JP2002509102A - リポマトリックス製剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、水和したときリポソームを形成する積層された二重層の脂質格子状構造を含むリポマトリックス（Ｌｉｐｏｍａｔｒｉｘ）に関する。本発明はまた、有効性の高いリポソーム製剤を製造するために使用される簡易法を提供する。優れた免疫学的特性を有するワクチン組成物は、安全で効率的な方法を使用して、リポマトリックスから製造することができる生医学用等級のリポソームを使用する。本発明の方法を使用すると、腫瘍抗原に対する強力なワクチンが製造される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 ［発明の背景］ リポソームは、薬剤を送達するための担体としてますます重要になっている。
このような用途に加えて、免疫アジュバントとしての用途が得に重要である。

【０００２】 従来のワクチンは、一般に、精製抗原または弱毒菌を用いた免疫化を伴う。こ
のような従来の方法は、例えば、人を免疫しようとすると同時に、実際に人に感
染する危険が生じる。精製抗原に伴う別の永続的な問題は、精製抗原は必ずしも
長期免疫応答を誘導するわけではなく、全く応答を誘導しないこともあるという
ことである。しかし、ある種の抗原単独による直接免疫化は短期免疫応答を形成
することができるが、リポソームに封入された抗原による免疫化は、いかなる効
果的なワクチンにとっても必須である長期応答を誘導することができることが発
見された。従って、リポソームは、従来の免疫化の障害を克服する際に有望であ
る。

【０００３】 １種以上の脂質または脂質および親油性分子を含むリポソームを製造するため
の一般的な方法では、成分が有機溶媒に溶解される。次に、２種の一般的方法の
うち１つが実施される。例えば、バンガム（Ｂａｎｇｈａｍ）、Ｃｈｅｍ．Ｐｈ
ｙｓ．Ｌｉｐｉｄｓ ６４：２７５−２８５（１９９３）；スゾカ（Ｓｚｏｋａ
）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７５：４１９４−９８（１９７
８）；およびキム（Ｋｉｍ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ
７２８；３３９−４８（１９８３）を参照のこと。

【０００４】 第１の方法では、脂質混合物を有機溶媒に加えたものを回転式留去装置を使用
して乾燥して薄層を形成する。次いで、通常被封入溶質を含有する水相を撹拌し
ながら添加してリポソームを形成する。他の方法では、溶質が封入されている水
相を有機相に添加し、その後真空下または不活性ガスの通気により有機相を除去
して、リポソームを形成する。

【０００５】 しかし、周知の方法は、技術的、経済的および環境的に重大な欠点を有する。
具体的には、薄層法は容易にスケールアップすることができない。さらに、有機
相と水相の混合系では、有機相の除去が煩わしく、完全でないことが多い。従っ
て、最終製品は、毒性で、発癌性である可能性が高い残存有機溶媒を含有してい
る。実際、両方法は、一般に、クロロホルム、アセトニトリルおよびアセトンを
例とするこのような毒性の物質を使用している。

【０００６】 従って、このような欠点を回避する、リポソームを製造するための改良法が必
要とされている。さらに、このような改善された方法によって製造することがで
きる、免疫学的および製薬的媒体として有効性の高い生医学的な用途に使用する
ための改善されたリポソーム組成物の必要性が存在する。

【０００７】 ［本発明の概要］ 従って、本発明の目的は、リポソームを主成分とするワクチン組成物を提供す
ることである。本発明の目的によると、再水和したときのみリポソームを形成す
るリポマトリックス（Ｌｉｐｏｍａｔｒｉｘ）組成物が提供される。本発明の組
成物は、優れた免疫応答を誘導する新規の腫瘍ワクチンを製造するのに特に好適
である。

【０００８】 本発明の他の目的は、（ａ）スケールアップすることができ、（ｂ）許容され
得ない残存溶媒を含有せず、（ｃ）製造の点で迅速で簡単であることを特徴とす
る、リポマトリックス（Ｌｉｐｏｍａｔｒｉｘ）を製造する方法を提供すること
を含む。これらも目的および他の目的とはさらに別に、多種多様の生医学的な用
途、特にワクチン用途に好適であるリポソームを製造するために使用することが
できるリポマトリックスを、経済的且つ安全に製造するための方法が提供される
。

【０００９】 一つの実施態様において、リン脂質および少なくとも１種の他の脂質を含有す
る水混和性有機相を水相と、約１００：１〜約５：１の容量比（ｖ／ｖ）で混合
し、次いで、混合物を乾燥することを特徴とする、リポマトリックスを製造する
方法が提供される。

【００１０】 本発明の別の実施態様は、約２０モル％〜約６０モル％のコレステロールを含
有するリポマトリックスを提供する。

【００１１】 さらに別の実施態様では、リポソームを製造する方法であって、本発明のリポ
マトリックスが再水和される方法が提供される。

【００１２】 さらに別の実施態様では、本発明の方法によってリポマトリックスから製造し
たリポソームを含むワクチンが提供される。

【００１３】 ［詳細な説明］ 本発明は、水和したときリポソームを形成する、脂質の格子状構造（または重
ねられた二重層の構造）を実質的に含むリポマトリックスを提供する。本発明は
また、リポマトリックスを水和することによって、有効性の高いリポソーム製剤
を製造するための簡易法を提供する。リポマトリックスからリポソームを製造す
る本発明の方法は、リポソームの効率的且つ安全な製造に対する上記の欠点を多
くを克服する。具体的な例では、ムチン系癌ワクチンを製造する際に、リポマト
リックスの有用性が実証されている。

