DE2946601A1

DE2946601A1 - Verfahren zur extemporierten herstellung von liposomen

Info

Publication number: DE2946601A1
Application number: DE19792946601
Authority: DE
Inventors: Umberto Bucciarelli; Enzo Marchetti
Original assignee: SERONO IST FARM; Istituto Farmacologico Serono SpA
Current assignee: SERONO IST FARM; Merck Serono SpA
Priority date: 1978-11-17
Filing date: 1979-11-19
Publication date: 1980-05-29
Anticipated expiration: 1999-11-20
Also published as: IT7851947A0; IL58584A; FR2441385B1; GB2035947B; CH643141A5; FR2441385A1; GB2035947A; US4308166A; SE7909282L; ES486055A1; IT1111367B; SE440450B; IL58584A0; DE2946601C2; AR219840A1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur extemporierten Herstellung von Liposomen, in die Y/irkstoffe eingearbeitet sind.

Liposomen sind bekanntlich künstliche Kügelchen aus Phospholipiden, die aus einer Reihe von konzentrischen Schichten, welche mit wäßrigen Abteilen abwechseln, zusammengesetzt sind. Substanzen verschiedener Art können in den wäßrigen Abteilen oder den konzentrischen Schichten "eingefangen¹¹ sein.

Liposome, die erstmals von Bangham ("J. Mol. Biol." 12,(1)» 238 bis 259, 1965) hergestellt und später von Sessa und Vfeissmann ("J. Lipid Res.¹¹, 1968 2(3), 310 bis 318) so benannt wurden, wurden als erste als künstliche Modelle zur Untersuchung der Eigenschaften von biologischen Membranen verwendet. Tatsächlich wurde rasch festgestellt, daß die Phospholipidwände von Liposomen Eigenschaften haben, die denjenigen von Erythrozyten, Lisosomen und Mitochondrien im Vergleich zu verschiedenen Arten von Substanzen, wie Steroiden, Toxinen, Antibiotika und Arzneimitteln, perfekt analog sind.

Das praktische Potential der Liposomen liegt in der Tatsache, daß von diesen festgestellt wurde, daß sie nicht nur dazu imstande sind, die meisten Substanzen zu überziehen, sondern auch sie vor Abbauprozessen zu schützen und sie in Richtung auf spezielle Zielorgane zu orientieren.

Nachteiligerweise hat die Komplexizität der Herstellungsprozesse für Lipsome, die therapeutisch aktive Substanzen

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enthalten, bislang noch nicht den Erhalt von gev/erblich anwendbaren Produktionsmethoden gestattet. Dazu kommt noch, daß bei den Verbindungen, die hergestellt v/erden konnten, schwerwiegende Stabilitätsprobleme auftreten.

Diese und andere Probleme, beispielsweise die hohen Kosten für die Herstellung, betonen die Notwendigkeit eines billigen und einfachen Verfahrens zur Herstellung von Liposomen, die aktive Substanzen bzw. Wirkstoffe enthalten. Durch das erfindungsgemäße Verfahren können nun Liposome, die therapeutische Wirkstoffe enthalten, durch einfache Auflösung zum Zeitpunkt des Gebrauchs des Wirkstoffes in einer Phospholipidemulsion in Wasser oder einer physiologischen Lösung oder einer Pufferlösung und durch anschließendes Rühren hergestellt werden. Bei der bevorzugten Methode verwendet man die Technik, die normalerweise für die Auflösung eines trockenen Pulvers oder eines Lyophilisats mit einem Lösungsmittel angewendet wird, nämlich

- Ansaugen der Phospholipidemulsion mit einer Spritze;

- Abgabe des Spritzeninhalts in einen Behälter (Gläschen oder Fläschchen), der den therapeutischen Wirkstoff in trockenem oder lyophilisierten Zustand enthält;

- Durchschüttlung des Gläschens oder des Fläschchens, um die Auflösung zu verbessern;

- Ansaugen der Lösung mit einer Spritze und gegebenenfalls erneute Abgabe in den Behälter, um sie von neuem anzusaugen.

