JPS63112512A - リポソ−ム製剤およびその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明はリボソーム製剤およびその製造法に関する。

従来の技術 薬物を封入したリボソームを静脈内投与し、体内の限定
された：πく位に薬物をターゲットさせろＤｒｕｇ　　
Ｄｅｌｉｖｅｒｙ　　Ｓｙｓｔｅｍ　　（Ｄ　Ｄ　Ｓ　
）はすてに−膜化されている　［ジ・グレゴリアゾイス
ら皆；リセプター・メディエイテソド・ターゲツティン
グ・オブ・ドラッグス、ブレナム・プレス（Ｇ。

ＧｒｅｇＯｒｉａｄｉＳ　　Ｏｔ　　ａｌ、、　　Ｒｅ
ｃｅｐｔｏｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄｔａｒｇｅｔｉｎｇ　
　ｏｆ　　ｄｒｕｇｓ、　　Ｐｌｅｎｕｍ　　Ｐｒｅｓ
ｓ、　　ＮｅｗＹｏｒｋ、Ｉ）２４３−２６６　　（１
９８０）］。そのようなりＤＳにおいてまず第一義的に
要求されるリボソームの特性は静脈内投与されたリボソ
ームがより長時間安定に血液とともに体内を循環するこ
とである。本来リボソームは、その膜成分である脂質と
血液中のリボブロテイノなとの成分とのインターラクシ
ョンにより、血液中ではそれほど安定ではない。また、
静脈内投与されｆこリボソームはその物理的形状や生化
学的特性によって、網内系（ＲＥｓ）により異物として
認識され血中から’ｉＮｉ失しやすい特性を持つ。その
ため静脈内投与されたリボソームの血中からの消失は期
待に反して速い。

従って、いかに血中てのリボソームの安定化をはかり、
ＲＥＳによる認識を回避さけて、リボソームの血中から
の消失時間を延長させろかが、従来より重要な検討課題
とされてきた。例えば、リボソームの膜組成にコレステ
ロールを添加することにより血中でのリボソームの安定
性を増大させる報告がある［シ・ジ・ナイト著、「リボ
ソーム；物理構造から治療的応用までｊ　　（Ｃ，Ｇ、
　　Ｋｎｉｇｈｔ。

Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ　；　　ｆｒｏｍ　　ｐｈｙｓｉｃ
ａｌ　　５ｔｒｕｃｔｕｒｅｔｏ　　ｔｈｅｒａｐｅｕ
ｔｉｃ　　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”、Ｅｌｓｅｖｉ
ｅｒ。

Ｎｏｒｔｈ　　ｌ１ｏｌｌａｎｄ　　ｐ３１０−３１１
（１９８１）］。

しかしその添加効果はｂともと用いられているリボソー
ムの膜組成に依存して大きく異なるといえる［バイオチ
ミカ・工・バイオフイジカ・アクタ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉ
ｃａ　　ｅｔ　　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ　　Ａｃｔａ）
８３９．１−８　　（１９８５）］。またこれとは別に
リボソームの膜組成にジアール基を有する糖蛋白を用い
てリボソームの膜表面をジアール酸で被覆することによ
りＲＥＳへの分布が抑えられるという報告がある［ケミ
カル・アンド・ファーマシュティカル・プラタン（Ｃｈ
ｅｍ、　　Ｐｈａｒｍ’、　　Ｂｕｌｌ、）。

旦、　　２９７９−２９８８（１９８６）’）。また、
それとは反対にそのようなジアール酸を有する糖脂質が
ＲＥ　Ｓのひとつである肝臓によく分布するという報告
もある（　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ　　ｅｔ　Ｂｉｏｐｂ
ｙｓｉｃａＡｃｔａ、　　±９７．　７６０−７６５　
　（１９７７））。

一方、これまでに硫酸基を打する糖脂質の一つであるス
ルファチドを用いて、薬物の血液脳関門（ＢＢバリアー
）透過性をあげて薬物を脳内にターゲットさせた報告が
ある（バイオケミストリー・インターナ７ョナル（Ｂｉ
ｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ
）。

１．２６７−２７２（１９８４）、特開昭５７−１４６
７１０）。すなわちスルファチドを構成成分として調製
したリボソームは、スルファチドを含まないコントロー
ルリボソームでは認められない（ｆ怠に高いＢＢバリア
ー透過性を示した。しかしＲＥＳへの分布の指標となる
肝臓への薬物の分布はスルファチド添加によってかえっ
て増大する傾向を示した。このようなスルファチドの効
果は、膜組成として、不飽和のアシル基を有する天然の
ホスファチノルコリンとコレステロールの組合せにおい
てえられたしのである。

発明が解決しようとする問題、張 リボソームＶ、組成を改質することにより、静脈内投与
後の血中からの消失時間を延長させろ効果的でかつ実用
性の高い手段はまた開発されていない。

間ｍ点を解決するための手段 上記の状況に鑑み、本発明者等は静脈内投与されたリボ
ソームが、より長時間、安定に血液とと乙に体内に循環
させるための方法をリボソーム膜組成に膜数質成分を添
加して膜を改質することに乙とめて、種々検討した結果
、本発明を完成した。

