BR112020021412A2 - Composição lipossômica, inalável de liberação prolongada para uso no tratamento de doenças pulmonares - Google Patents

Composição lipossômica, inalável de liberação prolongada para uso no tratamento de doenças pulmonares Download PDF

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Abstract

é fornecida uma composição lipossomal de liberação prolongada para uso no tratamento de doenças pulmonares. a composição de lipossomas de liberação prolongada compreende um lipossoma que inclui um lipídeo modificado por polietileno glicol (peg) e encapsula um inibidor de tirosina quinase. o inibidor da tirosina quinase está aprisionado estavelmente no lipossoma e a formulação do fármaco lipossomal resultante pode ser aerossolizada ou nebulizada para administração por inalação. esta formulação de fármaco lipossomal em aerossol produz perfis farmacocinéticos e farmacodinâmicos consistentes, ao mesmo tempo em que atinge a eficácia e segurança desejadas.

Description

"COMPOSIÇÃO LIPOSSÔMICA, INALÁVEL DE LIBERAÇÃO PROLONGADA PARA USO NO TRATAMENTO DE DOENÇAS PULMONARES" PEDIDOS CORRELATOS
[0001] Este pedido reivindica o benefício de prioridade do Pedido Provisório US Número 62/661.217, depositado em 23 de abril de 2018, que é incorporado ao presente documento como referência em sua totalidade.
ANTECEDENTES Campo técnico
[0002] A presente revelação se refere a um sistema de liberação de fármaco inalável para liberação de uma composição lipossomal de liberação prolongada. A presente revelação se refere a um método de preparação do sistema de liberação de fármacos. A presente revelação também se refere a uma composição farmacêutica de liberação prolongada, adaptada a um sistema de liberação pulmonar, que tem uma duração de eficácia prolongada.
DESCRIÇÃO DA TÉCNICA CORRELATA
[0003] Doenças pulmonares indesejáveis são iniciadas por vários efetores externos e se tornam questões avassaladoras para uma sociedade em envelhecimento. Uma doença pulmonar exemplar, a Fibrose Pulmonar Idiopática (IPF) atinge aproximadamente 3 milhões de pessoas em todo o mundo, com a maioria dos pacientes com mais de 50 anos de idade. O prognóstico desta doença é ruim, com o tempo médio de sobrevida para pacientes com IPF de 2 a 3 anos a partir do diagnóstico. IPF é quase uma doença pulmonar órfã, com um prognóstico devastador e sintomas debilitantes com opções de tratamento limitadas (dois fármacos aprovados no mercado).
[0004] O nintedanibe, um inibidor da tirosina quinase aprovado para o tratamento da IPF, é administrado em uma dosagem alta de 300 mg por dia, que é tomado por via oral em cápsula com uma dosagem recomendada de 150 mg duas vezes ao dia. Em ensaios clínicos, o regime de dosagem de tal inibidor oral da tirosina quinase reduziu o declínio da função pulmonar (aumento da capacidade vital forçada) em aproximadamente 50% quando comparado ao placebo.
[0005] No entanto, a administração oral do inibidor da tirosina quinase leva a uma biodisponibilidade muito baixa, por exemplo, de nintedanibe sendo 4,7%, em humanos. Os efeitos colaterais indesejados do tratamento oral com a quantidade terapêutica atual de nintedanibe incluem diarreia (evento adverso mais frequente), náusea, dor de estômago, problemas hepáticos, vômitos, diminuição do apetite, dor de cabeça, perda de peso e hipertensão.
[0006] Os lipossomas são vesículas de ácidos graxos auto-organizadas compostas por bicamadas fosfolipídicas com um interior aquoso. Essas vesículas têm sido utilizadas como transportadores de fármacos para a liberação prolongada de fármacos por décadas. A encapsulação de lipossomas de um fármaco altera o perfil farmacocinético do fármaco livre, fornece liberação lenta do fármaco sistemicamente ou no sítio da doença, permite altas doses administradas com administração do fármaco menos frequente, e possivelmente, reduz os efeitos colaterais e toxicidade. A encapsulação de altas doses de fármacos no interior de um lipossoma pode ser alcançada por meio de um método de carregamento remoto (também conhecido como carregamento ativo), que depende do pH da transmembrana e gradientes de íons para permitir a difusão de moléculas de fármaco livres e não carregadas no lipossoma. Enquanto dentro do lipossoma, a molécula do fármaco livre pode complexar com um agente de captura (um contra-íon) no interior aquoso para precipitar em um sal de contra-íon do fármaco que fica dentro do lipossoma. Uma formulação de fármaco lipossomal pode ser adaptada para alcançar a liberação lenta do fármaco in vivo, o que prolongaria o efeito terapêutico do fármaco. Isso pode ser realizado ajustando a formulação de lipossoma e otimizando certas propriedades de lipossoma, tais como os fosfolipídeos usados (diferentes comprimentos de cadeia, temperaturas de transição de fase), proporção de lipídeo para colesterol, quantidade de polietilenoglicol (PEG) no lipossoma (para evitar a depuração por macrófago), agente de captura usado para encapsulação de fármacos e, possivelmente, a lamelaridade do lipossoma.
[0007] Um fármaco que foi aprisionado de forma estável em um lipossoma pode ser aerossolizado ou nebulizado para administração por inalação. No entanto, não é prontamente aparente que a utilização de tecnologia de lipossomas para reformular o inibidor de tirosina quinase pode produzir uma formulação para inalação em uma dose terapêutica, para tratar IPF ou outras doenças pulmonares. A pesquisa mostra que perfis de liberação imprevisíveis, meias-vidas plasmáticas e bio-distribuições são obtidos por diferentes vias de administração de formulações de fármacos lipossomais in vivo. Isso foi observado em um amplo espectro de agentes farmacêuticos ativos que têm sido empregados para o tratamento de doenças pulmonares.
Portanto, as formulações de fármacos lipossomais devem ser adaptadas de tal forma que a administração por inalação produza farmacocinética consistente e perfis farmacodinâmicos ao atingir a eficácia e segurança desejadas.
[0008] Atualmente, há dois fármacos lipossomais inaláveis em desenvolvimento que chegaram aos estudos clínicos: amicacina lipossomal e ciprofloxacina lipossomal. Ambos os antibióticos lipossomais para inalação estão sendo investigados para o tratamento de várias doenças respiratórias, como fibrose cística (CF), bronquiectasia não-FF, doença pulmonar micobacteriana não tuberculosa e outras infecções virulentas. Ambas as formulações de fármacos lipossômicas para terapia por inalação são projetadas para que os antibióticos acessem facilmente microrganismos ou tecidos infectados, modificando o teor de lipídeos para serem eletricamente neutros (US 8.226.975) ou ajustando o tamanho da partícula e a quantidade de ciprofloxacina livre para atenuar a atração de macrófagos (US 8.071.127).
[0009] Infelizmente, as formulações lipossômicas inaláveis existentes são incapazes de satisfazer as necessidades não atendidas para o tratamento de outras doenças pulmonares, como IPF, que pode necessitar de um fármaco com diferentes perfis de produto alvo, incluindo, mas não se limitando a deposição pulmonar profunda, penetração de muco aumentada, retenção prolongada do fármaco no pulmão e aumento da estabilidade do fármaco lipossomal. Até o momento, nenhum estudo relevante relatou um fármaco inalável eficaz para o tratamento de doenças pulmonares por inibidor da tirosina quinase ou semelhante na forma de uma composição de liberação prolongada à base de lipídeos. Portanto, há uma necessidade não atendida de uma formulação adequada para o tratamento de doenças pulmonares, como IPF: ser inalável, ter uma estabilidade melhorada ou resistência à destruição por surfactante pulmonar local e, além disso, ter uma dose forte para garantir o potencial para atingir a eficácia desejada no meio pulmonar.
SUMÁRIO
[0010] A presente revelação fornece uma formulação de fármaco lipossomal inalável compreendendo fosfolipídeo (s), um esterol, um fosfolipídeo modificado por PEG e um inibidor de tirosina quinase aprisionado no interior aquoso do lipossoma. Em algumas formas de realização, o inibidor de tirosina quinase aprisionado é um composto de indolina substituído. Em algumas formas de realização, o composto de indolina substituído é nintedanibe.
[0011] De modo a melhorar os paradigmas de tratamento existentes de doenças pulmonares, como fibrose pulmonar, e para tirar proveito dos benefícios da liberação lenta e prolongada do fármaco, desenvolvemos uma composição de lipossomas de liberação prolongada de inibidor de tirosina quinase compreendendo inibidor de tirosina quinase encapsulado em lipossoma e uma quantidade pré-determinada de inibidor de tirosina quinase livre em uma suspensão aquosa que pode ser aerossolizada e inalada para tratamento intensificado de doença pulmonar. Particularmente, existe a necessidade de uma forma inalável de nintedanibe para o tratamento de IPF.