Zu diesem Punkt enthält die Spritze eine feine Suspension von Liposomen in einer wäßrigen Umgebung, die in ihrer Struktur den therapeutischen Wirkstoff einschließen.

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Als Phospholipideraulsion können beispielsweise alle beliebigen wäßrigen Emulsionen von Phospholipiden von Sojabohnen, Hirnrinde, Eiern etc. verwendet werden.

Eine bevorzugt verwendete Emulsion wird ausgehend vom Eigelb bzw. Dotter von frischen Eiern nach dem Verfahren gemäß der italienischen Patentschrift 989 501 hergestellt.

Die Erfindung wird in den Beispielen erläutert. Beispiel 1

Eine ex-ovo-Phospholipidemulsion wurde gemäß der italienischen Patentschrift 989 501 auf folgende Weise hergestellt: 1000 frische Eier wurden zerbrochen und die Dotter bzw. das Eigelb wurden von dem Albumin abgetrennt. Die Dotter wurden aufgespalten und in einen Extraktor eingegossen, der 70 1 Äthylalkohol 90,5° von Raumtemperatur (22 bis 25⁰C) enthielt. Nach 24-stündiger Infusion, während welcher Zeit die koagulierte Masse häufig gerührt wurde, um die Extraktion der Lipide zu erleichtern, wurde der alkoholische Extrakt erst durch eine Gazeschicht, die auf die Basis des Extraktors aufgebracht worden war, und sodann durch ein gefaltetes Filterpapier filtriert. Das Filtrat, das mit einem zweiten alkoholischen Extrakt vereinigt worden war, welcher in der Weise erhalten worden war, daß der Rückstand der ersten Extraktion 4 h lang mit 50 1 Äthylalkohol der Infusion unterworfen wurde, wurde in einen doppelwandigen Kolben gegeben, wobei heißes Wasser in dem Zwischenraum zirkulierte. Die Abdestillation des Alkohols wurde unter Vakuum (20 bis 30 mm Hg) begonnen. Der Destillationsvorgang wurde weitergeführt, bis ein Alkoholgehalt von ungefähr 25?« erhalten wurde. Zu diesem Zeitpunkt wurden12,5 1 sterile physio-

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logische Lösung in den Kolben gegossen und die Destillation wurde weitergeführt, bis der Alkohol vollständig entfernt war.

Das in dem Kolben zurückgebliebene Produkt wurde in 11 sterile 5-1-Kolben verteilt, von denen jeder 2,5 1 sterile physiologische Lösung bzw. sterile physiologische Kochsalzlösung enthielt. Die Kolben wurde etwa 12 h lang 3tehen gelassen, um die Abscheidung der Phospholipide zu gestatten. Am Ende dieses Zeitraums wurde die überstehende physüogische Lösung abdekantiert. Das sedimentierte Produkt stellte eine stabile Emulsion dar, die nach geeigneter Verdünnung direkt in Gläschen eingeführt werden kann.

Die durch Dünnschichtchromatographie durchgeführte Analyse der dispergierten Phase der Emulsion ergab die folgende prozentuale Zusammensetzung:

Phosphatidylcholin (Lecithin) 71,4

Phosphatidyläthanolamin (Cephalin) 15,4

Lysochosphatidylcholin 7,3

Sphyngomyelln 4,1

Phosphatidinsäure 0,4 andere nicht-identifizierte Phospholipide

Unter Verwendung der auf die obige Weise hergestellten Phospholipidemulsion wurden fünf verschiedene Suspensionen nach folgenden Techniken erhalten:

1) Beschallung. Das Phospholipidgemisch wurde in Wasser («-w50 mg/ml) suspendiert und einer Ultraschallbehandlung mit einer Ultratip-Vorrichtung (Wellenener-

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giesystem) mit einer Energie, die zwischen 40 und 60 W variierte, unterworfen. Die Temperatur wurde für die gesamte Dauer des Prozesses zwischen 4 und 6°C gehalten. Nach einer mehrminütigen Beschallung wurde eine Suspension von transparenten Liposomen (SUV) mit klarer gelber Farbe erhalten. Diese wurde auf einer Säule mit Sephadex G 50 eluiert, um gegebenenfalls vorhandene Mizellen mit größeren Abmessungen abzutrennen.