すなわち、本発明は、■）アシル基が飽和アシル基であ
るリン脂質と硫酸基を有する糖脂質とを膜構成成分とす
るリボソーム内に薬物を封入してなるリボソーム製剤お
よび２）薬物を封入してなるリボソーム製剤の製造に際
し、アシル基が飽和アシル基であるリン脂質と硫酸基を
有する糖脂質とを用いてリボソート膜を構成させること
を特徴と才ろリボソーム製剤の製造法、である。

本発明のリボソーム製剤の製造に用いられるリン脂質と
しては、アシル基が飽和アシル基であるグリセロリン脂
質あるいはスフィンゴリン脂質があげられる。本すン指
質としては、たとえばその２個のアシル基が炭素数８以
上の飽和アルキルであり、少なくともその一方が炭素数
１０以上、好ましくは１２〜１８の飽和アルキル基であ
るものがあげられる。さらに両方の飽和アシル基が炭素
数１２〜１８の飽和アルキルであるものがより好ましく
用いられる。このようなリン脂質としては、動植物起源
のレシチン（例、卵黄レシチン、大豆レシチン）に水素
添加して得られろ水添レシチンやラウリル、ミリストイ
ル、バルミトイル、ステアロイルなどの組合４からなる
半合成によりえられるホスファチノルコリン、ホスファ
デジルエタノールアミン、ホスファチノルセリン、ホス
ファデジルグリセロール、ホスファデジルイノシトール
、スフィンゴミエリンなどがあげられる。ざらに具体的
には、それぞれの相転移温度の実測値が（）内で示され
るような、シミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭ
ＰＣ，２３，９℃）、パルミトイルミリストイルホスフ
ァチジルコリン（ＰＭＰＣ。

２７．２℃）、ミリストイルバルミトイルホスファチジ
ルコリン０，４Ｐ　Ｐ　Ｃ，３５、３°Ｃ）、ジパルミ
トイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ，４１，４℃）
、ステアロイルバルミトイルホスファチジルコリン（Ｓ
ＰＰＣ，４４，０６Ｃ）、バルミトイルステアロイルホ
スファチジルコリン（ＰＳＰＣ。

４７．４°Ｃ）、ジステアロイルホスファチジルコリン
（ＤＳＰＣ，５４，９°Ｃ）、シミリストイルホスファ
デジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ、５０℃）、ジパル
ミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ、
６０°Ｃ）、ジステアロイルホスファチジルエタノール
アミン（ＤＳＰＥ、６０℃以上）、シミリストイルホス
ファチジルセリン（ＤＭＰＳ。

３８６Ｃ）、ジパルミトイルホスファチジルセリン（Ｄ
ＰＰＳ、５１０Ｃ）、ジステアロイルホスファチジルセ
リン（ＤＳＰ８．５０°Ｃ以上）、シミリストイルホス
ファデジルグリセロール（ＤＭＰＧ、２３°Ｃ）、ンパ
ルミトイルホスファチジルグリセ凸−ル（Ｄ　Ｐ　Ｐ　
Ｇ、４１　’Ｃ）、ジステアロイルホスファチノルグリ
セロール（ＤＳ、ＰＣ，５５°Ｃ）、ジパルミトイルス
フィンゴミエリン（Ｄ　Ｐ　Ｓ　Ｍ、４１　’Ｃ）、ノ
ステアロイルスフィンゴミエリン（ＤＳＳＭ。

５７℃）などがあげられる。リン脂質は単独で用いてら
よく併用してもよい。

次に、本発明のリボソーム製剤に用いられる硫酸基を有
する糖脂質としては、硫酸エステルを含むスルファトス
フィンゴ糖、例えばスルファチド［相転移温度は３４．
８℃および４７．３℃、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ　　ａｔ
　　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ　　Ａｃｔａ　、　　８５９
　。

２４Ｇ−２５６（１９８６）］やラクトンルスルファヂ
ドなど、まＬは硫酸エステルを含むスルファトグリセロ
糖脂質、例えばセミノリピッドやスルホグリセロ糖脂質
などがあげられろ。なかでもスルファチドが好ましく用
いられろ。

本発明においては、上記のようなリン脂質および糖脂質
を構成成分としてリボソーム膜を構成させる。

本発明におけるリン脂質と糖脂質の使用割合は、一般に
リン脂質の１００重量部に対し糖脂質を約０５〜５０重
量部、好ましくは約２〜２０重量部である。

本リボソーム膜は、その相転移温度か一般に約３７〜６
０℃、好ましくは約４０〜５５℃を示すように調製され
る。この相転移ｌ益度の調整は、用いるリン脂質および
糖脂質の各種類や配合割合などを適宜に選択ずろことに
よって行なうことができろ。

一般にリボソーム膜の相転移温度は用いられる側々の脂
質の相転移温度を重は比例配分して求められる理論的相
転移温度に近いので［文献、　Ｃ，Ｑ。

Ｋｎｉｇｈ５　”　Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ　；　ｆｒｏｍ
　　ｐｈｙｓｉｃａｌＳｔｒＬＩＣｌＵｒ（！　　ｔｏ
　　ｔｈｅｒａｐｅｕｔｌｃ　　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏ
ｎｓ”。

Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、　　Ｎｏｒｔｈ　　１ｌｏｌｌａｎ
ｄ　　ｐ３１０−３１１（１９８１）ｌ、この関係を用
いて、希望する膜の相転移温度となるように脂質組成を
選ぶことができる。

