JP2015180652A - リポソーム医薬製剤及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】多価イオン性薬物を良好な標的化能で送達し、且つ標的組織で効果的に薬物を放出することが可能なリポソーム製剤の提供。
【解決手段】有効成分として解離定数が４．５〜９．５の２つ以上の解離基を有するミトキサントロン、ビンクリスチン、ビノレルビン、ビンブラスチン等の多価イオン性薬物を含み、リポソームの大きさが３０〜８０ｎｍであり、該リポソームの二重層が、相転移温度が体温よりも高いリン脂質、コレステロール及び親水性ポリマー修飾脂質を含み、該リポソームのリポソーム内相が多価対イオンを含み、且つ相転移温度（Ｔｍ）が体温よりも高いリン脂質が、前記二重層中のリン脂質の合計含量に対して、５０〜１００ｍｏｌ／ｍｏｌ％であるリポソーム医薬製剤。
【選択図】なし

Description

本発明は、リポソーム製剤及び薬物を封入するリポソーム医薬製剤、とりわけミトキサントロンのリポソーム医薬製剤に関する。本発明はさらに、リポソーム、リポソーム医薬製剤を製造する方法、及びそれらの使用に関する。

リポソームは、多くの薬物、とりわけ抗腫瘍薬（特に化学療法薬）用の担体として使用することができる。リポソームは、正常組織への薬物の分布を低減させるが、腫瘍組織への薬物の蓄積を増大させて、それにより薬物の治療係数を改善することができる。リポソームが腫瘍に対して受動的に標的化され得る理由は、腫瘍組織の生理的特性に関連する。腫瘍血管は迅速に増殖するため、孔径が最大で１００〜７８０ｎｍになり得るのに対し、正常血管内皮細胞の典型的なスペースは約２ｎｍである。したがって、小型のリポソームは、静脈内注射で投与した後、正常組織に入ることはできないが、腫瘍領域の血管を浸透し、治療域に到達することができるため、リポソームは、血液中で比較的長期間循環することができ、大きさが２００ｎｍ未満である場合、腫瘍領域に受動的に蓄積することができる。

しかしながら、リポソームの治療的利点を達成することは容易でなく、以下の４つの要件を満たす必要がある：（１）薬物を、良好な封入効率及び十分な薬物負荷でリポソーム中に封入することができる；（２）ｉｎ ｖｉｔｒｏでの保存期間中に、薬物がリポソームから放出されない；（３）リポソーム薬物の血液循環時に顕著な薬物漏出がない；及び（４）リポソームが腫瘍領域に蓄積すると、薬物を効果的に放出し、それによりその治療効果を発揮することができる。現行のリポソーム技法に関しては、最初の３つの課題については十分に解決されているため、リポソーム薬物のｉｎ ｖｉｖｏでの合理的放出が多くの関心を集めている。幾つかのリポソーム薬物を開発するために解決すべき１つの重要な技術的課題は、腫瘍領域に対して標的化した後に、リポソーム薬物の合理的放出を効果的に制御することである。これは、幾つかの薬物、例えば、ミトキサントロンではとりわけ重要である。

カナダのリポソーム研究グループは、リン脂質二重層として水素添加大豆ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）及びコレステロールを用いると共に、３００ｍＭのクエン酸勾配で薬物を負荷することによって製造した、大きさが約１００ｎｍのリポソーム製剤が、遊離ミトキサントロンよりも良好でないことを見出した。リポソームの治療効果を改善するために、グループは最終的に、リン脂質二重層の組成を、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）及びコレステロールへと変更し、治療係数の改善された製剤を得た。しかしながら、ＤＭＰＣの相転移温度が約２１℃であるため、薬物の漏出が保存期間中に増大する可能性があることから、この製剤は安定でない可能性がある（ミトキサントロンのリポソーム製剤、特許文献１）。

米国のNeopharm Corporationは別の技法を用いて、負電荷を保有するカルジオリピンをリン脂質二重層に添加した、ミトキサントロンのリポソーム製剤を開発した。カルジオリピンとミトキサントロンとの間の強力な相互作用に起因して、ミトキサントロンを、受動的負荷様式で、リン脂質二重層に挿入することが可能であった。この受動的負荷技法は、能動的負荷技法とは異なる。能動的負荷技法によって、薬物は、リポソーム内の水相中で沈殿の形態で析出する。Neopharmの製品の第Ｉ相臨床試験から、リポソーム薬物が遊離薬物と比較して、偶発的な（occasional）感染の可能性を増大させる可能性があることが示された。この製品の開発は安全性を考慮して中止された（ミトキサントロンのリポソーム
製剤、特許文献２）。

太平洋薬物研究所（Pacific Institute of Materia Medica）（常州（Changchou）、中国）もミトキサントロンのリポソーム製剤に関して特許を出願した（ミトキサントロン又は塩酸ミトキサントロンのリポソーム注射剤及びその製造方法、特許文献３）。この出願では、従来のｐＨ値勾配法を用いて薬物が負荷された。この出願は、特定比の製剤の保護を求めており、リポソームの治療的効力及び毒性に対する、リン脂質の組成、内部水相中の緩衝塩の種類、リポソームの大きさ、薬物／リポソーム比等の因子の効果については開示されていない。

四川大学華西薬学院（West China School of Pharmacy, Sichuan University）のZhirong Zhang, et al.も、ミトキサントロンのリポソーム製剤を研究した。彼らは、相転移温度０℃の大豆ホスファチジルコリン（商品名ＥＰＩＫＵＲＯＮ ２００で市販されている）を使用して、約６０ｎｍのリポソームを製造した。この論文では、得られるリポソーム製剤の毒性及び治療的効力は考慮されず、薬物動態のみが研究された。適切な含量は、非特許文献１、非特許文献２及び非特許文献３で確認することができる。

上記研究において、リポソームの大きさが通常、８０ｎｍ〜１５０ｎｍの範囲に制御されるのは、リポソームの技術分野において、大きさが約１００ｎｍのリポソームが最高の標的化効率を有するというコンセンサスがあるためである（非特許文献４）。しかしながら、上述したように、リポソームは、優れた標的化効率を有するだけでなく、薬物がリポソームから十分に放出され、その効果を発揮する必要がある。

上記のように、従来技術分野によれば、血液循環中の薬物の漏出は、薬物を効果的に腫瘍へと移行させるためには、本質的に回避されるべきであるが、この要件により、腫瘍領域に標的化された場合には、リポソームからの薬物の放出が困難にもなる。リポソームを作製する従来の方法において、薬物は、通常、能動的負荷技法によって封入され、ここで、リポソーム中に封入された薬物は、生物活性のないコロイド沈殿形態で存在し、薬物が効果的にリポソームから放出された場合にのみ、生物活性のある治療的薬物へと変化し得る。薬物の放出速度が非常に遅い場合には、薬物が、腫瘍領域に効果的に標的化されていても、その治療的作用を発揮し難い場合があり、その治療効果が非封入薬物に比べ非常に劣る場合がある。

米国特許第５，８５８，３９７号明細書 中国特許第０１８１７４２４８号明細書 中国特許出願公開第２００４１００４１６１２１号明細書

「長期循環ミトキサントロンリポソームの製造及びその薬物動態（Preparation of long circulating mitoxantrone liposomes and its pharmacokinetics）」Zhirong Zhang, Botao Yu and Yisong Duan, Acta Pharmaceutica Sinica, 2002, Vol. 37, No. 6 「膜間硫酸アンモニウム勾配を用いた長期循環ミトキサントロンリポソームの製造に関する研究（Studies on preparation of long circulating mitoxantrone liposomes with transmembrane ammonium sulfate gradients）」Zhirong Zhang, Botao Yu, Yisong Duan and Yuan Huang, Chinese Pharmaceutical Journal, 2002 Vol. 37, No. 12 「ミトキサントロンリポソームの製造技法に関する研究（Study on the preparation techniques of mitoxantrone liposomes）」Yisong Duan, West China Journal of Pharmaceutcal Sciences, 2001 Vol. 16, No. 02 Pharmacol. Rev. 1999 51: 691-744