2) Wirbelrührung. Das Phospholipidgemisch in Wasser wurde 1 h lang einer Wirbelrührung unterworfen und ohne weitere Behandlung verwendet.

3) Manuelle Rührung. Das Phospholipidgemisch in Wasser wurde nach 5-minütigem manuellen Rühren verwendet.

4) Durchbewegung mit einer Spritze. Das Phospholipidgemisch in Wasser wurde nach aufeinanderfolgenden Ansaugungen und Ausdrückungen in bzw. aus einer Spritze für die intramuskuläre Injektion verwendet.

5) Es wurde die gleiche Technik, wie unter 4) beschrieben, durchgeführt, wobei Jedoch das Ausdrücken und das Ansaugen der Flüssigkeit aus bzw. in ein Gläschen erfolgte, das einen lyophilisierten Adrenocorticalextrakt mit folgender prozentualer Zusammensetzung enthielt:

Aldosteron 5,5%

Corticosteron 26,4%

Cortison 13,796

Hydrocortison 17,0%

11-Dehydrocorticosteron 17,6%

17-Hydroxy-H-desoxycorticosteron 5,1%

andere 14,7%

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Die fünf verschiedenen Suspensionen wurden durch Infrarot-(IR-), Ultraviolett- (UV-), kernmagnetische Resonanz- (NMR-) und elektronenmikroskopische Verfahren bei folgenden Versuchsbedingungen untersucht:

a) IR- und UV-Messungen:

Das Infrarotspektrum des Phospholipidgemisches allein und in Gegenwart des Adrenocorticalextrakts wurde mit einem Perkin-Elmer-577-Spektrophotometer mit einer Abtastzeit von 15 min. aufgezeichnet.

Die entsprechenden Ultraviolettspektren (Lösungsmittel: Petroläther 30 bis 50) wurden mit einem Beckman-DK-2-Spektrophotometer unter Verwendung einer Quarzzelle mit einer Kantenlänge von 1 cm aufgezeichnet.

b) IJIvIR-Hes sungen:

Die C-Spektren (in D₂O und in CDCl,) wurden mit einem Bruker-WH-90-Spektrophotometer, das bei 22,63 MHz in einer Fourier-Anordnung arbeitet, aufgezeichnet.

Die Versuchsbedingungen waren: Impulsbreite 30°, Anzahl der Impulse zwischen 20000 und 30000, 16K des Gedächtnisses, SW von 6000 Hz, Umgebungstemperatur, innerer Verschluß auf dem Deuterium des Lösungsmittels (CDCl, oder DpO). Die chemischen Verschiebungswerte wurden im Vergleich zu Tetramethylsilan (TMS) bestimmt, das als interne Referenz für die Lösungen in CDCl, und extern für die Suspensionen in D₂O verwendet wurde. Die Protonenspektren wurden bei 90 MHz mit einem Bruker-HX90-Instrument, das mit einer konti-

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neuerlichen Welle arbeitet, aufgezeichnet. DSS wurde als interne Referenz und als Verschluß verwendet. Die Proben wurden unter Verwendung der oben beschriebenen Techniken 4) und 5) hergestellt.

c) Elektronenmikroskopische Messungen:

Die ELektronenmikrophotographien wurden unter Verwendung eines Siemens-Elmiskop-102-Instruments erhalten. Die Beobachtungen erfolgten unter negativem Kontrast mit 2% Phosphorwolframsäure.

Ergebnisse
IR und UV:

Das IR-Spektrum des Phospholipidgemisches, das Zuordnungen der darin vorhandenen Signale gestattet, ist in Tabelle I dargestellt.