【００１４】 本発明のリポマトリックスは、実質的に、溶解したときリポソームを形成する
ことができる乾燥（例えば、凍結乾燥）された脂質組成物である。このような乾
燥状態では、組成物は積層された二重層のマトリックスとして特徴づけられ、実
質的にリポソームを含有しない。組成物は、ほとんどが脂質であり、多くとも痕
跡量程度の溶媒と約５重量パーセント未満の水とを含む乾燥形態中に含まれる。
痕跡量の溶媒は、一般に、約０．１重量％未満であり、典型的には約０．０５重
量％未満である。いくつかの例示的な組成物は約９３〜９４重量％の脂質を含有
し、約３〜４重量％の水を含有するものもある。

【００１５】 乾燥前には、リポマトリックスは、実質的にリポソームを含有しない脂質懸濁
液として存在する。この状態では、リポマトリックスはほとんどが溶媒と水であ
り、脂質濃度は、通常、約１０重量パーセント未満である。しかし、多くの場合
において、脂質は約５重量パーセント未満であるような、さらに低濃度で存在す
る。いくつかの例示的な組成物では、脂質は約１．５重量パーセント未満の濃度
である。以下の実施態様は約０．９％の脂質濃度を使用している。溶媒濃度は、
通常、約８０％を越えており、約９５％であってもよい場合もある。いくつかの
例示的な組成物は約８５％〜約９０％であるが、約９０％を越えるものもある。
一方、水は、通常はいくぶん低い濃度で存在し、典型的には約２０％未満である
。多くの組成物は約１０重量％〜約１５重量％の水を有する。

【００１６】 （乾燥する前の）懸濁液では、リポマトリックス組成物の一部は溶媒：水が容
量比で約５：１〜約２０：１であり、２つの例示的な組成物は比が７：１および
９：１である。特に、ワクチン用途が考慮される場合には、脂質：溶媒の質量比
は約１：２０より大きくするべきであり、通常、約１：５０未満である。優れた
ワクチンの製造を可能にするためには、この範囲の上限（例えば、約１：３５〜
１：５０）が好ましい。

【００１７】 簡単に説明すると、基本的な方法は、先ず、適当な脂質を水混和性有機溶媒に
溶解して有機相を形成し、これを少量の水相と混合して分子配列を誘導、すなわ
ちリポマトリックスを形成することを含む。得られたリポマトリックスを凍結乾
燥する。乾燥した混合物を適当な媒体中で水和し、それによって水相を封入する
ことができるリポソームを自然に形成することができる。従来技術と異なり、本
発明の方法では水和前のいかなるときでもリポソームは全く形成されていない。
実際、以下の実施例において実証されているように、水和前にはリポソーム構造
は検出されていない。従って、従来技術の方法とは異なり、本発明の方法は、乾
燥され水の添加によってのみ再水和される、事前形成のリポソームを含まない。
実際、以下に記載するように、本発明のリポマトリックス製剤は水和されるまで
、実質的にリポソームを含有しない。

【００１８】 特に、本発明の方法は、水和して、コレステロール含量が高く、有効性の高い
リポソーム組成物を製造することができるリポマトリックスを製造するために使
用することができる。添加されたコレステロールは、転移温度を広げ、リン脂質
、コレステロールまたは他の脂溶性成分およびそれらの組み合わせの領域を排除
すると考えられている。ラドブローク（Ｌａｄｂｒｏｋｅ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ
．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １５０：３３３−４０（１９６８）を参照。これ
らの過去の研究は、リポソームサイズを改良するため、または血漿膜組成を模倣
するために、リポソームにコレステロールを使用してリポソームからの溶質の漏
出を低下した。しかし、当技術は、高コレステロール含量のある種のリポソーム
が優れたアジュバント特性を有するとは認識していなかった。以下の実施例に実
証するように、このようなリポソームが本発明のリポマトリックスから製造され
ると、驚くべきことに、それらはより優れた免疫刺激特性を有する。

【００１９】 ［リポマトリックスを製造する方法］ リポマトリックスを製造する本発明の方法は、先ず、少なくとも１種の脂質を
水混和性の有機溶媒に溶解することによって有機相を作製することを含む。好適
な脂質には、リン脂質、特に、レシチン、ホスファチジルグリセロール、ホスフ
ァチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン並びに当技術上周知の他の天
然および合成化合物が含まれる。例えば、国際公開公報第９１／０４０１９号（
１９９１年）の８ページおよび９ページを参照。好ましいリン脂質には、具体的
には、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジパルミトイルホス
ファチジルコリン（ＤＰＰＣ）およびジミリストイルホスファチジルグリセロー
ル（ＤＭＰＧ）が含まれる。他の好適な脂質にはステロール、特にコレステロー
ルが含まれる。また、糖脂質およびモノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）またはリ
ピドＡなどの脂質アジュバントも好適である。

【００２０】 好ましいリポマトリックス懸濁液では、リン脂質の最終濃度は、１５ｍｇ／ｍ
Ｌ〜約３６ｍｇ／ｍＬであり、これは選択した溶媒に対する特定の脂質の溶解性
による。リポマトリックスを形成する際に軽度な加熱、例えば５０℃〜約６０℃
に加熱してもよい。選択的に行う加熱の程度は、それぞれの有機相成分の溶解度
および安定度に大部分依存する。