したがって、良好な標的化能で薬物を送達し、且つ標的組織で効果的に薬物を放出することが可能なリポソーム製剤、及び対応するリポソーム医薬製剤が当該技術分野で差し迫って必要とされている。

本発明者は驚くべきことに、複数の解離基を有し、且つ多価対イオンとコンパクトな沈殿物を形成する傾向のある幾つかの薬物を加工して、治療係数が効果的に改善された、小型の単層膜リポソーム製剤を形成することができ、その結果、上記技術的課題を解消することができることを偶然にも見出した。

したがって、一態様において、本発明は、大きさが約３０〜８０ｎｍであり、リン脂質二重層中にＴｍが体温よりも高いリン脂質を有し、その結果、リポソームの相転移温度が体温よりも高い、リポソーム製剤を提供する。上記リン脂質の例としては、限定するものではないが、ホスファチジルコリン、水素添加大豆ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）、水素添加卵黄ホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）若しくはジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）又はそれらの任意の組合せが挙げられる。

一実施の形態において、リン脂質二重層中のＴｍが体温よりも高いリン脂質は、リン脂質の合計含量の５０〜１００ｍｏｌ／ｍｏｌ％、好ましくは５５〜９５ｍｏｌ／ｍｏｌ％、より好ましくは５５〜９５ｍｏｌ／ｍｏｌ％である。

必要に応じて、本発明のリポソーム製剤のリン脂質二重層は、さらなるリン脂質、例えば、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）等のＴｍが体温以下のリン脂質をさらに含む。本発明のリポソーム製剤中のリン脂質の量は通常、リポソーム製剤のＴｍ値が体温よりも低い値まで著しく低下しない限り、当業者が決定することができる。

本発明のリポソーム製剤は、リポソーム膜の流動性を制御するために、必要に応じてコレステロールも含み得る。

本発明のリポソーム製剤は必要に応じて、さらなる賦形剤、とりわけリポソームの表面特性をさらに修飾して、リポソームにｉｎ ｖｉｖｏでのより良好な挙動を与える賦形剤も含み得る。かかる賦形剤としては、例えば、親水性ポリマーで修飾した脂質等が挙げられる。

別の態様において、本発明は、本発明のリポソーム製剤中に、目的とする薬物、とりわけ多価イオン性薬物を含む、リポソーム医薬製剤を提供する。したがって、本発明は、大きさが３０〜８０ｎｍのリポソーム医薬製剤であって、（１）リポソーム医薬製剤が有効成分として多価イオン性薬物を含み、（２）リン脂質二重層が、リポソームの相転移温度が体温よりも高くなるように、Ｔｍが体温よりも高いリン脂質を含み、且つ必要に応じて（３）リポソーム医薬製剤が、リポソーム医薬製剤に許容されるさらなる薬物及び／又はさらなる賦形剤を含む、リポソーム医薬製剤に関する。好ましくは、リポソーム医薬製剤の大きさの主ピークは、３５〜７５ｎｍ付近、とりわけ４０〜６０ｎｍ付近に中心がある。

別の態様において、本発明は、上記リポソーム医薬製剤を製造する方法であって、（１）Ｔｍが体温よりも高いリン脂質並びに必要に応じてさらなるリン脂質及び／又はコレステロールを用いてリポソームを製造する工程と、（２）目的とする薬物、とりわけ多価イオン性薬物をリポソーム中に封入する工程とを含む、方法を提供する。

本発明は、疾患を治療する方法であって、本発明のリポソーム医薬製剤を、治療を必要とする被験体に投与することを含む、方法も提供する。好ましくは、被験体は、哺乳類、とりわけヒトである。

昆明（Kunming）マウスにおけるＰＬＭ６０のｉｎ ｖｉｖｏでの薬物動態及びそれらの遊離ミトキサントロンのｉｎ ｖｉｖｏでの薬物動態との比較を示す図である。ここで、ＰＬＭは、ＰＥＧ化ミトキサントロンリポソームを表し、ＦＭは、遊離ミトキサントロンを表し、横軸は時間（時間）を表し、縦軸は、ミトキサントロンの血漿レベル（μｇミトキサントロン／ｍＬ血漿）を表す。 マウス腫瘍におけるＰＬＭ６０及びＦＭのプロファイルを示す図である。ここで、ＰＬＭ６０は、ＰＥＧ化ミトキサントロンリポソームを表し、ＦＭは遊離ミトキサントロンを表し、横軸は時間（時間）を表し、縦軸は、腫瘍組織におけるミトキサントロンの濃度（μｇミトキサントロン／ｇ腫瘍組織）を表す。 異なる製剤のマウスにおけるｉｎ ｖｉｖｏでの薬物動態の比較を示す図である。ここで、横軸は、時間（時間）を表し、縦軸は、ミトキサントロンの血漿レベル（μｇミトキサントロン／ｍＬ血漿）を表し、異なる製剤の投与量はすべて４ｍｇ／ｋｇである。

通常、リポソームは、膜材料としてリン脂質及びコレステロールを用いて形成する。これら２つの成分は、リポソーム二重層を形成する原材料であるだけでなく、非常に重要な生理的機能を有する。

リポソーム膜の物性は温度と密接に関連する。温度が上昇すると、脂質二重層のアシル側鎖が規則配列から不規則配列へと変化する。この種の変化は、脂質膜の物性の多くの変化を生じ得る。例えば、「ゲル」状態は、「液晶」状態へと変化する場合があり、膜の断面積は増大する場合があり、二重層の厚さは減少する場合があり、膜流動性は増大する場合がある。かかる変化が起こる温度を、相転移温度と呼ぶ。脂質膜の相転移温度は、示差走査熱量測定、電子スピン共鳴（ＥＳＲ）等によって求めることができる。リポソーム膜の相転移温度は、リン脂質の種類によって決まる。概して、アシル側鎖が長いほど、相転移温度は高くなり、逆もまた同様である。例えば、ジミリストイルホスファチジルコリンの相転移温度は２４℃であるのに対し、ジパルミトイルホスファチジルコリン及びジステアロイルホスファチジルコリンの相転移温度はそれぞれ、４１℃及び５８℃である。膜流動性は、リポソームの重要な特性である。相転移温度では、膜流動性が増大し、リポソーム中に封入された薬物の放出速度は最大となる。したがって、膜流動性はリポソームの安定性に直接的に影響を及ぼす。

一実施形態において、本発明は、大きさが約３０〜８０ｎｍであると共に、リン脂質二重層中のＴｍが体温よりも高いリン脂質を有し、リポソームの相転移温度が体温よりも高い、リポソーム製剤を提供する。

好ましくは、本発明のリポソーム医薬製剤は、相転移温度Ｔｍが比較的高いリン脂質、例えば、ホスファチジルコリンを用いて製造される。ホスファチジルコリンのＴｍが体温
よりも高い場合、その炭化水素鎖の長さは、好ましくは１６炭素以上である。好ましくは、本発明のリン脂質としては、限定するものではないが、水素添加大豆ホスファチジルコリン、水素添加卵黄ホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）若しくはジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）又はそれらの任意の組合せが挙げられる。

本発明のリポソーム製剤において、リン脂質二重層中のＴｍが体温よりも高いリン脂質は、すべてのリン脂質の合計含量に対して、約５０〜１００ｍｏｌ／ｍｏｌ％、好ましくは約５５〜９５ｍｏｌ／ｍｏｌ％、より好ましくは約６０〜９０ｍｏｌ／ｍｏｌ％である。必要に応じて、リン脂質二重層は、さらなるリン脂質、例えば、Ｔｍが体温以下であるリン脂質、例えば、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）等を含み得る。かかるリン脂質は、リポソーム製剤の相転移温度が体温より低くならない限り、リポソーム中に任意の好適な量で存在し得る。好適な量は、当業者が従来技法に従って決定することができる。