Aus dem UV-Spektrum kann nur die Anwesenheit von Fettsäuren mit Doppelbindungen, die an die Seitenketten von verestertem oder freiem Glycerin gebunden sind, hergeleitet werden. Die Zugabe des Corticosteroidextrakts bewirkte keine nennenswerte Veränderung der in den Spektren vorhandenen Signale.

Elektronenmikroskopie:

Die Mikrophotographien der Figuren 1 bis 5 zeigen die Ergebnisse, die mit den folgenden Proben erhalten wurden:

1) 5-minütige manuelle Rührung

Fig. 1A χ 15000

" 1Bx 60000

scheinbarer Durchmesser der Bläschen >5000 %

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2) einstündige Wirbelrührung

Fig. 2A x 15000 Fig. 2B χ 60000 scheinbarer Durchmesser der Bläschen 1000 bis 10000

3) 15-minütige Beschallung

Fig. 3 A χ 15000 Fig. 3B χ 60000 scheinbarer Durchmesser der Bläschen 300 bis 1000 %,

4) Rühren mit der Spritze

Fig. 4A x 15000 Fig. 4Bx 60000 scheinbarer Durchmesser der Bläschen 1000 bis 2500 X

5) Rühren mit der Spritze (die Illustrationen beziehen sich auf das Phospholipidgemisch in Gegenwart des Corticosteroidextrakts)

Fig. 5A χ 15000 Fig. 5Bx 60000 scheinbarer Durchmesser der Bläschen 1000 bis 2000 SL

Die Untersuchung der Mikrophotographien zeigt, daß die Herstellungsmethode der Phospholipidsuspensionen die Struktur der gebildeten Bläschen bestimmt. Tatsächlich zeigen Suspensionen, die durch eine einfache mehr oder weniger verlängerte Rührung erhalten worden sind, Bläschen, die im allgemeinen größer sind, einen nicht-gleichförmigen Durchmesser haben und strukturell dem MLV-Typ ähnlich sind. Im Gegensatz dazu zeigen Suspensionen, die durch Verwendung der Spritze erhalten worden sind, Bläschen, die im Durchmesser eindeutig kleiner sind als im vorliegenden Falle, deren Durchmesser homogener sind und die vom gleichen Typ

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sind, wie sie nach der Beschallungsmethode (SUV) hergestellt werden können.

NMR:

1 "^
Die Protonen-NMR- und die ^C-Spektren des Phospholipidgemisches in CDCl, zeigen die chemischen Verschiebungswerte (bezogen auf TMS) der verschiedenen Resonanzbanden, die in den Tabellen II und III angegeben sind, zusammen mit einigen Zuordnungen.

1 13

Die H- und -Χ-Spektren des gleichen Gemisches in DpO ergeben die chemischen Verschiebungswerte und die Zuordnungen, die in den Tabellen IV bzw. V angegeben sind.

Im allgemeinen zeigen diese Spektren erheblich größere Linienbreiten im Vergleich zu den entsprechenden Spektren in CDCl,-Lösungen.

1 *5
Im -^C-Spektrum werden jedoch eindeutig mehrere Linien, die bei 19,6, 60,26 und 63,58 ppm zentriert sind und die erheblich enger und in der Breite mit den Spektren in Chloroform vergleichbar sind, festgestellt.

1"?
Das ^C-Spektrum des Phospholipidgemisches in Gegenwart des Adrenocorticalextrakts in DpO und in CDCl-, ist im wesentlichen mit demjenigen identisch, das in Abwesenheit des lyophilisierten Extrakts erhalten wird.