【００２１】 本発明のリポマトリックスは、高含量のコレステロールを用いて製造する場合
に特に有用である。例えば、本発明の方法は、リン脂質マトリックス中に約２０
モル％以上のコレステロールを含んでもよい。いくつかの好ましいリポマトリッ
クス製剤は約３０モル％〜６０モル％のコレステロールを含有する。有機溶媒は
水混和性であるべきで、通常脂肪族アルコールである。好ましい脂肪族アルコー
ルには、エタノールおよびｔｅｒｔ−ブタノールが含まれるが、これらに限定さ
れない。他の有機溶媒、特に他のアルコールを使用してもよい。しかし、それら
は、例えば、凍結乾燥によって乾燥できるべきであり、またそられは毒性であっ
てはならない。従って、薄層法に一般に使用されるものなどの溶媒は一般に許容
されない。

【００２２】 第２に、水相を提供する。水相は１種以上の緩衝液、塩および充填剤を含有し
てもよい。好ましい充填剤には糖が含まれ、好ましい糖にはマンニトールが含ま
れる。適当な緩衝液、糖および充填剤は、好ましくは、生理学的に適合性であり
、そのようなものは当業者に周知である。当然のことであるが、選択したこれら
の緩衝液、塩および充填剤の濃度は、主に、生理学的な適合性に依存することが
、当業者に理解されている。

【００２３】 第３に、有機相および水相を混合し、選択的に滅菌ろ過するか、または選択的
に別個に滅菌ろ過し、次いで混合する。混合時、水相に対する有機相の比は、好
ましくは、容量比で約７：１〜約９：１である。しかし、この比は有機相：水相
が約１００：１と高くても、また約５：１と低くてもよい。約２０：１〜約６：
１などの範囲も許容されうる。また、脂質：溶媒の質量比は約１：２０〜約１：
５０であるべきで、この範囲の上限に近い方が好ましい（例えば、約１：３５〜
約１：５０）。混合は周囲温度で実施されてもよいが、使用した脂質の融点のう
ち最も高い融点程度の高い温度で実施してもよい。この段階では、分子配列が起
こり、開いた二重層（ｏｐｅｎ ｂｉｌａｙｅｒｓ）（すなわち、リポマトリッ
クス）が形成されるが、リポソームは検出されない。

【００２４】 リポマトリックスは凍結乾燥または他の好適な手段によって乾燥することがで
きる。リポマトリックスは全体として乾燥することができる。乾燥前に、好適な
サイズの分量に分割されてもよい。典型的には、リポマトリックス溶液は連続的
に混合しながらバイアルに小分けされ、次に凍結乾燥される。得られたリポマト
リックス製剤は安定で、貯蔵に好適である。

【００２５】 乾燥されたリポマトリックスフィルムまたは塊が、選択的にに封入用溶質を含
有する水、生理食塩液または適当な緩衝液などの好適な水溶液で水和されるとリ
ポソームが形成される。水和溶液の温度は、周囲温度から融点が最も高い脂質の
転移温度までであってもよい。水和されたときだけ、水溶性溶質を封入すること
ができるリポソームが形成される。これは、乾燥前にリポソームを事前成形する
従来技術よりもかなり簡単である。さらに、従来技術の方法はこのような事前成
形を使用したので、リポソームの完全性を維持するために安定剤が必要であった
。本発明の方法では水和前にリポソームが形成さることはないので、このような
安定剤は必要ない。

【００２６】 ［リポマトリックスの用途］ 本発明により製造されたリポマトリックスは、水和してリポソームを形成した
あとの種々の用途、特に生医学的な用途に使用することができる。例えば、それ
らは薬理学的に活性な多種多様の薬剤を送達するために使用することができる。
従って、脂溶性の薬剤、例えば疎水性ペプチドを有機相に含ませることができる
。また、親水性の薬理学的に活性な薬剤を、水和の結果得られるリポソーム内に
封入することができる。荷電分子はリポソームのリン脂質と静電気的に結合する
と思われる。好適な親油性および親水性薬剤の例は、引用することにより本明細
書の一部をなすものとする、ポペスク（Ｐｏｐｅｓｃｕ）ら、米国特許第５，１
４５，９３０号（１９９２年）に見いだすことができる。他の薬理学的に活性な
薬剤には、例えば、アジュバント、サイトカイン、抗体および任意の他の周知の
薬剤が含まれる。特に有用な薬剤には、インターロイキン２（ＩＬ−２）、顆粒
球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）およびインターフェロンγ
（ＩＦＮ−γ）などのサイトカインが含まれ、単独または他の薬剤と併用して使
用してもよい。これらの薬剤の任意のものの組み合わせも含まれる。

【００２７】 本発明の方法はワクチンを製造する際に特に有用である。ほとんどいかなる種
類の抗原を使用することもできるが、特に腫瘍抗原を使用することができる。腫
瘍抗原は、例えば、肺癌、結腸癌、黒色腫、神経芽細胞腫、乳癌、卵巣癌糖から
誘導することができる。好ましい腫瘍抗原はＭＵＣ−１および関連する抗原ペプ
チドである。ＭＵＣ−１ムチンは、アミノ酸２０個の配列のタンデムリピートお
よび高分岐炭水化物測鎖からなるタンパク質コアを有する高分子量糖タンパク質
である。乳癌、結腸癌、肺癌、卵巣癌および膵臓癌などの多数のヒトの腺癌はグ
リコシル化不足のＭＵＣ−１タンパク質を多量に過剰発現して分泌する。重要な
ことは、高レベルのＭＵＣ−１ムチン発現は高い転移の可能性および予後不良に
関連があることである。従って、ＭＵＣ−１はこれらの癌の臨床的に重要なマー
カーである。特に有用な抗原性ＭＵＣ−１ペプチド誘導体はアミノ酸２０個の繰
り返し配列に基づいている。

