojabønner, når R4 betyr 2-trimetylammonioetyl, og et naturlig kephalin, for eksempel egge-kephalin eller kephalin av sojabønner, når R4 betyr 2-aminoetyl.

Dessuten er det som ekstra lipider foretrukket syntetiske lecitiner (R4 = 2-trimetylammonioetyl) og syntetiske kephaliner (R4 = 2-trimetylammonioetyl) med formel A, hvori Rj og R2 betyr identiske acyloksyrester, for eksempel lauroyloksy, oleoyloksy, linoyloksy, 1inoleoyloksy eller arachinoyloksy, for eksempel dilauroyl-, dimyristoyl-, dipalmitoyl-, distearoyl-, diarachinoyl-, dioleoyl-, dilinoyl-, dilinoleoyl-, eller diarachinoyllechitin eller kephalin, R^ og R2 og betyr forskjellige acyloksyrester, for eksempel Rj palmitoyloksy og R2 oleoyloksy, for eksempel 1-palmitoyl-2-oleoyllechitin eller -kephalin, Rj og R2 betyr identiske alkoksyrester, for eksempel tetradecyloksy eller heksadecyloksy, for eksempel ditetradecyl- eller diheksa-decyllechitin eller -kephalin, R^ betyr alkenyl og R2 betyr acyloksy, for eksempel et plasmalogen (R4 = trimetylammonioetyl), eller Rj betyr acyloksy, for eksempel myri-stoyloksy eller palmitoyloksy, og R2 betyr hydroksy, for eksempel naturlig eller syntetisk lysolechitin eller lysokephalin, for eksempel 1-myristoyl- eller 1-palmitoyl-lysolechitin eller -kephalin, og R3 betyr hydrogen.

Et egnet ekstra lipid er videre et lipid med formel A, hvori m er 1, R^ betyr alkenyl, R2 betyr acylamino, R3 betyr hydrogen og R4 betyr 2-trimetylammonioetyl-rest, (cholin-rest). Et slikt lipid er kjent under navnet spingomyelin.

Et egnet ekstra lipid er dessuten en lysolecitinanalog, for eksempel 1-lauroyl-l,3-propandiol-3-fosforylcholin, et monoglycerid, for eksempel monoolein eller monomyristin, et cerebrosid, et gangliosid eller et glycerid, som ikke inneholder frie eller foretrede fosforyl- eller fosfonylgrup-per i 3-stilling. Et slikt glycerid er eksempelvis et diacylglycerid eller l-alkenyl-l-hydroksy-2-acylglycerid med de nevnte acyl- resp. alkenylgrupper, hvori 3-hydroksygrupper er foretret med en av de nevnte kullhydratrester, for eksempel en galaktosylrest, for eksempel en monogalak-tosylglycerol.

Et ekstra lipid er videre et nøytralt lipid, som er inneholdt i cellemembraner og bare er oppløselig i apolare- organiske oppløsningsmidler, for eksempel i kloroform. Nøytrale lipider er eksempelvis steroider, for eksempel ostradiol eller sterol, for eksempel kolestrol, p-sitosterol, demoste-rol, 7-keto-kolestrol, eller p<->kolestanol, fettoppløselige vitaminer, for- eksempel vitamin A, for eksempel vitamin Aj eller vitamin A>2, vitamin E, vitamin K, for eksempel vitamin Ki eller K2, vitamin D2 eller D3, eller et ønskelig protein.

Fortrinnsvis inneholder den vandige dispersjon et lipid med formel A, hvori m betyr 1, Rj betyr alkyl, for eksempel n-dodecyl (lauryl), n-tridecyl, n-tetradecyl (myristyl), n-pentadecyl, n-heksadecyl (cetyl), n-heptadecyl eller n-oktadecyl (stearyl), alkoksy, for eksempel n-dodecyloksy (lauryloksy), n-tetradecyloksy (myrlstyloksy), n-heksadecyloksy (cetyloksy), eller n-oktadecyloksy (stearyloksy), acyloksy, for eksempel lauroyloksy, myrlstoyloksy, palmltoyloksy eller stearoyloksy, R2 betyr hydrogen eller hydroksy, R3 betyr hydrogen eller Ci-C4-alkyl, for eksempel metyl, og R4 betyr hydrogen, Ci-C4~alkyl, for eksempel metyl eller etyl, Ci~C4-alkyl substituert med syre og basisk gruppe, for eksempel karboksy og amino, for eksempel o-amino-u-karboksy-laverealkyl, for eksempel 2-amino-2-karboksyetyl eller 3-amino-3-karboksy-n-propyl, hydroksy-Ci-C^-alkyl, for eksempel 2-hydroksyetyl eller 2,3-hydroksypropyl, C1-C4-alkylendioksy-Ci-C4-alkyl, for eksempel 2,3-etylendioksypropyl eller 2,3-(2,2-propylen)-dioksypropyl, halogen-Cj-C4-alkyl, for eksempel 2-klor- eller 2-brometyl, en kullhydratrest med 5-12 C-atomer, for eksempel inosit, eller en steroidrest, for eksempel et sterol, for eksempel kolestrol, og et ekstra lipid med formel A, hvori Rj og R2 betyr acyloksy, for eksempel lauroyloksy, myrlstoyloksy, palmitoyloksy eller stearoyloksy, R3 betyr hydrogen og R4 betyr 2-trimetylammonioetyl eller 2-aminoetyl. Den vandige dlspersjon, kan også fortrinnsvis inneholde et lipid med formel A, hvori Rj og R2 betyr acyloksy, for eksempel lauroyloksy, myrlstoyloksy, palmitoyloksy eller stearoyloksy, R3 betyr hydrogen og R4 betyr hydrogen og eventuelt et ekstra lipid med formel A, hvori R^ og R2 betyr acyloksy, for eksempel lauroyloksy, myrlstoyloksy, palmitoyloksy eller stearoyloksy, R3 betyr hydrogen og R4 betyr 2-trimetylammonioetyl, 2-aminoetyl, laverealkyl substituert sure og basiske grupper, for eksempel karboksy og amino, for eksempel cj-amino-u-karboksylaverealkyl, for eksempel 2-amino-2-karboksyetyl eller 3-amino-3-karboksy-n-propyl, eller en kullhydratrest med 5-12 C-atomer, for eksempel inosit.

I første rekke inneholder den vandige dispersjon en naturlig lysofosfatidsyre, for eksempel egge-lysofosfatidsyre, eller en syntetisk lysofosfatidsyre, for eksempel 1-lauroyl-, 1-myristoyl- eller 1-palmitoyllysofosfatidsyre, en lysofosfatidylserin, for eksempel et naturlig lysofosfatidylserin, for eksempel lysofosfatidylserin fra storfehjerne eller et syntetisk lysofosfatidylserin, for eksempel 1-myristoyl-eller 1-palmitoyllysofosfatidylserin, en lysofosfatidylglyse-rol, eller en lysofosfatidylindositol og i tillegg et lecitin, for eksempel et naturlig lecitin, for eksempel egge-lecitin eller et lecitin med like acyloksygrupper, for eksempel dimyristoyl- eller dipalmitoyllecitin, et lecitin med forskjellige acyloksygrupper, for eksempel l-palmitoyl-2-oleoyllecitin, eller tillegg et kefalin, for eksempel et naturlig kefalin, for eksempel egge-kefalin, eller kefalin med forskjellige acyloksygrupper, for eksempel l-palmitoyl-2-oleylkefalin.