[0012] A presente revelação fornece uma composição de lipossomas de liberação prolongada de inibidor de tirosina quinase para uso no tratamento de IPF com as vantagens de: 1) alcançar um efeito terapêutico com uma dose de fármaco muito mais baixa, 2) liberar um fármaco diretamente no sítio da doença, 3) iniciar ação mais rápida, 4) reduzir as reações adversas dos fármacos e efeitos sistêmicos, 5) contornar o metabolismo de primeira passagem observado na dosagem oral, aumentando assim a biodisponibilidade do fármaco (e possivelmente reduzindo a hepatotoxicidade), 6) aumentar o tempo de residência do fármaco no pulmão por meio de liberação prolongada da formulação do fármaco lipossomal, 7) diminuir a frequência de administração do fármaco, 8) administrar inalação não invasiva e 9) melhorar os resultados e adesão do paciente. A dose de fármaco inalada da composição lipossomal de liberação prolongada do inibidor de tirosina quinase para o tratamento de IPF em uma forma de partículas aerossolizadas pode ser significativamente menor do que uma dose oral, embora ainda consiga eficácia terapêutica semelhante.
[0013] O lipossoma com o inibidor de tirosina quinase aprisionado de acordo com a presente revelação incorpora uma quantidade significativa de fração de PEG para alcançar uma liberação prolongada de fármaco que será segura, eficaz e adequada para dosagem uma vez ao dia ou até menos frequente.
[0014] Em algumas formas de realização, os lipossomas com o inibidor de tirosina quinase aprisionado compreendem fosfocolina (PC): colesterol em uma razão molar de 1: 1 a 3: 2, em que a PC pode ser fosfatidilcolina de soja hidrogenada (HSPC), 1,2-distearoil-sn-glicero-3- fosfocolina (DSPC), 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3- fosfocolina (DPPC), ou uma mistura dos mesmos, como DSPC e l,2-dipalmitoil-sn-glicero-3- fosfoetanolamina (DPPE) a uma razão molar de 1: 1.
[0015] Em algumas formas de realização, a fosfoetanolamina modificada com PEG (PE) pode ser DSPE- PEG2000 e varia de 0,0001% em mol a 40% em mol do teor total de lipídeos dos lipossomas.
[0016] Em algumas formas de realização, a concentração de lipídeos da composição de lipossomas de liberação prolongada varia de 10 mM a 25 mM e a proporção de fármaco para lipídeo (D/L) varia de 300 g/mol a 700 g/mol.
[0017] Em algumas formas de realização, o diâmetro médio das partículas dos lipossomas com o inibidor da tirosina quinase aprisionado varia de 100 nm a 300 nm.
[0018] Em várias formas de realização, a presente revelação fornece uma composição em aerossol de partículas de composição lipossomal compreendendo lipossomas com inibidor de tirosina quinase aprisionado para uso no tratamento de fibrose pulmonar idiopática (IPF), em que os lipossomas com inibidor de tirosina quinase aprisionado têm um fármaco para razão lipídica de pelo menos 200 g/mol.
[0019] Em outro aspecto, a presente revelação fornece uma composição em aerossol de partículas da composição de lipossomas de liberação prolongada para uso no tratamento de fibrose pulmonar idiopática (IPF), em que a composição compreende lipossomas com o inibidor de tirosina quinase aprisionado tendo lipídeo modificado por PEG em uma quantidade predeterminada, por exemplo, mas não limitada a menos de 6% em mol com base nos fosfolipídeos e esterol totais.
[0020] Ainda em outro aspecto, a presente revelação fornece um método para o tratamento de doenças pulmonares, que compreende a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz do inibidor de tirosina quinase da composição em aerossol de partículas da composição lipossomal de liberação prolongada a um indivíduo em necessidade, em que a quantidade terapeuticamente eficaz do inibidor da tirosina quinase varia de 0,001 mg/kg a 50 mg/kg por peso corporal do indivíduo.
[0021] Outros objetivos, vantagens e características novas da revelação tornar-se-ão evidentes a partir da descrição detalhada que se segue, quando considerada em conjunto com os desenhos anexos.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0022] A figura 1 é um gráfico que mostra a estabilidade de armazenamento de sulfato de amônio 300 mM (A.S.) nintedanibe lipossomal a 4ºC;
[0023] A figura 2 é um gráfico que mostra o tamanho de partícula de sulfato de amônio 300 mM (A.S.) nintedanibe lipossomal armazenado a 4ºC;
[0024] A figura 3 é um gráfico que representa os perfis de liberação in vitro de formulações de TKI lipossomais em fluido pulmonar simulado (SLF); AS = sulfato de amônio; círculo aberto = formulação de TKI lipossomal compreendendo 300 mM de AS, 3,74 mg/mL de nintedanibe e 0,45% em mol de lipídeo modificado com PEG; quadrado fechado = formulação de TKI lipossomal compreendendo 300 mM de AS, 3,74 mg/mL de nintedanibe e 1,75% em mol de lipídeo modificado com PEG; Barras de erro representam o desvio padrão;
[0025] A figura 4 é um gráfico que representa a retenção de nintedanibe (Nin) no tecido pulmonar de camundongos saudáveis; AS = sulfato de amônio; círculo aberto = 3,74 mg/mL de forma livre de nintedanibe (Nin); triângulo aberto = formulação de TKI lipossomal compreendendo 300 mM de AS, 3,74 mg/mL de nintedanibe e 0,45% em mol de lipídeo modificado com PEG; triângulo fechado = formulação de TKI lipossomal compreendendo 300 mM de AS, 3,74 mg/mL de nintedanibe e 1,75% em mol de lipídeo modificado com PEG; Barras de erro representam o desvio padrão;
[0026] A figura 5 é um gráfico que representa a retenção de nintedanibe (Nin) no tecido pulmonar de camundongo em um modelo animal de IPF; a figura compara a retenção de nintedanibe administrado por via intratraqueal (IT) em uma formulação de TKI lipossomal compreendendo 300 mM de AS, 3,74 mg/mL de nintedanibe e 3% em mol de lipídeo modificado por PEG (círculo fechado) com a retenção de nintedanibe administrado por via oral (nintedanibe livre) (triângulo aberto); AS = sulfato de amônio; Barras de erro representam o desvio padrão.
DESCRIÇÃO DETALHADA DAS FORMAS DE REALIZAÇÃO
[0027] Conforme empregado acima e ao longo da revelação, os seguintes termos, salvo indicação em contrário, devem ser entendidos como tendo os seguintes significados.
[0028] Conforme usado neste documento, as formas singulares "um", "uma" e "o, a" incluem a referência no plural, a menos que o contexto indique claramente o contrário.
[0029] Todos os números no presente documento podem ser entendidos como modificados por "cerca de", que, quando se refere a um valor mensurável, como uma quantidade, uma duração temporal e semelhantes, se destina a abranger variações de ± 10%, de preferência ± 5%, mais preferencialmente ± 1%, e ainda mais preferencialmente ± 0,1% do valor especificado, uma vez que tais variações são apropriadas para obter uma quantidade desejada de fármaco lipossomal, a menos que especificado de outra forma.
[0030] O termo "tratando", "tratado" ou "tratamento", conforme usado neste documento, inclui usos ou resultados preventivos (por exemplo, profiláticos), paliativos e curativos.
[0031] O termo "indivíduo" inclui um vertebrado com câncer ou outra (s) doença (s) que afetam a função pulmonar. Em algumas formas de realização, o indivíduo é um animal de sangue quente, como um mamífero, incluindo um humano.
[0032] Tal como empregado no presente documento, o termo proporção de fármaco para lipídeo ("proporção D/L") refere-se à proporção do inibidor da tirosina quinase para o teor total de fosfolipídeos. O teor do inibidor de tirosina quinase da fármaco livre e lipossomal foi determinado por medições de absorvância de UV-Vis. O teor de fosfolipídeos, ou concentração, de lipossoma e fármaco lipossomal foi determinado analisando o teor de fósforo de amostras de lipossomas e fármacos lipossomais usando um ensaio de fósforo (adaptado de G. Rouser e outros, Lipids 1970, 5, 494-496). A razão D/L pode ser expressa em termos de g/mol ou mol/mol. Por exemplo, g/mol de nintedanibe lipossomal pode ser convertido em mol/mol de nintedanibe lipossomal dividindo o valor g/mol por 539,62 para obtenção do valor mol/mol.