【００２８】 腫瘍抗原以外に、臨床的に関連のある他の抗原にはアレルゲン、ウィルス抗原
、細菌抗原および寄生虫から誘導される抗原が含まれる。抗原は、通常、ペプチ
ド、脂質、炭水化物およびそれらを単に混合したものでも、または糖ペプチド、
糖脂質のようにそれらを共有結合したものでもよい、それらの組み合わせなどの
高分子である。

【００２９】 一般的なワクチン組成物は、腫瘍抗原などの抗原を含有する本発明のリポマト
リックス製剤から水和されたリポソームを含む。また、ワクチン組成物は１種以
上の免疫調節剤を含有してもよい。免疫調節剤は、免疫応答を変更し、好ましく
は抗原免疫応答を刺激する任意の物質である。一般的な免疫調節剤には、モノホ
スホリルリピドＡおよびリピドＡなどのアジュバントが含まれる。他の免疫調節
剤にはリンフォカインおよびサイトカイン、具体的にはインターロイキン、特に
ＩＬ−２が含まれる。

【００３０】 ワクチンは、一般に製薬的に許容されうる賦形剤を使用して製剤化される。こ
のような賦形剤は当技術上周知であるが、一般的には生理学的に耐性のある水溶
液である。生理学的に耐性のある溶液は、実質的に毒性のないものである。好ま
しい賦形剤は抗原性に関して不活性または増強性である。

【００３１】 以下の実施例において、腫瘍抗原である合成ＭＵＣ−１ペプチドを含有するリ
ポソームを含む抗腫瘍ワクチンを、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）またはリ
ピドＡを免疫調節アジュバントとして使用して製造した。コガンティ（Ｋｏｇａ
ｎｔｙ）ら、ＤＤＴ １：１９０−９８（１９９６）；アルビング（Ａｌｖｉｎ
ｇ）ら、リポソームと免疫（Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ
ｙ）、６７−７８ページ（１９８０）を参照。ＭＵＣ−１ペプチドは、親ＭＵＣ
−１糖タンパク質と同様の抗原特性を有する合成ペプチド物質である。このペプ
チド抗原を用いて製剤化したワクチンは現在臨床検討中である。コガンティ（Ｋ
ｏｇａｎｔｙ）ら、ＤＤＴ １：１９０−９８参照。抗原特異的Ｔ細胞応答の誘
導について種々の製剤をマウスで試験した。

【００３２】 ［実施例］ ［実施例 １］ ［リポマトリックスの製造］ ＤＰＰＣ（２００ｍｇ／ｍＬ）、コレステロール（５０ｍｇ／ｍＬ）、ＭＵＣ
−１リポペプチド（ＢＰ１−１４８、５ｍｇ／ｍＬ）およびリピドＡまたはＭＰ
Ｌ（５ｍｇ／ｍＬ）の適当なストック試薬のエタノール溶液を湯浴中で５５℃ま
での温度において１５〜２０分間加温した。ＢＰ１−１４８リポペプチドは以下
の構造を有する。ＮＨ₂−[ＳＴＡＰＰＡＨＧＶＴＳＡＰＤＴＲＰＡＰＧＳＴＡＰ
Ｐ（Ｋ脂質に結合）Ｇ]−ＣＯＯＨ。加温したストックソリューションのうち、 ４９．１μＬのＤＰＰＣ、１０３．５μＬのコレステロール、６０μＬのＢＰ１
−１４８、３０μＬのリピドＡおよび６５７．４μＬの無水アルコールを透明な
栓つきの５ｍＬのガラスバイアルに添加した。混合物を手短に撹拌し（３秒を７
回）、５５℃の湯浴に戻した。１００マイクロリッターの脱イオン水（５５℃）
をバイアルに添加し、上記のように混合物を撹拌した。混合物を５５℃の湯浴に
戻して、１５〜２０分おき、その間（上記のように）２回撹拌した。その後、バ
イアルを室温に冷却し、デューラ−ストップ（Ｄｕｒａ−Ｓｔｏｐ）ＭＰシェル
フ凍結乾燥器（ＦＴＳシステムズ製（ＦＴＳ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ニューヨーク
州、ストーンリッジ）中に置いた。

【００３３】 水を溶媒：水を容量比で９：１で添加すると、上記の結果、脂質：溶媒が質量
比で１：４７である典型的なリポマトリックスを形成した。凍結乾燥後、各バイ
アルは１５ｍｇの原料脂質（５０モル％のコレステロールのとき）、３００μg のＢＰ１−１４８および１５０μgのリピドＡを含有した。マイクロプロセッサ 制御下で実施した典型的な凍結乾燥サイクルを以下に記載する。 温度（℃） 真空 時間（分） −６０ ２０００ ２４０ −４０ １００ １４４０ −５ １０ ７２０ ５ １０ ３６０