Beispiel 2

Um den Grad zu bestimmen, mit dem ein Adrenocorticalextrakt innerhalb einer Phospholipidemulsion unter Bildung von Lipo-

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₁₂ _ 29A6601

somen gemäß der Erfindung umhüllt wird, wurde der folgende Versuch durchgeführt, wobei lyophilisierte Gläschen verwendet wurden, die jeweils 390 Mikrogramm Corticoid mit folgender prozentualer Zusammensetzung (berechnet als Hydrocortison) enthielten:

Tetrahydrocortison	0,20%
Aldosteron	5,28%
11-Dehydrocorticosteron	17,58%
Corticosteron	26,38%
Cortison	13,78%
Hydrocortison	17,00%
17-Hydroxy-11-desoxycorticosteron	5,13%
andere Fraktionen	14.65%
	100,00%

Um den Adrenocorticalextrakt in der Phospholipidemulsion freizusetzen, wurde die in Stufe 5 des Beispiels 1 beschriebene Technik verwendet.

Die Versuche wurden entsprechend dem folgenden Plan durchgeführt:

1) 390 u g lyophilisierter Adrenocorticalextrakt in einem Gläschen wurden in 15 ml HpO (Kontrolle) aufgelöst, 16 h lang bei 10⁰C gehalten und dann zu der gleichen Zeit wie die anderen Lösungen analysiert.

2) Vier lyophilisierte Gläschen, die die gleiche Menge Adrenocorticalextrakt enthielten, wurden in 20 ml ex-ovo-Phospholipidemulsion, 5% in physiologischer Lösung, aufgelöst.

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2a) 10 ml der Corticosteroidlösung in Phospholipidemulsion wurden 16 h bei ca. 10⁰C absetzen gelassen. Fast alle Phospholipide blieben am Boden des Behälters. Die überstehende Flüssigkeit wurde durch 5-minütiges Zentrifugieren bei 1000 Upm geklärt. 5 ml der zentrifugierten Flüssigkeit ivurden mit HpO auf 15 ml verdünnt.

2b) 5 ml Lösung 2), d.h. einer Lösung, die Corticosteroide und Phospholipide, die weder durch Stehenlassen noch durch Zentrifugieren abgetrennt worden waren, enthielt, wurden auf 15 ml mit ILpO verdünnt.

3) Zur gleichen Zeit wie die 20 ml Phospholipidemulsion ohne Corticosteroide wurden zwei Lösungen nach der gleichen Verfahrensweise hergestellt, die für die Lösungen 2a) und 2b) angewendet worden war. Auf diese Weise wurden zwei Lösungen, nämlich die Lösung 3a), die als Kontrolle für die Analyse der Lösung 2a) verwendet wurde, und die Lösung 3b), die als Kontrolle für die Lösung 2b) verwendet wurde, erhalten.

Analysen aller Lösungen wurden durchgeführt, indem Jeweils ml mit 4 χ 10 ml Chloroform extrahiert wurden. Die Chloroformextrakte wurden mit wasserfreiem Natriumsulfat entwässert und im Vakuum getrocknet. Der Rückstand wurde mit ml 95° Äthanol gesammelt und (bei 1 ml alkoholischer Lösung) einer kolorimetrischen Reaktion mit Tetrazoliumblau unterworfen. Es wurden folgende Ergebnisse erhalten:

03 0022/07 7 9

Corticosteroidbestimmungen (ug/15 ml)

Lösung 1 Lösung 2 Lösung 3

Cortico- Fhospholipide + Corticosteroide nur Phospholipide steroide 2a) überstehendes 2b) Gesamt- 3«0 überste- 3b) GeProdukt menge hendes Pro- samt-

dukt menge

345 57 410 0

Aus der Gleichung x 100 = 83,5^ wird abgeleitet, daß dies die Prozentmenge Corticosteroide ist, die von den Phospholipiden zurückgehalten wird.

Als Kontrolle ergibt die Gleichung χ 100 den

Wert von 79%» der in guter Übereinstimmung mit dem vorstehen den Wert steht. (Es sollte festgestellt werden, daß die Phos pholipide alleine gleichfalls eine Reaktion mit dem Tetrazoliumblau ergeben. Diese Tatsache sollte im Gedächtnis behalten werden).

Aus den oben beschriebenen Versuchen kann hergeleitet werden, daß die Phospholipide in Form von Liposomen den größten Teil (ca. 80%) der in der Lösung vorhandenen Corticosteroide zurückhalten.

