KR950002880B1 - 리포소옴의 제조방법 - Google Patents

Abstract

내용 없음.

Description

리포소옴의 제조방법

본 발명은 리포소옴(Liposome) 제조방법에 관한 것이다. 좀더 상세하게 설명하면 본 발명은 실제조업에 있어서 유리한 방법으로 증진된 약물 봉입율(Drung Trap Ratio)을 갖는 리포소옴을 제공함에 있다.

지금까지 알려진 리포소옴 종에는 MLV(Multilamellar vesicle), SUV (Small Unilamellar Vesicle) 및 LUV (Large Unilamellar Vesicle ; 일명 REV : Reverse-phase Evaporation Vesicle)가 있으며, 그의 특성 및 생산방법에 대해 예를들어 문헌[Cell Engineering, Vol.2, No.9, 1136(1983)]에 기재되어 있다. 그외에도 SPLV (Stable Phurilamellar Vesicle)로 지칭되는 상기의 세종류와는 다른 리포소옴종 들이 최근에 알려지기 시작했다(일본국 PCT 특허출원공개 제59-500952호).

지금까지 알려진 방법으로 수득된 리포소옴 종류는 제조되어 약제형으로 사용되는데 있어서 결점을 가지고 있다. MLV가 약제의 캡슐화에 사용되어 있을 때, MLV는 낮은 약물봉입율을 가지며 더구나 안정성도 낮아진다. SUV도 역시 낮은 약물봉입율을 가지게 한다. 약물의 몇몇 종류들은 결코 SUV를 함유해서는 안된다. REV는 상대적으로 높은 약물봉입율을 갖게 하는 리포소옴 종으로 알려져 있다. 그의 제조 방법은 포스포리피드(Phospholipid)를 유기용매에 용해시키고, 수층을 첨가하여 w/o 유제를 얻고 상기 유제에서 유기층을 증발시키는 방법이다(일본국 특허출원공개 제55-118415호). 이 발명은 유기용매를 사용하여 w/o미세유제를 제조하는 단계를 포함한다. 그러므로, 여러 문제점들 중 하기 문제점들이 REV 제조시 지적될수 있다 : 1) 상기 제조방법은 초음파 유화단계를 필요로 하며, 2) 많은 양의 유기용매를 필요로 하며, 3)용매 증발 공정중 진공도의 미세조정이 필요로 한다. 상기 사항중 어떤 문제점도 한번에 REV 대량 생산을 어렵게 한다. SPLV제조 공정시에도 지질과 비교하여 다량의 유기용매를 필요로하는 비슷한 문제점에 직면하여 또한 계란 노른자위 레시틴과 같은 낮은 상전이 온도를 갖는 지질(Lipid)을 사용해야할 필요성을 갖는다.

그러므로 지금까지 알려진 방법으로 리포소옴을 제조할 때, 리포소옴은 여전히 예를들어 그의 제조 및 약제형으로 미소 캡슐화 사용에 있어서의 문제점과 같은 문제점을 가지고 있다. 그렇기 때문에, 본 발명자들은 이에 대해 집중적인 조사를 한 결과, 생산규모의 크고 작음에 관계없이, 증진된 약물 봉입율 및 좋은 재생산성을 가지며, 쉽게 휘발하는 유기용매 소량을 기존 방법에 의해 제조되는 MLV 또는 초음파 처리에 의해 수득되는 SUV에 첨가한 다음 질소기체 기류내에서 생성된 겔로부터 통상의 감압처리하에 증발하여 유기용매를 제거하여 안정한 리포소옴을 제조하는 방법을 발견하였다. 상기 연구를 계속하여 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명은 쉽게 휘발하는 유기용매를 리포소옴이 분산되어 있는 약물 함유 액상에 첨가한 후 그 유기용매를 증발 제거함으로 이루어진, 증진된 약물 봉입율을 갖는 리포소옴 생산 방법으로 이루어져 있다.