I første rekke kan den vandige dispersjon også inneholde en naturlig fosfatidsyre, for eksempel egge-fosfatidsyre, en syntetisk fosfatidsyre, for eksempel dilauroyl-, dimyristoyl-, dipalmitoyl- eller l-palmitoyl-2-oleoylfosfatidsyre, og eventuelt i tillegg et lecitin, for eksempel et naturlig lecitin, for eksempel egge-lecitin, et lecitin med like acyloksygrupper, for eksempel dimyristoyl- eller dipalmitoyllecitin, eller et lecitin med forskjellige acyloksygrupper,

for eksempel l-palmitoyl-2-oleoyl-lecitin, eller et kefalin, for eksempel et naturlig kefalin, for eksempel egge-kefalin eller et kefalin med forskjellige acyloksygrupper, for eksempel l-palmitoyl-2-oleyolkefalin, eller et fosfatidylserin, for eksempel et naturlig fosfatidylserin, for eksempel fosfatidylserin fra storfehjerne ell^r et syntetisk fosfatidylserin, for eksempel dipalmitoylfosfatidylserin, et monoglycerid, for eksempel monoolein eller monomyristin, eller et sterin, for eksempel cholesterin.

For fremstilling av unilamellære liposomer fremstiller man i første rekke et homogent sjikt av lipidkomponentene. Fremstillingen av det homogene sjikt kan foregå på i og for seg kjent måte, og er omtalt videre nedenfor i avsnittet "Fremstilling av det homogene sjikt av lipidkomponentene".

Det homogene sjikt dispergerer man i vandig fase, og øker deretter pH-verdiene av slike vandige faser hvori bare er dispergert en lipidkomponent, for eksempel ren fosfatidsyre, inntil ca. 12, fortrinnsvis inntil 11. Dette foregår eksempelvis ved omsetning av fysiologisk godtagbare basiske oppløsninger, for eksempel fortynnet vandige, 0,01-0,2 n, spesielt ca. 0,1 n natriumhydroksyd eller kaliumhydroksyd-oppløsning, under samtidig kontroll av pH-verdien, for eksempel ved punktprøve eller et pH-meter. I vandige faser, hvortil det er dispergert flere 1ipidkomponenter, for eksempel fosfatidsyre og lecitin, er det tilstrekkelig med en økning av pH-verdien til 8-9. Man kan innstille dette pH-området likeledes ved tilsetning av vandig base, for eksempel fortynnet natronlut eller kalilut under samtidig pH-kontroll eller ved tilsetning av pufferoppløsninger, for eksempel fosfatpufferoppløsning med en egnet pH-verdi fra 7 til 8.

I en foretrukket utførelsesform dispergerer man et homogent sjikt av lipidkomponenten i vandig fase, en pH-verdi større enn 7, for eksempel i fysiologisk godtagbare basiske oppløsninger, for eksempel i fortynnet vandig, 0,01-0,2 n, spesielt 0,1 natriumhydroksyd- eller kaliumhydroksydoppløs-ning. En lipidkomponent, for eksempel ren fosfatidsyre, dispergerer man i vandig fase med en pH-verdi inntil 12, fortrinnsvis 9 til 11. Flere 1ipidkomponenter for eksempel fosfatidsyre og lecitin dispergerer man i vandige faser med en pH-verdi fra 8 til 9.

Fremgangsmåte b)

For et lipid med formel A hvori m er 0 eller 1, en av restene Ri og R2 betyr hydrogen, hydroksy, Ci-C4-alkyl, og den annen rest betyr alkyl, alkenyl, alkoksy eller alkenyloksy med hver 10-20 C-atomer eller acyloksy med 10-50 C-atomer, R3 betyr hydrogen og R4 betyr med ammoniogrupper substituert C2-C4~alkyl, har R^ og R2 de videre ovenfor under fremgangsmåte

a) nevnte betydninger.

Med en ammoniogruppe substituert C2-C4-alkyl R4 er eksempelvis med en trilaverealkylammoniogruppe, for eksempel trimetyl- eller trietylammonio, substituert C2-C4~alkyl, for eksempel 2-trimetyl- eller 2-trietylammonioetyl.

For et lipid med formel A, hvori m er 0 eller 1, er Rj og R2 uavhengig av hverandre betyr alkyl, alkenyl, alkoksy eller alkenyloksy, med hver 10-20 C-atomer, eller acyloksy med 10-50 C-atomer, R3 betyr hydrogen og R4 betyr en ammonio-C2-C4-alkylammoniogruppe substituert C2-C4-alkyl, har R^ og R2 de videre ovenfor under fremgangsmåte a) nevnte betydning.

Med en ammonio-Ci-C4-alkylammoniogruppe substituert C1-C4-alkyl er eksempelvis 2-[N,N-di-C2-C4-alkyl-N-(2-N',N',N'-tri-C2-C4-alkylammonioetyl)-ammonio]-etyl, for eksempel 2-[N,N-dimetyl-N-(2-N',N',N'-trimetylammonioetyl)-ammonio]-etyl. . Et egnet ekstra lipid er en av de videre ovenfor under fremgangsmåten a) nevnte ekstra lipider.

Fortrinnsvis inneholder en vandig dispersjon et lipid med formel A, hvori Rj betyr acyloksy, for eksempel lauroyloksy, myrlstoyloksy, palmitoyloksy eller stearoyloksy, R2 betyr hydroksy, R3 betyr hydrogen og R4 betyr 2-trimetylammonioetyl, og et ekstra lipid med formel A, hvori R^ og R2 betyr acyloksy, for eksempel lauroyloksy, myrlstoyloksy, palmitoyloksy eller stearoyloksy, R3 betyr hydrogen, og R4 betyr 2-aminoetyl eller 2-trimetylammonioetyl. Den vandige dispersjon kan også fortrinnsvis inneholde et lipid med formel A, hvori Rj og R2 betyr acyloksy, for eksempel lauroyloksy, myrlstoyloksy, palmitoyloksy, eller stearoyloksy, R3 betyr hydrogen, og R2 betyr 2-[N,N-dimetyl-N-(2-N',N',N'-trimetylammonioetyl)-ammonio]-etyl og eventuelt et ekstra lipid med formel A, hvori R^ og R2 betyr acyloksy, for eksempel lauroyloksy, myrlstoyloksy, palmitoyloksy, eller stearoyloksy, R3 betyr hydrogen og R4 betyr 2-aminoetyl eller 2-trimetylammonioetyl.

I første rekke inneholder den vandige dispersjon et lysofos-fatidylcholin (lysolecitin) og et naturlig lecitin, for eksempel egge-lecitin. I første rekke kan den vandige dispersjon også inneholde et fosfatidyl-2-[N,N-dimetyl-N-(2-N<*>,N',N<*->trimetylammonioetyl)-ammonio]-etylklorld, og eventuelt et naturlig lecitin, for eksempel egge-lecitin.