通常、上記のような使用割合にすることにより膜の相転
ｆ多温度を」二足に示すよう体範囲に調整することがで
き、得られるリボソーム製剤の血中での消失時間を長く
するという本発明の目的が達せられる。本リボソームの
調製に際しては、本発明の目的を阻害しない範囲におい
て、抗酸化剤等の安定化剤やその他の添加物（例、浸透
圧調整剤としての糖類）を用いてもよい。

本発明はリボソーム膜の構成成分として上記のようなリ
ン脂質および糖脂質を用いることが特徴であって、リボ
ソーム製剤の製法自体には公知の技術が用いられろ。例
えば、飽和アンル基を存するリン脂質と硫酸基を有する
糖脂質を含む上記リボソーム膜構成成分をジエヂルエー
テル、イソプロピルエーテル、またはクロロポルムなど
の有機溶媒に溶解した後、さらに薬物水溶液を加えて乳
化し、Ｗ１０型エマルジョンをえて、７１０℃以上の温
度の減圧下で有機溶媒を蒸発除去してリバースフェーズ
エバボレイションヘンクル（ＲＥＶ）をえることができ
る。また」二足脂質有機溶媒溶液のＹＴ賎溶媒を減圧下
で蒸発除去して薄膜とした後に、薬物溶液を加えて、４
０°Ｃ以上の温度で、見合することによって、マルチラ
メラ−ベシクル（ＭＬＶ）をえることができる。またさ
らに、ＭＬＶをプローブ型超音波振イコ機で振丑するこ
とによってスモールユニラメラ−ベンクル（ＳＵＶ）を
えることができる。さらに他のリボソーム製法としては
ステイブル　ブルリラメラー　ベシクル法（特開昭５９
−００９５２）や、デハイドレインヨン　レハイドレイ
ンヨン　ベンクル法［Ｃ，Ｋｉｒｂｙ　　ｅｔａｔ、、
バイオチクノロノー（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）。

Ｎｏｖ、、　　９７９（１９８４）コが挙げられろ。ま
た上記のように硫酸基を有する糖脂質を有機溶媒に溶解
させるかわりに薬物水溶液に分散して用いることらでき
る。さらに、飽和アシル基を有ずろリン脂質で予じめ薬
物を封入するりボソームを調製した後に、これを硫酸基
を存する糖脂質を含む分散液に加えて加温下で混合する
ことにより、既にできたリボソーム膜に硫酸基を何ずろ
糖脂質を配列さける方法を採用することもてきる。

また脂溶性てあって水への溶解度が低い薬物の場合は、
薬物を」二足脂質有機溶媒溶液に溶かして薬物を封入す
るリボソームをえることができる。

このようにしてえられる薬物を封入したリボソームは必
要とあらば好ましい粒子サイズに調製することかできる
。このリボソームはそのまま使用してらよいが、例えば
、遠心分離、ゲルろ過あるいは透析によって封入されな
いｌｌｉ　＞％ｉの薬物を分離除去した後に使用するの
が好ましい。

次に、本発明において使用される薬物は、ＤＤＳの目的
で使用されろものであれば特に限定されず、親水性薬物
と親油性薬物のいずれかあるいは両者の混合物を用いろ
ことができる。たとえばシスブラチンおよびその誘導体
（例、カルボブラヂン、スピロブラヂン）、アトリヤマ
イシン、マイトマイシンＣ１アクヂノマインン、アトリ
マイシン、プレオマイシン、５−ＦＵ、メトトレキセー
ト え型インターフェロン（α，β、γ）や天然型あるいは
逍伝子組換え型インターロイキン２のようなリンホカイ
ン類、マンガンスーパーオキサイドデスムクーゼ（ＳＯ
Ｄ）あるいはその誘導体であるスーパーオキザイドデス
ムターセＰＥＧ（ＰＥＧー５０００）（特開昭５８−１
６６８５）のような生理活性ペブヂド類、スルファセン
ンのようなベーターラクタム系抗生物質、ゲンタマイシ
ン、ストレプトマイシン、カナマイノンのようなアミノ
配糖体系抗生ｖり質、ンアノコバラミン、ユビキノンの
ようなビタミン類、アンヂモン酸メグルミンのような抗
原虫薬、アルカリホスファターゼ等の酵素剤、ヘパリン
等の抗血液凝固剤、アモキザノクス等の抗アレルギー剤
、ムラミシジペプチド、ムラミルトリペプヂド、ＴＭＤ
−６Ｃｉ　　（Ｇａｎｎ　　７４（２）、１９２〜！９
５（１９８３）のような免疫賦活剤、プロプラノロル、
グルタチオンのような一般薬があげられる。

本発明のリボソーム製剤は一般に水剤あるいは乳剤とし
て治療目的に応じて適宜の量を生理食塩水あるいはリン
酸緩衝生理食塩液等に分散して注射あるいは点滴なとに
より静脈内に投与して用いられる。