"분산된 리포소옴을 갖는 약물 함유 액상"은 생산 공정에 었어서 사용된 약물이 혼합되거나 혼합되지 않은 리포소옴이 분산되어 있는 약물 함유 액체를 의미한다. 상기 리포소옴은 어떠한 기존 방법에 의해서도 제조될 수 있으며 특히, MLV 또는 SUV 리포소옴이 유리하게 사용된다. 예를들어, 본 발명을 수행하는데 사용되는 MLV는 기존 방법에 의해 수득될 수 있으며 ; 약물 수용액의 5∼100 체적부를 사전에 필름 방법에 의해 수득된 박막 형태의 지질 1 중량부에 첨가한 다음, 지질과 약물 용액의 혼합물을 와류 혼합기(Vortex Mixer)로 교반하여 MLV를 수득한다. 상기예에 있어서, 약물 농도는 그의 종류에 따라 적절하게 선택될 수 있다. SUV는 상기 MLV를 미분쇄, 예를들어 탐침형(Probe-type) 초음파발생기(20 KHz)에서 처리하여 수득될 수 있다. 이와같이 수득된 MLV 또는 SUV는 본 발명에서 리포소옴 제조용 출발물질로 사용될 수 있다. 본 발명에 있어서 지질 이중막을 형성할 수 있는 어떠한 소포(Vesicle)도 상기의 MLV 및SUV경우와 동일한 방법으로 리포소옴 제조용 출발물질로 사용될 수 있으며, 상기의 소포가 낮은 약물 포획비를 갖거나 불안정 하더라도, 사용될 수 있다. 이와같은 출발 물질로서, 에테르 부가 방법[문헌(Biochemica et biophyica Acta, Vol, 443, P. 629(1976)], 물에 동결 건조제를 분산시키는 방법(일본국특허출원 공개 제51-86117호), 및 동결-융해법(일본국 특허출원 공개 제51-86117호)에 의해 수득되는 각각의 리포소옴을 예로들 수 있다.

그외도 지질 및 약물-유리 용액으로 부터 제조되는 약물-유리 리포소옴이 출발 물질로서 사용될 수 있다. 이와같은 약물-유리 리포소옴은 약물-함유 액체에 분산되어 있을 수 있다. 본 발명에 있어서, 필요시에는 pH 조절제, 산화방지제, 삼투압 조정물질 또는 방부제 등이 약물-함유 액체에 첨가될 수 있다·

본 발명의 실제로 사용되는 약물에 대해서는 특별한 제한은 없으나, 친수성 약물 또는 친지방성 약물이될 수 있다. 그러나 본 발명의 제조방법은 로그 값으로 10 미만인 "옥틸알코올/물 분배계수"를 갖는 친수성약물에 사용하는 것이 가장 바람직하다. 이와같은 친수성 약물의 예로는 각종 항염증 진통제, 림포킨(Limphokines), 항암제, 면역 상승제(Immunopotentiator), 생리적 활성 펩타이드, 항생제, 항프로토조아제(Antiprotozoa Agent), 효소, 항 알레르기 약 등을 들 수 있다. 친수성 약물의 더 상세한 예로 인터페론 및 인터류킨 2(Interleukin 2)와 같은 림포킨 ; 망간 함유 슈퍼옥사이드 디스무타제(SOD), SOD 유도체인 슈퍼옥사이드 디스무타제-PEG(SOD-PEG)(일본국 특허공개 제58-16685호 및 유럽특허공보 제0070656호), 리포모듈린과 같은 항염증 진통 펩타이드 ; 시스플라틴, 미토마이신 C, 5-FU, 아드리아마아신, 악티노마이신 및 블레오 마이신과 같은 항암제 ; 무르아밀디펩타이드 및 무르아밀트리펩타이드와 같은 면역 상승제 ; 티로이드 호르몬-유리 호르몬(TRH), 류프롤리드, 인슐린 및 DN-1417과 같은 생리적 활성물질(일본국 특허공개 제57-132658호 및 유럽특허 공보 제0094157호) ; 술베니실린, 세포티암, 세프메녹심 및 카나마이신과 같은 아미노 글리코사이드 항생제 ; 비타민(시아노 코발아민), 항프로토조아제(예, 메글루민 안티모네이트) ; 효소(예, 알칼리 포스파타제) ; 항응고제(예, 헤파린) ; 항 알레르기제 및 기타 일반용도 약물(예, 글루타티온)이 있다.

본 발명의 실시에 사용되는 지질 재료로는 지질 이중막을 형성할 수 있는 물질이면 어느것이든지 사용될 수 있다. 일례로 계란 노른자위, 콩 또는 기타 동물성 또는 식물성 조직에서 유도되며, 포스파티딜콜린, 포스타티딜에탄올 아민, 포스파티딜리노시틴, 포스파티딜 세린 및 스핑고미엘린과 같은 포스포리피드 ; 계란노른자위 레시튼과 같은 상기 물질의 혼합물 ; 수소화된 레시틴 ; 디팔미토일포스파티딜콜린, 반합성 디스테아로일포스파티딜 콜린; 콜레스테롤, 모노글리세라이드, 디글리세라이드 및 트리글리세라이드와 같은 상기의 아포스포리피드 이외의 지질을 언급한 수 있다. 상기 화합물들은 단독 또는 혼합물로 사용될 수 있다.