Til fremstilling av unilamellære liposomer fremstiller man i første rekke et homogent sjikt av lipidkomponentene, for eksempel lysolecitin eller fosfatidyl-2-[N,N-dimetyl-N-(2-N<*>,N<*>,N'-trimetylammonioetyl)-ammonio]-etylklorld.

Fremstillingen av det homogene sjikt kan foregå på i og for seg kjent måte, og er videre beskrevet nedenfor i avsnittet "fremstilling av det homogene sjikt av lipidkomponentene".

Det homogene sjikt dispergerer man i vandig fase og senker deretter pH-verdien inntil 1 eller lavere, og samtidig kontroll av pH-verdien, for eksempel ved pumpeprøver eller et pH-meter. Dette foregår eksempelvis ved tilsetning av fysiologisk godtagbare syrer, eksempelvis fortynnede vandige mineralsyrer, for eksempel fortynnet vandig svovelsyre, saltsyre, eller fosforsyre.

I en foretrukket utførelsesform dispergerer man det homogne sjikt av lipidkomponentene i vandige faser med en pH-verdi på 1 eller verdier lavere, for eksempel i fortynnede vandige mineralsyrer, for eksempel fortynnet vandig svovelsyre, saltsyre eller fosforsyre, under samtidig kontroll av pH-verdien.

En etterfølgende nøytralisering av de vandige faser er nødvendig når man på forhånd har innstilt pH-verdien av den vandige fase ifølge fremgangsmåten a) på verdier høyere enn 9, eller ifølge fremgangsmåte b) lavere enn 1. Det foregår for umiddelbart etter pH-verdisenkning eller økning å unngå en ødeleggelse av det virksomme stoff og/eller liposomene under basiske respektivt sure betingelser. Den vandige fase som er gjort basisk nøytraliserer man med en egnet fysiologisk godtagbar syre, eller en pufferoppløsnsing, for eksempel fosfatpufferoppløsning av en pH-verdi fra 7 til 8. Egnede syrer er eksempelvis de videre forannevnte fortynnede vandige mineralsyrer, som svake organiske syrer, for eksempel maursyre eller eddiksyre. Den sure vandige fase nøytrali-serer man ved tilsetning av vandig fase, for eksempel fortynnet vandig natrium- eller kaliumhydroksydoppløsning. Man nøytraliserer under samtidig kontroll av pH-verdien.

Lipidene er dispergert i konsentrasjoner inntil over 70% i den vandige fase. Konsentrasjonsområdet fra \% til 20$ er foretrukket.

Man arbeider hensiktsmessig ved værelsestemperatur eller forhøyet temperatur, for eksempel inntil 60°C. Hvis følsomheten av det virksomme stoff som skal innkapsles forlanger det, gjennomfører man fremgangsmåten under avkjøling og eventuelt i inertgass-atmosfære, for eksempel nitrogenatmosfære.

Så vel etter fremgangsmåte a) som også etter fremgangsmåte b) finner dannelsen av unilamellære liposomer sted spontant (sponaneous vsiculation), det vil si uten ekstra energi-tilførsel utenifra og med stor hastighet.

De etter fremgangsmåte a) og b) oppnåelige unilamellære liposomer er relativt lenge stabile i vandig fase. Eksempelvis forblir unilamellære liposomer bestående av egg-fosfatidsyre eller egg-fosfatidsyre og egge-lecitin lagret i vandig fase ved 4<*>C, stabile mer enn 14 dager. Vandige faser med ifølge oppfinnelsen fremstillbare unilamellære liposomer, kan gjøres lagringsdyktige etter den i europeisk patentpublika-sjon 0065 292 angitte fremgangsmåter.

Den foreslåtte dannelse av unilamellære liposomer og deres innhold i vandig fase lar seg påvise på i og for seg kjent måte ved hjelp av forskjellige målemetoder, for eksempel optisk i elektronmikroskop, ved massebestemmelser i den analytiske ultrasentrifuge og fremfor alt spektroskopisk, for eksempel i kjerneresonansspektrum (<*>H, <l>^C og ^<lp>). Således gir eksempelvis skarpe signaler i kjerneresonansspektret en henvisning til foregått dannelse av små unilamellære liposomer. Mengden av dannede små unilamellære liposomer i systemet kan beregnes fra signalenes intensitet. Således er i proton-kjerneresonansspektret et skarpt metylensignal, karakteristisk ved S - 1,28 ppm, og et skarpt metylsignal ved S ■= 0,89 ppm for små unilamellære liposomer, som dannes som fosfatidsyre. Små unilamellære liposomer som består av fosfatidsyre og lecitin, viser likeledes metylen- og metylsignaler ved S 1,28 og 0,89 ppm og i tilegg et metylsignal ved S = 3,23 ppm, som tilordnes trimetyl-ammon i ogruppe.

Størrelsen av de dannede unilamellære liposomer er blant annet avhengig av strukturen av lipidkomponentene, blandingsforholdet av lipidkomponentene, disse 1ipidkomponenters konsentrasjon i den vandige fase og av mengden og strukturen av det virksomme s;toff som skal innkapsles. Således kan man eksempelvis ved variasjon av konsentrasjonen av lipidkomponenten fremstille vandige faser med en høy mengde av små eller store unilamellære liposomer. Eksempelvis økes ved tilsetning av egge-fosfatidsyre til den disperse fase, mengde av små unilamellære liposomer (KUL). Mengden av GUL i en dispers fase lar seg også øke ved tilsetning av salter, for eksempel NaCl eller KC1. Diameteren av eksempelvis av fosfatidsyre eller fosfatidsyre og lecitin dannet KUL utgjør 200 til 600 Å. Innslutningsvolumet for KUL av denne størrelse utgjør 0,5 til 1 liter pr. mol anvendt lipidkomponent .

I tillegg til KUL oppstår også store unilamellære liposomer (GUL-diameter inntil 50.000 Å). Disse inneslutter større volum pr. mol anvendt lipidkomponenter og egner seg til innkapsling med større utbytte i innslutning av voluminøse materialer, for eksempel vira, bakterier eller celle-organeller .

Utskillelse av KUL fra GUL foregår ved hjelp av vanlige skillemetoder, for eksempel gelfiltrering, for eksempel med sepharose 4B som bærer eller ved sedimentasjon av GUL i ultrasentrifuge ved 160.000 x g. Eksempelvis avsetter det seg etter flere timer ca. 3 timers sentrifugering i dette mengdefelt GUL, mens KUL forblir dispergert og kan dekante-res. Etter flere gangers sentrifugering oppnår man en fullstendig adskillelse av GUL fra KUL.

Også ved gelf iltrering kan man adskille alle i den vandige fase befinnende liposomer med en diameter på større enn 600 Å, for eksempel GUL, eller multilame1lære liposomer, samt ikke innkapslede virksomme stoffer og overskytende dis-pergerte lipider, således oppnå en vandig fase med en fraksjon KUL av relativt enhetlig størrelse.