【００３４】 ［実施例２］ この実施例は、乾燥された脂質製剤が水和されるまで、本発明のリポマトリッ
クスはリポソームを形成しないことを実証している。９：１または７：１のエタ
ノール：水の容量比で混合した水相を、１４．８ｍｇのＤＰＰＣ、７．８ｍｇの
コレステロール、０．２ｍｇのＭＰＬおよび０．１１ｍｇのＭＵＣ−１ペプチド
を含有する０．２９７ｍＬのエタノールに５５℃において添加した。周囲温度ま
で冷却すると沈殿が生成した。９：１または７：１のエタノールと水の混合物で
２倍希釈すると沈殿物は再度溶解した。これは、沈殿は溶解度の低下によって形
成し、かならずしもリポソームではないことを意味している。

【００３５】 上記混合物の別の０．２９７ｍＬを、カルボキシフルオレセイン（ＣＦ）を含有
する水相に溶媒：水の容量比が９：１または７：１となるように混合した。総蛍
光を測定し、図２に示す。これは、リポソームが溶質を１００％封入して存在す
る場合に予測される値を示す。この試料を生理食塩水でさらに２倍に希釈し、次
に遠心分離して５回洗浄すると、容量比で９：１および７：１の総ＣＦはそれぞ
れ１％および２％であった。これは、リポソームが９：１または７：１で最初に
混合されたとき形成される場合に予測されるものより低いが、リポソームが過剰
の生理食塩水で希釈されたときに形成される場合に予測されるものである。

【００３６】 上記のように、エタノールを生理食塩水と容量比で９：１または７：１となる
ように混合して製造したリポソームについて凍結割断電子顕微鏡撮影を実施した
。凍結乾燥しなかった試料では、シート状の二重層が観察されたが、容量比で９
：１のリピドＡ製剤ではリポソーム構造は観察されなかった。図３のパネル（ａ
）参照。しかし、凍結乾燥製剤を溶解すると、リポソームが観察された。図３の
パネル（ｂ）参照。エタノール相を水相と７：１の容量比で混合したときも同様
の結果が観察された。

【００３７】 ［実施例３］ この実施例は、免疫応答を形成する際の、本発明の方法によってリポマトリッ
クスから製造された種々のリポソーム製剤の有効性を示す。概略するように、脂
質およびリポペプチドを含有する９部のエタノール溶液を、１部の水に添加する
ことによってリポマトリックスを製造した。得られたリポソームは、０．１ｍＬ
用量あたり、１０μgのＭＵＣ−１ペプチド（例えば、コガンティ（Ｋｏｇａｎ ｔｙ）ら、ＤＤＴ １：１９０−９８（１９９６））、２０μgのＭＰＬ、およ びＭＢ−ＩＸ−１には２ｍｇのＤＭＰＣ、ＭＢ−ＩＸ−２には２ｍｇのＤＰＰＣ
、ＭＢ−ＩＸ−３には１．８６ｍｇのＤＭＰＣと０．１４ｍｇのＤＭＰＧ、ＭＢ
−ＩＸ−４には１．８６ｍｇのＤＰＰＣと０．１４ｍｇのＤＭＰＧ、ＭＢ−ＩＸ
−５には１．６３ｍｇのＤＰＰＣと０．３７ｍｇのコレステロール、ＭＢ−ＩＸ
−６には１．６ｍｇのＤＰＰＣと０．１２５ｍｇのＤＭＰＧと０．３７５ｍｇの
コレステロールを含有した。

【００３８】 マウスは、鼡径部に皮下注射することによって免疫し、９日後に犠牲にした。
リンパ節および脾臓を切除した。ナイロンウールカラムを通過させてリンパ節Ｔ
細胞を精製した。リンパ節アッセイでは、未処理のマウスの脾臓細胞をマイトマ
イシンＣで処理することによって抗原提示細胞（ＡＰＣｓ）を調製した。細胞増
殖アッセイでは、リンパ節細胞（ＡＰＣｓを有する）および脾臓細胞を適当なペ
プチド抗原と共に４日間インキュベーションし、次にアラマーブルーと共に２４
時間インキュベーションし、その後６１０〜５７０ｎｍにおけるＯＤ比を測定し
た。アラマーブルーを添加する前に、細胞増殖アッセイ液の上清を採取し、免疫
蛍光アッセイ（ＩＦＡ）でγインターフェロンを測定した。アフメン（Ａｈｍｅ
ｎ）ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １７０：２１１−２２４参照。

【００３９】 結果を図４に示す。試料ＭＢ−ＩＸ−１およびＭＢ−ＩＸ−２などの単一脂質
製剤は有効でなかった。一方、ＤＰＰＣとコレステロールを含むリポソーム製剤
は高いＩＦＮ−γ応答を誘導し、強力な免疫応答を示している。対照実験は、こ
れらの結果はコレステロール自体のせいでも、リポソームのサイズのせいでもな
いことを確認している。

【００４０】 ［実施例４］ この実施例は、本発明によって製造したＤＰＰＣとコレステロールを含むリポ
ソームによって誘導される免疫応答に対するコレステロールの重要性を実証して
いる。以下のコレステロール濃度が１０、２０、３０、４０および５０モル％の
ものを用いて実施例３のようにリポソームを製造した。

【００４１】 図５からわかるように、ＤＰＰＣとコレステロールを含む製剤は、リンパ球Ｉ
ＦＮ−γ産生に関しては強力な免疫を誘導する。応答は製剤中のコレステロール
のモル％に依存し、１０または２０モル％のコレステロールを含有する製剤では
生物応答は観察されなかった。