본 발명에 있어서, 쉽게 휘발될 수 있는 유기용매를 상기와 같은 "분산된 리포소옴을 갖는 약물 함유 액상"에 첨가하여 겔을 형성 시킨다.

여기서 사용된 쉽게 휘발될 수 있는 유기용매는 지질에 대해 큰 친화성을 가지며 물 보다 더 쉽게 증발될 수 있는 유기용매이면 어떠한 용매이든지 사용될 수 있다. 물에 대한 용해도는 문제시되지 않는다. 일반적으로 100℃ 보다 높지 않은 비등점을 갖는 유기용매는 유리하게 사용된다. 일례로 에테르를 (예, 디에틸에테르, 이소프로필에테르), 클로로포름, 아세톤 및 알코올(예, 메틸 알코올, 에틸알코올)을 들 수 있다. 이들 용매는 단독 또는 혼합물로 사용될 수 있다. 이들 중에서 디에틸에테르 및 아세톤이 특히 바람직하다.

쉽게 휘발될 수 있는 유기용매는 분산된 리포소옴을 갖는 약물 함유액의 10체적부당 약 1∼30 체적부양, 바람직하게는 2∼10 체적부가 첨가된다. 이 혼합물을 와류 혼합기 또는 몇몇 다른 적당한 장치에서 일반적으로 수십초 내지 수분간 교반 및/또는 흔들어주어 균일한 겔을 수득한다. 상기 처리결과 원료로서 사용된 리포소옴의 소포구조가 유기용매에 의해 이완되거나 분해되며, 이에 의해 균일한 겔상태가 생성된다.

다음 쉽게 휘발될 수 있는 유기용매가 증발에 의해 게거된다. 증발 방법으로 통상 사용되는 회전증발기 또는 진동 진공 증발기를 사용하는 증발방법 및 질소 기체 기류를 주입하여 증발시키는 증발 방법을 들 수있다. 특히, 질소 기체기류 주입에 있어서 와류 혼합기 또는 베트형 음과 발생기를 사용하여 외부에서 진동을 시켜주면 더 효율적으로 유기용매가 제거될 수 있다. 증발에 의한 겔 형성 및 유기용매 제거는 사용된 지질의 상전이 온도보다 낮은 온도에서 수행되는 것이 바람직하다. 예를들어 실온보다 낮은 온도는 계란 노른자위 레시틴 및 콩 레시틴에 적용하는 것이 바람직하고, 50℃ 보다 낮은 온도는 디팔미토일포스파티딜 콜린, 60℃ 보다 낮은 온도는 디스테아로일포스파티딜콜린에 적용하는 것이 바람직하다.

유기용매의 제거하는 리포소옴의 재구성을 초래하며, 이 경우에 있어서 출발물질로 MLV나 SUV가 사용되었을 때와 비교하여 약물 포획비가 증가된 리포소옴이 수득된다.

이와같이 수득된 약물 함유 리포소옴은 필요시에 초음파 균일화기(Ultrasonic Homogenizer) 또는 몇몇 다른 균일화기를 사용하여 미세 분쇄될 수 있으며, 여과기를 통해 여과하여 유리한 입자 크기로 조정할 수 있다. 리포소옴은 그 자체로서 사용될 수 있지만, 예를들어 원심분리, 겔 여과 또는 투석에 의해 리포소옴에 함유되지 않고 남아있는 약물의 일부를 제거한 후 주사액, 경구용 제제(Oral Preparation) 및 좌약과 같은 약제형으로 제조될 수 있다.

본 발명에 의한 생산 방법에 의해 수득되는 리포소옴은 통상적인 MLV, SUV 또는 REV 방법에 의해수득되는 리포소옴에 비해 더 큰 약물 봉입율을 가지며 리포소옴을 미소캡슐로 사용되는 실질적 관점에 유리한 제제형을 갖는다. 본 발명에 있어서, 약물 봉입물은 하기식에 의해 계산된다:

이외에도, 본 발명에 의한 제조방법은 통상의 제조방법에 비해 하기의 특성을 갖는다.

(a) REV 방법에서는 필요한 w/o 유제가 제조가 반드시 필요하지 않게 된다.