Ifølge oppfinnelsen oppnåelige liposomer, (KUL og GUL) er egnede bæresystemer som i vandig fase kan anvendes til solubilisering av lipofile stoffer, for eksempel fett-oppløselige fargestoffer, til stabilisering av hydrolyseføl-somme stoffer, for eksempel prostaglandiner til innslutning av skadedyrbekjempelsesmidler, for eksempel til endring av virkningsprofilene av diklorfos, til innslutning av nærings-middeltilsetninger, for eksempel for endring av adsorbsjons-forholdet av vitaminer eller fargestoffer, eller til innslutning av forkapslede virksomme stoffer, enzymer, antistoffer, hormoner, gener, vira, vitaminer eller celle-organeller i cellene av en cellekultur.

Vandige faser, som inneholder de ifølge oppfinnelsen oppnåelige liposomer med forkapslede virksomme stoffer, er administreringssystemer som egner seg eventuelt etter konsentrering eller isolering av liposomene, for eksempel ved ultrasentrifugering, til terapeutiske formål for oral (p.o.), parenteral (i.v., i.m. eller i.p.) eller topisk administrering.

Ved oral administrering kan administreringssystemene på liposombasis beskytte et virksomt stoff, eksempelvis insulin som er ubestandig i fordøyelseskanalen, og forbedre dets resorpsjon. For den orale administrering kan den liposom-holdige vandige fase blandes med farmasøytisk godtagbare fortynningsmidler eller bærere eller med vanlige tilset-ninger, for eksempel fargestoffer eller smaksstoffer, og administreres som syre eller i form av kapsler.

Ved parenteral administrering kan administreringssystemet på liposombasis eksempelvis forlenge oppholdstiden i for eksempel av deferrioksamin, se Guilmette R.A., Life Sei. 22 (4) 313-320, 1978, eller Gentamycin, se Scheld W.M. et al., Clin. Res. 26, nr. 1, 59 A, 1978, i en organisme. Likeledes forlenges oppholdstiden i organismen av innkapslede gelat-dannere, for eksempel EDTA (etylendiamintetraeddiksyre), således at man ved gelatdannelse kan fjerne tungmetaller, spesielt fra lever, milt eller nyrer, se Rahmann et al, Science, bind.180, 300-302, 1973, og J. Lab. Clin. Med. 640-647, 1974. Med administreringssystemer på liposombasis kan man anrike virksomme stoffer i myokard, se Lanesmann et al., Science Vol., 198, 737-738, 1977. Anti-inflammatorisk virkende stoffer, for eksempel kortisol, se Nature 271, nr. 5643, 372-373, 1978, eller protaseinhibitorer, se anal. Biochem. 89, nr. 2, 400-407, 1978, kan man anrike i leddvæs-ken og cytostatika i tumorvevnad, se oversiktsartikkel av Kaye St. B., Cancer Treatment Reviews 8, 27-50, 1981, og de mange deri siterte litteraturreferanser. Mange kjemoterapeu-tika i kreftterapien er mindre toksiske og bedre tålbare, når de administreres innkapslet i liposomer, for eksempel 1iposominnkapslede aktinomycin D, se Rahman et al., Proceed-ings of the Society for Experimental Biology and Medicine 146, 1173-1176, 1974, Methotrexat, se Lesermann L.D. et al. Proe. Nati. Acad. Sei. 77, nr. 7, 4089-93, 1980, vinblastin, daunomycin eller cytosin-arabinosid, Se Milhlensiepen et al., Cancer Res. 41, nr. 5, 1602-1607, 981. Liposomer kan anvendes til innslusing av virksomme stoffer, for eksempel enzymer, peptidhormoner, gener eller vira i cytoplasma av celler i levende organismer, for eksempel til innslusing av asparaginase, se oversiktsartikkel av Finkelstein M. og Weissmann G. , J. Lipid Research, vol. 19, 1978, 289-303, av amyloglucosidase, se Gregoriadis G. og Ryman B.E., Eur. J. Biochem. 24 (1972), 484-491, eller neuroinidase, se Gregoriadis et al., Biochem. J. (1974), 140, 232-330, til forankring av spesifikke erkjenningsmolekyler, for eksempel monoklonalt antistoff for målrettet innslusing i definerte målceller, se Leserman et al., Nature 293 (5829), 226-228, 1981, til immunstimulering som adjuvans ved podninger, for eksempel mot leismaniaser, se New R.R.C. et al. Nature272 (5648), 55-56, 1978, eller til indusert frigjøring av virksomme stoffer ved signaler, som temperaturøkninger, for eksempel i betent vev eller pH-verdiendringer. For den parenterale administrering i en egnet bærevæske, eksempelvis i sterilt, destillert vann, eller i fysiologisk koksaltoppløsning.

Fremstilling av det homogene sjikt av lipidkomponentene

Fremstillingen av det homogene sjikt av lipidkomponentene kan foregå på i og for seg kjente måter. Eksempelvis oppløser man i første rekke lipid eller lipidblandinger med formel A og eksempelvis rent egge-fosfatidsyre eller en blanding av egge-fosfatidsyre og egge-lecitin, spesielt under tilblanding av et lipofilt virksomt stoff, for eksempel protein, som ved dannelsen av liposomene innesluttes i lipidsjiktet, i et organisk oppløsningsmiddel. Ved fjerning av det organiske oppløsningsmiddel mest hensiktsmessig i vakuum, eller ved avblåsning i inertgass, for eksempel nitrogen, fremstiller man et homogent sjikt av lipidkomponentene.

Valg av angjeldende oppløsningsmiddel er avhengig av oppløseligheten av de angjeldende 1ipidkomponenter deri. Egnede oppløsningsmidler er eksempelvis usubstituerte eller substituerte for eksempel halogenerte alifatiske, cyklo-alifatiske, aromatiske eller aromatisk-alifatiske hydrokar-boner, for eksempel benzen, toluen, metylenklorid eller kloroform, alkoholer, for eksempel metanol eller etanol, laverealkankarboksylsyreestere, for eksempel eddiksyre-etylester, etere, for eksempel dietyleter, dioksan eller tetrahydrofuran eller blandinger av disse oppløsningsmidler.

De i forbindelse med foreliggende oppfinnelse nevnte lipider er kjente og kan hvis de er nye, fremstilles på i og for seg kjent måte, etter i standardverk av Knight C.G. Liposomes, Elpevier 1981, kapittel 3 angitte fremgangsmåter. Alle nevnte lipider kan være inneholdt den vandige dispersjon som optisk aktive derivater, eller som racemater. De følgende eksempler anskueliggjør oppfinnelsen uten å begrense den. Temperaturen er angitt i Celciusgrader og blandingsforholdet er referert til volum.

Eksempel 1

a) Man oppløser 1 g egge-fosfatidsyre i 20 ml av en kloroform/metanolblanding (2:1) og inndamper denne oppløsning

i vakuum 1 rotasjonsfordamper. Man dispergerer det filmaktige residuet i 200 ml destillert vann ved 5 minutters rysting, idet det innstiller seg en pH-verdi på ca. 3. For dannelse av unilamellære liposomer setter man deretter til den disperse fase ved værelsestemperatur under kontroll med pH-meter så meget 0,1 N natriumhydroksydoppløsning, inntil pH-verdien stiger til 11. Den vandige fases pH-verdi senkes deretter ved tilsetning av 0,1 N HC1 fra 11 til ca. 7. Man får en svakt opaliserende vandig fase.

