JPH04506207A - リポソームおよび脂質複合体組成物の調製 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 リポソーム及び脂質複合体組成物の調整産業上の利用分野 本発明は、医薬品成分に関するものであり、水溶性に乏しい化合物の輸送に関す るものである。さらに、本発明は、規定された粒子サイズのリポソームおよび脂 質粒子の製造に関するものである。

発明の背景 リポソームは、球状二分子層構造を有する両親媒性脂質からなる小胞である。リ ポソームは、通常、小さな１枚膜小胞（ＳＵｖ）、大きな１枚膜小胞（ＬＵＶ） 、または多重小胞（ＭＬＶ）に分類される。その定義としては、ＳＵＭとＬＵＶ は１枚の二分子層のみを有し、ＭＬＶは多件の同心性二分子膜を有する。リポソ ームは、親水性化合物を水性の内部や二分子層間に取り込むか、または疎水性化 合物を二分子層中に取り込むとにより、種々の物質を封入するために用いること が可能である。

リポソームは、その大きさ、組成、荷電により種々の特性を示す。例えば、不飽 和脂質の割合の低いリポソームはわずかに透過性が高く、コレステロール又は他 のステロールを組み込まれたリポソームは、より堅く、透過性が低い傾向を示す 。リポソームは、その親水基により、正、負、または中性の電荷を有すると考え られる。例えば、コリンに基づく脂質は正電荷を与え、リン酸および硫酸に基づ く脂質は負電荷を与え、グリセロールに基づく脂質および、ステロールは、一般 に溶液中で中性である。

リポソームは、生物学的活性物質の輸送に用いられてきた。

Ａ１１ｉｓｏｎ、米国特許第４．０５３．５８５号を例にあげると、負に荷電さ れたリポソームに入れた種々の抗原に、随意にＭ、　Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ （ヒト結核菌）の死菌を含めた投与が開示されているのを参照されたいｏ　Ｆｕ ｌｌｅｒｔｏｎを、米国特許第４．２６１．９７５号には、インフルエンザワク チンとして、ヘマグルチニンスパイクの付いたインフルエンザ分離膜をリポソー ムに結合させることが開示されている。

リポソームは、水溶性に乏しい、あるいは治療用量では望ましくない毒性を示す 多くの化合物を封入するために用いられてきた、例えば、アンホテリンＢは、水 、アルコール、クロロホルム、およびその他通常のハロゲン化炭素溶媒にいずれ にも溶けに（い抗真菌性抗生物質である。アンホテリシンＢは、効果的な殺真菌 剤であるが、治療濃度のわずかに高濃度で危険なほどに有毒でもある。リポソー ムに封入すると、哺乳類細胞に対するインビボでの毒性は減少するようであるが 、−万般真菌活性は比較的変化しないまま保たれる。（Ｆ。

Ｃ，５ｚｏｋａら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ　Ａｇｅｎｔｓ　Ｃｈｅｍｏｔｈａｒ 　（１９８７）３１：４２１−２９）。細胞毒性および殺真菌活性に対する作用 は、リポソームの組成、リポソームの構造（例えば、ＳＵＶ、ＭＬＶ等）調製方 法に依存した。

リン脂質小胞（リポソーム）は種々の技術により作成することができるが、一般 的には、「乾燥」脂質を水相へ導入する方法により形成し得る（Ｄ、Ｌａ５ｉｃ 、　Ｊ、Ｔｈｅｏｒ、Ｂｉｏｌ　（１９８７）１２４：３５−４１）。一度脂質 が水和されると、自然にリポソームが形成される。リポソーム中の層の数を制御 し、規定されたサイズの粒子を製造するための技術が開発されてきた。利用可能 な製造方法は、少量の物質を必要とする適用のほとんどに対して満足のいくもの である。（Ｇ、　Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ、　ｒリポソーム技術Ｊ　Ｉ　−ｍ　 （Ｂｏｃａ　Ｒａｔｏｎ、Ｆｌｏｒｉｄａ、ＣＲＣＰｒｅｓｓ、　Ｉｎｃ）　１ ９８４）。

しかし、大規模な小胞製造においては、脂質の水和工程が小胞製造における重大 な律速段階となり得る。

脂質の水和工程を促進するため、脂質を有機溶媒に溶かし水相に注入することが できる。これにより、この溶媒を透析または蒸発により除去できることから、小 胞の連続的製造が可能となる。エタノールを溶媒として用いると、注入により規 定されたサイズの１枚膜リポソームが形成され得る（　Ｓ、　ＢａｔＺｒｉら、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ　（１９７３）２９８：１０１５ −１０１９；　Ｊ。

Ｋｒｅｍｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　（１９７７）１６：３９３２−３ ９３５）。この方法は、エタノール中の脂質濃度が４０ｍＭ未満で、水性懸濁液 中の最終エタノール濃度が約１０％未満の場合に限り１枚膜小胞を形成する（　 Ｆ、　Ｂｏｌ　ｌｅｒら、ＥＰＯ８７３０６２０２，０，１９８７年７月１４日 出願）。これらの２つの因子は、エタノール注入により形成される限定されたサ イズのリポソームの濃度を約４ｍＭに制限する。

これはどちらかといえば薄い、リポソーム溶液である。すなわち、水溶性化合物 では封入効率が悪く、脂溶性化合物では、物質の十分な量を得るために大きな体 積が必要となるということである。これらの制限があるため、エタノール注入法 は、脂質水胞を作成する場合広く用いられなかった（Ｄ、Ｌｉｃｈｔｅｎｂｅｒ ｇ、ら＋Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ａｎａｌｙｓｉｓ” 　（Ｄ、Ｇ１１ｃｋ＆ｉ、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　５ｏｎｓ、Ｎ、Ｙ、＞（ １９８８）３３：３３７−４６２）。

脂質粒子は、両親媒性脂質と他の分子との一定の比率による複合体であり、その 結果、超分子の構造または粒子となる。

リポソームと脂質粒子との主な違いは、リポソームは水性コアを囲む連続した脂 貫二分子層を持つが、脂質粒子は持たないことである。この違いのため、多くの 場合、脂質粒子は水溶性分子を封入することができない。脂質粒子は、約５ｎｍ のサイズから１１０００ｎを超えるものまである。最終的な脂質粒子のサイズは 、組成および調製法に依存する。脂質粒子の例には、脂質エマルジョン（Ｓ、　 Ｌｊｕｎｇｂｅｒｇら、Ａｃｔａ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ　５ｕｅｃｉｃ ａ　（１９７０）７：４３５−４０）、リポタン／ｆり　（Ａ、Ｇ。

ｔｔｏら、Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ（１９８６）１２９ニア８３−８９）、 およびイスコム（ｉｓｃｏｍ）　（Ｋ、Ｌｏｖｇｒｅｎ　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ 、　Ｍａｔｈ、　（１９８７）９８：１３７−４３）がある。

発明の開示 新しい方法は、水、アルコール、ハロゲン化炭化水素溶媒中で低い溶解度を示す 化合物を含むリポソーム懸濁液の調製について開示する。この方法は、高く効率 の良い封入率を示す。さらにこの方法は、工業的規模での製造の実施に適してお り、連続工程として実施され得る。この方法の他の有意な利点は、・高濃度リポ ソームの形成、規定された直径の調製物、簡便さ、粒子形成スピード、大量生産 への移行が簡単、水／有機溶媒に対する溶解度は低いが非プロトン性溶媒に対す る溶解度は高い化合物の封入が可能であること、を含む。

この方法は、ＤＭＳＯのような非プロトン性溶媒中に難溶性化合物と、適当な脂 質とを含む溶液で、随意１こ低級アルコールの可溶量を含む溶液を調製する工程 、および、得られた溶液を適当なイオン強度と薬物組成の攪拌され、または混合 された水溶液中に、適当なサイズの開口部から注入する工程を包含する。この工 程は、連続的な製造に適して−）る。得られたリポソーム懸濁液は、必要に応じ て透析され、ある（λは濃縮され得る。