(b) REV 방법에서 필요한 유기용매 증류시 진공도의 미세조정이 불필요하다.

(c) REV 방법이 1회분 리포소옴 생산규모를 제한하나, 본 발명에 의한 방법은 보다 큰 생산 규모에서도 쉽게 수행될 수 있다.

(d) REV 또는 SPLV경우와는 달리, 많은 양의 유기용매를 사용함이 필요하지 않게 된다.

(e) 많은 종류의 유기용매와 사용될 수 있다. 어떤 약물이 유기용매에 의해서 쉽게 비활성화될 수 있을때에도, 아세튼 또는 에틸알코올과 같은 친수성 유기용매를 사용하여 이와같온 비활성화를 방지할 수 있다.

이와같은 이유와 또 다른 이유에 의해, 함유되어 있는 약물의 특성을 충분히 고려하면서, 적절한 유기용매를 선택할 수 있다.

(f) 일반적으로, 유기용매에 대해 비교적 낮은 용해도를 갖는 지질, 예를들어 높은 상전이 온도를 갖는 지질(특히 DPPC 또는 DSPC와 같은 포화된 종류의 지질)이 사용될 때, REV 방법에서와 같이 지질을 용해시키는 데 다량의 유기용매가 필요하다. 그러나 본 발명의 방법에 있어서, 어떠한 지질도 사용될 수 있으며 소량의 유기용매에서도 수행될 수 있다.

실시예

하기의 실시예 및 시험예들은 본 발명을 보다 상세히 설명해 준다.

실시예1

다팔미토일포스파티딜콜린과 디스테아로일포스파리딜콜린의 9 : 1(W/W) 혼합물의 1%를 함유하는 클로로포름 용액 10ml를 사용하여 50ml가지형 플라스크의 유리벽에 얇은 지질막이 형성되게 한다. 플라스크안에 50mM 6-카르복시플루오레신(6-CF) 용액 3ml를 첨가하여 pH 7로 조정한다. 플라스크 내용물을 55℃로 유지된 베트형 음파발생기내에서 잘 교반하고 흔들어 주어서 6-CF가 함유되게 해준다. 이와같이 하여 6-CF 용액에 분산된 MLV 리포소옴을 제조한다. 생성된 MLV 분산액에 상기와 같은 온도에서 에틸에테르 3ml를 첨가해준다. 약 1분간 와류 혼합기에서 생성된 혼합물을 교반하고 흔들어 주어 균일한 겔을 수득한다. 음파발생기로 겔을 진동시키면서 N₂기체를 주입하여 겔 내에 있는 에틸에테르를 증발 제거한다. 6-CF가 함유된 리포소옴 분산액 약 3ml를 수득한다. 이 액을 생리식염수 2ml로 희석하고 그 희석액을 1.2μ여과기(상품명 : Acro-disc

; Gelman)로 여과한 다음 투석막(상품명 : Spectriapor

: Spectrum Medical)을 사용하여 생리식염수 1000ml와 함께 24 시간 투석시켜 28.9%의 6-CF 포획비를 갖는 리포소옴을 수득한다.

실시예 2

디팔미토일포스파티딜콜린과 디스테아로일포스파티딜콜린의 7 : 3(W/W) 혼합물의 1%를 함유하는 클로로포름 용액을 사용하고 60℃의 반응 온도에서 실시예 1의 절차를 수행하여 32.2%의 6-CF 포획비를 갖는 리포소옴을 수득한다.

실시예 3

디스테아로일포스파티딜콜린의 1%를 함유하는 클로로포름 용액을 사용하고 70℃의 반응 온도에서 실시예1의 절차를 수행하여 37.7%의 6-CF 포획비를 갖는 리포소옴을 수득한다.

실시예 4

에틸에테르를 약 1ml사용하고 실온의 반응 온도와 같이 더 변형된 조건에서, 실시예 1에서 사용된 반합성 레시틴 대신 계란노른자위 레시틴 10%를 함유하는 클로로포름 1ml를 사용하여 실시예 1의 절차를 수행한다. 이에 의해 30.1%의 6-CF 포획비를 갖는 리포소옴이 수득된다.

실시예 5

실시예 4의 방법에 의해 수회분의 MLV를 제조한다. 수차례에 걸쳐 생성된 MLV양을 모아 수득한 MLV30ml에 에틸에테르 10ml를 부가하고 생성된 혼합물을 실시예 4와 동일 방법으로 처리하여 증진된 6-CF포획비를 갖는 리포소옴을 수득한다.