De dannede unilamellære liposomer kan gjøres synlige i elektronmikroskop. Liposomdispersjonen underkastes i første rekke vanlig frysebruddmetoden (freeze-fracture). Det foreligger hovedsaklig to "populasjoner" av unilamellære liposomer som adskiller seg ved deres gjennomsnittlige størrelse. 1. Små unilamellære liposomer (KUL) med en diameter på 200-600 Å, og 2. store unilamellære liposomer (GUL) med en diameter på 1000-10.000 Å.

KUL er synlig i proton-NMR-spektret med signalene S = 1,28 (metylen) og S «= 0,89 pp (metyl). Utbyttet av KUL kan vurderes fra signalenes intensitet og utgjør ca. 5656.

b) Analogt eksempel la) oppløser man fire ganger, hver gang 10 mg, egge-fosfatidsyre i fire ganger hver gang 0,2 ml av en

kloroform/metanolblanding (2:1) og inndamper disse opp-løsninger i vakuum. Man dispergerer hver gang et filmaktig residu i 1 ml destillert vann med 5 minutters rysting. For dannelse av unilamellære liposomer setter man deretter til hver enkelt dispers fase under kontroll med et pH-meter, så

meget 0,1 N natriumhydroksydoppløsning inntil det er fremkommet en pH-sluttverdi på hver gang 6,8, 11,3 og 11,6. Utbyttet av KUL utgjør med økende pH-verdi for hver prøve 5, 24, 57 og 6056.

Eksempel 2

a) Man oppløser 1 g egge-fosfatidsyre i 20 ml av en kloroform/metanolblanding (2:1) og inndamper denne oppløsning

i vakuum. Man dispergerer det filmaktige residuet i 50 ml av en 0,01 N natriumhydroksydoppløsning under rysting, idet det innstiller seg en pH-verdi på ca. 12. Den vandige dispersjons pH-verdi senkes deretter ved tilsetning av 0,1 N saltsyre til 7 til 8. Utbytte av KUL utgjør ca. 10056.

b) Analogt eksempel 2a) oppløser man fire ganger hver gang 10 mg egge-fosfatidsyre i fire ganger hver gang 0,2 ml av en

kloroform/metanolblanding (2:1) og inndamper denne oppløsning i vakuum. Man dispergerer hver prøve i så meget 0,01 N natriumhydroksydoppløsning og destillert vann under rysting at det innstiller seg pH-verdier på ca. 7,3, 8,0, 9,4 og 10,0. Utbytte av KUL utgjør med økende pH-verdi for hver prøve 33, 46, 65 og 8156.

Eksempel 3

Man oppløser 0,1 g dilauroylfosfatidsyre i 5 ml av en kloroform/metanolblanding (2:1) og inndamper denne oppløsning i vakuum. Man dispergerer det filmaktige residuet i 50 ml av en 0,01 N natriumhydroksydoppløsning under rysting, idet det innstiller seg en pH-verdi på ca. 12. Den vandige dispersjons pH-verdi senkes deretter ved tilsetning av 0,1 N saltsyre til 7 til 8. Utbytte av KUL (300-800 Å) utgjør 7356.

Eksempel 4

a) Man oppløser 3 mg egge-fosfatidsyre og 7 mg egge-lecitin i 0,5 ml av en kloroform/metanolblanding (2:1) og inndamper

denne oppløsning i vakuum. Man dispergerer det filmaktige residuet i 1 ml destillert vann ved 5 minutters rysting ved vaerelsestemperatur hvorpå det innstiller seg en pH-verdi på ca. 3. For dannelse av unilamellære liposomer setter man deretter ved vaerelsestemperatur under kontroll med et pH-meter så meget 0,1 N natronlut inntil pH-verdien stiger til ca. 11,2. Ved tilsetning av fosfatpufferoppløsning innstiller man deretter pH-verdien av den vandige fase på ca. 7. Man får en svak opaliserende, vandig fase. Den foretatte dannelse av unilamellære liposomer er synlige i NMR-spektre ved signalene 5 = 1,28 (metylen), S = 0,89 (metyl) og S = 2,23 (N-CH3). I den elektronmikroskopiske avbildning sees hovedsaklig to "populasjoner" av unilamellære liposomer som adskiller seg ved deres gjennomsnittlige størrelse:

1. KUL med en diameter på 200-800 Å, og

2. GUL med en diameter på 1.000-10.000 Å.

Utbyttet av KUL utgjør 4556.

b) Analogt eksempel 4a) oppløser man to ganger med hver gang 3 mg egge-fosfatidsyre og 7 ml egge-lecitin i to ganger med

hver gang 0,5 ml av en kloroform/metanolblanding (2:1), og inndamper disse oppløsninger i vakuum. Man dispergerer hver gang det filmaktige residuet i 1,0 ml destillert vann ved 5 minutters rysting. For dannelse av unilamellære liposomer setter man deretter til hver enkelt fase under kontroll med et pH-meter så meget 0,1 N natriumhydroksydoppløsning under rysting inntil det er innstilt en slutt pH-verdi på 8,6 og 10. Utbyttet av KUL utgjør med økende pH-verdi 22 og 3556.

b) Analogt eksempel 4a) oppløser man prøver av forskjellig innhold av egge-fosfatidsyre og egge-lecitin med hver gang

0,5 ml av en kloroform/metanolblanding (2:1), og inndamper disse oppløsninger i vakuum. Man dispergerer hver gang det filmaktige residuet i 1,0 ml destillert vann ved 5 minutters rysting. For dannelse av unilamellære liposomer setter man deretter til hver enkelt fase under kontroll med et pH-meter så meget 0,1 natriumhydroksydoppløsning under rysting inntil det er innstilt seg en pH-verdi på ca. 11,2. Utbyttet av KUL utgjør for hver prøve med økende egge-fosfatidsyreinnhold:

Eksempel 5

a) Man oppløser 0,3 g egge-fosfatidsyre og 0,7 g egge-lecitin i 10 ml av en kloroform/metanolblanding (2:1) og

inndamper denne oppløsning i vakuum. Man dispergerer dette residuet i 10 ml av en 0,01 N natriumhydroksydoppløsning under rysting, idet det innstiller seg en pH-verdi på ca. 12. Den vandige dispersjons pH-verd isenkes deretter ved tilsetning av 0,2 N saltsrye til 7-8. Utbyttet av KUL utgjør ca. 30%.

b) Analogt eksempel 5a) oppløser man prøver av forskjellig innhold av egge-fosfatidoppløsning og egge-lecitin (til

sammen 10 mg lipid), i hver gang 0,5 ml av en kloroform/- metanolblanding (2:1), og inndamper denne oppløsning i vakuum. Man dispergerer hver gang det filmaktige residuet i hver gang 1 ml av en 0,01 N natriumhydroksydoppløsning under rysting, idet det innstiller seg en pH-verdi på ca. 12. Den vandige dispersjons pH-verdi senkes til 7-8. Utbyttet av

KUL utgjør for hver prøve med økende egge-fosfatidsyreinnhold:

Eksempel 6

a) Man oppløser 0,7 g egge-lecitin, 0,3 g fosfatidylserin av storfehjerne og 2 g egge-fosfatidsyre i 20 ml av en kloroform/metanolblanding (2:1) og inndamper denne oppløsning i vakuum i rotasjonsfordamper. Man dispergerer det filmaktige residuet i 100 ml 0,01 N natriumhydroksydoppløsning ved 5 minutters rysting ved vaerelsestemperatur, idet det innstiller seg en pH-verdi på ca. 12. Ved tilsetning av 1 N saltsyre innstilles den vandige fases pH-verdi på ca. 7. Man får en svakt opaliserende, vandig fase.