好ましくは、本発明のリポソーム製剤は、コレステロールをさらに含み得る。コレステロールは、膜流動性を調節する機能を有する。リポソーム膜が５０％（ｍｏｌ／ｍｏｌ）コレステロールを含む場合、リポソーム膜の相転移は消失する場合がある。コレステロールはPapahadjopoulos et al.によって「流動性緩衝剤」と呼ばれるが、相転移温度下のリン脂質にコレステロールを添加すると、膜の規則配列が低減し、且つ膜流動性を増大することができる一方、相転移温度を上回るリン脂質へコレステロールを添加すると、膜の規則配列が増大し、且つ膜流動性が低減する可能性がある。本発明のリポソーム製剤において、コレステロールの含量は、リポソームの成分の総量に対して、２〜６０ｍｏｌ／ｍｏｌ％、５〜５５ｍｏｌ／ｍｏｌ％又は１０〜５０ｍｏｌ／ｍｏｌ％であり得る。より具体的には、コレステロールの含量は、リポソームの成分の総量に対して、１５〜４５ｍｏｌ／ｍｏｌ％、例えば２０〜４０ｍｏｌ／ｍｏｌ％であり得る。本発明のリポソーム中のコレステロールの含量は、当業者が従来技法に従って容易に決定することができる。

当然のことながら、本発明のリポソーム中のリン脂質二重層は、さらなる賦形剤、とりわけリポソームの表面特性をさらに修飾してリポソームにより良好なｉｎ ｖｉｖｏでの挙動を与える賦形剤も含み得る。かかる賦形剤としては、例えば、親水性ポリマーで修飾した脂質物質が挙げられ、その例は、ＰＥＧ修飾ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ）、ＰＥＧ修飾ジステアロイルホスファチジルグリセロール（ＤＳＰＧ−ＰＥＧ）、ＰＥＧ修飾コレステロール（ｃｈｏｌ−ＰＥＧ）、ポリビドン修飾ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ−ＰＶＰ）、ＰＥＧ修飾ジステアロイルホスファチジルグリセロール（ＤＳＰＧ−ＰＶＰ）又はＰＥＧ修飾コレステロール（ｃｈｏｌ−ＰＶＰ）である。上記賦形剤はまた、特異的抗体又はリガンドで修飾した膜材料であり得る。本発明のリポソーム中のかかる賦形剤の量は、当業者が従来技法に従って決定することができ、例えば、リン脂質のモル数に対して、０．１〜２０ｍｏｌ／ｍｏｌ％、好ましくは０．３〜１８ｍｏｌ／ｍｏｌ％、より好ましくは０．５〜１５ｍｏｌ／ｍｏｌ％、とりわけ０．８〜１２ｍｏｌ／ｍｏｌ％、例えば１〜１０ｍｏｌ／ｍｏｌ％、又は２〜８ｍｏｌ／ｍｏｌ％、２．５〜７ｍｏｌ／ｍｏｌ％、３〜６ｍｏｌ／ｍｏｌ％等であり得る。賦形剤としてＰＥＧ修飾脂質を用いる場合、ＰＥＧ部分の分子量は、例えば、４００〜２００００Ｄａｌｔｏｎ、好ましくは６００〜１５０００Ｄａｌｔｏｎ、より好ましくは８００〜１００００Ｄａｌｔｏｎ、とりわけ１０００〜８０００Ｄａｌｔｏｎ、例えば１２００〜５０００Ｄａｌｔｏｎであり得る。本発明におけるＰＥＧの使用も、当業者が通常の道筋に従って容易に決定することができる。

本発明のリポソーム製剤は、小型の単層膜リポソーム製剤であり、大きさが好適である必要がある。好ましくは、製剤の大きさは３０〜８０ｎｍ、より好ましくは３５〜７０ｎ
ｍ、とりわけ好ましくは４０〜６０ｎｍである。リポソームの大きさは、粒度分析計若しくは電子顕微鏡又は他の手段によって求めることができる。当然のことながら、本発明におけるリポソーム粒子は、リポソーム自体の性質及び製造方法の特性に起因して、完全に均一な大きさを有するのではなく、或る大きさの範囲をとり得る。したがって、本発明のリポソーム製剤では、本発明のリポソーム製剤又はリポソーム医薬製剤の特性に明らかに影響を及ぼさない限り、上述した大きさの範囲を外れたリポソーム粒子の存在を除外しない場合がある。

本発明におけるリポソームは、例えば、膜分散法、注入法、超音波分散法、凍結乾燥法、凍結融解法等を含む、各種の好適な方法によって製造することができる。リポソームを製造するのに使用される開始系により、この方法は、（１）乾燥脂質膜、脂質粉末に基づく方法；（２）乳化剤に基づく方法；（３）混合ミセルに基づくリポソーム製造方法；及び（４）エタノール、リン脂質及び水の三相混合物に基づくリポソーム製造方法に分けることができる。薬物の封入は、受動的負荷様式又は能動的負荷様式のいずれかで実行することができる。これらの方法は、リポソームに関する多くの総説中に見出すことができる。

リポソーム製剤の製造中又は製造後、多くの好適な方法を用いて、リポソーム中に薬物を封入し、リポソーム医薬製剤を形成することができる。好適な方法としては、例えば、能動的負荷方法及び受動的負荷方法が挙げられる。能動的負荷方法は通常、勾配法、例えば、硫酸アンモニウム勾配法によって実施され、すなわち、水相として硫酸アンモニウム溶液を用いて、最初にリポソーム内相及びリポソーム外相の両方に硫酸アンモニウムを含むリポソームを製造し、次いで、リポソーム外の硫酸アンモニウムを除去することによって、リポソーム内相とリポソーム外相との間で硫酸アンモニウムの濃度勾配を形成する。リポソーム内のＮＨ_４ ^＋は、ＮＨ_３及びＨ^＋へと解離し、これが、リポソーム内相とリポソーム外相との間にＨ^＋の濃度差（すなわち、ｐＨ勾配）をもたらす結果、分子状態のリポソーム外薬物がリポソーム内の水相に移行した後、イオン状態に変化し、それにより薬物がリポソーム外の水相に戻ることができず、リポソームは薬物の漏出が少なくなり、より安定になる。受動的負荷方法は、有機溶媒注入法、膜分散法、凍結融解法等によって実施することができる。

本発明では、任意の好適な薬物成分を使用することができる。好ましくは、本発明のリポソーム医薬製剤中の有効医薬成分は、多価イオン性薬物である。「多価イオン性薬物」という用語は、ｐＫａの範囲内で薬物がより多くの正電荷又はより多くの負電荷を有するような、解離定数ｐＫａが４．５〜９．５の２つ以上の解離基を有する薬物を意味する。好ましくは、上記解離定数の範囲は５．０〜９．５である。より好ましくは、上記解離定数の範囲は５．５〜９．５である。とりわけ好ましくは、上記解離定数の範囲は６．０〜９．０、とりわけ６．５〜９．０である。イオン薬物の各解離基のｐＫａ値は、当業者が通常の技法に従って容易に求めることができる。

本発明において、多価イオン性薬物としては、限定するものではないが、抗癌薬、例えば、以下の癌：肺癌（非小細胞性肺癌等）、膵臓癌、乳癌、直腸癌又は多発性骨髄腫、肝臓癌、子宮頸癌、胃癌、前立腺癌、腎臓癌及び／又は膀胱癌の予防又は治療に有用な薬物が挙げられる。したがって、本発明の一実施形態において、多価イオン性薬物は多価イオン性抗癌薬である。好ましくは、多価イオン性薬物は、ミトキサントロン、ビンクリスチン、ビノレルビン又はビンブラスチンである。より好ましくは、上記多価イオン性薬物は、ミトキサントロンであり、必要に応じて例えば、ビンクリスチン、ビノレルビン又はビンブラスチン等の抗腫瘍薬物であり得るさらなる薬物のうち少なくとも１つと組み合わせることができる。

具体的には、本発明において、多価イオン性薬物は、上記薬物のいずれか１つ又は２つ以上の組合せ、例えば、２つの抗癌薬の組合せ、１つ又は複数の抗癌薬と免疫賦活薬等のさらなる薬物との組合せ、及び２つ以上の他の種類の薬物の組合せでもあり得ることに留意する必要がある。

なお、本発明のリポソーム薬物はまた、必要に応じて上述した多価イオン性薬物の他に、上述した多価イオン性薬物との組合せで投与することができる、さらなる非多価イオン性薬物の１つ又は複数を含み得る。組合せ投与は、すべての構成成分の一製剤での投与を含み、別個の単位剤形での組合せ投与も含む。
。