【００４２】 ［実施例５］ この実施例は、エタノール：水が容量比で９：１であるものを用いて製造され
たリポマトリックスプロセスを使用して製造した水和後の製剤の均一性を示す。
示差走査熱量測定法（ＤＳＣ）およびラマン振動分光法を使用して製剤を分析し
た。最終製品は１３．１ｍｇ／ｍＬのＤＰＰＣ、６．９ｍｇ／ｍＬのコレステロ
ール（すなわち、５０モル％）、２００μg／ｍＬのリピドＡおよび４００μg／
ｍＬのＢＰ１−１４８を含有した。

【００４３】 ＤＳＣ走査は、ハート社製（Ｈａｒｔ）（現ＣＳＣ）サイエンティフィック（
Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）モデル７７０７シリーズ示差走査熱量計（プロボ、ユタ
州）で６０℃／ｈｒで実施した。各経過時間において、５５℃で水和した１試料
から採取直後の少量を使用した。各走査には、ベースライン測定用の通常の生理
食塩水を含有する細胞を含めた。ベースライン値を差し引き、熱効果計器応答に
ついて補正した後、ハートサイエンティフィック（ＨａｒｔＳｃｉｅｎｔｉｆｉ
ｃ）より提供されたソフトウェアーを使用して、熱量分析データを分析して過剰
の熱含量（μワット）を温度の関数として得た。ベースラインおよびオフセット
補正、スムージング並びにプロッティングのために熱量分析データをＧｒａｍｓ
／３２、ｖ．５．０（ギャラクティック インダストリーズ コーポレーション
社製（Ｇａｌａｃｔｉｃ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、
サレム、ニューハンプシャー州）に入力した。データは、サビツスキーゴレイ（
Ｓａｖｉｔｓｋｙ−Ｇｏｌａｙ）スムージングルーティンを使用してスムージン
グされないか、またはごくわずかにスムージングされただけだった。この方法は
回旋近接法（ｃｏｎｖｏｌｕｔｉｏｎ ａｐｐｒｏａｃｈ）を使用し、指定され たウィンドウに対する最小自乗法フィットを実施する。データは３次元多項式お
よび５〜１１データポイントウィンドウを使用してスムージングした。

【００４４】 ラマン振動分光は室温においてラマン顕微分光計を使用してデータ採取した。
凍結乾燥した粉末については、アルゴンレーザーを１〜２μｍスポットに焦点を
絞った（励起波長５１４ｎｍ、対物レンズ５０倍）。水和した製剤については、
ヘマトクリット遠心分離器で室温において１５分間遠心分離することによって試
料をガラス製の毛細管に充填した。５０倍の対物レンズを使用してラマンスペク
トルを再度収集したが、二重層構造の局所的な加熱を防止するためにレーザーは
８０％焦点をぼかした。両方の場合において、レーザーヘッドの電源は３００ｍ
Ｗに設定し、顕微鏡では２５％まで低下した。ラマンシグナルは、ＣＣＤ検出器
では分光器によって分散された（１８００ｇｒ／回折格子１ｍｍあたり）。一般
には、収集あたり３０〜６０秒の時定数を使用して、１０スペクトルを同時加算
した。スペクトルの分解能は１ｃｍ^-1であった。

【００４５】 図６に示すように、実施例１に概略を示すリポマトリックスプロセスによって
製造されたリポソーム製剤のＤＳＣプロフィールは、時間経過によって変化しな
い非常に平坦な吸熱グラフを示した。比較のために、ＤＰＰＣを単独で含むリポ
ソームのＤＳＣ加熱プロフィールは、３８℃（前駆転移）および４１℃（主転移
）に２カ所の顕著な転移を示す。５０モル％のコレステロールのリポマトリック
ス製剤にこのような転移が見られないのは、成分がＤＰＰＣ豊富領域を含有しな
いことを示し、成分が十分に混合されたリポソーム製剤を示す。分子レベルでリ
ポマトリックス製剤の均一性をさらに特徴づけるために、ラマン振動分光法を使
用した。図７Ａは、凍結乾燥したフィルムの２カ所の異なる部位において（実線
および点線）、ＤＰＰＣに対するコレステロールの相対濃度に有意な差がなかっ
たことを示す。さらに、水和した製品においてもＤＰＰＣに対するコレステロー
ルの同じ相対比を観察した（図７Ｂ）。

【００４６】 ［実施例６］ この実施例は、本発明の方法がより大規模でも利用性を維持することを実証し
ている。実施例１に概略したように、１バイアルあたり１５ｍｇの原料脂質（５
０モル％のコレステロール）、３００μgのＢＰ１−１４８、１５０μgのリピド
Ａを用いたリポソームＭＵＣ−１ワクチンのリポマトリックスプロセスによって
１２０ｍＬのバッチを製造し、製造後１時間経過してから（ＭＢ−ＸＬＩＶ−Ｂ
）、また製造後８時間してから（ＭＢ−ＸＬＩＶ−Ａ）室温でろ過した。以下の
表に示すように、ＨＰＬＣでは検出できるような損失は観察されなかった。