Den foretatte dannelsen av unilamllære liposomer kan påvises analogt eksempel la) spektroskopisk, for eksempel i NMR-spektrum, eller i elektronmikroskop. I den elektronmikroskopiske bildning sees GUL og KUL.

b) Analogt eksemkpel 6a) oppløser man prøver av forskjellig innhold av egge-fosfatidsyre, men lik mengde av egge-lecitin

og fosfatidylserin (til sammen 10 mg lipid) i hver gang 0,5 ml av en en kloroform/metanolblanding (2:1) og inndamper disse oppløsninger i vakuum. Man dispergerer hver gang residuet 1,0 ml av en 0,01 N natriumhydroksydoppløsning under rysting, idet det innstiller seg en pH-verdi på ca.12. Denvandige dispersjons pH-verdi senkes deretter ved tilsetning av 0,1 N saltsyre til 7-8. Utbyttet av KUL utgjør for hver prøve med økende egge-fosfatidsyreinnhold:

Eksempel 7

a) Man oppløser 1 g asolecitln (fosfolipidblanding hovedsaklig bestående av lecitin, kefalin, fosfatidylserin og

fosfatidylinosit) og 0,2 g egge-fosfatidsyre i 20 ml av en kloroform/metanolblanding (2:1) og inndamper denne oppløsning i vakuum. Man dispergerer det filmaktige residuet i 100 ml 0,01 N natriumhydroksydoppløsning ved 5 minutters rysting ved værelsestemperatur, idet det innstiller seg en pH-verdi på ca. 12. Ved tilsetning av 1 N saltsyre bringes den vandige fases pH-verdi på ca. 7. Man får en lett, svak, opaliserende vandig fase.

Den foregåtte dannelse av unilamellære liposomer kan påvises analogt eksempel la) spektroskopisk, for eksempel i NMR-spektrum, eller i elektronmikroskop. I den elektronmikroskopiske avbildning sees GUL og KUL.

b) Analogt eksempel 6a) oppløser man prøver av forskjellig innhold av egge-fosfatidsyre, men lik mengde av asolectin

(til sammen 10 mg lipid), i hver gang 0,5 ml av en kloroform/metanolblanding (2:1) og inndamper denne oppløsning i vakuum. Man dispergerer hver gang residuet i 1 ml av en

0,01 N natriumhydroksydoppløsning under rysting, idet det innstiller seg en pH-verdi på ca. 12. Den vandige dispersjons pH-verdi senkes deretter ved tilsetning av 0,1 N saltsyre til 7 til 8. Utbyttet av KUL utgjør for hver prøve med økende egge-fosfatidsyreinnhold:

Eksempel 8

a) Man oppløser 0,1 g av en blanding av egge-lecitin og kolestrol (molforhold 1:1) og 0,1 g egge-fosfatidsyre, i 10 ml av en kloroform/metanolblanding (2:1) og inndamper denne oppløsning i vakuum. Man dispergerer det filmaktige residuet i 10 ml 0,01 N natriumhydroksydoppløsning ved 5 minutters rysting ved værelsestemperatur, idet det innstiller seg en pH-verdi på ca. 12. Ved tilsetning av 1 N saltsyre bringes den vandige fases pH-verdi på ca. 7. Man får en svak, opaliserende vandig fase.

Den foregåtte dannelse av unilamellære liposomer kan påvises analogt eksempel la) spektroskopisk, for eksempel i NMR-spektrum, eller i elektronmikroskop. I den elektronmikroskopiske avbildning sees GUL og KUL.

b) Analogt eksempel 8a) oppløser man prøver av forskjellig innhold av egge-fosfatidsyre med like mengder av egge-lecitin

og kolestrol (til sammen 10 mg lipid) i hver gang 0,5 ml av en kloroform/metanolblanding (2:1), og Inndamper denne oppløsning i vakuum. Man dispergerer hver gang residuet i hver gang 1,0 ml av en 0,01 N natriumhydroksydoppløsning under rysting, idet det innstiller sg en pH-verdi på ca. 12. Den vandige dispersjons pH-verdi senkes deretter ved tilsetning av 0,1 N saltsyre til 7 til 8. Utbytte av KUL utgjør for hver prøve med økende egge-fosfatidsyreinnhold:

Eksempel 9

Man oppløser 0,5 g egge-fosfatidsyre og 0,5 g dimyristoyllecitin i 10 ml av en kloroform/metanolblanding (2:1) og inndamper oppløsningen i vakuum. Man dispergerer det filmaktige residuet i 50 ml av en 0,01 N natriumhydroksyd-oppløsning under rysting, idet det innstiller seg en pH-verdi på ca. 12. Den vandige dispersjons pH-verdi senkes deretter ved tilsetning av 0,1 N saltsyre til 7 til 8. Utbytte av KUL utgjør 36*.

Eksempel 10

Man fremstiller analogt eksempel 9 1iposomblandinger bestående av en 0,5 g egge-fosfatidsyre og hver gang 0,5 g dipalmitoyllecitin eller distearoyllecitin. Utbytte av KUL utgjør 10*.

Eksempel 11

Man fremstiller analogt eksempel 9 en liposomblanding av

0,5 g dipalmitoylfosfatidsyre og 0,5 g egge-lecitin. Utbytte av KUL utgjør 10*.

Eksempel 12

Man oppløser 5 mg lysolecitin og 5 mg egge-lecitin i 1 ml av en kloroform/metanolblanding (2:1) og inndamper denne oppløsning i vakuum. Man dispergerer det filmaktige residuet i 1 ml destillert vann ved 5 minutters rysting, idet det innstiller seg en pH-verdi på 5-7. For dannelse av unilamellære liposomer setter man deretter til en vandig dispersjon ved værelsestemperatur under kontroll med et pH-meter så meget 0,1 N saltsyre inntil den vandige fases pH-verdi er sunket til 0,5. Ved tilsetning av 0,1 N natriumhydrok-sydoppløsning øker man deretter pH-verdien til 7.

Den foregåtte dannelsen av unilamellære liposomer kan påvises analogt eksempel la) spektroskopisk, for eksempel i NMR-spektret eller i elektronmikroskopet. I den elektronmikroskopiske avbildning sees KUL og GUL. Utbyttet av KUL utgjør 50*.