[0033] Tal como empregado no presente documento, o termo % em mol significa a percentagem de mols de um determinado componente de uma mistura, em relação ao total de mols dessa mistura. Lipossoma
[0034] O termo "lipossoma", tal como empregado no presente documento, refere-se a uma partícula caracterizada por ter um espaço interno aquoso sequestrado de um meio externo por uma membrana de uma ou mais membranas de bicamada formando uma vesícula. As membranas de duas camadas de lipossomas são tipicamente formadas por lipídeos, isto é, moléculas anfifílicas de origem sintética ou natural que compreendem domínios hidrofóbicos e hidrofílicos separados espacialmente. Em certas formas de realização da presente revelação, o termo "lipossomas" refere-se aos lipossomas de vesícula unilamelar pequena (SUV) em que uma bicamada lipídica forma a membrana.
[0035] Em geral, os lipossomas compreendem uma mistura de lipídeos tipicamente incluindo um ou mais lipídeos selecionados do grupo que consiste em: lipídeos de cadeia dialifática, tais como fosfolipídeos, diglicerídeos, glicolipídeos dialifáticos, lipídeos individuais, tais como, esfingomielina e glicosfingolipídeos, esteróides como colesterol e seus derivados e suas combinações.
[0036] Exemplos de fosfolipídeos de acordo com a presente revelação incluem, mas não estão limitados a 1,2- dilauroil-sn-glicero-3-fosfocolina (DLPC), 1,2-dimiristoil- sn-glicero-3-fosfocolina (DMPC), 1,2-dipalmitoil-sn- glicero-3-fosfocolina (DPPC), 1-palmitoil-2-estearoil-sn- glicero-3-fosfocolina (PSPC), 1-palmitoil-2-oleoil-sn- glicero-3-fosfatidilcolina (POPC), 1,2-distearoil-sn- glicero-3-fosfocolina (DSPC), 1,2-dioleoi1-sn-glicero-3- fosfocolina (DOPC), fosfatidilcolina de soja hidrogenada (HSPC), 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfo-(1’-rac- glicerol) (sal sódico) (DMPG), 1,2-dipalmitoil-sn-glicero- 3-fosfo-(1’-rac-glicerol) (sal sódico) (DPPG), 1-palmitoil- 2-estearoil-sn-glicero-3-fosfo-(1’-rac-glicerol) (sal sódico) (PSPG), 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfo-(1’-rac- glicerol) (sal sódico) (DSPG), 1,2-dioleoil-sn-glicero-3- fosfo-(1’-rac-glicerol) (DOPG), 1,2-dimiristoil-sn-glicero- 3-fosfo-L-serina (sal sódico) (DMPS), 1,2-dipalmitoil-sn- glicero-3-fosfo-L-serina (sal sódico) (DPPS), 1,2- distearoil-sn-glicero-3-fosfo-L-serina (sal sódico) (DSPS), 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfo-L-serina (DOPS), 1,2- dimiristoil-sn-glicero-3-fosfato (sal sódico) (DMPA), 1,2- dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfato (sal sódico) (DPPA), 1,2- distearoil-sn-glicero-3-fosfato (sal sódico) (DSPA), 1,2-
dioleoil-sn-glicero-3-fosfato (sal sódico) (DOPA), 1,2- dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DPPE), 1- palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (POPE), 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DSPE), 1,2- dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DOPE), 1,2- dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfo-(1’-mio-inositol) (sal de amônio) (DPPI), 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoinositol (sal de amônio) (DSPI), 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfo- (1’-mio-inositol) (sal de amônio) (DOPI), cardiolipin, L-α- fosfatidilcolina (EPC) e L-α-fosfatidiletanolamina (EPE). Lipídeo modificado com polietileno glicol (PG)
[0037] Lipídeo modificado com polietileno glicol compreende uma porção de polietileno glicol conjugada com um lipídeo. Em algumas formas de realização, a fração PEG tem um peso molecular de cerca de 1.000 a cerca de 20.000 dalton. Em algumas formas de realização, o lipídeo modificado por PEG é misturado com os fosfolipídeos para formar lipossomas com uma ou mais membranas de bicamada. Em algumas formas de realização, a quantidade de lipídeo modificado com PEG varia de 0,0001% em mol a 40% em mol, opcionalmente de 0,001% em mol a 30% em mol, e opcionalmente de 0,01% em mol a 20% em mol, com base nos fosfolipídeos totais e esterol. Em algumas formas de realização, a quantidade de lipídeo modificado por PEG não é superior a 6% em mol, não superior a 5% em mol, não superior a 3% em mol, ou não superior a 2% em mol, com base nos fosfolipídeos totais e esterol. Em algumas formas de realização, o lipídeo modificado por PEG tem uma fração de PEG com um peso molecular médio variando de 1.000 g/mol a
5.000 g/mol. Em algumas formas de realização, o lipídeo modificado por PEG é fosfatidiletanolamina ligada a um grupo polietilenoglicol (PEG-PE). Em algumas formas de realização, a fosfatidiletanolamina modificada com PEG é 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metóxi (polietileno glicol)] (DSPE-PEG). Composições lipossomais de liberação prolongada
[0038] Os termos "formulação de fármaco lipossomal" e "composição lipossomal de liberação prolongada" são usados alternadamente na presente revelação. A composição de lipossomas de liberação prolongada de acordo com a presente revelação inclui, mas não está limitada aos lipossomas com inibidor de tirosina quinase aprisionado preparado por aprisionamento do inibidor de tirosina quinase no interior aquoso do lipossoma por meio de um método de carregamento remoto controlado por gradiente de pH de transmembrana. Em algumas formas de realização, o gradiente de pH transmembrana é criado usando um agente de captura para carregamento remoto do inibidor de tirosina quinase em lipossomas. Em várias formas de realização, o agente de captura é selecionado do grupo que consiste em sulfato de amônio, mesilato de amônio, tosilato de amônio, sacarose octassulfato de trietil amônio e combinações dos mesmos.
[0039] Em certas formas de realização, o lipossoma com o inibidor de tirosina quinase aprisionado compreende (a) uma bicamada lipídica compreendendo um ou mais fosfolipídeos, um esterol e um lipídeo modificado por polietileno glicol (PEG), incluindo, mas não se limitando a uma fosfatidiletanolamina modificada por PEG; e (b) um interior aquoso englobado pela bicamada lipídica que aprisiona um inibidor de tirosina quinase.
[0040] Em algumas formas de realização, o um ou mais fosfolipídeos é um fosfolipídeo neutro. Em algumas formas de realização, o lipídeo modificado por PEG é DSPE- PEG e a quantidade de DSPE-PEG no lipossoma varia de 0,001% em mol a 5% em mol com base no fosfolipídeo e esterol total.
[0041] Em algumas formas de realização, os lipossomas com o inibidor de tirosina quinase aprisionado têm um diâmetro médio de partícula entre 50 nm e 400 nm.
[0042] O termo "inibidores da tirosina quinase" (TKIs) se refere a um ou mais grupos de substâncias que inibem as tirosina quinases, enzimas responsáveis pela ativação de muitas proteínas por adição de um grupo fosfato à proteína (fosforilação). Em algumas formas de realização, o termo TKI inclui, mas não está limitado ao composto de indolina. Em algumas formas de realização, o TKI é um composto de indolina substituído, como nintedanibe ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis.
[0043] Em algumas formas de realização, o inibidor de tirosina quinase de acordo com a presente revelação é selecionado a partir do grupo que consiste em nintedanibe, saracatinibe, axitinibe, cabozantinibe, pazopanibe, vandetanibe, regorafenibe, sorafenibe, sunitinibe, imatinibe, bosutinibe, dasatinibe, afatinibinibe, patinib, erlotinibe, gefitinibe, lapatinibe, crizotinibe e ruxolitinibe.
[0044] Em algumas formas de realização, o inibidor de tirosina quinase de acordo com a presente revelação é nintedanibe, em que 180,6 mg de esilato de nintedanibe são equivalentes a 150 mg de base de nintedanibe.
[0045] Em algumas formas de realização, o inibidor de tirosina quinase de acordo com a presente revelação é um composto de indolina substituída, referindo- se a um composto de indol com um ou mais grupos substituídos, que tem como alvo o receptor do fator de crescimento endotelial vascular (VEGFR), receptor do fator de crescimento de fibroblastos (FGFR) e receptor de fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGFR).