실시예 6

실시예 4에서 에틸에테르 대신 아세톤 3ml를 사용하는 점만 달리 실시예 4와 동일한 방법으로 증진된 6-CF 포획비를 갖는 리포소옴을 수득한다.

실시예 7

실시예 4에서 생성된 MLV를 미세 분쇄하여 수득된 SUV 탐침형 초음파 교반기(Porve-Type Ultrasonic Shaker)에 의해 흔들어 주면서 실시예 4와 동일한 방법으로 조업하여 증진된 6-CF 포획비를 갖는 리포소옴을 수득한다.

실시예 8

디팔미토일포스파티딜콜린과 디스테아로일포스파티딜콜린의 9 : 1(W/W) 혼합물의 1%를 함유하는 클로로포름 1.5ml를 사용하여 50ml가지형 플라스크의 유리벽에 얇은 지질막을 형성시킨다. 플라스크내에 인터류킨 2(성분 : 308㎍ 단백질/ml ; 용액종류; 인체의 세륨 알부민이 함유된 5mM 암모늄 아세테이트 용액, pH 5) 수용액 0.5ml를 첨가한다. 플라스크의 내용물을 55℃로 유지되어 있는 베트형 음파발생기내에서 잘교반하고 흔들어 주어서 인터류킨 2가 함유되게 한다. 이에 의해 상기 약물 용액에 분산된 MLV 분산액을 수득한다. 그 다음, 동일 온도에서 MLV 분산액 0.5ml에틸에테르를 첨가하고 생성된 혼합물을 약 1분간 와류 혼합기에서 교반해 주고 흔들어 주어 겔을 수득한다. 음파발생기로 겔을 진동 시키면서 N₂기체를 주입하여 겔내에 있는 에틸에테르를 증발 제거한다. 인터류킨 2가 함유된 리포소옴 분산액 약 3ml가 수득된다. 인터류킨-유리용액 10ml를 더 첨가하여 희석시킨 인터류킨 2수용액(인터류킨 2 리포소옴용 분산제)을 제조하며, 전 혼합물을 30분간 30,000rpm으로 초원심 분리기 내에서 원심 분리하여 증진된 인터류킨 2 봉입율을 갖는 리포소옴을 수득한다.

실시예 9

디팔미토일포스파티딜콜린과 디스테아로일포스파티딜콜린의 9:1(W/W) 혼합물의 1%가 함유된 클로로포름 용액 10ml를 사용하여 50ml가지형 플라스크의 유리벽에 얇은 지질막을 형성시킨다. 플라스크 내용물에 망간-SOD 수용액(내용물:6mg 단백질/ml ; 용액의 종류 ; 67mM 포스페이트 완충용액, pH 7.0) 3ml를 첨가하고, 55℃로 유지되어 있는 베트형 음파발생기 내에서 잘 교반하고 혼를어 주어 망간-SOD가 함유된 약물용액에 MLV 리포소옴이 분산되어 있는 분산액을 수득한다. 수득된 MLV 분산액 에틸에테르3ml를 첨가하고 생성 혼합물을 약 1분간 와류 혼합기로 흔들어 주면서 교반하여 균일한 겔을 수득한다. 음파발생기로 더 진동하면서 겔에 대해 N₂기체를 주입하여 발생하는 증발 현상으로 겔내에 있는 에틸 에테르를 제거하여 망간-SOD가 함유된 리포소옴 분산액 약 3ml를 수득한다. 상기 수득물에 생리식염수 10ml를 더 첨가하고, 30,000rpm으로 작동하는 초원심 분리기(Sorvall

: Sorvall)에서 30분간 원심 분리한다.

25.3%의 망간 -SOD 봉입율을 갖는 리포소옴이 수득된다.