図面の簡単な説明 図１は、実施例１に述べた、リポソーム直径に対する攪拌速度の影響を示す。

図２は、リポソーム直径に対する注入速度の影響を示す。

図３は、リポソーム直径に対する注入量の影響を示す。

図４は、リポソーム懸濁液対する水溶液量の影響を示す。

図５は、リポソーム直径に対し非プロトン性溶媒量を増加させた場合（脂質濃度 および水溶液量は一定）の影響を示す。

図６は、リポソーム直径に対する水溶液温度の影響を示す。

図７は、リポソーム直径に対する水相のイオン強度の影響を示す。

図８は、リポソーム直径に対する水溶液溶貫組成の影響を示す。・ 図９は、リポソーム直径に対する水溶液中尿素濃度の影響を示す。

図１０は、リポソーム直径に対する水溶液ｐＨの影響を示す。

図１１は、ＤＭＳＯに対するＥｔＯＨの比の、リポソーム直径に対する影響を示 す。

図１２は、リポソーム直径に対する注入後のＥｔＯＨ濃度の影響を示す。

図１３は、リポソームの直径に対する種々のアルカノール／ＤＭＳＯ混合物の影 響を示す。

図１４は、リポソームの直径に対するＥｔＯＨおよび種々の非プロトン性溶媒の 影響を示す。

図１５は、ＥｔＯＨおよび３種のＤＭＳｏ／アルカノール混合物について、リポ ソーム直径に対する脂質濃度の影響を示す。

発明の実施形態 Ａ　定義 ここで用いられている「難溶性化合物」とは、標準的溶媒中で、生理的温度およ びｐＨにおいて、極めてわずかに溶けるか、実質的には溶けない（約１　ｍｇ／ ｍＬ未満）と考えられる化合物をさす。「標準的溶媒」は、水および水溶液、低 級アルコール（例、ｔば、メタノール、エタノール、プロノず７−ル、イソプロ パ７−ル、ブタノール、ｔ−ブタノール等）、ハロゲン化炭化水素（例えば、ジ クロロメタン、クロロホルム。

１．１．１−）ジクロロエタン等）を含む。適当な難溶性化合物は、シスプラチ ン、ドキソルビシン、エピネフリン、メベンダゾール、ニリダゾール、アンホテ リシンＢのようなポリエン系抗生物質、ナイスクチン、およびブリマリシン等を 含む。

ここで用いられる用語「適当な脂質」とは、リポソーム形成可能で、必要とする 濃度をリポソームとして投与する場合に実質的に毒性を示さない両親媒性化合物 をさす。適当な脂質は、一般的に極性末端またＬヨ暮水性末端と、非極性末端ま たは疎水性末端とを有する。適当な脂質には、限定されないカ、卵フォスファチ ジルコリン（ＥＰＣ）、卵フォスファチジルグリセロール（ＥＰＧ）、ジパルミ トイルフォスファチジルコリン（Ｄ　Ｐ　Ｐ　Ｃ）、コレステロール（Ｃｈｏ　 １）　、硫酸コレステロールおよびその塩（Ｃ３）、ヘミコハク酸コレステロー ルおよびその塩（Ｃｈｅｍｓ）、リン酸コレステロールおよびその塩（ＣＰ）、 フタル酸コレステロール、コレステリルフォスフォリルコリン、３．　６．　９ −トリオフサオクタン−１−オール−コレステリル−３ｅ−オール、ジミリスト イルフォスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）、ジミリストイルフォスファチ ジルコリン（ＤＭＰＣ）　、水素添加大豆フォスファチジルコリン（Ｈ３ＰＣ） 、　および他の水酸化コレステロールまたはアミンコレステロール誘導体が含ま れる（例えば、Ｋ、Ｒ，Ｐａｔｅｌら、ＢｉｏｃｈｉＩＩｌ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ 。

Ａｃｔａ（１９’８５）８１４：２５６−６４を参照）。

用語「封入量」とは、難溶性化合物を封入して適当なサイズのリポソームまたは 脂質粒子を形成するために必要な脂質量をさす。好ましくは、リポソームまたは 脂質粒子の平均サイズは、直径１．ＯＯＯｎｍ未満であり、さらに好ましくは、 約２０〜６００ｎｍである。この封入量は、特定の化合物および選択される工程 条件に依存するが、一般的には、化合物：脂質が約２＝１から約１：１００まで の範囲であり、約ｌ：ｌから約１：２０が好ましい。

用語「規定された粒子サイズの脂質−化合物懸濁液」とは、一般的に、適当な脂 質と封入あるいは複合体形成させる化合物とから形成される本発明の複合体をさ す。規定された粒子サイズの脂質−化合物懸濁液には、直径がおよそ＜１１００ ０ｎの、好ましくは２０〜６００ｎｍの粒子サイズ分布を有するリポソームおよ び脂質粒子が含まれる。