[0046] Em algumas formas de realização, o composto de indolina substituído é selecionado do grupo que consiste em: (a) 3-Z-[1-(4-(piperidin-1-il-metil)-anilino)-1- fenil-metileno]-6-etoxicarbonil-2-indolinona, (b) 3-Z-[(1-(4-(piperidin-1-il-metil)-anilino)-1- fenil-metileno]-6-carbamoil-2-indolinona, (c) 3-Z-[1-(4-(piperidin-1-il-metil)-anilino)-1- fenil-metileno]-6-metoxicarbonil-2-indolinona, (d)3-Z-[1-(4-(dimetilaminometil)-anilino)-1- fenil-metileno]-6-etoxicarbonil-2-indolinona, (e)3-Z-[1-(4-((2,6-dimetil-piperidin-1-il)- metil)-anilino)-1-fenil-metileno]-6-etoxicarbonil-2- indolinona, (f) 3-Z-[1-(4-(N-(2-dimetilamino-etil)-N-acetil- amino)-anilino)-1-fenil-metileno]-6-etoxicarbonil-2- indolinona,
(g)3-Z-[1-(4-(N-(3-dimetilamino-propil)-N-acetil- amino)-anilino)-1-fenil-metileno]-6-etoxicarbonil-2- indolinona, (h)3-Z-[1-(4-(N-(2-dimetilamino-etil)-N- metilssulfonil-amino)-anilino)-1-fenil-metileno]-6- etoxicarbonil-2-indolinona, (i)3-Z-[1-(4-(dimetilaminometil)-anilino)-1- fenil-metileno]-6-metoxicarbonil-2-indolinona, (j)3-Z-[1-(4-(N-acetil-N- dimetilaminocarbonilmetil-amino)-anilino)-1-fenil- metileno]-6-metoxicarbonil-2-indolinona, (k)3-Z-[1-(4-etilaminometil-anilino)-1-fenil- metileno]-6-metoxicarbonil-2-indolinona, (l) 3-Z-[1-(4-(1-metil-imidazol-2-il)-anilino)-1- fenil-metileno]-6-metoxicarbonil-2-indolinona, (m)3-Z-[1-(4-(N-dimetilaminometilcarbonil-N- metil-amino)-anilino)-1-fenil-metileno]-6-metoxicarbonil-2- indolinona, (n)3-Z-[1-(4-(N-(2-dimetilamino-etil)-N- metilssulfonil-amino)-anilino)-1-fenil-metileno]-6- metoxicarbonil-2-indolinona, (o)3-Z-[1-(4-(N-(3-dimetilamino-propil)-N- metilssulfonil-amino)-anilino)-1-fenil-metileno]-6- metoxicarbonil-2-indolinona, (p)3-Z-[1-(4-(N-dimetilaminocarbonilmetil-N- metilssulfonil-amino)-anilino)-1-fenil-metileno]-6- metoxicarbonil-2-indolinona, (q)3-Z-[1-(4-(N-((2-dimetilamino-etil)-carbonil)- N-metil-amino)-anilino)-1-fenil-metileno]-6-metoxicarbonil- 2-indolinona,
(r)3-Z-[1-(4-(N-(2-dimetilamino-etil)-N-acetil- amino)-anilino)-1-fenil-metileno]-6-metoxicarbonil-2- indolinona, (s)3-Z-[1-(4-metilaminometil-anilino)-1-fenil- metileno]-6-metoxicarbonil-2-indolinona, (t)3-Z-[1-(4-(N-((4-metil-piperazin-1-il)- metilcarbonil)-N-metil-amino)-anilino)-1-fenil-metileno]-6- metoxicarbonil-2-indolinona, e (3Z)-3-[[4-[metil-[2-(4-metilpiperazin-1- il)acetil]amino]anilino]-fenilmetilideno]-2-oxo-1H-indol-6- carboxilato de (u) metila. Partículas da composição lipossomal de liberação prolongada aerossolizadas
[0047] A composição lipossomal de liberação prolongada, de acordo com a presente revelação, pode ser adaptada para a preparação de uma composição de partículas em aerossol. Em algumas formas de realização, o lipossoma com o inibidor de tirosina quinase aprisionado compreende (a) uma bicamada lipídica compreendendo um fosfolipídeo, um esterol e uma fosfatidiletanolamina modificada por PEG; e (b) um interior aquoso englobado pela bicamada lipídica e contendo um inibidor de tirosina quinase, e em que o vazamento de fármaco do inibidor de tirosina quinase do lipossoma após a aerossolização é inferior a 10%.
[0048] Em algumas formas de realização, a composição lipossomal de liberação prolongada do inibidor de tirosina quinase para uso de acordo com a presente revelação tem uma concentração de lipídeos que varia de 1 mM a 25 mM. Em certas formas de realização, a composição lipossomal de liberação prolongada de inibidor de tirosina quinase para uso de acordo com a presente revelação tem uma concentração do inibidor de tirosina quinase variando de 1 mg/mL a 15 mg/mL. Em várias formas de realização, a composição de lipossomas de liberação prolongada do inibidor de tirosina quinase para uso de acordo com a presente revelação tem uma razão de fármaco para fosfolipídeo variando de 100 g de fármaco/mol de fosfolipídeo a 1.000 g de fármaco/mol de fosfolipídeo, opcionalmente 500 g de fármaco/mol de fosfolipídeo fosfolipídeo para 1.000 g de fármaco/mol de fosfolipídeo e, opcionalmente, 0,01 mol de fármaco/mol de fosfolipídeo para 2,5 mol de fármaco/mol de fosfolipídeo, 0,05 mol de fármaco/mol de fosfolipídeo para 2 mol de fármaco/mol de fosfolipídeo, 0,1 mol de fármaco/mol de fosfolipídeo para 1,5 mol de fármaco/mol de fosfolipídeo e 0,5 mol de fármaco/mol de fosfolipídeo a 1,5 mol de fármaco/mol de fosfolipídeo.
[0049] Em algumas formas de realização, o inibidor de tirosina quinase livre da composição de lipossomas de liberação prolongada está presente em uma quantidade inferior a 50%, opcionalmente variando de 0,5% a 40%, de 1% a 30%, de 2% a 20% ou de 3% a 10% da quantidade total (isto é, livre mais encapsulado em lipossoma) do inibidor de tirosina quinase da composição de lipossomas de liberação prolongada.
[0050] Em algumas formas de realização, uma composição em aerossol de partículas é gerada a partir da composição de lipossomas de liberação prolongada usando um nebulizador. Em certas formas de realização, o nebulizador é selecionado do grupo que consiste em um nebulizador de jato de ar, um nebulizador ultrassônico e um nebulizador de malha vibratória.
[0051] Em algumas formas de realização, a composição aerossolizada de partículas tem um diâmetro aerodinâmico mediano de massa entre 0,5 µm e 5 µm.
[0052] Em algumas formas de realização, a composição em aerossol de partículas é administrada em uma quantidade de 0,001 mg/kg a 50 mg/kg, 0,005 mg/kg a 40 mg/kg, 0,01 mg/kg a 30 mg/kg, 0,05 mg/kg a 20 mg/kg, 0,1 mg/kg a 10 mg/kg ou 0,5 mg/kg a 5 mg/kg por peso corporal de um indivíduo por liberação pulmonar ao indivíduo para atingir uma taxa de liberação entre cerca de 0,5% e 25% da dose de inibidor de tirosina quinase administrada pó hora, com liberação completa do inibidor de tirosina quinase ocorrendo após um mínimo de cerca de 12 horas. Doenças pulmonares
[0053] As doenças pulmonares de acordo com a presente revelação são incorporadas em doenças pulmonares não infecciosas.As doenças pulmonares não infecciosas referem-se a doenças pulmonares, excluindo infecção pulmonar causada por bactéria gram negativa. Em algumas formas de realização, as doenças pulmonares incluem, mas não estão limitadas a: fibrose pulmonar (como fibrose pulmonar idiopática ou fibrose induzida por radioterapia), câncer de pulmão (como câncer de pulmão de células não pequenas) ou esclerose sistêmica (também conhecida como esclerodermia). O termo “Fibrose Pulmonar Idiopática” (IPF) refere-se a um tipo de doença pulmonar crônica caracterizada por um declínio progressivo e irreversível da função pulmonar. A IPF pertence a uma família de doenças pulmonares conhecidas como doenças pulmonares intersticiais (ILDs) ou, mais precisamente, doenças pulmonares parenquimatosas difusas. Dentro desta categoria de doenças pulmonares difusas, a IPF pertence ao subgrupo conhecido como pneumonia intersticial idiopática (IIP). Existem sete IIPs distintas, diferenciadas por características clínicas e padrões patológicos específicos. IPF é a forma mais comum de IIP. Os sintomas de IPF geralmente incluem início gradual de falta de ar e tosse seca. Outros sintomas de IPF podem incluir sensação de cansaço e baqueteamento de unhas. Falta de ar induzida por exercício e tosse seca crônica também podem ser sintomas proeminentes de IPF. As complicações da IPF incluem hipertensão pulmonar, insuficiência cardíaca, pneumonia e embolia pulmonar.
[0054] A revelação será ainda descrita com referência aos seguintes exemplos específicos e não limitativos.