Beispiel 3

Unter Verwendung der erfindungsgemäß hergestellten Suspension der Corticosteroide enthaltenden Liposome wurde ein pharmakologischer Test des Überlebens von adrenalektomisierten Mäusen durchgeführt, der in folgender Weise ausgeführt wurde:

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Die Versuche wurden mit Schweizer Hausen vom Morini-Stamm durchgeführt, die unter Äthernarkose transabdominal adrenalektomisiert worden waren. Die Mäuse wurden unmittelbar nach dem Entwöhnen (durchschnittliches Gewicht 10 - 1 g) adrenalektomisiert.

Die adrenalektomisierten Mäuse wurden in vier Gruppen aufgeteilt: Eine Gruppe diente als Kontrollgruppe, die anderen drei Gruppen erhielten eine einzige Injektion des lyophilisierten Adrenalsteroidgemisches mit folgender Zusammensetzung: H-Desoxy-17-hydroxycorticosteron 6%; 11-Dehydrocorticosteron 11,5%; Hydrocortison 31%; Aldosteron 2,9%; Corticosteron 18,22%; andere Fraktionen 4,6%. Das Gemisch wurde in destilliertem Wasser, Sesamöl oder in dem Phospholipidgemisch, erhalten aus einer 5%igen Eidotteremulsion in physiologischer Lösung gemäß Beispiel 1, dispergiert, wobei die Technik der Stufe 5) des gleichen Beispiels angewendet vnirde.

Die Injektion erfolgte unter die Dorsalhaut in den interskapulären Bereich 5 min vor der Adrenalektomie. Die injizierten Gesamtvolumina betrugen 0,4 ml pro Tier. Die Tiere wurden bei einer Temperatur von 22 - 1°C und einer relativen Feuchtigkeit von 60% mit einem 24-stündigen Nacht- und Tagesthythmus (12 h Licht/24) über die gesamte Versuchsdauer gehalten.

Die Mortalität pro h wurde sowohl bei den behandelten als auch bei der Kontrollgruppe über einen Zeitraum von 66 h aufgezeichnet. Die Vierte wurden auf Differenzen nach Student "t" und Dunnet "t" für Globalität der Versuche umgerechnet, wobei die faktorielle Methode von R.A. Fisher zum "Vergleich der Verhältnisse" während verschiedenen h der Beobachtung angewendet wurde.

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Ergebnisse

Die Analyse des Vergleiches der Verhältnisse, die auch nach der Fisher-Methode auf alle Zeitintervalle der Beobachtungen angewendet wurde, zeigte, wie erwartet, eine statistisch signifikante Differenz des Überlebens der Tiere, die mit dem Adrenalhormongemisch im Vergleich zu den unbehandelten Tieren (Tabellen VI und VII) behandelt worden waren. Im Falle des wäßrigen Trägers war jedoch das Überleben bis zu der 18. h begrenzt. Über diese Grenze hinaus besteht praktisch kein Schutz auf den Teil einer Dosis von Corticoiden, die verwendet wird, wenn als Träger V/asser verwendet wird.

Dagegen ist das Verhältnis der Mäuse, die mit Adrenocorticalhormonen, die mit Phospholipiden getragen werden, im Vergleich zu Kontrolltieren überleben, sehr augenscheinlich (Tabelle VI). Es ist bereits von der 12. h hoch signifikant (Tabelle VII). Wenn die Tiere mit Hormonen behandelt wurden, die in Öl getragen waren, dann ist das Verhältnis des Überlebens im Vergleich zu den Kontrolltieren statistisch signifikant (P 0,05) und beginnt mit der 18. und endet mit der 30. h.