当然のことながら、本明細書中で言及する有効成分としての薬物は、その原形だけでなく、その誘導体、例えば溶媒和物（水和物及びアルコール付加体等）、プロドラッグ及び他の生理的に許容される誘導体、並びに活性代謝物等を含む。誘導体、プロドラッグ及び他の生理的に許容される誘導体並びに薬物の活性代謝物はすべて、当業者に既知である。

本発明のリポソーム医薬製剤は、有効成分の電荷とは反対の電荷を有する２つ以上の多価対イオンをさらに含み得る。多価対イオンの例としては、限定するものではないが、以下の飽和又は不飽和の有機酸：クエン酸、酒石酸、フマル酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、リンゴ酸及びマレイン酸等の酸アニオン等の有機酸アニオン；硫酸アニオン、リン酸アニオン等の無機酸アニオンが挙げられる。中でも、クエン酸アニオン、硫酸アニオン又はリン酸アニオンが好ましい。さらに、上記多価対イオンは、シスチン等のアミノ酸でもあり得る。特定の理論に縛られることなく、多価対イオンは、リポソーム中に封入した目的とする薬物（例えば、多価イオン性薬物）と不溶性の沈殿物を形成することが可能であり、それによりリポソーム中の多価イオン性薬物の存在が安定化すると推定される。

本発明のリポソーム医薬製剤は、必要に応じて、医薬分野で一般的に既知のさらなる賦形剤及び担体、ショ糖、ヒスチジン、酸化防止剤、安定剤、分散剤、防腐剤、希釈剤、溶媒、浸透圧を変化させる塩等をさらに含む。

一実施形態において、本発明は、本発明のリポソーム医薬製剤を製造する方法であって、最初に上記本発明のリポソーム製剤を製造することと、引き続いて目的とする薬物とリポソーム製剤とを好適な条件でインキュベートすることとを含む、方法を提供する。より具体的には、本発明のリポソーム医薬製剤を製造する方法は、（１）リポソームを製造するのに好適な脂質賦形剤をｔｅｒｔ−ブチルアルコール又はシクロヘキサン等の好適な有機溶媒に溶解させ、次いで凍結乾燥して、凍結乾燥粉末を得る工程と、（２）目的とする薬物有効成分の対イオンを含有する溶液で凍結乾燥粉末を水和して、空のリポソームを形成する工程と、（３）透析又はカラムクロマトグラフィ等の好適な手段によって、リポソーム外の対イオンを除去して、リポソーム内相とリポソーム外相との間の対イオン勾配を形成する工程と、（４）薬物をリポソームとインキュベートして、リポソーム薬物を得る工程とを含む。リン脂質、コレステロール、賦形剤等に関する記載は、リポソーム製剤に関して前述したものを参照されたい。

好ましくは、脂質は、リン脂質、とりわけ、相転移温度が比較的高い脂質、例えば、ホスファチジルコリン、水素添加大豆ホスファチジルコリン、水素添加卵黄ホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）若しくはジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）又はそれらの任意の組合せである。必要に応じて、上記脂質はまた、コレステロールを、例えば、２〜６０ｍｏｌ／ｍｏｌ％、５〜５５ｍｏｌ／ｍｏｌ％又は１０〜５０ｍｏｌ／ｍｏｌ％の量で含み得る。より具体的には、コレステロールの量は、リポソーム中の全成分の総モル数に対して、１５〜４５ｍｏｌ／ｍｏｌ％、例
えば２０〜４０ｍｏｌ／ｍｏｌ％であり得る。当業者は、得られるリポソームの相転移温度及び所望の性質に対する特定の要件に応じて、コレステロール量を決定することができる。

リポソーム医薬製剤を製造した場合、リポソームへの薬物の封入効率は、従来技法によって求めることができる。リポソームの封入効率を求める方法としては、限外濾過、透析、カラムクロマトグラフィ、ミニカラム遠心分離等が挙げられる。限外濾過は、実験機器に対する要件が高いために使用せず；カラムクロマトグラフィは、希釈に大量の溶離液が必要であり、且つ薬物の含量が非常に低いため、含量を求めることが困難であり、さらに、大量の溶離液の希釈により、リポソーム中の薬物の漏出が引き起こされる可能性があることから使用せず、試験データから、透析の封入効率は（おそらく、希釈後にリポソームが破壊するため）低く、透析の時間は長いため、この方法は好適ではないと理解することができる。ミニカラム遠心分離による封入効率の判定には、短時間しかかからない、リポソームの溶液に対する希釈率が小さい、また、高価な器具を必要としないという利点がある。

本発明のリポソーム医薬製剤は、十分な封入効率及び十分な薬物負荷だけでなく、ｉｎ
ｖｉｔｒｏでの保存中にリポソームから薬物を放出しないこと、毒性を増大させる血液循環中のリポソームからの薬物の顕著な漏出がないことも保証する。本発明のリポソーム薬物の重要で顕著な効果は、当該分野における現行の製品と比較して、薬物の放出速度が効率的に促進され、リポソームの治療係数（therapy index）が改善し、半減期が有意に
延長し、毒性が著しく低減するため、薬物の有効な治療効果が達成されることである。例えば、水素添加大豆ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）及びジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）を用いて製造したリポソーム医薬製剤については、それらの毒性は著しく低減すると共に、それらの治療係数は有意に改善する。これに対して、リン脂質二重層がジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）から成る場合は、薬物の放出が極めて速く、顕著な毒性がもたらされ、実際、遊離薬物よりも安全性が良好でない。或る特定の理論に縛られることなく、本発明の小型の単層膜リポソーム製剤は、小型の単層膜リポソーム製剤が、薬物／脂質比を固定した場合には、より大型の単層膜リポソーム製剤と比較して、粒度の小さい薬物沈殿を含有するより多くのリポソーム粒子を含有し得るため、薬物の放出を促進することができると推定される。粒度の小さい薬物沈殿は、比較的大きな比表面積を有するため、同一条件下では溶出速度がより迅速になる。

さらに、本発明のリポソーム医薬製剤は、標的組織、とりわけ腫瘍における薬物の効果的な放出を達成するために、好適なリン脂質を用いて製造する必要がある。好ましくは、本発明のリポソーム医薬製剤のリン脂質二重層は、相転移温度が比較的高いリン脂質から成る。実験時、水素添加大豆ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）及びジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）等を製剤に用いた場合に、製剤の毒性が有意に減少し、治療係数が顕著に改善することが見出された。リン脂質二重層がジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）から成る場合、薬物の放出が極めて速く、顕著な毒性がもたらされ、実際、非封入薬物よりも安全性が良好でない。

本発明のリポソーム医薬製剤は、当該技術分野で一般的に使用される投与経路でそれらを必要とする患者に投与することができる。本発明の一実施形態において、リポソーム薬物は、非経口投与用の製剤に製剤化される。本発明の好ましい一実施形態では、リポソーム薬物を注射によって投与する。

本発明は、患者における疾患、とりわけ腫瘍を治療する方法であって、本発明のリポソーム医薬製剤を、治療を必要とする患者に投与することを含む、方法も提供する。好ましくは、リポソーム医薬製剤の治療効果を高めるために、温熱療法（例えば、放射線温熱療
法）を組み合わせて腫瘍患者に適用することもできる。本発明において、患者は、哺乳動物、好ましくはヒトであり得る。