EXEMPLOS
[0055] Os exemplos a seguir ilustram a preparação e as propriedades de certas formas de realização da presente revelação. Exemplo 1 Preparação de inibidor de tirosina quinase lipossomal (TKI) I. Preparação de lipossomas vazios
[0056] Os lipossomas foram preparados através do método de hidratação em película fina ou método de injeção de solvente. O processo de preparação de lipossomas vazios pelo método de hidratação de película fina compreende as seguintes etapas:
1. pesagem de uma mistura de lipídeos de fosfolipídeos e colesterol em uma razão molar predeterminada na presença ou ausência de DSPE-PEG2000 e adição da mistura de lipídeos a 10 mL de clorofórmio em um frasco de fundo redondo;
2. colocar o frasco em um evaporador rotativo a 60ºC e agitar o frasco para dissolver a mistura de lipídeos, seguido por colocar o frasco sob vácuo enquanto se agita para evaporar o clorofórmio, de modo a obter um filme lipídico seco;
3. preparar uma solução de agente de captura (por exemplo, sulfato de amônio (A.S.)) adicionando um agente de captura a 5 mL de água destilada e agitando a solução em vórtice para dissolver o pó;
4. adicionar a solução do agente de captura ao filme lipídico seco e agitar a 60ºC durante 30 minutos para formar uma solução de prolipossoma;
5. congelar-descongelar a solução de prolipossoma 5 vezes com nitrogênio líquido e um banho de água a 60ºC para obter uma amostra de lipossoma;
6. extrusão da amostra de lipossoma 10 vezes através de uma membrana de policarbonato de 0,2 pm a 60ºC, a seguir 10 vezes através de uma membrana de policarbonato de 0,1 pm a 60ºC;
7. dialisar a amostra de lipossoma extrusada para remover o agente de captura livre, seguido por adição da amostra a uma bolsa de diálise (MWCO: 25 kDa), selar a bolsa e agitar a bolsa de diálise em volume 100X de uma solução de sacarose 9,4% (p/v); e substituindo posteriormente a solução de sacarose após 1 hora e após 4 horas, e deixando o saco de diálise agitar durante a noite; e
8. esterilizar a amostra de lipossoma dialisada filtrando-a através de uma membrana de politetrafluoroetileno (PTFE) de 0,45 pm para obter os lipossomas vazios.
[0057] As várias formulações de lipossomas que foram preparadas para formar os lipossomas vazios a serem usados para carregar o inibidor de tirosina quinase (por exemplo, nintedanibe) estão listadas na Tabela 1 abaixo (todas as formulações de lipossomas foram preparadas em uma solução de sacarose a 9,4% (p/v)). Para formulações de lipossomas compreendendo lipídeos DSPC e DPPE, as etapas # 4-6 foram realizadas a 70ºC em vez de 60ºC devido ao DPPE ter um Tm relativamente alto de 63ºC. O diâmetro médio das partículas destes lipossomas era de aproximadamente 120 nm. Tabela 1 - Formulações de lipossomas Razão molar Fosfolipídeos Número da DSPE- Agente de formulação HSPC DSPC DPPE PEG2000 Colesterol aprisionamento 1 3 0 0 0 2 2 3 0 0 0,045 2 3 3 0 0 0,1 2 4 3 0 0 0,15 2 5 3 0 0 0,26 2 300 mM A.S. 6 0 3 0 0,045 2 7 0 3 0 0,26 2 8 0 3 3 0,09 4 9 0 3 3 0,526 4 II. Carregamento de fármaco de TKI em lipossomas para obter TKI lipossomal
[0058] O método a seguir é um protocolo exemplar para o encapsulamento de TKI (ou seja, nintedanibe) em lipossomas por carregamento remoto, que compreende as etapas de:
1. preparar as soluções de 9,4% (p/v) de sacarose e 9,4% (p/v) de tampão de sacarose contendo 31 mg/mL de L- histidina (L-His), pH 6,5;
2. preparar uma solução de 15 mg/mL de etanossulfonato de nintedanibe em 9,4% (p/v) de sacarose e aquecer brevemente a solução a 60ºC para obter uma solução estoque compreendendo nintedanibe (doravante denominado como solução estoque de Nin);
3. misturar em conjunto, em um tubo cônico: (a) lipossomas vazios conforme preparados pelo processo de acordo com a Parte I do Exemplo 1 (em algumas formas de realização, com a condição de DSPC: colesterol: DSPE- PEG2000 em uma razão molar de 3:2:0,045, 300 mM de sulfato de amônio (AS) e 58,27 mM de concentração de lipídeos), (b) uma solução de sacarose de 9,4% (p/v), (c) um tampão de sacarose de 9,4% (p/v) contendo 31 mg/mL L-His, pH 6,5, e (d) solução estoque de Nin, para obter uma solução de carga. Em algumas formas de realização, a solução de carregamento tem uma razão D/L de 500 g/mol. Em uma forma de realização, os lipossomas vazios, solução de sacarose, tampão de sacarose e solução de estoque de Nin são misturados como fornecido na Tabela 2, abaixo;
4. agitar a solução de carga vigorosamente em um banho de água a 60ºC e incubar a 60ºC por 15 minutos para formar a amostra de fármaco lipossomal, seguido de colocação da amostra de fármaco lipossomal em gelo por alguns minutos;
5. diálise por adição da amostra de fármaco lipossomal resfriada em uma bolsa de diálise (MWCO: 25 kDa), selando a bolsa e agitando a bolsa de diálise em 100X volume de uma solução de sacarose 9,4% (p/v); e substituir a solução de sacarose após 1 hora e após 4 horas, e deixar o saco de diálise agitar durante a noite; e
6. determinar a encapsulação do fármaco (isto é, eficiência de carregamento) da amostra final usando cromatografia em coluna de exclusão por tamanho e análise de HPLC (concentrações de fármaco de todas as amostras, forma lipossomal ou total, foram determinadas por medições de absorvância a 388 nm). Tabela 2 – Condições exemplares para carga remota de TKI nos lipossomas Concentração Volume de 9,4% (peso/ 9.4% 15 mg/mL pH final de lipídeo lipossoma volume) de (peso/volume) de da alvo final vazio sacarose tampão de solução solução (mM) sacarose com 31 de de mg/mL de L-His, estoque carrega- pH 6,5 de Nin mento 15 772,2 µL 277,8 µL 150 µL 1.800 µL 6,0 a 6,5 Exemplo 2 Aprisionamento de TKI no lipossoma
[0059] No TKI incorporado, nintedanibe, foi carregado em lipossomas vazios com um diâmetro médio de partícula de aproximadamente 120 nm e compreendendo vários fosfolipídeos (por exemplo, HSPC, DSPC, DSPC/DPPE, ou combinações dos mesmos), com 300 mM A.S. como o agente de captura, e o teor indicado de fosfolipídeo modificado com PEG (por exemplo, 0,9% em mol DSPE-PEG2000) de acordo com o método descrito no Exemplo 1, seção II.
[0060] A Tabela 3 resume os resultados de encapsulação de nintedanibe para esses experimentos de carregamento ativo.
Os 300 mM A.S. de lipossomas vazios compreendendo 0,9% em mol de lipídeo modificado com PEG encapsulado uma razão D/L de pelo menos 0,9 mol/mol de nintedanibe, independentemente dos lipídeos PC ou combinação de lipídeos PC/PE na formulação de lipossoma vazio.
Portanto, para lipossomas que compreendem o mesmo agente de captura (sulfato de amônio) e teor de PEG, há flexibilidade na escolha de diferentes fosfolipídeos para uma formulação de nintedanibe lipossomal inalável que pode atingir alta encapsulação da fármaco, liberação prolongada desejada e retenção prolongada da fármaco no ambiente pulmonar.
Tabela 3 – Resultados de encapsulação de Nintedanibe para lipossomas de ~ 120 nm compreendendo vários fosfolipídeos e 0,9% em mol de lipídeo modificado com PEG Composição de lipossoma Concen- Razão de Eficiên Taxa (razão molar) tração de D/L cia de lipossoma fármaco Total carre- l D/L total (mol/mol) gamento (mol/mol) (mg/mL) (%) HSPC:colesterol:DSPE- 9,22 1,47 66,0 0,97 PEG2000 3:2:0,045 7,35 0,92 106 0,98
DSPC:colesterol:DSPE- 7,48 0,93 103 0,96 PEG2000 3:2:0,045
DSPC:DPPE:colesterol:DSPE 7,80 1,02 98,0 1,00 -PEG2000 3:3:4:0,09
Exemplo 3
Efeito do tamanho do lipossoma vazio na estabilidade de TKI lipossomal nebulizado
[0061] A estabilidade de TKI lipossomal após nebulização foi investigada para fármacos lipossomais de tamanhos de partícula variados para formulações de baixo teor de PEG com alto encapsulamento de nintedanibe. Lipossomas de tamanhos diferentes foram preparados por extrusão de lipídeos hidratados através de membranas de policarbonato de tamanhos de poros variados (0,1 µm, 0,2 µm, 0,4 µm e 1 µm) antes do carregamento remoto de nintedanibe nos referidos lipossomas. A formulação de lipossoma usada para os testes de estabilidade de nebulização tinha uma composição de HSPC: colesterol: DSPE- PEG2000 em uma razão molar de 3:2:0,045 com 300 mM A.S. como o agente de captura. O protocolo para nebulização da amostra de TKI lipossomal foi o seguinte:
1. adicionar 2 mL de fármaco lipossomal à câmara de medicação de um Nebulizador Vib-Mesh HL100 (comercializado pela Health and Life Corporation);
2. deslizar e conectar a câmara de fármaco ao restante do nebulizador;
3. ligar o nebulizador para iniciar a aerossolização da amostra e nebulização de toda a amostra de 2 mL (o tempo total de nebulização foi de quase 6 minutos);
4. coletar as partículas do aerossol em um tubo cônico de 50 mL firmemente conectado à saída do nebulizador e lacrado com parafilme; e
5. determinar a eficiência de carregamento de fármaco da amostra de fármaco lipossomal antes e após a nebulização usando cromatografia em coluna de exclusão de tamanho e análise de HPLC.