Eksempel 13

Man fremstiller analogt eksempel 12 en liposomblanding bestående av 5 mg fosfatidyl-2-[N,N-dimetyl-N-(2-N<*>,N<*>,N<»->trimetylammonioetyl)-ammonio]-etylklorld, hvis fremstilling er omtalt i Knight C.G. Liposoms Elsevier 1981, kap. 3, og

5 mg egge-lecitin.

Den foregåtte dannelsen av unilamellære liposomer kan påvises analogt eksempel la) spektroskopisk, for eksempel NMR-spektrum, eller i elektronmikroskop. I den elektronmikroskopiske avbildning sees KUL med en diameter på 250 Å og GUL med en diameter på 600 - > 10.000 Å. Utbyttet av KUL utgjør 50*.

Eksempel 14

a) Man oppløser 0,5 g monoolein (9-cis-oktadecenoyl-glycerol) og 0,5 g egge-fosfatidsyre i 20 ml av en kloroform/metanolblanding (2:1) og inndamper denne oppløsning i vakuum. Man dispergerer det filmaktige residuet i 100 ml av en 0,01 N natriumhydroksydoppløsning ved 5 minutters rysting ved værelsestemperatur, idet det innstiller seg en pH-verdi på ca. 12. Ved tilsetning av 1 N saltsyre bringes den vandige fases pH-verdi til ca. 7. Man får en lett, svak, opakiserende, vandig fase.

Den foregåtte dannelse av unilamellære liposomer kan påvises analogt eksempel la) spektroskopisk, for eksempel i NMR-spektrum eller i elektronmikroskop. I den elektronmikroskopiske avbildning sees GUL og KUL.

b) Analogt eksempel 14a) oppløser man prøver av forskjellig innhold av egge-fosfatidsyre og monoolein (total lipldmengde

- 10 mg) i hver gang 0,5 ml av en kloroform/metanolblanding (2:1) og inndamper denne oppløsning i vakuum. Man dispergerer hver gang residuet i hver gang 1 ml av en 0,01 N natriumhydroksydoppløsning under rysting, idet det innstiller seg en pH-verdi på ca. 12. Den vandige dispersjons pH-verdi senkes deretter ved tilsetning av 0,1 N saltsyre til 7 til 8. Utbytte av KUL utgjør for hver gang med økende egge-fosfatidsyreinnhold:

Eksempel 15

Analogt eksempel 14a) oppløser man prøver av forskjellig innhold av egge-fosfatidsyre og monomyristin (samlet lipldmengde: 10 g) i hver gang 0,5 ml av en kloroform/meta-nolblanding (2:1) og inndamper denne oppløsning i vakuum. Man dispergerer hver gang residuet i hver gang 1 ml av en 0,01 N natriumhydroksydoppløsning under rysting, idet det innstiller seg en pH-verdi på ca. 12. Den vandige dispersjons pH-verdi senkes deretter ved tilsetning av 0,1 N saltsyre til 7 til 8. Utbytte av KUL utgjør for hver prøve med økende egge-fosfatidsyreinnhold:

Eksempel 16

a) Man fremstiller analogt eksempel la) og lb) en liposomblanding bestående av egge-fosfatidsyre, idet man får et utbytte inntil 66* KUL. For å øke mengden av GUL i liposom-blandingen setter man til den disperse fase som inneholder nyfremstilte unilamellære liposomer ved 0,5 molar koksalt-oppløsning. Med økende NaCl-konsentrasjon i den disperse fase senkes mengde av KUL: b) For å øke mengden av GUL i 1iposomblandingen setter man til den disperse fase som inneholder nyfremstilte unilamellære liposomer bestående av rene egge-fosfatidsyrer, 0,5 molar kaliumkloridoppløsning. Med økende KCl-konsentrasjon i den disperse fase senkes mengden av KUL:

Eksempel 17

Analogt eksempel 1-16 kan man fremstille unilamellære liposomer av myristinsyre og egge-lecitin, myristinsyre og egge-kefalin, oljesyre og egge-lecitin, oljesyre og egge-kefalin, dimyristoylfosfatidsyre og dimyristoyllecitin, dipalmitoylfosfatidsyre og l-palmitoyl-2-oleyllecitin, 1-palmltoyl-2-oleylfosfatidsyre og dipalmitoyllecitin, 1-palmitoyl-2-oleylfosfatidsyre og l-palmitoyl-2-oleyllecitin, egge-lysofosfatidsyre og egge-lecitin, 1-myristoyllysofos-fatidsyre og l-palmitoyl-2-oleyllecitin, 1-palmitoyllysofosfatidsyre og l-palmitoyl-2-oleyllecitin, lysofosfatidylserin fra storfehjerne og egge-lecitin, 1-palmitoyl-lysofosfatidylserin, l-palmitoyl-2-oleyl-fosfatidylserin og l-palmitoyl-2-oleyllecitin og lysofofatidylserin fra storfehjerne og egge-kefalin.

Eksempel 18

2 mg hydrokortison-21-palmitat, 40 g egge-lecitin og 20 mg egge-fosfatidsyre oppløses i 5 ml tert.-butanol, sterilfUtreres gjennom et 0,2 pm filter og fylles i en 25 ml vial ved inndypning av vialen i en tørris/etanol-kuldeblanding, fryses og lyofiliseres. Man blander det dannede skum med 5 ml sterilt vann, dispergerer ved 10 minutters rysting. Ved tilsetning av 0,1 N sterilfUtrert natronlut bringer man pH-verdien til 10,5, og lar det stå 1 minutt. Deretter tilsetter man 0,5 ml av et 10 ganger konsentrat av fosfat-pufferet isotonisk koksaltoppløsning av pH 7,4 (PBS for injeksjonsformål). Den således dannede dispersjon av unilamellære liposomer egner seg til injeksjon i på grunn av betennelse endrede leddkapsler.

Eksempel 19

0,1 mg N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutamyl-L-alanyl-2-(1 *,2'-dipalmitoyl-sn-glycero-3'-fosforyl)-etylamld, 7 mg kromatografisk renset glycidin fra hønseeggehvite og 3 mg egge-fosfatidsyre oppløses i 2 ml av en kloroform-metanol-blanding (2:1) og inndampes i vakuum. Det blir tilbake en klar lipidfilm. Man dispergerer denne film ved tilsetning av 2 ml sterilt destillert vann under omsvingning og tilsetter en dråpe 0,l*-ig tymolftalinoppløsning. Til dispersjoneh setter man inntil fargeomslag 0,1 N natronlut, hvoretter det foregår spontan dannelse av unilamellære liposomer. Man tilfører deretter med en gang ved tilsetning av 0,2 ml av et 10 ganger konsentrat av fosfatpuffer isotonisk koksalt-

36

oppløsning (PBS for injeksjonsformål ), pH-verdien ned til 7,4.

Den dannede dispersjon egner seg direkte til aktivering av alveolære makrofager i cellekulturer og in vivo på rotte.