本発明は、腫瘍患者を治療する薬剤の製造における、上述したリポソーム製剤又はリポソーム医薬製剤の使用にも関する。

本発明を以下の実施例によってさらに説明するが、これは例示に過ぎず、本発明に対する限定として解釈されるものではない。

第１部：リポソームの製造
実施例１
リポソームを製造する一般法
１．一般法１
リン脂質（例えば、水素添加大豆ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）又はジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ））及びコレステロール（１：１〜１０：１のモル比）をｔ−ブチルアルコール又はシクロヘキサン等の有機溶媒に溶解させて、清澄溶液を形成する。この溶液を通常の凍結乾燥で処理して、凍結乾燥粉末を得る。凍結乾燥粉末を（５０ｍＭ〜１０００ｍＭ）硫酸アンモニウム溶液、クエン酸溶液又は遷移金属硫酸塩（例えば、硫酸ニッケル）溶液を用いて６０℃〜６５℃で水和し、約１時間振盪することにより、不均一な多層膜小胞を得る。得られた小胞の大きさをマイクロフルイダイザー又は高圧押出装置で小さくして、リポソームを得る。得られたリポソームの試料を０．９％ ＮａＣｌ溶液で２００倍に希釈し、ＮａｎｏＺＳで検出する。リポソーム外の緩衝溶液を限外濾過装置で除去して、動的な膜間勾配を形成する。塩酸ミトキサントロン溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）を好適なリポソーム／薬物比で空のリポソームに添加し、薬物の負荷を６０℃〜６５℃で実施する。約１時間インキュベートした後、ゲル排除クロマトグラフィを用いて封入効率（ＥＥ）を求める。

２．一般法２
リン脂質（例えば、水素添加大豆ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）又はジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ））及びコレステロール（１：１〜１０：１のモル比）を混合し、リン脂質の０．１〜２０ｍｏｌ％のポリエチレングリコール修飾ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ）を同時に添加する。得られた混合物をｔ−ブチルアルコール又はシクロヘキサン等の有機溶媒に溶解させて、清澄溶液を形成する。この溶液を通常の凍結乾燥で処理して、凍結乾燥粉末を得る。凍結乾燥粉末を（５０ｍＭ〜１０００ｍＭ）硫酸アンモニウム溶液、クエン酸溶液又は遷移金属硫酸塩（例えば、硫酸ニッケル）溶液を用いて６０℃〜６５℃で水和し、約１時間振盪することにより、不均一な多層膜小胞を得る。得られた小胞の大きさをマイクロフルイダイザー又は高圧押出装置で小さくして、リポソームを得る。得られたリポソームの試料を０．９％ ＮａＣｌ溶液で２００倍に希釈し、ＮａｎｏＺＳで検出する。リポソーム外の緩衝溶液を限外濾過装置で除去して、動的な膜間勾配を形成する。塩酸ミトキサントロン溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）を好適なリポソーム／薬物比で空のリポソームに添加し、薬物の負荷を６０℃〜６５℃で実施する。約１時間インキュベートした後、ゲル排除クロマトグラフィを用いて封入効率（ＥＥ）を求める。

実施例２
ミトキサントロンリポソームＰＬＭ６０の製造
ＨＳＰＣ、コレステロール及びＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００を３：１：１の重量比で９５％ ｔ−ブチルアルコールに溶解させて、清澄溶液を形成した。この溶液を凍結乾燥で処理して、凍結乾燥粉末を得た。凍結乾燥粉末を硫酸アンモニウム溶液（３００ｍＭ）を用
いて６０℃〜６５℃で水和し、約１時間振盪することにより、リン脂質の最終濃度が９６ｍｇ／ｍＬの不均一な多層膜小胞を得た。小胞の大きさをマイクロフルイダイザーで小さくして、リポソームを得た。得られたリポソームの試料を０．９％ ＮａＣｌで２００倍に希釈し、ＮａｎｏＺＳで検出したところ、平均の大きさが約６０ｎｍ、主ピークが４０ｎｍ〜６０ｎｍであった。リポソーム外の硫酸アンモニウム溶液を限外濾過装置で除去し、２５０ｍＭショ糖及び５０ｍＭグリシンを含む溶液で置換することにより、動的な膜間勾配を形成した。塩酸ミトキサントロン溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）を、１６：１のリポソーム／薬物比で空のリポソームに添加し、薬物の負荷を６０℃〜６５℃で実施した。約１時間インキュベートした後、封入効率（ＥＥ）をゲル排除クロマトグラフィにより１００％と求めた。得られたリポソームをＰＬＭ６０と命名した。

実施例３
ミトキサントロンリポソームＰＬＭ８５の製造
ＨＳＰＣ、コレステロール及びＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００を、３：１：１の重量比で９５％ ｔ−ブチルアルコールに溶解させて、清澄溶液を形成した。この溶液を凍結乾燥で処理して、凍結乾燥粉末を得た。凍結乾燥粉末を硫酸アンモニウム溶液（３００ｍＭ）を用いて６０℃〜６５℃で水和し、約１時間振盪することにより、リン脂質の最終濃度が９６ｍｇ／ｍＬの不均一な多層膜小胞を得た。小胞の大きさを高圧押出装置で小さくして、リポソームを得た。得られたリポソームの試料をＮａＣｌ溶液で２００倍に希釈し、ＮａｎｏＺＳによって検出したところ、平均の大きさが約８５ｎｍであった。リポソーム外の硫酸アンモニウム溶液を限外濾過装置で除去し、２５０ｍＭショ糖及び５０ｍＭグリシンを含む溶液で置換することにより、動的な膜間勾配を形成した。塩酸ミトキサントロン溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）を１６：１のリポソーム／薬物比で空のリポソームに添加し、薬物の負荷を６０℃〜６５℃で実施した。約１時間インキュベートした後、封入効率（ＥＥ）をゲル排除クロマトグラフィにより１００％と求めた。得られたリポソームをＰＬＭ８５と命名した。

実施例４
ミトキサントロンリポソームＰＬＭ１００の製造
実施例３で記載したものと同様の方法を用いて、塩酸ミトキサントロンリポソームＰＬＭ１００を製造した。ここで、処方はＰＬＭ６０及びＰＬＭ８５と同一であるが、リポソームの大きさは１００ｎｍであった。

実施例５
ミトキサントロンリポソームＰＬＭ６０−ｄｐｐｃの製造
ＤＰＰＣ、コレステロール及びＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００を３：１：１の重量比で混合し、他の工程は実施例２と同一とした。得られたリポソームをＰＬＭ６０−ｄｐｐｃと命名した。

実施例６
ミトキサントロンリポソームＰＬＭ６０−ｄｍｐｃの製造
ＤＭＰＣ、コレステロール及びＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００を３：１：１の重量比で混合し、他の工程は実施例２と同一とした。得られたリポソームをＰＬＭ６０−ｄｍｐｃと命名した。

実施例７
ミトキサントロンリポソームＰＬＭ６０−ｄｍｐｃ−０．１の製造
ＤＭＰＣ、コレステロール及びＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００を３：１：０．１の重量比で混合し、他の工程は実施例２と同一とした。得られたリポソームをＰＬＭ６０−ｄｍｐｃ−０．１と命名した。

実施例８
アドリアマイシンリポソームＰＬＤ６０の製造
薬物を負荷する工程時にミトキサントロンをアドリアマイシンへと置換し、他の工程は実施例２と同一にした。得られたリポソームをＰＬＤ６０と命名した。

第２部：異なるリポソーム製剤の薬物放出
実施例９
アドリアマイシンリポソームＰＬＤ６０とミトキサントロンリポソームＰＬＭ６０との間の薬物放出の相違
本実施例では、ミトキサントロン及びアドリアマイシンをｐＨ勾配下で負荷した。或る特定濃度の塩化アンモニウムを放出媒体に添加した場合、遊離アンモニア分子が、勾配のの助けを借りて、リポソームの内相へと拡散するため、内相のｐＨが上昇し、内相のプロトン化された薬物が、膜を通じて拡散することができるその中性体へと変換される。この過程により、その間、リポソームの内相における沈殿の溶出が促進され得る。薬物放出の速度は、沈殿の溶出及びリポソームの膜透過性の両方で制御した。薬物放出の条件は以下の通りとした。リポソームを放出媒体で２５倍に希釈した。放出媒体は等張とし、ｐＨは７．４、塩化アンモニウムの濃度はそれぞれ２ｍＭ、１０ｍＭ及び４０ｍＭとした。希釈したリポソームを透析管に入れ、３７℃の放出媒体４００ｍＬで、希釈したリポソーム２ｍＬに対して透析を実施した。９６時間後まで異なる時点で分析用の試料を採取した。