[0062] Os resultados dos testes de estabilidade de nebulização são mostrados na Tabela 4 abaixo. As formulações de fármacos lipossomais compreendendo lipossomas com diâmetros médios de partícula abaixo de 300 nm foram muito estáveis com praticamente nenhum vazamento de fármaco (≤1%). As formulações lipossomais de fármaco com diâmetros médios de partícula ligeiramente maiores do que 300 nm apresentaram uma pequena quantidade de vazamento de fármaco (cerca de 5%). No geral, as partículas aerossolizadas da formulação de fármaco lipossomal em que os lipossomas tinham diâmetros médios de partícula na faixa de 100 nm a 300 nm eram estáveis, pois o vazamento de fármaco era mínimo e o tamanho de partícula não se alterou significativamente antes e após a nebulização. Tabela 4 - Estabilidade de nebulização de nintedanibe lipossomal Tamanho Diâmetro de partícula Razão de fármaco- Vazamento de poroso médio de TKI lipídeo de TKI de TKI de lipossomal(nm) liposossomal (%) membrana nebulizado (D/L) usada (mol/mol) para Pré- Pós- Livre + Liposomal extrusar nebulização nebulização liposomal lipossoma vazio (µm) 0,1 128 128 0,92 0,92 0 0,2 191 189 0,91 0,90 1,1 0,4 244 244 0,93 0,93 0 1 322 311 1,03 0,98 4,9
Exemplo 4 Estabilidade de armazenamento de formulações de fármacos lipossomais
[0063] A estabilidade dos TKI lipossomais armazenados a 4ºC foi monitorada por dois anos. Nintedanibe foi carregado remotamente em lipossomas compreendendo HSPC: colesterol: DSPE-PEG2000 a uma razão molar de 3:2:0,045 (0,9% em mol de lipídeo modificado com PEG) com 300 mM A.S. como o agente de captura. Depois de carregar o fármaco nos lipossomas, a amostra do fármaco lipossomal foi agitada e dialisada em um volume 100X de uma solução de sacarose a 9,4% (p/v). A solução de sacarose foi substituída após 1 hora e após 4 horas, e a amostra foi agitada em solução durante a noite. A encapsulação do fármaco (razão D/L) para o lipossoma foi de cerca de 0,9 mol/mol. Após o armazenamento da amostra de fármaco lipossomal dialisado a 4ºC por dois anos, praticamente nenhum fármaco encapsulado (<3%) vazou do lipossoma (figura 1). Além disso, o tamanho de partícula da suspensão de TKI lipossomal permaneceu o mesmo (diâmetro dentro de ± 1 nm) ao longo do período de armazenamento de dois anos a 4ºC (figura 2). Exemplo 5 Liberação de fármaco in vitro em fluido pulmonar simulado
[0064] Os perfis de liberação de fármacos de duas formulações de TKI lipossomais, com 0,45% em mol de lipídeo modificado com PEG ou 1,75% em mol de lipídeo modificado com PEG, foram avaliados em fluido pulmonar simulado (SLF) para demonstrar suas propriedades de liberação prolongada. As duas amostras de TKI lipossomais foram preparadas com aproximadamente a mesma concentração de nintedanibe (3,85 a 3,95 mg/mL de fármaco) com quase nenhum fármaco livre presente em nenhuma das amostras (Tabela 5). O protocolo para os experimentos de liberação in vitro (IVR) foi o seguinte:
1. diluir cada amostra de TKI lipossomal 10 vezes misturando 0,5 mL de cada amostra com 4,5 mL de SLF (pré- aquecido a 37ºC) e colocando a amostra diluída em um tubo de centrífuga de 15 mL;
2. colocar os tubos de centrífuga, com as amostras diluídas, nas cavidades de amostra de um rotador Intelli-mixer, que está incubando a 37ºC e girando a 20 rpm;
3. amostrar 1 mL da amostra de TKI lipossomal diluída em pontos de tempo predeterminados (por exemplo, 0, 4 e 24 horas);
4. determinar a eficiência de encapsulamento, em que o método analítico para determinar a eficiência de encapsulamento de cada amostra de 1 mL foi o seguinte: uma. embalar e lavar uma coluna de 2 mL de Sepharose® CL-4B com uma solução de sacarose a 9,4% (menos de 5 mL); b. adicionar 0,1 mL da amostra à coluna, depois adicionar 0,15 mL de uma solução de sacarose a 9,4% três vezes separadas e esperar que a solução elua da coluna; c. adicionar 1 mL de uma solução de sacarose a 9,4% à coluna e coletar o eluente (fração lipossomal do fármaco) em um balão volumétrico de 10 mL; adicionar metanol ao balão volumétrico para aumentar o volume e misturar bem (esta é a forma de fármaco lipossomal);
d. em um balão volumétrico de 10 mL separado, adicione 0,1 mL da amostra não purificada ao frasco e adicione metanol ao balão volumétrico para trazê-lo até o volume e misture bem (esta é a forma total do fármaco); e. medir a absorbância das amostras diluídas finais em 380 nm usando um leitor de placa UV-Vis para determinar as concentrações de fármaco de cada amostra.
5. A eficiência de encapsulação (EE) é definida como a forma lipossomal (LF) do fármaco dividida pela forma total (TF) da fármaco: EE (%) = LF/TF * 100%. Tabela 5 - Resultados de encapsulamento para amostras IVR Forma Concentração Denominação da Amostra do do fármaco EE (%) fármaco (mg/mL) LF 3,85 AS300mM/Nin 3,74 mg/mL/PEG 0,45 mol% 98,2 TF 3,92 LF 3,88 AS300mM/Nin 3,74 mg/mL/PEG 1,75 mol% 98,2 TF 3,95
[0065] Os perfis de IVR das duas formulações de TKI lipossomais são mostrados na figura 3. As formulações de lipossomas retiveram uma porcentagem significativa do teor total da fármaco e exibiram uma liberação lenta da fármaco ao longo de um período de 24 horas. Os lipossomas com PEG eram muito estáveis, pois quase nenhum nintedanibe foi liberado em SLF nas primeiras quatro horas e apenas 30% do teor total do fármaco foi liberado no SLF em um período de 24 horas. Estes resultados de IVR indicam que nossas formulações de fármacos lipossomais podem alcançar liberação prolongada in vivo no ambiente pulmonar.
Exemplo 6 Retenção pulmonar prolongada e toxicidade reduzida de fármacos de TKI lipossomal em animais saudáveis
[0066] Um estudo de retenção pulmonar de TKI lipossomal em camundongos saudáveis foi conduzido para comparar os tempos de residência da forma livre versus formulações de TKI lipossomal no pulmão de camundongos. Quatro composições foram usadas no estudo: 1) placebo (solução salina); 2) nintedanibe livre (fármaco dissolvido em solução de sacarose a 9,4% (p/v)); 3) 300 mM A.S. nintedanibe lipossomal (0,45% em mol PEG); e 4) 300 mM A.S. nintedanibe lipossomal (1,75% em mol de PEG). A concentração da fármaco nas composições #2-4 era a mesma: cerca de 3,74 mg/mL de nintedanibe.