実施例 以下に実施例、試験例および実験例をあげて本発明をさ
らに具体的に説明する。なお、以下に用いられるスルフ
ァチドは牛脳より抽出精製してえられたものである。

相転移温度の測定は示差熱分升法によった。

実施例１ ２７０ｍｇのＤＰＰＣ，３０ｍｇのＤＳＰＣおよび３０
ｍｇのスルファチドを１リツターのビーカー内でクロロ
ホルムとイソプコビルエーテルのｌ；１の，見合溶液７
０轍に溶解させた。それにあらかじめ生理食塩液と同じ
浸透圧となるように調製しておいたｐｌ−１７の６−カ
ルポキシフルオレツセイン（６−ＣＦ）溶液を１０１ｎ
１．加えプローブ型超音波振盪機（Ｏｈｔａｋｅ）で乳
化し、Ｗ１０型エマルジョンを作製した。超音波の照射
は５０ワツトの条件で３０秒間、１０回くりかえして行
った。このようにしてえたエマルジョンをロータリーエ
バポレーターにかけて、６０℃、減圧下で有機溶媒を留
去しＲＥＶをえｆこ。エバポレーターの真空度は初めは
高く、何機溶媒の蒸発が進むにつれて真空度をさげて突
ｌ弗しないように調節した。その後さらにＲＥＶ中に残
存する少量の有機溶媒をｇ素ガスをふきつけることによ
り留去した。次いで、えられたＲＥＶに適当量の生理食
塩溶液を加え１０ｄとし、１．２ミクロンのフィルター
（Ａｃｒｏｄｉｓｃ。

Ｇｅ１ｍａｒ＋）でろ過し、透析膜（Ｓｐｅｃｔｒａｐ
ｏｒ、　ＳｐｅｃｔｒｕｍＭｅｄｉｃａｌ）を用いて生
理食塩溶液下で２４時間透析することにより６−ＣＦを
封入したリボソームをえた。さらに、リボソーム中に封
入された６−ＣＦの量を定量することにより（註Ｉ）、
６−ＣＦの封入率は、２２．４％であることがゎがっｆ
こ。また、このリボソーム膜の相転移温度は４２．１℃
であった。

リボソーム０．１蔵をリン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ、
１）Ｈ７，２）で１００倍希釈後、さらに０．０２％）
１，１トンｘ−１００を含有するＰＢＳで１００倍希択
し、６０°Ｃ１３０分加温して、リボソームを破壊し、
その溶液の蛍光強度を測定（日立、Ｆ３０００蛍光スペ
クトロメーター、励起波長４９４　ｎｍ、　ｉｆり定波
長５１５ｎｍ）することによりリボソーム分散液中の総
６−ＣＰ量を求めた。またそれとは別にリボソームＯ，
！−をＰ　Ｂ　Ｓで１００００倍希釈し、その２．５旋
を遠心分離型フィルター（ＣｅｎｔｒｉｓａｒｔＳＳ　
Ｍ　　Ｉ　３２４９　Ｅ　。

５ａｒｔｏｒｉｕｓ）でろ過し、そのろ液の蛍光強度を
測定することにより封入されないでリボソーム分散液中
に残存するＪ雌の６−ＣＦ量をしとめん。

実施例２ 実施例［て用いられる３０ｍｇスルファチドの代わりに
１５ｍｇのスルファチドを用いて、実ＩＩ　例１と同じ
方法で封入率が２３．３％の６−ＣＦを封入し、相転移
温度・１２４℃のリボソームをえ）こ。

実施例３ 実施例１て用いられる３０ｍｇスルファチドの代わりに
４５ｍｇのスルファチドを用いて、実施例１と同じ方法
て封入率が１８．９％の６−ＣＦを封入し、相転移温度
４２，４°Ｃのリボソームをえた。

実施例４ 実施例Ｉで用いられる２７０ｍｇのＤＰＰＣおよび３０
ｍｇのＤＳＰＣの代イつりに、２１０ｍｇのＤＰｐｃお
よび９０ｍｇのＤＳＰＣを用いて、実施例１と同じ方法
で封入率が２９．１％のＧ−ＣＦを封入し、相転移温度
４１，７℃のリボソームをえた。

実施例５ 実施例１て用いられるスルファチドをクロロポルム、イ
ソプロピルエーテルの混合溶液に溶解さＵｏる代わりに
、そこで用いられる６−ＣＦ溶液に分散さけて、実施例
１と同し方法で封入率か１８．８％の６−ＣＦをよ・１
人し、惧転移温度、１２　、１　’Ｃのリボソームをえ
た。

実施例６ ３６０ｍｇのＤＰＰＣ，４０ｍｇのＤＳＰＣおよび１１
０ｍｇのスルファチドを１リツターヒーカー内で、クロ
ロポルム４０ｂＪに溶解させた。さらに、ロータリーエ
バポレーク−を用いて有機溶媒を留去し、カラス壁に指
質薄、膜を形成させた。薄膜中に残存する微岸の有機溶
媒は、窒素ガスをふきつけることにより除去しノこ。こ
のようにして作製した薄膜に、６０℃の、凭度下で、あ
らかじめ６０℃に保っておいた実２旌例１で用いたＧ−
ＣＦ溶液を１０５−加えて、ポルテックスずろことによ
りＭ　Ｌ　Ｖをえた。このようにしてえられたＭ　Ｌ　
Ｖに対して、実施例１で用いられろプローブ型超音波振
付機を用いて超音波の照射を５０ワットの条件て約１０
分間行いＳＵＶをえｆ二。さらに実施例１と同じ方、去
でろ過および透析を行い、封入率が５．５％の６−ＣＦ
を封入し、相転移ｉ：ｌ！１度４２１℃のリボソームを
えた。

実ｉ＋ｉ！ｉ例７ 実施例６て用いられろ３６０ｍｇのＤＰＰＣお上び４０
ｍｇのＤＳＰＣの代イつりに、２８０ｍｇのＤＰｐｃお
よび１２０ｍｇのＤＳＰＣを用いて、実施例６と同じ方
法で封入率が６．０％の６−ＣＦを封入し、相転移温度
４２．ピＣのリボソームをえた。