ここで用いられている用語「脂質粒子」とは、適当な脂質と、封入されあるいは 複合体形成される化合物とからなる、構造の規定されない粒子をさす。抗生物質 の脂質に対する比が高いとポリエン系抗生物質は、ポリエン構造とその脂質との 相互作用のために、典型的にはリポソームよりむしろ脂質粒子を形成する。脂質 粒子は、層状構造を有し得るが、いかなる規定し得る構造もとる必要はない。こ れらの粒子の構造については、現在不明である。

ここで用いられてる用語「非プロトン性溶媒」とは、水素供与体でない溶媒をさ し、炭化水素溶媒またはハロゲン化炭化水素溶媒は含まない。適当な非プロトン 性溶媒には、ジメチルスルフオキシド（ＤＭＳＯ）、ジオキサン、ジメチルホル ムアミド（ＤＭＦ）、アセトニトリル、１，２−ジメトキシエタン（ＤＭＥ）　 、Ｎ、Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）、スルホレイン、γブチロラクトン 、１−メチル−２−ピロリジノン（ＭＰ）　、メチルピロリンが含まれ、ＤＭＳ Ｏが好ましい。

用語「低級アルコールＪとは、式Ｒ−ＯＨ，ただしＲは炭素原子１〜６個を有す る完全に飽和した炭化水素ラジカル、で表される化合物をさす。適当な低級アル コールには、メタノール、エタノール、ｎ−７’ロバ／−ル、インプロパツール 。

ｎ−ブタノール等が含まれる。ここではエタノールとメタノールが好ましく、特 にエタノールが好ましい。

Ｂ、一般的方法 本発明の組成物は、難溶性化合物を、適当な脂質の封入量と共に、非プロトン性 溶媒中に溶かすことにより調製される。

この非プロトン性溶媒の溶液は、この脂質を溶かす必要のあるときは、さらに低 級アルカノールを含有し得る。次に得られた溶液を水溶液中に攪拌しながら押し 出し、リポソームまたは脂質粒子懸濁液を形成させる。この懸濁液は、必要に応 じて、透析され、あるいは濃縮され得る。

この非プロトン性溶媒は、ジメチルスルフオキシド（ＤＭＳＯ）、ジオキサン、 ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、アセトニトリル、１，２−ジメトキシエタン （ＤＭＥ）、Ｎ。

Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）　、スルホレイン、γブチロラクトン、１ −メチル−２−ピロリジノン（ＭＰ）　、ｔｉｊよびメチルピロリンから選択さ れる。ここでは、ＤＭＳＯが好ましい。

非プロトン性溶媒溶液中の脂質濃度は、選択される特定の脂質または脂質混合物 によって異なる。しかし、本発明の実施においては、約２ｍＭ〜約４００ｍＭの 範囲の脂質濃度を用いることができ、約４０〜１２０ｍＭが好ましい。この脂質 溶液は、低級アルカノール、好ましくはエタノールまたはメタノールを、約１： ２から８：１の非プロトン性溶媒：アルカメール比として含んでいる。ここでの 好ましい溶媒比は、ＤＭＳＯ：ＥｔＯＨが１：１から７：３である。

難溶性化合物は、使用される非プロトン性溶媒または非プロトン性溶媒／低級ア ルカノール混合液中での溶解度について選択される。使用される化合物の脂質に 対する割合の比は、使用される化合物によって化合物：脂質が約２：１から約１ ＝１００の範囲であり得、約１：１〜約１：２０が好ましい。

アンホテリシンＢ等のポリエン系化合物の場合、ここでは、約１：１の割合であ ることが好ましい。水溶性化合物は、望ましい化合物：脂質比となるよう適当な 濃度を水層中に溶かすかあるいは懸濁する。

次にこの化合物／脂質溶液を、適当な水溶液中に押し出すかあるいは注入する。

この押し出し手段は、注射筒、穴のあいた平板または管、あるいは他の適当な装 置で、約０．０５ｍｍから約５ｍｍ、好ましくは約０．８ｍｍの開口部を備えた ものであり得る。さらに、名目上の保持サイズが０．　１〜５０μである焼結し たディスクも用いることができる。本発明の方法は、押し出しの速度に敏感では ない。好都合であるためには、約０．　５〜１０ｍＬ／分／開口部の速度が示さ れる。本発明の方法は、攪拌速度にも特に敏感ではない。しかし、水溶液は、少 なくとも１５０ｒｐｍの速度で攪拌することが好ましい。脂溶性化合物の場合、 この水溶液は、緩衝化合物、防腐剤等の少量を含み得るが、そのイオン強度は約 ＩＭ　ＮａＣ１で得られるイオン強度を超えるべきではない。