Das prozentuale Überleben im Verhältnis zu dem Träger zeigt daher eine klargeschnittene Zunahme des hormoneilen Schutzes bei dem Phospholipidträger (Tabelle VI). Tatsächlich geht im Vergleich zu Tieren, die mit Adrenocorticalhormonen in Wasser behandelt worden waren, das Überleben über die 36. h hinaus und es ist fast bis zur 66. h ersichtlich (Tabelle VII). Selbst die Injektion der Adrenalhormone in öl scheint das überleben im Vergleich zu Hormonen in Wasser eindeutig zu verlängern, doch ist der erhaltene Schutz verhältnismäßig geringer als derjenige, der mit Adrenal-

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hormonen und Phospholipidgemisch erhalten wird. 10050 der Tiere, die mit Corticalhormonen in wäßrigem Träger behandelt worden waren, waren um die 13. h gestorben. Um die 16. h waren 100% der Tiere, die mit Corticalhormonen in dem öligen Träger behandelt worden waren, gestorben, während 25% der Tiere, denen die Corticalhormone mit den Phospholipiden injiziert worden waren, immer noch überlebten.

Tabelle I Eiphospholipidsuspension - IR-Spektrum

Wellenzahl (cm~ )

Zuordnungen

2915 und 2845 mit Schulter bei 2948

1725

1460 und 1380 1235

1090 und 1050

970

Streckung der CHp-Gruppen und CH^-Terminale

Streckung der CO-Estergruppe

Biegung der CHp-Gruppen und CKU-Terminale

a) Hin- und Herbewegung der CHg- und CH,-Gruppen

b) Streckung der PO-Gruppe

a) Schaukeln der Terminale der CH,-Gruppe

b) Streckung der P-O-C-Gruppe (aliphatisch)

a) Herausdeformationen aus der Ebene der Gruppe -CH = CH- (trans) der Sphyngomyeline

b) Streckung der P-O-C-Gruppe (aliphatisch

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Tabelle II NMR-Werte - ¹H in CDCl,

i> (ppm von TT-IS) Zuordnungen

CH,-Terminale

-(CH₂)_n-Fettketten

CH₂-AlIyI

CH₂ CO

=CH CH₂ CH =

⁺N

₃₃

3,91) breite MuI- CH₂N voll, CH₂ OP 4,33j ^t:LP^letts -CH₂O Glycerin

5,36 CH = ; CH-O

Tabelle III

NMR-Werte - ¹^C in CDCl₃ (ppm von TMS) Zuordnungen

11,66 - CH₃

13,89 - CH₃-Terminale

18,52 19,23 20,95

22,37 CH₂ CH₃

22,50 23,70

24,73 CH₂ CH₂ CO

25,44 = CH CH₂ CH =

26,35

27,03 = CH₂ CH =

27,81 28,07

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₁₉ - 2346601

Fortsetzung Tabelle III

29,04

29,13 -(CH₂)_n-Fettketten

29,52 31,34

31,72 CH₂ CH₂ CH₃

33,96

34,12 CH₂ CO

35,61 36,03 36,35 37,19

39,36 CH₂N Äthanolamin

39,65 42,18 50,06

54,15 ft (CH₃)₃

56,64 Kohlenstoffatome des Glycerins und

59,46 der Alkoholketten, die das Phos-

62,91 phat verestern

63,54 66,16

70,53 <?H-0

71,11 121,18 CH₂ = (Vinylgruppen)

127,75 127,95 128,17 128,46 CH = CH

128,79 128,88 129,5

Ö30022/0779

Fortsetzung Tabelle III

129,82 130,05 130,31

14O,99 yC = (quaternäre Gruppe auf Doppelbindung)

172,93 - CO-Ester '

173,32

In der Position der Signale besteht beim Vorhandensein des Adrenocorticalextrakts keine Variierung.

Tabelle IV NMR-Werte - ¹H in D₂O

ο(ppm von DSS) Zuordnungen

0,93 CEz-Terminale

1,33 -(CH₂)_n-Kette

2,11 CH₂ Allylgruppen, CH₂CO

3,29 &

Es handelt sich um sehr breite Bänder. Das Signal für CH wird von demjenigen des Wassers (4,79 ppm) versteckt.