【００４７】

【表１】

【００４８】 ［実施例７］ この実施例は、腫瘍抗原特異的癌ワクチンを製造する際の本発明のリポマトリ
ックス製剤の用途を例示する。実施例１のように、１バイアルあたり１５ｍｇの
原料脂質（５０モル％のコレステロール）、３００μgのＢＰ１−１４８、１５ ０μgのリピドＡを含有するリポソームＭＵＣ−１ワクチンを製造した。以下の パラメーター、ａ．アルコール、エタノールまたはｔｅｒｔ−ブタノール、ｂ．
水に対する溶媒比、ｃ．溶媒に対する脂質の質量比を変更した。

【００４９】 簡単に説明すると、実施例４のように、試料を５５℃において水和し、室温ま
で冷却し、マウスに注射した。以下の表は、ほとんど全ての変更下において、特
に、より大きい質量比の溶媒：脂質において強力なＩＦＮ−γ応答が観察された
ことを示す。より大きい質量比の溶媒：脂質にしたことによる利益は少なくとも
２倍である。先ず、溶媒の量を増加することによって、充填容量が増加されると
思われる（製造をより容易にする）。第２に、より大きい質量比の溶媒：脂質に
したことにより、室温ろ過および充填が可能になり、スケールアップという大き
な利点が得られる（下記参照）。表はまた、８時間後のろ過（実施例６のように
）は活性に有害な影響を与えないことを示す。

【００５０】

【表２】

【００５１】 ［実施例８］ この実施例は、凍結乾燥したリポマトリックスの安定性を示す。実施例１の方
法により１バイアルあたり１５ｍｇの原料脂質（５０モル％のコレステロール）
、３００μgのＭＰ１−１４８、１５０μgのリピドＡを有するリポソームＭＵＣ
−１ワクチンを製造し、０、３、６ヶ月経過時にＨＰＬＣ分析によって安定性を
求めた。ＡおよびＢの命名は実施例６に規定するとおりである。以下に示すよう
に、最初の経過時点からの有意な変化は観察されなかった。

【００５２】

【表３】

【００５３】 ［実施例９］ この実施例は、本発明の水和されたリポマトリックス製剤が室温で安定である
ことを示す。リポマトリックスプロセスを使用して、エタノール溶媒：水を容量
比で９：１としたものを使用して１バイアルあたり１５ｍｇの原料脂質（５０モ
ル％のコレステロール）、１５０μgのＢＰ１−１４８、１５０μgのリピドＡを
有する、いくつかのバイアルのリポソームＭＵＣ−１ワクチンを製造した。

【００５４】 水和した製剤を０、２、４、２４時間室温保存してから、マウスにこれらの製
剤を皮下注射した。各経過時点において４匹のマウスからなる２セットに注射し
た。図８に示す平均値は、全ての経過時点において水和後の安定な製品を実証し
ている。

【００５５】 上記の詳細な記載および例は例示的な目的のためだけに示されており、限定す
る意図のもではない。従って、当業者は、具体的に例示されていない追加の実施
態様が本発明の範囲内にあることを容易に認識するべきである。

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は本発明によりリポマトリックスを製造するための一般的な方法を例示す
る略図である。

【図２】 図２は封入率１００％について予測されるものと比較した、リポマトリックス
に封入されたカルボキシフルオレセインの蛍光発光スペクトルを示す。

【図３Ａおよび３Ｂ】 図３Ａおよび３Ｂは電子顕微鏡写真である。図３Ａは凍結乾燥前に典型的なリ
ポマトリックス中にリポソーム構造が見られないことを示し、図３Ｂはリポマト
リックスの水和後にリポソームが形成されていることを示す。

【図４Ａおよび４Ｂ】 図４Ａおよび４Ｂは抗原投与に応答したマウスリンパ節（図４Ａ）および脾臓
細胞（図４Ｂ）のインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）産生を示す。マウスは、実
施例３に記載するリポマトリックス製剤を水和することによって製造したリポソ
ームＭＵＣ−１で免疫した。

【図５】 図５は抗原投与に応答したマウスリンパ節細胞および脾臓細胞のインターフェ
ロンγ（ＩＦＮ−γ）産生を示す。マウスは、実施例４に記載する種々の量のコ
レステロールを含有したリポマトリックス製剤を水和することによって製造した
リポソームＭＵＣ−１ワクチンで免疫した。

【図６】 図６は５０モル％のコレステロールで製剤化したリポマトリックスを水和する
ことによって製造したリポソームＭＵＣ−１製剤の示差走査熱量測定法（ＤＳＣ
）の加熱走査図と同じ原料脂質濃度（２０ｍｇ／ｍＬ）のＤＰＰＣリポソームの
それとを比較している。

【図７】 図７は実施例１に記載するように製造したリポマトリックス製剤のラマン振動
分光プロフィールを示す。パネルＡでは、実線および点線は凍結乾燥フィブロネ
クチンの２カ所の異なる部位を示す。パネルＢは水和した製剤のラマンプロフィ
ールを示す。

【図８】 図８はリポマトリックスから製造したリポソームＭＵＣ−１ワクチンで免疫化
した後に、抗原投与に応答してリンパ節細胞および脾臓細胞が産生したインター
フェロンγ（ＩＦＮ−γ）を示す。経過時間は、マウスに皮下注射する前に水和
したリポマトリックス製剤を室温に放置した時間を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＤ ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ， ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，Ｍ Ｄ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ， ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，Ｕ Ｚ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 ネヴィル，メアリ・イー アメリカ合衆国ニュージャージー州08831， ジェイムズバーグ，ストアリー・ヒル・ロ ード 19 (72)発明者 ロブ，リチャード・ジェイ アメリカ合衆国ニュージャージー州08850， プリンストン・ジャンクション，ハンティ ントン・ドライヴ 24 (72)発明者 ポペスク，ミルセア・シー アメリカ合衆国ニュージャージー州08536， プレインズボロ，パークウェイ・アヴェニ ュー ５ Ｆターム(参考） 4C076 AA19 CC07 DD37 DD63 DD70 FF36 FF67 4C085 AA03 BB50 EE06 FF21