실시예 10

디팔미토일포스파티딜콜린과 디스테아로일포스파티딜콜린의 9 : 1(W/W) 혼합물의 1%가 함유된 클로로포름 용액 10ml를 사용하여 50ml가지형 플라스크의 유리벽내에 얇은 지질막을 형성시킨다. 플라스크 내용물에 망간-SOD-PEG(5000) 수용액(내용물 : 0.5mg 단백질/ml ; 수용액의 종류 ; 67mM 포스페이트 완충용액, pH 7.2) 3ml를 첨가한다. 상기 내용물을 55℃로 유지되어 있는 베트형 음파발생기 내에서 잘 교반하고 흔들어 주어 망간-SOD-PEG(5000)가 함유된 MLV 리포소옴 분산액을 수득한다. 에틸에테르 3ml를 동일 온도에서 수득된 MLV 분산액에 첨가해 주고, 그 혼합물을 와류 혼합기로 약 1분간 흔들어 주면서 교반하여 균일한 겔을 수득한다. 음파발생기로 생성물을 진동시키면서 겔에 대해 N₂기체를 주입하여 야기되는 증발 현상에 의해 겔내에 있는 에틸에테르를 제거하여 망간 -SOD-PEG(5000)이 함유된 리포소옴분산액 약 3ml를 수득한다. 생리 식염수 10ml를 더 첨가하고, 생성된 혼합물을 실시예 6과 동일한 방법으로 원심 분리하여 27.0%의 망간-SOD-PEG(5000)봉입율을 갖는 리포소옴을 수득한다.

실시예 11

디팔미토일포스파티딜콜린과 디스테아로일포스파티딜콜린의 9 : 1(W/W) 혼합물의 1%가 함유된 클로로포름 용액 10ml를 사용하여 50ml가지형 플라스크의 유리벽내에 얇은 지질막을 형성시킨다. 플라스크 내용물에 시스플라틴 수용액(내용물 : 0.5mg/ml ; 수용액 종류 ; 생리식염수) 3ml를 첨가한다. 상기 내용물을 55℃로 유지되어 있는 베트형 음파발생기 내에서 잘 교반하고 흔들어 주어 시스플라틴 수용액이 함유된 약물 용액에 분산된 MLV 리포소옴 분산액을 수득한다. 에틸에테르(3ml)를 동일 온도에서 수득된 MLV 분산액에 첨가해 주고, 그 혼합물을 와류 혼합기로 약 1분간 흔들어 주면서 교반하여 균일한 겔을 수득한다. 음파발생기로 생성물을 진동 시키면서 겔에 대해 N₂기체를 주입하여 야기되는 증발 현상에 의해 겔내에 있는 에틸에테르를 제거하여 시스플라틴을 함유하는 리포소옴 분산액 약 3ml를 수득한다. 생리 식염수 2ml를 수득물에 더 첨가하고, 생성된 혼합물을 1.2μ여과기(Acrodisc

; Gelman)로 여과하고 투석막(Spectrapor

; Spectrum Medical)을 사용하여 24시간 동안 생리식염수 1000ml에 대해 더 투석한다. 29.8%의 시스플라틴 봉입율을 갖는 리포소옴을 수득한다.

실시예 12

디팔미토일포스파티딜콜린과 디스테아로일포스파티딜콜린의 7 : 3(W/W)혼합물의 1%를 함유하는 클로로포름 용액을 사용하고 반응 온도를 60℃로 하여 실시예 11의 절차를 수행하여 32.4%의 시스플라틴 포획비를 갖는 리포소옴을 수득한다.

실시예 13

디스테아로일포스파티딜콜린 1%를 함유하는 클로로포름 용액을 사용하고 반응 온도를 70℃로 하여 실시예 11의 절차를 수행하여 35.2%의 시스플라틴 봉입율을 갖는 리포소옴을 수득한다.

실시예 14

실시예 1과 동일한 방법으로 제조된 얇은 지질막에 생리식염수 2ml를 첨가하여 약 성분이 함유되지 않은 MLV형 리포소옴을 제조하며, 실시예 1과 동일한 방법으로 반응을 수행한다. 생성물에 50mM 6-CF 용액(pH 7) 1ml를 첨가하여 6-CF 용액에 분산된 MLV 분산액이 6-CF가 함유되지 않은 상태로 수득된다. 수득된 MLV 분산액을 사용하고 실시예 1과 동일한 방법으로 반응을 진행시켜, 21.3%의 6-CF 포획비를 갖는 리포소옴을 수득한다.