好ましくは、約０．１Ｍ　ＮａＣ１溶液のイオン強度を超えるべきではなく、さ らに好ましくは、約１０ｍＭ　ＮａＣ１溶液のイオン強度を超えるべきではない 。この水溶液の温度は、一般的に、使用される脂質の転移温度と、非プロント性 溶媒／アルカノール混合物の沸点との間である。好ましくは、この温度は約２５ 〜８０°Ｃの範囲であり、さらに好ましくは、約３０〜６０℃である。この脂質 溶液の温度は、非プロント性溶媒／アルカノール混合物の凝固点から沸点までの 範囲であり得るが、一般的にはだいたい環境温度が好ましい。この水溶液の雪は 、特に本発明の方法に対し重大ではなく、形成後のリポソームまたは脂質粒子の 濃度を高くするために最低限に抑えることが好ましい。一般的に、脂質溶液の水 溶液に対する比は、約１：２５〜約１：１の範囲とすることができ、約１＝１０ 〜約１：１５であることが好ましい。

必要に応じて、得られたリポソームまたは脂質粒子懸濁液を、遠心分離、透析、 濾過、同流透析等を含む標準的技術により濃縮することができる。

懸濁液は、封入された難溶性化合物に適当な方法により使用される。この化合物 が医薬として活性のある化合物の場合、本発明の懸濁液は、例えば筋肉内、皮下 、静脈内注射のように、非経口的に投与することが好ましい。点眼、鼻腔内スプ レーまたは点鼻、局所用軟膏等の他の投与法も含まれる。

Ｃ５実施例 以下に示す実施例は、通常の当業者である実施者に対するなお一層の指針として 提供され、いかなるようにも本発明に限定を加えると解釈されるものではない。

ｌ１と扛且 以下に示す実施例において、卵フオスファチジルコリン（ＥＰＣ）　、卵フオス ファチジルグリセロール（ＥＰＧ）　、ジノ（ルミトイルフォスファチジルコリ ン（ＤＰＰＣ）は、Ｓｉｇ＋ｎａ　Ｉｎｃ、、　５ｔＬｏｕｔｓ、　Ｍｏから、 クロロホルム／エタノール溶液として入手した。コレステロール（Ｃｈｏｌ）　 、硫酸コレステロール（ナトリウム塩）（Ｃ８）、およびヘミコノ翫り酸コレス テロール（トリス塩）　（Ｃｈｅｗｓ）は、Ｓｉｇｍａから乾燥粉末として入手 した。

一部の実験において、用いられたＥＰＣ，ジミリストイルフオスファチジルグリ セロール、ジミリストイルフオスファチジルコリン、水素添加大豆フォスファチ ジルコリン（ＨＳＰＣ）は、Ｎａｔｔｅｒｍａｎ、　Ｃｏｌｏｇｎｅから乾燥粉 末として入手した。シリカゲルａｏ　（Ｍｅｒｃｋ）による、展開溶媒クロロホ ルム／メタノール／水（ｓｓ／２５／４）を泪いた、高脂質負荷の条件下での薄 層クロマトグラフィーは、上記各リン脂質について１成分のみを示した。ＤＬ− α゛−トコフエロール、５ｅｒｖａから入手した。シス−プラチナは、Ｂｒｉｓ ｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ、　５ｙｒａｃｕｓｅ、　Ｎ、Ｙ、の製品であった。

ド牛ソルビシンは、Ｆａｒｍｉｔａｌｉａから、ラクトース含有凍結乾燥粉末と して入手した。ニーメチル−２−ピロリジノン（ＭＰ）、１．２−ジメトキシエ タン（ＤＭＥ）　、γブチロラクトン、ラクトース、尿素、アンホテリシンＢ　 （Ａｍｐ　Ｂ）　、ナイスクチン、プリマリシンは、Ｓｉｇｍａから入手した。

他の化学物質は、試薬用等級であった。上記以外の溶媒は、Ｍｅｒｃｋから入手 し、それらは純品またはＨＰＬＣ用等級であった。無水エタノール（Ｅ　ｔｏｎ ）は、Ｍｅｒｃｋから入手した。２回蒸留し、脱イオン化した水を、全ての溶液 の調製に用いた。