実施例８ 実施例６で用いられる３６０ｍｇのＤＰＰＣおよび４０
ｍｇのＤ　Ｓ　Ｉ）　Ｃの代イつりに、４００ｍｇのＤ
ＳＰＣを１−Ｔ１１．”で、実施例６と同し方法で封入
率が７０％の６−ＣＦを封入し、相転移温度５２．９°
Ｃのリボソームをえた。

実施例９ 実施例６の方法において、スルファチドを初めからＭ　
Ｌ　Ｖの膜成分とする代わりに、あらかじめスルファチ
ド抜きのＭ　Ｌ　Ｖを実施例６と同じ条件で作製した後
、４０ｍｇのスルファチドを分散する生理食塩液１０ｙ
Ｊを加え６０’Ｃの温度下で約３０分間混合することに
よりＭ　Ｌ　Ｖ膜にスルファチドがスパイクしたＭ　Ｌ
　Ｖを作製し、以下実施例６と同じ方法で封入率が４．
５％の６−ＣＦを封入し、相転移温度４２．１０Ｃのリ
ボソームをえた。

実験例１−１ 上記実施例１，２．３．４および６のリボソームに対し
て、スルファチドを含まないリボソームを作製した。ま
た、実施例Ｉの２７０ｍｇのＤＰＰＣ１３０ｍｇ０′）
ＤＳＰＣおよび３０ｍｇのスルファチドの代わりに、２
５０ｍｇの卵黄レシチン、４０ｍｇのコレステロールお
よび４０ｍｇのスルファチドを用いて実、ＩｉＩ例１と
同じ方法でリボソームを作製した。また、さらにこのリ
ボソームに対してスルファチドを含まないリボソームを
作製した。

実験例１−２ 上記実施例１．２．３．４および６で得られたリボソー
ムと、スルファチドを加えないで同様に調製したリボソ
ームの各０．１−０．５ｄをラットに静脈内投与するこ
とにより血中からのリボソームの消失を調べると（註２
）、第１．２．３．４および５図の結果をえた。これら
の各図に示されろように、スルファチドを含むリボソー
ムの１時間後、２時間後、４時間後および６時間後の血
中濃度はいずれムそれを含まない対照リボソームよりも
高く、それぞれ、平均１１．４．１４．Ｇ、Ｔ５．２お
よび２０９倍となった。一方、卵黄レシチンおよびコレ
ステロールより調製したスルファチドを含むリボソーム
の血中からの消失は、第６図に示されるように対照リボ
ソームと間柱に速いことがわかった。これらの結果が示
すように、リボソームｊｌＱ組成として飽和系のアンル
基を有するリン脂質と硫酸基を有する糖指質を用いる本
発明のリボソームの製法は、リボソームの静脈内投与後
の血液中からの消失時間の延長のために効果的でかつ実
用性の高い手段といえろ。

実験例１−３ 実験例１−２で用いたリボソームをラットに静脈内投与
して１時間後の肝臓中の６ＣＦ＆’３度を測定しリボソ
ームのＲＥＳへの分布を調べろと（註２）、表１の結果
をえた。　これらの結果は、＋１ボソームの血中からの
消失時間が延長し、肝臓などのｎ　ＣＳ−＼の分布か減
少したことを示していた 表１１時間後のリボソームの１ｌＴ−臓中濃度（％）リ
ボソーム　　　スルファチド　スルファチドの種類　　
　　　在り　　　　　　無し実施例１　　　　　　８．
０　　　　３０．１実施例２　　　　　　７．２　　　
　３０．１実施例３　　　　　　７．６　　　　３０．
１実施例４　　　　　１２，４　　　　５９．７実施例
６　　　　　１＝１．２　　　　　＝１４．７卵黄レシ
チン− コレステロール　３２．３　　　　３３．９尾静脈より
えたヘパリン処理血液０．２顧に１０７禮のＰ　Ｂ　Ｓ
を加えた血ｌ夜分散液をえた。さらにこれを遠心分離（
３０００ｒｐｍ、］　００分してえられろ分離上清５轍
にトリトンｘ−ｉｏｏを００５轍加えて６０−７０℃加
温下でリボソームを破壊し、放出される６−ＣＦの蛍光
を４１１定することにより、血中のリボソーム濃度を求
めた。

また開腹脱血後えられた肝臓を０．０２％ｌ・リドンＸ
、−１００を含有するＰＢＳにつ（す、Ｉ　００　ｒｔ
＝１の容積とし組織破壊Ｍ’Ｊ（Ｐｏｌｙｔｒｏｎ、　
　Ｋｉｎｅｍａｔｊｃａ）て組織を破壊し、さらに６０
−７０°Ｃて加温処理した後、６−ＣＦがすべて遊離す
るホモシネ−１・をえた。このホモジネートは超遠心分
離型（５００００ｇ、１０分）した後２０−５０倍希釈
後０．４５ミクロンのメンブランフィルタ−（Ａｃｒｏ
ｄｉｓｋ、　　Ｇｅｌｍａｎ）でろ退役その蛍光を測定
することにより肝臓中のリボソーム濃度をらとめｆこ。