得られたデータを回帰分析にかけた。２ｍＭ、１０ｍＭ及び４０ｍＭの塩化アンモニウムを有する放出媒体において、ＰＬＤ６０の薬物放出半減期はそれぞれ、９４．３時間、３１．９時間及び１１．２時間であった。ＰＬＭ６０に関しては、３つの放出媒体で明らかな放出は観察されなかった。ＰＬＤ６０及びＰＬＭ６０の組成及び大きさは異ならないため、薬物放出の速度論的特性の違いは、それらの異なる薬学的特徴に起因する可能性がある。アドリアマイシン及びミトキサントロンは共にアントラサイクリン系抗生物質であり、これらは、アドリアマイシンが生理的ｐＨで１つの解離基を含有するのに対し、ミトキサントロンは、生理的ｐＨで２つの解離基（ｐＫａ＝８．１５）を含有する点で相違している。本実施例は、能動的負荷方法を用いると、ミトキサントロン等の複数の解離基を有する薬物が対イオンと複合沈殿を形成する可能性があり、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの薬物の放出が有意に遅延することを例示している。一方、アドリアマイシン等の１つの解離基しか有しない薬物は、小型のリポソームを用いると、血漿を含まない放出媒体中であっても極めて迅速に放出される可能性がある。

実施例１０
大きさの異なるミトキサントロンリポソームの放出挙動
２つの放出条件を採用して、大きさの異なるミトキサントロンリポソームの放出挙動を比較した。

放出条件１：リポソームを放出媒体で２５倍に希釈した。５０％ヒト血漿を含有する放出媒体をグルコースで等張に調整し、ｐＨ７．４とした。他の条件は実施例９と同一とした。得られたデータを回帰分析にかけた。結果から、ＰＬＭ６０の放出半減期が５６．４時間であるのに対し、ＰＬＭ８５は同一条件下で有意に放出されないことが示された。

放出条件２：５０％ヒト血漿及び２０ｍＭ塩化アンモニウムを含有する放出媒体を使用し、他の条件は実施例９と同一とした。得られたデータを回帰分析にかけた。結果から、ＰＬＭ６０の放出半減期が２６．２時間であるのに対し、ＰＬＭ８５の放出半減期は３６．７時間であることが示された。

本実施例から、リポソームの大きさを小さくすることによって薬物の放出を有意に高めることができることが十分に示された。

実施例１１
膜組成の異なるミトキサントロンリポソームの放出挙動
実施例９に記載したものと同一の放出条件を使用した。結果から、ＰＬＭ６０−ＤＰＰＣの放出半減期が１１６時間、ＰＬＭ６０−ＤＭＰＣの放出半減期が２６時間、ＰＬＭ６０−ＤＭＰＣ−０．１の放出半減期が１５時間であることが示された。本実施例から、相転移温度Ｔｍが低めのリン脂質を使用すると薬物放出を促進することができることが示された。しかしながら、薬物の放出が過度に促進されると、薬物の毒性も過度に増大する可能性があり、このことは、以下の実施例でさらに確認した。

第３部：ｉｎ ｖｉｖｏでの薬物動態
実施例１２
昆明マウスにおけるＰＬＭ６０の薬物動態挙動及びＰＬＭ６０と遊離ミトキサントロンとの間の比較
本実施例は、体重約２０ｇの雄性昆明マウスで実施した。異なる用量レベルのミトキサントロンをマウスの尾静脈から注射した。ＰＬＭ６０の投与量は１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ及び４ｍｇ／ｋｇとし、遊離ミトキサントロン（ＦＭ）の投与量は２ｍｇ／ｋｇとした。血漿試料を異なる時点で採取した。血漿試料を加工及び検出する方法は、文献：Methods in enzymology, Vol: 391, p176-185に記載されたものである。結果を表１及び図１
に示した。ここで、ミトキサントロンの半減期は、リポソームの封入によって有意に延長することが明確に示された。同一投与量で、ＰＬＭ６０の血液循環中での保持時間はＦＭの３２倍であり、ＡＵＣはＦＭの３７００倍であった。用量に対してＡＵＣをプロットすることにより、ＰＬＭ６０がｉｎ ｖｉｖｏで線形の薬物動態を有することが示された。

実施例１３
腫瘍保持マウスにおけるＰＬＭ６０及びＦＭの組織分布
腫瘍保持マウスにおけるＰＬＭ６０とＦＭとの間に組織分布の明らかな相違があった。本実施例では、体重約２０ｇの雄性昆明マウスを使用した。マウスの右腋下に５×１０^５の分量でＳ−１８０肉腫細胞を接種した。腫瘍が０．４ｇ〜０．７ｇまで増殖した際に、薬物をマウスの静脈から注射した。薬物の投与後、マウスを様々な時点で殺し、その組織を取り出して、ミトキサントロンの濃度を求めた。組織には、心臓、肝臓、脾臓、肺、腎臓、腸、骨髄及び腫瘍が含まれた。結果から、ＰＬＭ６０が腫瘍組織に対して非常に明確に標的化されていることが示された。詳細データを表２及び図２に示した。

実施例１４
異なるリポソーム製剤の薬物動態比較
本実施例で使用した動物は実施例１２と同様であった。ＰＬＭ６０−ＤＰＰＣ、ＰＬＭ６０−ＤＭＰＣ−０．１及びＰＬＭ６０−ＤＭＰＣをマウスの尾静脈から４ｍｇ／ｋｇで注射した。データを表３及び図３に示した。リポソーム薬物の薬物動態は、リポソーム膜の組成の変化に伴い有意に変化することが示された。ｉｎ ｖｉｖｏでのＰＬＭ６０−ＤＰＰＣ、ＰＬＭ６０−ＤＭＰＣ−０．１及びＰＬＭ６０−ＤＭＰＣのＭＲＴ値はそれぞれ、１４．２２時間、７．９１４時間及び１０．１２３時間であった。ＰＬＭ６０−ＤＰＰＣ及びＰＬＭ６０−ＤＭＰＣは、リン脂質の炭化水素鎖の長さがそれぞれ１６炭素及び１４炭素である点で相違した。アシル鎖の長さは、リン脂質二重層の膜透過性に有意に影響を及ぼし得る。ＤＰＰＣの相転移温度は４１℃であり、ＤＭＰＣの相転移温度は２３℃であった。ＰＬＭ６０−ＤＭＰＣ−０．１及びＰＬＭ６０−ＤＭＰＣは、ＰＥＧ化の程度で相違した。血漿中でのリポソーム薬物の放出は、２つの因子によって決まる：１つはリン脂質二重層を通じたリポソーム薬物の放出であり、もう１つはリポ蛋白及び細網内皮系（ＲＥＳ）による排除である。ＰＬＭ６０−ＤＭＰＣ−０．１のＰＥＧ化は完全ではないため、血漿構成成分によって引き起こされる放出の方がそれに対してより影響が大きかった。

第４部：異なる製剤の毒性の比較
実施例１５
ＰＬＭ６０とＦＭとの間の急性毒性の比較
体重１８ｇ〜２２ｇの昆明マウス１００匹（雄性半分、雌性半分）を１０個の群に分け、各群は１０匹（雄性半分、雌性半分）とした。群１〜群５のマウスには、異なる用量レベルのＦＭを投与したのに対し、群６〜群１０のマウスには等価な用量レベルのリポソーム薬物を投与した。体重変化を観察し、各動物の死亡時間を記録した。死亡した動物を解剖及び剖検した。すべての群の結果を表４に示すが、これによりＰＬＭ６０の急性毒性がＦＭよりもはるかに低いことが示された。