保　゛　の− 脂質は、重量のわかっている丸底フラスコに重量を計り取るか、クロロホルム／ エタノール溶液からロータリーエヴアポレーターを用いて溶媒を除くことにより 沈着させた。この脂質は、室温で高真空下に２４時間装いた。この後、フラスコ を再度重量測定し、保存用脂質濃度を得るため、メスフラスコ中に無水エタノー ルを用いて標準量とした。０．０５ｍｏ１％トコフェロール含有卵フオスファチ ジルコリンの透明な窒素環境下の保存用溶液は、通常、エタノール溶液を６０″ Ｃに加熱することにより、３００〜４００ｍＭに調製した。ＤＰＰＣとＨＳＰＣ は、加熱しながら溶かし、３００ｍＭ濃度とした。この濃度のＨＳＰＣは、温度 が２０’Ｃまで下がるとゲル化した。全ての脂質溶液の調製には、無水溶媒を用 い、これらの溶液が空気と接触するのが最小限となるよう注意した。メタノール （ＭａＯＨ）　、プロパツール、イソプロパツールおよび３級ブタノールのよう な他のアルコールを用いた場合、卵フォスファチジルコリンは、６０℃に加熱す ることにより４（ｌｏｍＭに溶解した。保存用アルコール脂質溶液と種々の他の 溶媒は、アルコール脂質溶液をメスフラスコにピペットで測りとり、もう一方の 溶媒を印まで加えることにより、Ｖ／Ｖに基づいて混合した。コレステロールは 、６０℃に加熱することにより、エタノール中で１００！ＬＭに調製した。室温 まで温度を下げると、コレステロールは溶液から結晶化するであろう。いくつか の実験では、コレステロールは、１−メチル−２−ピロリジノンに、３６４ｍＭ の濃度で溶解した。硫酸コレステロールとＣｈｅｗｓは、ジメチルスルフオキシ ド（ＤＭＳＯ）に７ｉｎ＋Ｍ濃度で溶解した。脂質の混合物は、保存用溶液から 容量−容量に基づいて調製した。保存用脂質は、窒素環境下−２０°Ｃで保存し た。最終リポソーム調製物のリン脂質濃度は、既に記載された通り（Ｇ、　Ｂａ ｒｔｌｅｔｔ、　Ｊ、　Ｂｔｏｌ、　Ｃｈｅｗ、（１９５９）　２３４：　４６ ６−４６８）　、酸分解後リン濃度を測定することにより決定した。

注ノ（五 水槽に入ったガラス製１５ｍ１容量の反応容器を、水相を入れるために用いた。

この容器の温度は、他に指示がない限り、恒温水浴の水を循環させることにより 、３０℃に保った。この容器をマグネティックスターラーの上に置き、１　ｃｍ の攪拌子を受容コンパートメントの底に置いた。攪拌子の回転速度は、マグネテ ィックスターラーの可変抵抗器により制御し、約１１００Ｏｒｐ以下で連続的に 混合した。溶媒注入の典型的条件は以下の通りとした。３ｍｌの受容水相を容器 中に入れ、マグネティックスターラーで７５Ｏｒｐｍで攪拌した。この水相は、 設定されたａ度に平衡化させた。０．５ｍ１未満の注入には、テフロン製プラン ジャーを付けた気密性の０．５ｍｌハミルトン注射注射用いた。０．５＋ｓｌ〜 ３．０＋＊１の注入には、３ｍｌプラスチック製注射筒を用いた。この注射筒を 容器の中央で攪拌子の真上に置き、注射針（２５ゲージ）の先を、水相中、攪拌 子の約２〜４ｍｍ上に置いた。典型的実験においては、溶媒中の脂質溶液０．３ ｍｌを、３、６ｍｌ／分の速度で注入した（５秒）。この操作により、脂質溶液 は水溶液に、非常に速やかに、かつ完全に混合された。

混合状態は、脂質溶液中に色素を落し、それを水相中に注入することによって観 察できた。脂質懸濁液は、５分間攪拌した後、容器から取り出し、透析用バッグ に移した。この試料は、１００倍容の適当な緩衝液を２回交換して２４時間透析 した。

結果として、この系はきわめて強健なものであり、攪拌速度、注射速度、温度、 受容体積、水溶液：溶媒量比の広い範囲にわたる異なる注入条件下で、同様の直 径の小胞が得られる。