実験例１−４ 」二足実施例１．２．３および１１のリボソームとこれ
らのリボソームに対するスルファチドを含まないリボソ
ームのＰＢＳてｔｏｏｏｏ倍希釈したものの熱放出性を
昇温ンステンムと連結した蛍光測定装置を用いて、リボ
ソームからの６−　ＣＦの放出量を連続的に測定するこ
とにより求め、リボソーム膜の田変化（ゲルから液晶へ
の変化）を調べた。この牧山曲線より求められる熱放出
開始温度は表２の結果となった。

表２　リボソームｊ漠の相転移温度（０Ｃ）とリボソー
ムからの６−ＣＦの熱放出開始温度（°Ｃ）実施例Ｉ（
スルファチド有り）　　　　　　４２，１　　　３７．
２実施例２（スルファチド有り）　　　　　　４２．４
　　　３７．０実施例３（スルファチド有り）　　　　
　　４１．７　　　３５．５実施例１．２．３のスルフ
ァチド無し）　　４２．８　　　３９．０実施例４（ス
ルファチド有り）　　　　　４４．５　　　３７．２実
施例ＩＯ 実施例１で用いられる６−ＣＦ溶液の代わりに、５００
μｇ／藏濃度のシスブラチン（ＣＤＤＰ）生理食塩溶液
を用いて、実施例１と同じ方法でＣＤＤ　Ｉ）の封入率
が２１，５％で、相転移温度・１２．１°Ｃのリボソー
ム製剤をえた。

（註３）リボソーム中のＣＤ　Ｄ　Ｐ含量の測定方法リ
ボソーム０　、１　ｎｒｌを０　、５　ｒｒ＆の生理食
塩溶液に分散させ、その２　、５　ｈａを凍結ならびに
加温処理し、えられｆニリボソームの破壊夜釣２．５雁
をＣｃｎｔｒｉｓａｌｔてろ過し、そのろ液０　、１．
　ｒａにジエチルジヂオカルハメート（ＤＤＴＣ）を１
０％含有するＯ　、　Ｉ　Ｎ　　ＮａＯＩ−ｒ溶液を２
ｍ＋２加え、３０分間室温下で放置後えられるアダクト
をｎ−ヘキサン５藏で抽出して、その抽出、夜をＨＰ　
Ｌ　Ｃ（カラム；２ｏｒｂａｘ　　ＣＮ　、溶液；ｎ−
ヘキサン／イソプロピルアルコール−８／２：ＵＶ−２
５０ｎｍ）で定量し、リボソーム分散液の総ＣＤＤＰ量
をもとめた。またそれとは別に、リボソームの生理食塩
液の残り約２　、５　ｒｎｌｌをＣｅｎｔｒｉｓａｌｔ
でろ過し、同上の条件でアダクトとしてリボソーム分散
中のリボソームに封入されないて存在する遊離のＣＩ）
　Ｄ　Ｐ　ｆｆｔを定量した。

実施例１１ 実施例１０で用いられろＣＤ　Ｉ）　Ｐ溶液の代わりに
６−ＣＦとＣＤＤＰの濃度がそれぞれ２５ｍＭ。

２５０μｇ／ｙｕである混合溶液を用いて、実施例１０
と同し方法で６〜ＣＦおよびＣＤＤＰをそれぞれ封入率
１８．２％および１７．６％で同時に封入し、相転移温
度４２　、１℃のリボソーム製剤をえた。

実施例１２ 実施例１０て用いられる３０ｍｇスルファチドの代わり
に１５ｍｇのスルファチドを用いて、実施例ＩＯと同じ
方法で封入率均相８４％のＣＤ　Ｄ　Ｉ）を封入し、相
転移を語文／１２　　ｌｌ’Ｃのリボソーム製剤をえた
。

実施例１３ 実施例ＩＩで用いられる３０ｍｇスルファチドの代わり
に１５ｍｇのスルファチドを用いて、実施例ＩＩと同じ
方法で６−ＣＦおよびＣＤ　Ｄ　Ｐをそれぞれ封入率１
６．５％および１６．２％で同時ｒ、＝　ｉｆ人し、相
転移温度４２　、１１．　’Ｃのリボソーム製剤をえに
。

実施例１４ 実施例１０で用いられる３０ｍｇスルファチドの代わり
４５ｍｇのスルファチドを用いて、実施例１Ｏと同じ方
法で封入率１９．４％のＣＤＤＰを封入し、相転移温度
４１．７℃のリボソーム製剤をえた。

実施例１５ 実施例ＩＩで用いられる３０ｍｇスルファチドの代わり
に４５ｍｇのスルファチドを用いて、実施例１１と同じ
方法で６−ＣＦおよびＣＤＤＰをそれぞれ封入率１７．
６％および１６．８％で同時に封入し、相転移温度４１
．７°Ｃのリボソーム製剤をえた。

実施例１６ 実施例１Ｏで用いられる２７０ｍｇのＤＰＰＣおよび３
０ｍｇのＤＳＰＣの代わりに、２１０ｍｇのＤＰＰＣお
よび９０ｍｇのＤＳＰＣを用いて、実施例ＩＯと同じ方
法で封入率２３．４％のＣＤＤＰを封入し、を回転移温
度４４，５°Ｃのリボソーム製剤をえた。