実施例１６
異なるリポソーム製剤の急性毒性比較
体重１８ｇ〜２２ｇの雄性Ｂａｌｂ／ｃマウス９０匹を９つの群に分け、各群は１０匹とした。群１のマウスには、ＦＭを６ｍｇ／ｋｇで投与したのに対し、他の８群のマウスにはそれぞれ、ＰＬＭ６０、ＰＬＭ６０−ＤＰＰＣ及びＰＬＭ６０−ＤＭＰＣ−０．１及びＰＬＭ６０−ＤＭＰＣを６ｍｇ／ｋｇ及び１２ｍｇ／ｋｇで投与した。体重変化を観察し、各動物の死亡時間を記録した。死亡した動物を解剖及び剖検した。ＦＭ群及びリポソーム薬物群のマウスの死亡に関する結果を表５に示した。本実験から、急性毒性の順番は、ＰＬＭ６０＜ＰＬＭ６０−ＤＰＰＣ＜ＰＬＭ６０−ＤＭＰＣ−０．１ ＦＭ＜ＰＬＭ６０−ＤＭＰＣであることが示された。本実験からも、薬物の放出が、小型の単層膜小胞及び二重層の組成としてのＴｍが低めのリン脂質、例えば、ＰＬＭ６０−ＤＭＰＣの使用によってさらに促進され、それによりｉｎ ｖｉｖｏでより大きな毒性を生じ得ることが確認された。なお、ＰＥＧ化が不完全なリポソームの毒性は、より完全にＰＥＧ化されたリポソームの毒性よりも低かった。これは、血液循環時のリポ蛋白の作用及び免疫系の攻撃の下、ＰＥＧ化が不完全なＰＬＭ６０−ＤＭＰＣ−０．１は、ＰＬＭ６０−ＤＭＰＣよりも早く薬物を放出し、重要組織で突然放出することがなく、それにより毒性がより低くなることに起因する可能性があるが、ＰＬＭ６０−ＤＭＰＣ−０．１の毒性は依然として、遊離ミトキサントロンの毒性とほぼ等価であった。

実施例１７
大きさの異なるリポソーム製剤の毒性比較
体重１８ｇ〜２２ｇの雄性Ｃ５７マウスを、ＰＬＭ６０、ＰＬＭ８５及びＰＬＭ１００の毒性比較に使用した。用量は９ｍｇ／ｋｇとした。結果から、３つのリポソーム製剤が引き起こす体重変動は等価であることが示され、これにより３つのリポソーム製剤には実験条件下での毒性に有意差がないことが確認された。ＦＭ群のマウスでは、体重が３０％超減少し、約２０％のマウスが死亡した。

第５部：ｉｎ ｖｉｖｏでの抗腫瘍効果
実施例１８
Ｓ−１８０肉腫に対するＰＬＭ６０及びＦＭの治療効果の比較
７日前にＳ１８０腫瘍細胞を接種した腹水腫瘍保持マウスを断首により殺し、乳状で粘性のある腹水を抽出し、ＲＰＭＩ １６４０培地で希釈した。希釈後、腫瘍細胞数を２．５×１０^６細胞／ｍｌに調整した。約５×１０^５個の腫瘍細胞を含有する腫瘍細胞懸濁液０．２ｍＬを、体重１８ｇ〜２２ｇの雄性ＫＭマウスの前肢腋下組織に接種した。接種後、残りの腫瘍細胞懸濁液中の細胞を光学顕微鏡下で計数したところ、生存腫瘍細胞は９５％を超えていた。接種したマウスの数は８０匹であった。

接種７日後、直径約５ｍｍの明確な腫瘍を有する３９匹のマウスを選択し、腫瘍体積及び体重の両方で５つの群（すなわち、ブランク対照群は７匹、４ｍｇ／ｋｇ ＰＬＭ６０群、６ｍｇ／ｋｇ ＰＬＭ６０群、４ｍｇ／ｋｇ ＦＭ群及び６ｍｇ／ｋｇ ＦＭ群はそれぞれ８匹ずつ）に分けた。マウスには静脈内注射によって投与した。

投与後、マウスは正常に発育した。腫瘍直径をノギスで週３回測定し、体重を同時に測定した。腫瘍体積（ＴＶ）は、以下の式を用いて算出した：Ｖ＝１／２×ａ×ｂ^２（式中、ａ及びｂはそれぞれ、長さ及び幅である）。腫瘍体積は、測定結果を用いて算出した。マウスを接種後２１日目に断首により殺し、腫瘍を取り出し、秤量した。腫瘍阻害率（％）は、以下の式を用いて算出した：腫瘍阻害率＝（１−薬物群の平均腫瘍重量／対照群の平均腫瘍重量）×１００％。実験結果はｔ検定により検定した。

表６は、Ｓ１８０固形腫瘍の増殖が４ｍｇ／ｋｇ ＰＬＭ６０群及び６ｍｇ／ｋｇ ＰＬＭ６０群で有意に抑制されたことを示す。

実施例１９
Ｌ１２１０腹水モデルに対するＰＬＭ６０及びＦＭの治療効果
７日前にＬ１２１０腹水腫瘍細胞を接種した腹水腫瘍ＢＤＦ１マウスを断首により殺し、乳状で粘性のある腹水を無菌条件下で抽出し、ＲＰＭＩ １６４０培地で希釈した。希釈後、腫瘍細胞数を２．５×１０^６細胞／ｍｌに調整した。約５．０×１０^５個の腫瘍細
胞を含有する腫瘍細胞懸濁液０．２ｍＬを、７週齢〜８週齢の雌性ＢＤＦ１マウスの腹腔内に接種した。接種後、残りの腫瘍細胞懸濁液中の細胞を光学顕微鏡で計数したところ、生存腫瘍細胞は９５％を超えていた。

２４時間後、マウスを体重によって８つの群に分け、ＦＭを２ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ及び８ｍｇ／ｋｇで、ＰＬＭ６０を２ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ、６ｍｇ／ｋｇ及び８ｍｇ／ｋｇでマウスの尾静脈から２０ｍｌ／ｋｇの容量で注射によりそれぞれ投与した。投与後、マウスは正常に発育した。それらの体重を週３回測定し、各マウスの死亡時間を観察及び記録し、生存時間を算出した。生存時間平均値（ＭＳＴ）及び生存時間中央値を用いて、各群の生存時間を評価した。実験観察は、接種後６０日間継続した。

データをＳＰＳＳ １１．５統計ソフトウェアで解析した。結果から、すべての投与群が、対照群と比較して、生存時間の有意な増大を示し、ＰＬＭ６０（８ｍｇ／ｋｇ）群が、同一用量のＦＭ群と比較して、治療の有意な改善を示すことが示された（Ｐ＜０．０５）。結果を表７に示した。

実施例２０
Ｌ１２１０肝臓転移モデルに対するＰＬＭ６０及びＦＭの治療効果
７日前にＬ１２１０腹水腫瘍細胞を接種した腹水腫瘍ＢＤＦ１マウスを断首により殺し、乳状で粘性のある腹水を無菌条件下で抽出し、ＲＰＭＩ １６４０培地で希釈した。希釈後、腫瘍細胞数を２．５×１０^５細胞／ｍｌに調整した。約５．０×１０^４個の腫瘍細胞を含有する腫瘍細胞懸濁液０．２ｍＬを、７週齢〜８週齢の雄性ＢＤＦ１マウスの静脈内に接種した。接種後、残りの腫瘍細胞懸濁液中の細胞を光学顕微鏡下で計数したところ、生存腫瘍細胞は９５％を超えていた。合計６２匹のマウスを接種した。

２４時間後、マウスをグループ分けし、投与した。投与後、マウスは正常に発育した。マウスの体重を週３回測定し、各マウスの死亡時間を毎日観察及び記録し、生存時間を算出した。実験観察は、接種後６０日間継続した。

結果から、対照群のすべてのマウスは、接種後１１日目〜１４日目に死亡し、３つのＦＭ用量レベル群のすべてのマウスは、接種後１１日目〜１７日目に死亡し、２ｍｇ／ｋｇ
ＰＬＭ６０群のすべてのマウスは、接種後１５日目〜２９日目に死亡し、６ｍｇ／ｋｇ
ＰＬＭ６０群のマウスは１匹だけが、接種後３９日目に死亡し、８ｍｇ／ｋｇ ＰＬＭ６０群のマウスは、観察中に死亡しないことが示された。

データをＳＰＳＳ １１．５統計ソフトウェアで解析した。結果から、６ｍｇ／ｋｇ ＦＭ群及びすべてのリポソーム薬物群が、ブランク対照群と比較して、マウスの生存時間の有意な増大を示すことが示された。同一用量レベルで、リポソームミトキサントロンは、遊離ミトキサントロンと比較して、マウスの生存時間の有意な増大を示した。結果を表８に示した。