[0067] O protocolo para o estudo de retenção foi o seguinte:
1. anestesiar camundongos C57BL/6 de 7 semanas de idade com isoflurano;
2. administrar intratraquealmente (IT) 50 µL da composição em camundongos anestesiados usando um micro- pulverizador (HRH-MAG4);
3. anestesiar e sacrificar camundongos em pontos de tempo predeterminados (por exemplo, 2, 6 e 24 horas);
4. nos mesmos pontos de tempo predeterminados (por exemplo, 2, 6 e 24 horas), coletar amostras de tecido pulmonar para determinação da fármaco;
5. analisar o nintedanibe no tecido pulmonar por:
a) homogeneizar cada amostra de tecido pulmonar a
6.000 rpm duas vezes (2 execuções/ciclo) com 1 mL de metanol; b) centrifugar cada amostra a 20.000 g por 10 minutos a 4ºC; c) transferir 0,5 mL de cada sobrenadante para um balão volumétrico de 5 mL e aumentar o volume com metanol; d) medir a absorbância da amostra final diluída a 380 nm usando um leitor de placa UV-Vis para determinar a concentração do fármaco na amostra.
[0068] Os resultados do estudo de retenção pulmonar são mostrados na figura 4. Para nintedanibe livre (fármaco livre dissolvido em solução aquosa) administrado por via intratraqueal, quase nenhum fármaco foi retido no pulmão após apenas duas horas. Assim, quase todo o fármaco foi absorvido e eliminado do pulmão nesse curto período de tempo. Em contraste, os animais administrados com nintedanibe lipossomal (compreendendo 0,45% em mol ou 1,75% em mol de lipídeo modificado com PEG) retiveram cerca de metade da dose total da fármaco no pulmão seis horas após a administração de IT. Além disso, de 16% a mais de 30% da dose total ainda foram observados no pulmão após 24 horas. Portanto, o tempo de residência do nintedanibe lipossomal foi muito maior do que o do fármaco livre. Além disso, as formulações de fármacos lipossomais parecem ser adequadas para uma dosagem diária ou até menos frequente. Em comparação com o fármaco livre, o nintedanibe lipossomal reteve até cerca de 20 vezes mais nintedanibe no pulmão ao longo de 24 horas.
[0069] Durante o estudo de retenção pulmonar, nenhuma morte foi observada em camundongos que receberam uma solução em branco ou nintedanibe lipossomal (Tabela 6). No entanto, os camundongos que receberam nintedanibe livre (como uma solução aquosa) na mesma concentração de 3,74 mg/mL da forma lipossomal não se saíram tão bem.
Dois dos nove camundongos administrados com nintedanibe livre morreram, com os sete camundongos sobreviventes exibindo fraqueza significativa (Tabela 6). Esses resultados demonstram que a forma lipossomal de nintedanibe é mais segura e menos tóxica do que a forma livre de nintedanibe.
Esses resultados também indicam que seria possível aumentar a dose de nintedanibe na forma de fármaco lipossomal acima de 3,74 mg/mL para aumentar a eficácia e prolongar a liberação prolongada, mantendo a segurança.
Tabela 6 - Observações de camundongos durante o estudo de retenção pulmonar Artigos de teste Número de camundongos Mortalidade amostrados em pontos de tempo diferentes (horas) 0 2 6 24 Placebo 3 0 0 0 0/3 3,74 mg/mL Nin 0 3 3 3 2/9 (os 7 (forma livre) camundongos sobreviventes estavam muito fracos) 300 mM A.S. – 3,74 0 3 3 3 0/9 mg/mL Nin PEG de 0,45 mol% (forma lipossomal)
300 mM A.S. – 3,74 0 3 3 3 0/9 mg/mL Nin PEG de 1,75 mol% (forma lipossomal)
Exemplo 7 Retenção pulmonar de TKI em um modelo animal de
IPF
[0070] Para expandir o estudo de retenção pulmonar do Exemplo 6, a retenção de nintedanibe no tecido pulmonar de camundongo também foi investigada em um modelo de IPF. Os detalhes do desenho do estudo são fornecidos na Tabela 7. Resumidamente, 21 camundongos foram divididos em dois grupos (duas composições de nintedanibe diferentes) com nove camundongos no Grupo #1 e 12 camundongos no Grupo #2.
[0071] A descrição de cada composição de nintedanibe é fornecida abaixo: Grupo # 1: AS-Nin 3,74 mg/mL-PEG3% representado nintedanibe carregado em 300 mM A.S. lipossomas compreendendo 3% em mol de PEG; concentração de lipídeos de 15 mM, concentração de nintedanibe de 3,74 mg/mL; Grupo #2: nintedanibe livre representou 150 mg de cápsulas moles de nintedanibe (soluções de nintedanibe livre foram preparadas diariamente dissolvendo o teor da cápsula mole em óleo de gergelim para render uma concentração de nintedanibe de 7,6 mg/mL para dosagem; o volume para administração oral foi de 200 µL/camundongo).
[0072] Primeiro, a fibrose pulmonar foi induzida por instilação IT de 2,5 mg/kg de bleomicina em cada camundongo. Após sete dias, 25 µL de nintedanibe lipossomal (Grupo #1) foram instilados por via intratraqueal ou nintedanibe oral (Grupo #2), um dos dois fármacos aprovados pela FDA para o tratamento de IPF, foi administrado por via oral aos camundongos fibróticos. Os regimes de dosagem são mostrados na Tabela 7. Q2Dx2 significa uma dose administrada em dias alternados para um total de duas doses. Amostras de sangue e tecido pulmonar foram coletadas em pontos de tempo predeterminados (Tabela 7). Tabela 7 - Projeto do estudo de retenção pulmonar de nintedanibe em um modelo animal de IPF Número Composição Número Frequência Pontos de do de de dose tempo de grupo animais (números) amostragem de sangue/tecido (pós-dose)* 1 AS-Nin 3,74 mg/mL- 9Uma vez 24 e 48 h PEG3% (N=6) (4,68 mg/kg, IT) Q2Dx2 (N=3) 48 h 2 Nintedanibe livre 12 Uma vez 1 e 5 h (60 mg/kg, oral) (N=6) QD para 5 1 e 5 h dias (N=6) *3 camundongos por ponto de tempo em todos os grupos
[0073] Os resultados da retenção pulmonar do estudo de modelo animal de IPF são mostrados na figura 5. A quantidade de nintedanibe no tecido pulmonar de camundongo foi determinada e monitorada por até cinco dias. Apesar da dosagem oral uma vez ao dia de 60 mg/kg de nintedanibe, nintedanibe livre mostrou muito pouca, ou nenhuma, retenção de fármaco no pulmão de camundongo, pois nenhum nintedanibe foi detectado no tecido pulmonar após apenas algumas horas. Em contraste, uma dose IT de 4,68 mg/kg de nintedanibe lipossomal administrada em dias alternados produziu uma libertação prolongada do fármaco no tecido pulmonar do camundongo durante até 48 horas. Além disso, mais de 12% da dose instilada de 300 mM A.S. formulação lipossomal de nintedanibe (-0,06 mg de fármaco/g de tecido pulmonar) foi ainda observada no tecido pulmonar após 48 horas. Esses resultados demonstram que nossa formulação de fármaco lipossomal, em uma dose significativamente mais baixa, foi amplamente superior ao fármaco oral no prolongamento da retenção de nintedanibe no pulmão de camundongos doentes e que a dosagem infrequente de nintedanibe lipossomal inalado é possível. Exemplo 8 Eficácia do nintedanibe lipossomal inalado em um modelo animal de IPF
[0074] A eficácia do nintedanibe lipossomal e oral no tratamento da fibrose pulmonar induzida por bleomicina em camundongos foi investigada. Os detalhes do projeto do estudo são fornecidos na Tabela 8. Resumidamente, oito camundongos foram divididos em três grupos (N = 3 cada para duas composições de nintedanibe e vias de administração diferentes, N = 2 para controle não tratado).
[0075] A descrição de cada composição de nintedanibe é fornecida abaixo: Grupo #1: AS-Nin 3,74 mg/mL-PEG 3% representou nintedanibe carregado em 300 mM A.S. lipossomas compreendendo 3% em mol de PEG; concentração de lipídeos de 15 mM, concentração de nintedanibe de 3,74 mg/mL; Grupo # 2: nintedanibe livre representou 150 mg de cápsulas moles de nintedanibe (soluções de nintedanibe livre foram preparadas diariamente dissolvendo o teor da cápsula mole em óleo de gergelim para render uma concentração de nintedanibe de 7,6 mg/mL para dosagem; o volume para administração oral foi de 200 µL/camundongo).