030022/077Ö

29Λ6601

Tabelle V

NMR-Werte -

C in D₂O

(ppm von TMS)

Zuordnungen

breit

- CH, - Terminale

16,6
19,61*

25,34 breit
31,72 35,44 sehr breit - (CH₂)_n-Fettketten 56,35)

CH₂ CH,

Band N (CH,),

sehr breit CH =

* Diese Signale sind eng, wobei J^y 1/2 mit demjenigen der Signale in Chloroformlösung vergleichbar ist.

In Gegenwart des Adrenocorticalextrakts ist das ^C-Spektrum mit Ausnahme von drei engen und gut definierten Signalen bei 66,06, 72,21 und 73,79 ppm identisch.

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Tabelle VI

Überlebensstunden von Mäusen, die adrenalektomisiert und mit einem Adrenocorticalextrakt in einem wäßrigen, öligen und Phospholipidträger behandelt wurden.

Behandlung	destilliertes Wasser (Kontrollen)	Überlebensstunden	Dunnet "t"	0,8	Signifikanz
	Adrenocorticalextrakt in destilliertem Wasser	χ + SE		2,3
D	Adrenocorticalextrakt in Sesamöl	14 i 4,671	1 vs 2	4,9 4,0	N.S.
2)	Adrenocorticalextrakt in Phospholipiden	18 ± 7,441	1 vs 3	1,4	0,05
Ο3) 0	29 i 16,405	1 vs 4	0,01 0,01
S»> NJ	40 i 20,674	2 vs 3	N.S.

Tabelle VII

Vergleich zwischen einer Kontrolle und drei Behandlungen, die zwischen der 6. und 66. h studiert wurden; durchgeführt nach der "direkten oder faktoriellen Methode" von R.A.

Fisher

% Probabilität
6 h 12 h 18 h 24 h 30 h 36 h 48 h 54 h 60 h 66 h

Kontrolle gegen ACE +

Wasser 50 23,3 4,7* 23,9 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0

Kontrolle gegen ACE +

Phospholipid 23,9 3,2* 0,1** 0,2** 0,7** 0,7**10,9 10,9 10,9 50,0

oj Kontrolle gegen ACE + Öl 38,6 12,8 0,9** 3,6* 3,6* 36,8 36,8 36,8 100,0 100,0

rv>

ο ACE + H₅O gegen ACE +

νϊ Phospholipid 50,0 14,0 1,7** 4,0* 0,7** 0,7**10,9 10,9 10,9 50,0

ü ACE + H₂O gegen ACE + Öl 63,2 29,8 22,9 19,9 3,6* 36,8 36,8 36,8 100,0 100,0

° ACE + Phospholipid

Zj gegen ACE + Öl 100,0 49,1 19,9 30,0 35,0 12,8 39,7 39,7 36,8 63,2 '

* = signifikant bis zur 5%-Sicherheitsgrenze
** ss signifikant bis zur 1%-Sicherheitsgrenze

ACE = Adrenocorticalextrakt

N) CO

Ende der Beschreibung. .p*

cn cn

L e e r s e i t e

Claims

Verfahren zur extemporierten Herstellung von Liposonen Patentansprüche

1. Verfahren zur extemporierten Herstellung von Liposonen, in die Wirkstoffe eingearbeitet sind, dadurch gekennzeichnet, daß man den Wirkstoff in einer Phospholipidemulsion in V/asser oder physiologischer Lösung bzw. physiologischer Kochsalzlösung unter Ansaugen und Ausdrücken des Gemisches unter Verwendung einer Spritze in ein Gläschen oder eine Flasche bzw. aus einem Gläschen oder einer Flasche, die den Wirkstoff in Form von entweder einem trockenen Pulver oder einem Lyophilisat enthält, auflöst.

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2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Phospholipidemulsion eine Phospholipidemulsion verwendet, die aus dem Dotter bzv:.
Eigelb von Hühnereiern hergestellt worden ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirkstoff ein Adrenocorticalextrakt ist.

030022/077ί