実施例２１
Ｌ１２１０腹水腫瘍に対する大きさの異なるリポソームミトキサントロンの治療効果
実験スキーム及びデータ加工様式は実施例１９と同一とした。対照群、ＦＭ群、ＰＬＭ６０群、ＰＬＭ８５群及びＰＬＭ１００群を含む５つの群を用意した。各群のマウスに対する投与量は４ｍｇ／ｋｇとした。結果を表９に示した。この結果から、リポソームの大きさが小さいほど、良好な治療効果を有することが示された。

本発明の幾つかの好ましい実施例を上記に記載しているが、これらの実施例は、決して本発明の範囲を限定するものではない。本文中に記載及び例示したもの以外にも、当業者は、本発明の開示内容を通読することにより、本発明の他の修飾形態及び変形形態及び変更形態を明確に理解し、それらはすべて本発明の保護範囲に包含されるものとする。引用するすべての特許、公開特許出願及び刊行物は、それらの全文が本文中に援用されるような形で、本明細書中に参照により援用される。

Claims (19)

1. 大きさが約３０〜８０ｎｍであり、且つリン脂質二重層中にＴｍが体温よりも高いリン脂質を含有し、それによりリポソームの相転移温度が体温よりも高く、該リン脂質が、好ましくは、ホスファチジルコリン、水素添加大豆ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）、水素添加卵黄ホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）若しくはジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）又はそれらの任意の組合せから選択される、リポソーム製剤。
2. 前記リン脂質二重層中の前記Ｔｍが体温よりも高いリン脂質が、リン脂質の合計含量に対して、５０〜１００ｍｏｌ／ｍｏｌ％、好ましくは５５〜９５ｍｏｌ／ｍｏｌ％、より好ましくは６０〜９０ｍｏｌ／ｍｏｌ％である、請求項１に記載のリポソーム製剤。
3. 前記リン脂質二重層が、必要に応じて、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）等のＴｍが体温以下であるリン脂質等のさらなるリン脂質を含む、請求項１に記載のリポソーム製剤。
4. 必要に応じて、コレステロールを、前記リポソーム製剤中の成分の合計含量に対して、５〜５５ｍｏｌ／ｍｏｌ％、とりわけ１０〜５０ｍｏｌ／ｍｏｌ％、特に１５〜４５ｍｏｌ／ｍｏｌ％、より詳細には２０〜４０ｍｏｌ／ｍｏｌ％等、２〜６０ｍｏｌ／ｍｏｌ％の量で含む、請求項１に記載のリポソーム製剤。
5. 必要に応じて、ＰＥＧ修飾ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ）、ＰＥＧ修飾ジステアロイルホスファチジルグリセロール（ＤＳＰＧ−ＰＥＧ）、ＰＥＧ修飾コレステロール（ｃｈｏｌ−ＰＥＧ）、ポリビドン修飾ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ−ＰＶＰ）、ＰＥＧ修飾ジステアロイルホスファチジルグリセロール（ＤＳＰＧ−ＰＶＰ）若しくはＰＥＧ修飾コレステロール（ｃｈｏｌ−ＰＶＰ）又はそれらの任意の組合せ等から選択され得る親水性ポリマーで修飾された脂質等の、前記リポソーム製剤の表面特性をさらに修飾する賦形剤等の、さらなる賦形剤を、前記リン脂質のモル数に対して、好ましくは、０．３〜１８ｍｏｌ／ｍｏｌ％、０．５〜１５ｍｏｌ／ｍｏｌ％、０．８〜１２ｍｏｌ／ｍｏｌ％、１〜１０ｍｏｌ／ｍｏｌ％、２〜８ｍｏｌ／ｍｏｌ％、２．５〜７ｍｏｌ／ｍｏｌ％又は３〜６ｍｏｌ／ｍｏｌ％等の０．１〜２０ｍｏｌ／ｍｏｌ％の量（該量は、前記リポソームに対して、好ましくは約１〜３０ｍｏｌ／ｍｏｌ％、３〜２８ｍｏｌ／ｍｏｌ％、５〜２５ｍｏｌ／ｍｏｌ％又は８〜２０ｍｏｌ／ｍｏｌ％、とりわけ１０〜２０ｍｏｌ／ｍｏｌ％である）で含む、請求項１に記載のリポソーム製剤。
6. 大きさが３５〜７５ｎｍ、好ましくは４０〜７０ｎｍ、とりわけ４０〜６０ｎｍである、請求項１に記載のリポソーム製剤。
7. 水素添加大豆ホスファチジルコリン、コレステロール及びＰＥＧ修飾ジステアロイルホスファチジルエタノールアミンを３：１：１の重量比で含み、該ＰＥＧ修飾ジステアロイルホスファチジルエタノールアミンが、好ましくはＰＥＧ２０００修飾ジステアロイルホスファチジルエタノールアミンである、請求項１に記載のリポソーム製剤。
8. 請求項１〜７のいずれか一項に記載のリポソーム製剤中に薬物を含み、該薬物が、好ましくは多価イオン性薬物である、リポソーム薬物。
9. 前記薬物が、解離定数ｐＫａが４．５〜９．５、好ましくは５．０〜９．５、より好ましくは５．５〜９．５、とりわけ６．０〜９．０、特に６．５〜９．０である２つ以上の
   解離基を有することを特徴とする、請求項８に記載のリポソーム薬物。
10. 前記多価イオン性薬物が、ミトキサントロン、ビンクリスチン、ビノレルビン若しくはビンブラスチン又はそれらの任意の組合せ等の抗癌薬、好ましくはミトキサントロンである、請求項８に記載のリポソーム薬物。
11. 前記薬物の量が、前記リポソーム薬物の合計重量に対して、０．１〜５０ｗｔ％、好ましくは０．５〜４０ｗｔ％、より好ましくは１〜３５ｗｔ％、とりわけ好ましくは３〜３０ｗｔ％又は５〜２５ｗｔ％又は８〜２０ｗｔ％である、請求項８〜１０のいずれか一項に記載のリポソーム薬物。
12. 必要に応じて、１つ若しくは複数のさらなる医薬成分、並びに／又は薬学的に許容される担体及び／若しくは賦形剤を含む、請求項８〜１０のいずれか一項に記載のリポソーム薬物。
13. 前記リポソームが、内部に、対イオン、好ましくは、以下の飽和若しくは不飽和の有機酸：クエン酸、酒石酸、フマル酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、リンゴ酸及びマレイン酸等の酸アニオン等の有機酸アニオン；硫酸アニオン、リン酸アニオン等の無機酸アニオン；又はシスチン等のアミノ酸のイオン体等の多価対イオン；好ましくは、クエン酸アニオン、硫酸アニオン又はリン酸アニオンを含む、請求項８に記載のリポソーム薬物。
14. 前記多価対イオンが、前記有効薬物成分とは反対の２以上の電荷を保有する、請求項１３に記載のリポソーム薬物。
15. 前記リポソームが、ホスファチジルコリン、水素添加大豆ホスファチジルコリン、水素添加卵黄ホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン若しくはジステアロイルホスファチジルコリン又はそれらの任意の組合せを含む、請求項８〜１０のいずれか一項に記載のリポソーム薬物。
16. 請求項８〜１５のいずれか一項に記載のリポソーム薬物を製造する方法であって、（１）Ｔｍが体温よりも高いリン脂質、並びに必要に応じてさらなるリン脂質及び／又はコレステロールを用いてリポソームを製造する工程と、（２）前記リポソーム中に目的とする薬物、とりわけ多価イオン性薬物を封入する工程とを含む、方法。
17. 患者における疾患、とりわけ腫瘍を治療する方法であって、請求項８〜１５のいずれか一項に記載のリポソーム薬物を、治療を必要とする該患者に投与することを含む、方法。
18. 前記患者を放射線温熱療法等の温熱療法によって治療することをさらに含む、請求項１７に記載の方法。
19. 腫瘍を有する患者を治療する薬剤の製造における、請求項１〜７のいずれか一項に記載のリポソーム製剤又は請求項８〜１５のいずれか一項に記載のリポソーム薬物の使用。

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