Claims (26)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 実質的にリポソームを含有しない積層された二重層のマトリ
   ックスであり、総脂質含量が少なくとも約９０重量パーセントであり、総水分含
   量が約１０重量パーセント未満であり、ごく少量の溶媒を有する、少なくとも１
   種のリン脂質を含むリポマトリックス（Ｌｉｐｏｍａｔｒｉｘ）。
2. 【請求項２】 総脂質含量が少なくとも約９３重量パーセントであることを
   特徴とする、請求項１に記載のリポマトリックス。
3. 【請求項３】 総水分含量が約４重量パーセント未満であることを特徴とす
   る、請求項２に記載のリポマトリックス。
4. 【請求項４】 前記リン脂質がジミリストイルホスファチジルコリン、ジパ
   ルミトイルホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルグリセロール
   からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載のリポマトリック
   ス。
5. 【請求項５】 約２０モル％〜６０モル％のコレステロールをさらに含むこ
   とを特徴とする、請求項１に記載のリポマトリックス。
6. 【請求項６】 親油性の薬理学的に活性な薬剤をさらに含むことを特徴とす
   る、請求項１に記載のリポマトリックス。
7. 【請求項７】 親水性の薬理学的に活性な薬剤をさらに含むことを特徴とす
   る、請求項１に記載のリポマトリックス。
8. 【請求項８】 抗原をさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載のリポ
   マトリックス。
9. 【請求項９】 前記抗原が腫瘍抗原であることを特徴とする、請求項８に記
   載のリポマトリックス。
10. 【請求項１０】 前記腫瘍抗原がペプチド、脂質、炭水化物およびそれらの
    組み合わせからなる群から選択される高分子であることを特徴とする、請求項９
    に記載のリポマトリックス。
11. 【請求項１１】 前記ペプチドがＭＵＣ−１ペプチドであることを特徴とす
    る、請求項１０に記載のリポマトリックス。
12. 【請求項１２】 少なくとも１種の免疫調節剤を含むことを特徴とする、請
    求項１に記載のリポマトリックス。
13. 【請求項１３】 前記免疫調節剤がリンフォカイン、サイトカインおよびア
    ジュバントからなる群から選択されることを特徴とする、請求項１２に記載のリ
    ポマトリックス。
14. 【請求項１４】 前記アジュバントが、モノホスホリルリピドＡまたはリピ
    ドＡであることを特徴とする、請求項１３に記載のリポマトリックス。
15. 【請求項１５】 少なくとも１種のリン脂質と少なくとも１種の他の脂質を
    含有する水混和性有機相と水相とを、約１００：１〜約５：１の容量比（ｖ／ｖ
    ）、且つ１：２０〜１：５０の脂質：溶媒の質量比で混合することによって、実
    質的にリポソームを含有しない混合物を形成するステップと、該混合物を乾燥す
    るステップとを含む、水和したときリポソームを形成することができるリポマト
    リックスを製造する方法。
16. 【請求項１６】 前記混合比が、有機相：水相が約９：１〜約７：１の容量
    比（ｖ／ｖ）であることを特徴とする、請求項１５に記載の方法。
17. 【請求項１７】 前記有機相がアルコールであることを特徴とする、請求項
    １５に記載の方法。
18. 【請求項１８】 前記アルコールがエタノールまたはｔｅｒｔ−ブタノール
    であることを特徴とする、請求項１７に記載の方法。
19. 【請求項１９】 前記乾燥するステップが凍結乾燥によって達成されること
    を特徴とする、請求項１５に記載の方法。
20. 【請求項２０】 リポマトリックスが実質的にリポソームを含有しない積層
    された二重層のマトリックスであり、少なくとも１種のリン脂質を含み、総脂質
    含量が少なくとも約９０重量パーセントであり、総水分含量が約１０重量パーセ
    ントより少なく、ごく少量の溶媒を有することを特徴とする、リポマトリックス
    を水溶液で水和することによってリポソームを形成するステップを含むリポソー
    ムを製造する方法。
21. 【請求項２１】 前記水和が抗原および許容されうる賦形剤の存在下で実施
    され、それによってリポソームワクチンが製造されることを特徴とする、請求項
    ２０に記載の方法。
22. 【請求項２２】 請求項２１の方法により製造されるリポソームワクチン。
23. 【請求項２３】 前記抗原が腫瘍抗原である、請求項２１に記載のワクチン
    。
24. 【請求項２４】 前記腫瘍抗原がペプチド、脂質、炭水化物およびそれらの
    組み合わせからなる群から選択される高分子であることを特徴とする、請求項２
    ３に記載のワクチン。
25. 【請求項２５】 少なくとも１種のリン脂質、免疫調節剤および少なくとも
    ２０モル％のコレステロールをさらに含むことを特徴とする、請求項２３に記載
    のワクチン。
26. 【請求項２６】 前記免疫調節剤がモノホスホリルリピドＡまたはリピドＡ
    であることを特徴とする、請求項２５に記載のワクチン。