実施例１７ 実施例１１て用いられる２７０ｍｇのＤＰＰＣおよび３
０ｍｇのＤＳＰＣの代わりに、２１０ｍｇのＤＰＰＣお
よび９０ｍｇのＤＳＰＣを用いて、実施例１１と同じ方
法で６−ＣＦおよびＣＤＤＰをそれぞれ封入率２１．７
％および１８．１％で同時に封入し、相転移温度４４．
５℃のリボソーム製剤をえた。

実施例１８ 実施例６で用いられる６−ＣＦ溶液の代わりＣＤ　Ｄ　
Ｐ生理食塩溶液を用いて、実施例ＩＯと同じ方法で封入
率６．２％のＣＤＤＰを封入し、相転移温度４２．Ｍｃ
のリボソーム製剤をえた。

実施例１９ 実施例１８で用いられるＣＤＤＦ）溶液の代わり６−Ｃ
ＦとＣＤＤＰの混合溶液を用いて、実施例１１と同じ方
法で６−ＣＦおよびＣＤＤＰをそれぞれ封入率５．８％
および４．５％で同時に封入し、相転移ｌＬ度４２．１
０Ｃのリボソーム製剤をえた。

実施例２０ 実施例Ｉ４で用いられる３６０ｍｇのＤＰＰＣおよび４
．０ｍｇのＤＳＰＣの代わりに、２８０ｍｇのＤＰＰＣ
および１２０ｍｇのＤＳＰＣを用いて、実施例１４と同
じ方法で封入率７．４％のＣＤＤＰを封入し、相転移温
度４４．５℃のリボソーム製剤をえた。

実施例２１ 実施例２０で用いられろＣＤＤＰ溶液の代わり６−ＣＦ
とＣＤＤＰの混合溶液を用いて、実施例２０と同じ方法
で６−ＣＦおよびＣＤＤＰをそれぞれ封入率６．２％お
よび４，９％で同時に封入し、相転移温度４４．５°Ｃ
のリボソーム製剤をえた。

実験例２−１ 上記実施例１１，１３．１７およびＩ９の方法において
、スルファチドを加えないほかは同様の方法によりそれ
ぞれリボソーム製剤を作製した。

実験例２−２ 上記実施例ＩＩ、１３、Ｉ７および１９のリボソーム製
剤とこれらのリボソームに対応するスルファチドを含ま
ないリボソームの各０．１−０．５蔵をラットに静脈内
投与して、６時間までの血中ての６〜ＣＦ濃度を測定す
ることにより血中からのリボソームの消失を調べろと、
スルファチドを含むリボソームの１時間後、２時間後、
４時間後および６時間後の血中濃度はいずれもそれを含
まない対照リボソームよりも高く、それぞれ平均８．５
．１９．７．１６．＝１および２８５倍となっｆ為また
１時間までの血中でのＣＤＤＰ濃度を測定すると（註４
）、いずれら６−ＣＦと同程度の濃度を示し、ＣＤＤＰ
が血中で６−ＣＦと共にリボソームに封入されて存在す
ることを示しｆこ。これらの結果が示すように、リボソ
ーム膜組成として飽和系のアシル括を有ずろリン脂質と
硫酸法を有ずろ糖脂質を用いる本発明のリボソームの製
法は、リボソームの静脈内投与後の血液中からの消失時
間を延長させるために効果的でかつ実用性の高い手段と
いえろ。

（註＝１　）　　ＣＤ　Ｄ　Ｐの血中濃度の測定方法尾
静脈よりえたヘパリン処理血液０．２症に２７１１１の
ＰＢＳをくわえた血液分散液をえノー。さらにこの逮心
分離してえられる分離」１清ＩＩｆにＩ　ＺＪのＤ　Ｄ
　’Ｉ’溶液を加えて前述のＣＤＤＰの定量方法と同様
にして血中の総ＣＤＤＰｆｆｋを定量した。

実施例２２ 実施例１て用いられる６−ＣＦ溶液の代わりに３０８μ
ｇプロティン／滅のインターロイキン２（ＩＩ、−２）
水溶液（溶液のＦ１類；２５ｍＭ酢酸アンモニウム溶液
ｐＨ６）を用いて、実施例１と同じ方法で封入率２４４
％のＩＬ−２（註６）を封入し、相転移温度２１２．ピ
Ｃのリボソーム製剤をえた。

なお、リボソーム中の遊離のＩ　Ｌ−２は、逮心分雌（
Ｓｏｒｖａｌｉ、分離条件；５００００ｇ、３０分）で
分離した。

（註６）リボソーム中のＩ　Ｌ−２含量の測定方法超遠
心分離により遊離のＩＬ−２を除去したＩ　Ｌ　−２を
封入するリボソームに等虫のＯ、＝１％１・υトンＸ−
１００水溶液（Ｖ／Ｖ）をくわえ、７°Ｃて３０分イン
クベインヨンすることによりリボゾームを破壊し、遊離
してくるＩＬ−２または、超遠心分離によりえられる」
−清をグラフ；エンドを用いたＩＩＰＪ、Ｃ（カラム；
Ｕｌｔｒａｐｏｒｅ、　ＵＶ＝２１０ｎｍ）で定量した
。なおＩＩ　Ｉ）　Ｌ　Ｃの溶離液としては、アセトニ
トリル／水（４０／　６０　Ｖ　／　Ｖ　）ニ０　、１
　％のトリフロロ酢酸（Ｖ／Ｖ）を含む液（Ａ液）およ
びアセトニトリル／水（６５／３５Ｖ／Ｖ）に０．１％
のトリフロロ酢酸（Ｖ／Ｖ）を含む液（Ｂ液）を用い、
以下の条件でグラジェントを行った。