Primeiro, a fibrose pulmonar foi induzida por instilação de IT de bleomicina a 2,5 mg/kg no dia 0. Após sete dias, 25 µL de nintedanibe lipossomal (Grupo #1, N=3) foi instilado por via intratraqueal ou nintedanibe oral (Grupo #2, N=3) foi administrado por via oral aos camundongos fibróticos para avaliação do efeito terapêutico em comparação com o controle não tratado (Grupo # 3, N = 2). Os regimes de dosagem das composições de nintedanibe são mostrados na Tabela 8. Q2Dx4 significa uma dose administrada em dias alternados nos dias 7, 9, 15 e 17. QDxl0 significa que os camundongos receberam uma dosagem diária no dia 7, 8, 9, 10, 11, 14, 15, 16, 17, e 18. Amostras de sangue e tecido pulmonar foram coletadas no dia
21. Tabela 8 – Projeto de estudo de eficácia do nintedanibe em um modelo animal de IPF Número Composição Número de Frequência Pontos de tempo do animais de dose de amostragem Grupo de tecido 1 AS-Nin 3,74 1 a 3 Q2Dx4 Dia 21 mg/mL-PEG3% (4.68 mg/kg, IT) 2 Nintedanibe 4 a 6 QDx10 Dia 21 livre (60 mg/kg, oral) 3 Controle não 7 a 8 N/A Dia 21 tratado
[0076] A eficácia foi determinada por avaliação histopatológica do tecido pulmonar de camundongo. A Tabela 9 mostra os resultados histopatológicos após o tratamento de camundongos fibróticos com os Grupos #1-3. A redução da fibrose pulmonar foi observada no Grupo #1 e no Grupo #2 em comparação com o Grupo #3, pois os pulmões exibiam inflamação bronquíolo-alveolar crônica leve e fibrose intersticial e subpleural leve após o tratamento com nintedanibe lipossomal ou livre (pontuação de fibrose de ~ 2). Como o Exemplo 7 demonstra que a administração de IT de nintedanibe lipossomal resulta em uma concentração mais alta de fármaco no tecido pulmonar por períodos mais longos, nossos dados mostram que a instilação intratraqueal de nintedanibe lipossomal pode reduzir significativamente a dose necessária e a frequência de nintedanibe administrado por via oral para o tratamento do IPF.
Tabela 9 - Resultados histopatológicos de tecido pulmonar de camundongo no estudo de eficácia (classificado por coloração com tricrômio de Masson) Grupo #1: Grupo #2: Grupo #3: Verificações nintedanibe nintedanibe controle histopatológicas lipossomal livre não (4,68 mg/kg, IT) (60 mg/kg, oral) tratado Número do animal 1 2 3 4 5 6 7 8 Intersticial, 2 3 2 2 2 2 5 4 subpleural, 2 2 2 2 2 2 4 3 classificações 2 2 2 2 1 2 4 3 de fibrose 2 2 2 2 1 2 3 2 multifocal 2 2 1 2 1 2 3 2 Classificação 2,0 2,2 1,8 2,0 1,4 2,0 3,8 2,8 media
Grau das lesões coradas com HE foi classificado de um a cinco dependendo da gravidade: 1 = mínimo (< 1@); 2 leve (1,25%(, 3 moderado (15 a 50%). 4 = moderado/grave (51-75%), 5 = severo/alto (76 a 100%). O grau de lesões coradas com HE foi classificado de um a cinco, dependendo da gravidade:
1 = mínimo (<1%); 2 = leve (1-25%); 3 = moderado (26-50%); 4 = moderado/grave (51-75%); 5 = grave/alto (76- 100%).
[0077] REFERÊNCIAS CITADAS
DOCUMENTOS DE PATENTES DOS US
[0078] 8.071.127 B2 12/2011 Cipolla e outros.
[0079] 8.119.156 B2 2/2012 Cipolla e outros.
[0080] 8.226.975 B2 7/2012 Weers
[0081] 8.652.512 B2 2/2014 Schmehl e outros.
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PATENTES ESTRANGEIRAS
[0087] EP 0223831 7/1992
[0088] EP 0267050 9/1994
[0089] EP 1438955 6/2006
[0090] EP 1530466 12/2014
[0091] EP 1658851 5/2006
[0092] EP 2079443 8/2014
[0093] EP 2363114 5/2015
[0094] EP 2384751 9/2015
[0095] WO WO 2015/106150 11/2016
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Claims (20)

REIVINDICAÇÕES
1. Composição lipossomal de liberação prolongada para uso no tratamento de doença pulmonar, compreendendo lipossomas com inibidor de tirosina quinase aprisionado, em que cada lipossoma compreende: uma bicamada lipídica compreendendo um ou mais fosfolipídeos, um esterol e um lipídeo modificado por polietileno glicol (PEG); e um interior aquoso englobado pela bicamada lipídica e aprisionando um inibidor de tirosina quinase.
2. Composição de liberação prolongada lipossomal, de acordo com a reivindicação 1, em que a composição tem uma proporção de fármaco para fosfolipídeo que é selecionada a partir de uma faixa de cerca de 100 g fármaco/mol de fosfolipídeo a cerca de 1.000 g de fármaco/mol de fosfolipídeo, cerca de 200 g de fármaco/mol de fosfolipídeo cerca de 1.000 g de fármaco/mol de fosfolipídeo e cerca de 0,1 mol de fármaco/mol de fosfolipídeo a cerca de 2,5 mol de fármaco/mol de fosfolipídeo.
3. Composição lipossomal de liberação prolongada, de acordo com a reivindicação 1, em que a composição tem uma concentração de lipídeos variando de cerca de 1 mM a cerca de 25 mM.
4. Composição lipossomal de liberação prolongada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que a concentração do inibidor de tirosina quinase varia de cerca de 1 mg/mL a cerca de 15 mg/mL.
5. Composição lipossomal de liberação prolongada, de acordo com a reivindicação 4, em que o lipídeo modificado com PEG está presente em uma quantidade inferior a 6% em mol com base nos fosfolipídeos totais e esterol.
6. Composição lipossomal de liberação prolongada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que a doença pulmonar é selecionada a partir do grupo que consiste em fibrose pulmonar, câncer de pulmão de células não pequenas e esclerose sistêmica.
7. Composição lipossomal de liberação prolongada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que o lipídeo modificado por PEG tem uma fração de PEG com um peso molecular médio variando de cerca de 1.000 g/mol a cerca de 5.000 g/mol.
8. Composição lipossomal de liberação prolongada, de acordo com a reivindicação 7, em que o lipídeo modificado com PEG é 1,2-distearoil-sn-glicero-3- fosfoetanolamina-N-[metóxi (polietileno glicol)] (DSPE- PEG).
9. Composição lipossomal de liberação prolongada, de acordo com a reivindicação 8, em que o um ou mais fosfolipídeos é um fosfolipídeo neutro e o DSPE-PEG do lipossoma está presente em uma quantidade que varia de cerca de 0,001% em mol a cerca de 5% em mol com base no fosfolipídeo total e esterol.
10. Composição lipossomal de liberação prolongada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que o um ou mais fosfolipídeos são selecionados do grupo que consiste em fosfatidilcolina de soja hidrogenada (HSPC), 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DSPC), 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DPPC) e lipídeo de fosfatidiletanolamina e suas combinações.
11. Composição lipossomal de liberação prolongada de acordo com a reivindicação 1, em que a razão molar dos fosfolipídeos totais para esterol varia de cerca de 1:1 a cerca de 3:2.
12. Composição lipossomal de liberação prolongada, de acordo com a reivindicação 1, em que os lipossomas da composição têm um diâmetro médio de partícula entre cerca de 50 nm e cerca de 400 nm.
13. Composição de liberação prolongada lipossoma, de acordo com a reivindicação 1, em que o inibidor da tirosina quinase é selecionado do grupo que consiste em nintedanibe, saracatinibe, axitinibe, cabozantinibe, pazopanibe, vandetanibe, regorafenibe, sorafenibe e sunitinibe.
14. Composição lipossomal de liberação prolongada de acordo com a reivindicação 1, em que o inibidor de tirosina quinase é um composto de indolina substituída.
15. Composição lipossomal de liberação prolongada de acordo com a reivindicação 1, em que o inibidor de tirosina quinase é encapsulado no interior aquoso do lipossoma por meio de um método de carregamento remoto impulsionado por gradiente de pH transmembrana usando um agente de aprisionamento.
16. Composição de liberação prolongada lipossomal de acordo com a reivindicação 15, em que o agente de captura é sulfato de amônio.
17. Composição de partículas em aerossol para uso no tratamento de doença pulmonar, compreendendo a composição de lipossomas de liberação prolongada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16.
18. Composição aerossolizada de partículas de acordo com a reivindicação 17, em que as partículas têm um diâmetro aerodinâmico médio de massa de cerca de 0,5 pm a cerca de 5 pm.
19. Composição aerossolizada de partículas de acordo com a reivindicação 17, em que os lipossomas com o inibidor de tirosina quinase aprisionado tem uma taxa de liberação entre cerca de 0,5% e cerca de 25% do inibidor de tirosina quinase total por hora no pulmão com liberação completa do inibidor de tirosina quinase aprisionado ocorrendo após um mínimo de cerca de 12 horas ou um mínimo de cerca de 24 horas.
20. Composição em aerossol de partículas da reivindicação 17, que é administrada em uma quantidade de 0,001 mg/kg a 50 mg/kg.
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