Eksempel 20

0,15 g N-acetylmyramyl-L-alanyl-D-isoglutamyl-L-alanyl-2-(1',2'-dipalmitoyl-sn-glycero-3'-fosforyl)-etylamid, 27 g egge-lecitin med 97* fosfatidylcholininnhold og 3 g egge-fosfatidsyre oppløses i en blanding av 200 ml kloroform og 20 ml metanol, oppfylles med 200 ml tert. butanol og inndampes til 180 ml. Oppløsningen sterilfUtreres med et 0,2 pm filter, fryses hurtig i en etanol/tørrisblanding og frysetørkes deretter. Det ved maling knuste lyofilisat innføres i 300 ml sterilt fremstilt 0,01 N natriumhydrok-sydoppløsning under kraftig omrøring. Etter fullstendig dispergering nøytraliseres den vandige fase ved tilsetning av 0,1 N HC1. Den dannede opaliserende dispersjon ifylles i en omrørt ultrafiltreringscelle ("Amicon"), som i stedet for ultrafilter er utstyrt med et rettporet filter av polykar-bonat ("Nucelopore") med en porediameter på 0,1 pm, og ble vasket partikkelfri, og under svakt overtrykk og stadig tilførsel av sterilfUtrert pufferoppløsning ifølge Dulbecco (pH 7,4 uten Ca og Mg), filtreres således at volumet i cellen ikke synker under 300 ml. Etter gjennomtredenen av 3 liter filtrat er alle KUL adskilt og den ovenstående dispersjon kan ampulleres på GUL og anvendes for behandlingsforsøk.

Eksempel 21

15 mg N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutamyl-L-alanyl-2-(1',2'-dipalmitoyl-sn-glycero-3'-fosforyl)-etylamid, 0,6 g rent egge-lecitin og 2,4 g egge-fosfatidsyre, oppløses i en blanding av 20 ml kloroform av 2 ml metanol, sterilf Utreres gjennom et 0,2 pm filter og inndampes på en partikkelfri vasket over sterilfilter avluftet rotasjonsformdaper i en 300 ml rørkolbe således at lipidblandingen tørker som mest mulig jevn film på kolbeveggen. Etter tørking av residuet natten over i høyvakuum tilsettes 30 ml sterilfremstilt 0,01 N natriumhydroksydoppløsning, kolben lukkes og rystes i 5 minutter. Den dannede opaliserende vandige fase innstilles ved tilsetning av steril 0,1 N saltsyre på pH 7,4. Etter ifylling i en omrørt filtercelle (totalvolum 100 ml) ifølge eksempel 18, filtreres under tilsetning av sterilt partik-kelfritt filtrert vann så lenge inntil det er samlet 500 ml filtrat. Filtratet inndampes kontinuerlig i en omrørt filtercelle som er utrustet med et ultrafilter, for eksempel "Amicon" U 10 og konsentreres til et volum på 30 ml. Den konsentrerte dispersjon inneholder små unilamellære liposomer, og kan etter ved tilsetning av et konsentrat av fosfatpuffer ifølge "Dulbecco" (pH 7,4 uten Ca og Mg) ampulleres og anvendes for behandlingsforsøk.

Claims (8)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av unilamellære liposomer, karakterisert ved at man dispergerer a) et lipid av formel hvori m er 0 eller 1, en av restene Ri og Rg er hydrogen, hydroksy eller C^-C^-alkyl og den andre er alkyl, alkenyl, alkoksy eller alkenyloksy, hver inneholdende fra 10 til 20 karbonatomer, eller er acyloksy med fra 10 til 50 kar bonatomer, R3 er hydrogen eller Ci-C4-alkyl og R4 er hydrogen, Ci-C4-alkyl, C^-Cy-alkyl substituert med karboksy eller med sulfo, C^-Cy-alkyl substituert med karboksyl eller med amino, aminogruppen befinner seg i a-posisj onen til karboksylgruppen, Ci-C4~alkyl substituert med halogen, C1-C4- alkoksykarbonyl eller med Ci-C4-alkansulfonyl, eller C2-C4- alkyl substituert med frie eller foretrede hydroksygrupper, hvor to foretrede hydroksygrupper kan være forbundet med hverandre gjennom metylen, etylen, etyl iden, 1,2-propylen eller 2,2-propylen, eller en en karbohydratrest med fra 5 til

12 karbonatomer eller, dersom R^ og R2 er hydrogen eller hydroksy og R3 er hydrogen, er en steroidrest, og et ytterligere lipid av formel A, hvori m er 0 eller 1, hver av Ri og R2 er uavhengig av hverandre alkyl, alkenyl, alkoksy, hver med fra 10 til 20 karbonatomer, eller er acyloksy med fra 10 til 50 karbonatomer, R3 og R4 er hydrogen, og eventuelt et av de nevnte ytterligere lipidene av formel A, i en vandig fase som har en pH-verdi høyere enn 9, eller b) et lipid av formel A, hvori m er 0 eller 1, en av restene Ri og R2 er hydrogen, hydroksy eller Ci-C4-alkyl, og den andre er alkyl, alkenyl, alkoksy eller alkenyloksy, hver med fra 10 til 20 karbonatomer, eller er acyloksy med fra 10 til 50 karbonatomer, R3 er hydrogen, og R4 er C^-C^-alkyl som er substituert med en ammoniogruppe, og eventuelt et av de ytterligere lipidene av formel A som angitt under a); eller et lipid med formel A, hvori m er 0 eller 1, hver av Ri og R2 er uavhengig av hverandre alkyl, alkenyl eller alkenyloksy, hver med fra 10 til 20 karbonatomer, eller er acyloksy med fra 10 til 50 karbonatomer, R3 er hydrogen og R4 er C2-C4-alkyl som er substituert med en ammonio-C2-C4-alkyl-ammoniogruppe, og et av de ytterligere lipidene av formel A som angitt under a) dispergeres i en vandig fase som har en pH-verdi på ca. 1 eller lavere, og den vandige fasen nøytraliseres og, om ønsket, anrikes og/eller separeres de derved oppnådd unilamellære liposomene. 2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at den vannholdige dispersjonen inneholder et lipid med formel A hvori Ri er <c>10_c20-alky1'<C>i0-<C>2o-alkoksy, C10-<C>2o-acyloksy, R2 er hydrogen eller hydroksy, R3 er hydrogen eller metyl og R4 er hydrogen, Ci-C4~alkyl, 2-amino-2-karboksyetyl eller 3-amino-3-karboksy-n-propyl, 2-hydroksyetyl, 2,3-hydroksypropyl, 2,3-etylendioksypropyl, 2,3-(2,2-propylen)-dioksypropyl, halogen-C2-C4~alkyl eller en karbohydratrest med 5-12 karbonatomer, og av et ytterligere lipid med formel A hvori Ri og R2 er <c>10~c20"acvloksy» R3 er hydrogen og R4 er 2-trimetylammonioetyl eller 2-aminoetyl.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at den vandige dispersjon inneholder egge-fosfatidsyre eller egge-fosfatidsyre og egge-lecitin .

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at den vandige dispersjon inneholder egge-fosfatidsyre, egge-lecitin eller fosfatidylserin fra storfehjerne.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at den vandige dispersjon inneholder asolectin.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at den vandige dispersjon inneholder egge-fosfatidsyre, egge-lecitin og kolestrol.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at den vandige dispersjon inneholder lysolecitin og egge-lecitin.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at den vandige dispersjon inneholder naturlig lysofosfatidylserin og egge-lecitin.