실시예 15

디팔미일포스파티딜콜린과 디스테아로일포스파티딜콜린의 9 : 1(W/W) 혼합물의 1%를 함유하는 클로로포름 용액 10ml를 사용하여 50ml가지형 플라스크의 유리벽에 얇은 지질막이 형성되게 한다. 플라스크안에 50mM 6-카르복시플루오레신(6-CF) 용액 3ml를 첨가하여 pH7로 조정한다. 플라스트 내용물을 55℃로 유지된 베트형 음파 발생기 내에서 잘 교반하고 흔들어 주어서 6-CF가 함유되게 해준다. 이와같이 하여 6-CF 용액에 분산된 MLV 리포소옴을 제조한다. 생성된 MLV 분산액에 상기와 같은 온도에서 에틸알코올 1ml를 첨가해 준다. 약 1분간 와류 혼합기에서 생성된 혼합물을 교반하고 흔들어 주어 균일한 겔을 수득한다. 물 0.2ml를 10회 겔에 첨가해 주면서, 음파발생기로 겔을 진동시키고 N₂기체를 주입하여 겔내에 있는 에틸 알코올을 증발제거한다. 6-CF가 함유된 리포소옴 분산액 약 3ml를 수득한다. 이 액을 생리식염수 2ml로 희석하고 그 희석액을 1.2μ여과기(상품명 : Acrodisc

; Gelman)로 여과한 다음 투석막(상품명 : Spectrapor

; Spectrum Medical)을 사용하여 생리 식염수 100ml와 함께 24시간 투석시켜 13.5%의 6-CF 봉입율을 갖는 리포소옴을 수득한다.

시험예 1

실시예 4의 방법으로 제조한 MLV 분산액 3ml에 에틸에테르를 0.1ml에서 0.1ml의 범위로 첨가하여 에틸에테르의 겔 형성 능력 및 사용된 에틸에테르 양 중에서 에틸에테르의 제거양에 따른 리포소옴 형성 능력에 대한 의존도를 조사하였다. 그 결과 본 발명에 있어서 겔 형성 및 리포소옴 제조에 필요한 에틸에테르의 최소양이 표 1에 표시된 바와같이 0.3ml이다.

[표 1]

- …겔의 불형성

±…겔의 부분 형성

+ …겔의 형성이 잘됨

시험예 2

6-CF의 형광세기를 측정하여 (I), 실시예 1, 2, 3 및 4에서 제조된 본 발명에 의한 6-CF 함유 리포소옴을 분석하고, 형광측정결과(2)를 기초로 하여 계산된 6-CF 포획비를 각각의 실시예에서 제조된 MLV 및 같은 지질 구조를 갖도록 REV 방법(3)에 의해 각각 제조되는 6-CF 봉입율과 비교한다. 그 결과 본 발명에 의한 모든 리포소옴은 표 2에 표시된 바와같이 큰 봉입율을 갖는다.

(1) 리포소옴내의 6-CF 함량 결정

리포소옴(0.1ml)을 포스페이트-완충된 생리식염수(PES)로 100배 희석하고, 그 희석액 0.1ml를 트리톤X-100(Trition X-100) 0.02%를 함유하는 PBS로 다시 100배 희석하고, 그 희석액을 30분간 60℃에서 가열하여 리포소옴을 분해시킨다. 생성된 용액의 형광세기를 측정하고 (히다찌모델 F 3000형광 분광계 ; 여기 파장 494 nm ; 측정파장 ; 515nm), 리포소옴 분산액 내의 총 6-CF 양(리포소옴에 혼합되지 않은 유리된 6-CF 포함)을 결정한다. 이외는 별도로 리포소옴 분산액 0.1ml를 PBS로 10,000배로 희석시키고, 그 희석액 2.5ml를 초원심 여과기(Centrisatr

SM 13249 E ; Sartorius)로 여과하고 그 여액의 형광세기를 측정하여 리포소옴 분산액내의 포함되지 않은 상태의 유리된 6-CF 양을 측정한다.

(2)REV 제조방법

실시예 1, 2, 3 및 4 각각에서 사용된 지질 100mg을 100ml 가지형 플라스크 내에 정치하고 10ml 클로로포름 및 10ml 이소프로필 에테르를 첨가하여 용해시키고 각각의 실시예에서 사용된 6-CF 용액을 더 첨가한다. 생성된 혼합물을 탐침형 초음파 교반기(20KHz)에서 유화시킨다. 그 다음, 유기용매를 회전 증발기에서 증발 제거하고(온도 조건 : 각 실시예 경우와 동일), 잔여 분산액을 각 실시예와 동일한 방법으로 투석하여 6-CF가 함유된 REV를 수득한다.