時間　　　　　　Ａ液　　　　　　　Ｂ液０分　　　　
９０％　　　　　　１０％２０分　　　　　０％　　　
　　１００％２５分　　　　　０％１　　　　［ＯＯ％
実施例２３ 実施例２２て用いられるＩＬ−２溶液の代わりに６−　
ＣＦとＩ　Ｌ　−２のそれぞれ２５　ｍＭ、ｌ　５４／
１ｇプロティン／〃Ｉ５度である混合溶液を用いて、実
ｊ池例２２と同じ方法でＧ−ＣＦおよびｌ　Ｌ−２をそ
れぞれ封入率１９，０％および１８．５％で同時に封入
し、相伝ｆり温度＝１２　、１℃のリボソーム製剤をえ
た。

実験例３−１ 上記実施例２３の方法において、スルファチドを加えな
いほかは同（５ｐの方法によりリボソームを作製した。

実験例３−２ 上２肥実施例２３のリボソームとこのリボソームに対ず
ろスルファチドを含まないリボソーム０　、　Ｉ　−０
、５ｒｒｊＱをラットに静脈内投与して、６時間までの
血中での６−ＣＦ濃度をｉｔ＋’ｌ定オろことにより血
中からリボソームの消失を、凋へろと、スルファチドを
含むリボソームの１時間後、２時間後、７１時間後およ
び６時間後の血中濃度はいずれもそれを含まない対照リ
ボソームよりも高く、それぞれ平均１０９、ｌ　１．０
．ｌ　５．３および１１１７倍となった。これらの拮果
か示すように、リボソーム膜組成として飽和系のアノル
基を有するリン脂質と硫酸拮を（Ｔ１１−ろ糖脂質を用
いろ本発明のリボソームの製法は、リボソームの静脈内
投与後の＋ｎｔ液中からの消失時間を延長させるために
効果的でかつ実用性の高い手段といえろ。

実施例２４ 実施例１で用いられる６−ＣＦ溶液の代わり、１００μ
／　ｈ＝ｎの濃度のアンザマイトシン生理食塩溶液を用
いて、実施ｌと同じ方法で、アンザマイトンンを封入し
、…転移温度４２．１’Ｃのリボソーム製剤をえた。

実施例２５ 実施例１て用いられろ６−ＣＦ溶液の代わり、ｂｍｇ／
ｙの濃度のメｌ−トレキセート生理食塩溶液を用いて、
実施ｌと同じ方法で、メトトレキセー）・を封入し、（
・１］転転移度４２．１’Ｃのリボソーム製剤をえた。

実施例２６ 実施（テｌＩで用いられろ６−ＣＦ溶液の代わり、２０
０１１　！！／’ｈ）濃度のマイトマインンＣ生理食塩
溶液を用いて、実１血ｌと同じ方法で、マイトマイノン
Ｃを」を人し、）目ト云移、語文・＋　２　、１　’Ｃ
のリポソー　ム　）ソ１刊をえ　ノニ。

実施例２７ 実施例１で用いられる６−ＣＦ、液の代わり、１ｍｇ／
成の濃度のアトリヤマイシン生理食塩溶液を用いて、実
施Ｉと同じ方法でアトリヤマイシンを封入し、相転移温
度４２　、１　’Ｃのリボソーム製剤をえた。

実施例２８ 実施例１で用いられる６−ＣＦ溶液の代わり、３ｍｇ／
滅の６度のプレオマイシン生理食塩溶液を用いて、実施
ｌと同じ方法でブレオマイシンを封入し、相転移温度４
２．１’Ｃのリボソーム製剤をえた。

発明の効果 本発明のリボソーム製剤は、静脈内投与後、長時間安定
に血液とともに体内を循環し、そのことにより薬物本来
の毒性を緩和するとともに特定の病巣への薬物のターゲ
ット効果を増大させ、薬物の持続的治療効果をたかめる
ために有用である。

とりわけ、抗癌剤を封入してなる本発明のリボソーム製
剤は、癌の加温療法時に投与することによりて治療効果
の向上が期待でき、この場合にはリボソーム膜の相転移
温度が約４０〜５５℃のものを好ましく用い得る。

【図面の簡単な説明】

第１，２．３．４および５図は、それぞれ実施例１．２
．３．４および６で得られたリボソーム製剤をラットに
静脈内投与した後の経過時間とリボソーム製剤の血中濃
度との関係を示す。また、同様に第６図は、実験例１−
１の方法で得られたリボソームの血中濃度変化を示す。 各図中、−−−−−一−・−一−−−−−はスルファチ
ドを加えないで調製したリボソームの場合の血中濃度の
変化を示す。血中濃度は、投与量に対する百分率を意味
し、ラットの全血液量は体重の１割とした。 ＄　１　図 ＄　２　図 時間（ｈ「） 茅４図 時開（ｈｒ）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）アシル基が飽和アシル基であるリン脂質と硫酸基を
   有する糖脂質とを膜構成成分とするリボソーム内に薬物
   を封入してなるリボソーム製剤。 ２）薬物を封入してなるリボソーム製剤の製造に際し、
   アシル基が飽和アシル基であるリン脂質と硫酸基を有す
   る糖脂質とを用いてリボソーム膜を構成させることを特
   徴とするリボソーム製剤の製造法。