(3)봉입율 계산

[표 2]

a) 실시예 1의 생성물

b) 실시예 2의 생성물

c) 실시예 3의 생성물

d) 실시예 4의 생성물

e) 디팔미토일포스파티딜콜린

f) 디스에아로일포스파티딜콜린

시험예 3

본 시험예에서는 실시예 11, 12 및 13에서 제조된 시스플라틴을 함유하고 있는 본 발명에 의한 리포소옴이 사용된다. 각 리포소옴 분산액에서 시스플라틴과 디에틸디티오카르바메이트(DDTC)의 반응으로 형성되는 내전물로서 시스플라틴을 HPLC(컬럼 : Zorbax CN

; 용리제 ; n-헥산/이소프로필 알코올=δ/2 ; UV=254nm)로 분석한다(1). 상기 분석 결과를 기초로 하여 계산된 시스플라틴 포획비를 각각의 실시예에서 제조된 MLV 및 같은 지질구조를 갖도록 REV 방법에 의해 각각 제조된 시스플라틴 함유 리포소옴의 시스플라틴 포획비를 비교한다.

이리하여 표 3의 자료를 얻었고 본 발명에 의한 리포소옴은 항상 큰 봉입율을 갖는다.

리포소옴 내의 시스플라틴 함량 결정

리포소옴(0.1ml)을 생리식염수 5ml에 분산시킨다. 분산액 2.5ml를 동결-용해처리하고 리포소옴 분해생성물을 센트리자트

여과기(Centrizart

Filter)를 통해 여과한다. 여과액 0.1ml에 0.1N NaOH 용액 2ml를 첨가한다. 생성된 혼합물을 실온에서 30분간 방치하고, 생성된 내전물을 n-헥산 5ml로 추출한다. 추출액내의 시스플라틴을 상기 조건하에서 HPLC로 분석한다. 이와는 별도로 생리식염수 내에 잔류하는 리포소옴 분산액 약 2.5ml를 센트리자트

여과기를 통해 여과하고 상기와 동일한 조건하에서 내전물을 형성시킨다. 상기 리포소옴 분산액의 리포소옴내에 포함되지 않고 남아있는 유리시스플라틴 양을 결정한다.

[표 3]

a) 실시예 11의 생성물.

b) 실시예 12의 생성물.

c) 실시예 13의 생성물.

Claims (13)

1. 증진된 약물 봉입율을 갖는 리포소옴 제조방법에 있어서, (1) 포스포리피드로 부터 제조된 리포소옴 및 약물을 함유하는 분산액을 제조하고 (2) 100℃ 이하의 비등점을 갖는 유기용매를 분산액에 첨가하여 겔을 형성시키고, (3) 유기용매를 증발 제거하여 리포소옴을 재구성 시키는 세단계로 이루어짐을 특징으로 하는 리포소옴 제조방법.
2. 제1항에 있어서, 분산제가 다층소포(MLV)를 함유함을 특징으로 하는 리포소옴 제조방법.
3. 제1항에 있어서, 분산제가 작은 단층 소포(SUV)를 함유함을 특징으로 하는 리포소옴 제조방법.
4. 제1항에 있어서, 약물이 로그값으로 10 미만의 옥틸 알코올/물 분배 계수를 갖는 친수성 약물임을 특징으로 하는 리포소옴 제조방법.
5. 제1항에 있어서, 약물이 항염증 진통제, 림포킨, 항염제, 면역상승제, 생리적 활성 펩타이드, 항생제, 항프로토조아제, 효소 또는 항알레르기제 중 하나임을 특징으로 하는 리포소옴 제조방법.
6. 제5항에 있어서, 림포킨이 인터류킨 2 임을 특징으로 하는 리포소옴 제조방법.
7. 제5항에 있어서, 항암제가 시스플라틴임을 특징으로 하는 리포소옴 제조방법.
8. 제5항에 있어서, 항염증 진통제가 망간 슈퍼옥사이드 디스무타제 또는 슈퍼옥사이드 디스무타제-PEG임을 특징으로 하는 리포소옴 제조방법.
9. 제1항에 있어서, 유기용매가 에틸에테르임을 특징으로 하는 리포소옴 제조방법.
10. 제1항에 있어서, 유기용매가 아세톤임을 특징으로 하는 리포소옴 제조방법,
11. 제1항에 있어서, 유기용매가 에틸알코올임을 특징으로 하는 리포소옴 제조방법.
12. 제1항에 있어서, 부가되는 유기용매 양이 약물 및 리포소옴을 함유하는 분산액 10 체적부당 약 1 내지 30 체적부로 비율로 첨가됨을 특징으로 하는 리포소옴 제조방법.
13. 제12항에 있어서, 부가되는 유기용매 양이 약물 및 리포소옴을 함유하는 분산액 10 체적부당 2 내지10체적부 비율임을 특징으로 하는 리포소옴 제조방법.