±囚」ｊし凶１定 小胞の直径は、ヘリウム−ネオン１００ｍＷ　ＮＥＣガスレーザーおよびＭａｌ ｖｅｒｎ　Ｋ７０２７コレレーターを用いて、動的光散乱により測定した。各検 体について３回以上測定した。この直径と多分散性は、３回の測定の平均として 報告した。

Ｋ良性上 （リポソーム作製のパラメーター） 以下の実験は、製造工程パラメーターの最終リポソーム生成物に対する影響を調 べるために行った。

（Ａ）注入条件の影響 注入条件は、まず最初に、溶媒混合液に色素を溶かすことにより調べた。注射針 の先を、マグネティックスターラーの攪拌子の真上の水相に置くと、混合が速や かであることが観察された。ＤＭＳＯ：ＥｔＯＨ（７：３）中ノア０ｍＭ　ＲＰ Ｃ溶液の０．２ｍｌを２ｍｌの水の中へ注入した場合、溶媒を混合した直後にわ ずかに乳白色の懸濁液が生成した。攪拌を行わないと、小胞直径は、１５２＋ｖ であった。攪拌速度を２５Ｏｒｐｍに増加させると、小胞直径が７１＋ｕ＋に減 少した（図１）。さらに攪拌速度を７５Ｏｒｐｍまで増加させても、得られた小 胞の直径は一定であった（図１）。従って、全ての以下の実験において、攪拌速 度は７５０ｒｐｍとした。

ｏ、　４＋１／分〜６ｍｌ／分の注入速度に対して得られたリポソームの直径は 、比較的変化しなかった（図２）。全ての以下の実験において、注入速度は、２ 〜６　ｍ１７分とした。

水相体積を一定とし、脂質および溶媒の量を増加させると、得られた小胞の直径 は、はとんど変化しなかった（図３）。

水相の溶媒に対する比および最終脂質濃度を一定として、水相体積を２ｍｌから ５ａ＋１に増加させると、小胞の直径は、６１３ｍｍから４８ｍｍへとわずかに 減少した（図４）。全ての以下の実験において、水相体積は少なくとも３　ｍｌ 、多くとも４ｍｌとした。

脂質注入量と水相量を一定とし、注入溶媒量を増加させても得られた小胞の直径 は変化しなかった（図５）。これは、試験した最高濃度では、注入後の最終混合 液は溶媒を５０％含んでいたにも関わらず、こうであった。

これらの実験において、水相の温度は３０℃を保った。しかし、水相の温度を３ ０〜８０℃へ変化させても、得られた小胞の直径に対する影響は中程度に過ぎな かった（図６）。全ての以下の注入実験において、水相の温度は、３０°Ｃに調 節した。

溶媒混合物中の脂質は、室温（２０〜２４℃）において用いた。

従って、最初の実験により、溶媒注入手順中に形成された小胞の直径は、注入系 に影響を与えることが考えられる多数の変数により、比較的変わらないことが示 された。これらの結果に基づき、標準的注入条件を以下の通りとした：脂質は、 ３０℃を保ち７５０ｒｐｍで攪拌した水相３〜４１１１１中に、２〜６１１１／ 分の速度で注入し、水相に対する最終的な溶媒の比を、０．０７５〜０．３３の 間とした。このように手順は粗く強健なものであるため、通常の実験装備で容易 に組み立てることが可能である。

（Ｂ）水相の影響 リポソーム作製の多くの手順において、イオン強度、ｐＨ１緩衝液のタイプ等の 、リポソーム形成中の水相の性質は、得られたリポソームの性質に影響を及ぼす 可能性がある（Ｌｉｃｈｔｅｎｂｅｒｇ、上述）。小胞直径とＮａＣ１モル濃度 のｌｏｇ値との間に、直線的相関がみられた（ｒ２＝０．８８）　（図７）。こ のイオン強度の小胞直径に対する明らかな影響は、塩が０．００１〜１．０ｍＭ で完全な滴定を行ったどの点においてもみられた。２種以上の調製物を比較した 場合、他の条件がすべて同一であると、高いイオン強度の水相中で形成された小 胞は大きな直径を有するという知見は首尾一貫していた。

水相中に非イオン性の溶質（グリセロール、ラクトース、尿素）を加えた場合、 小胞直径に対する影響はなく（図８）、尿素濃度を０〜８Ｍに増加させた場合で も、影響はなかった（図９）。このことは、この塩による影響がイオン強度の変 化によるものであり、水性懸濁液の浸透圧の変化によるものではないことを示唆 している。

イオン強度を比較的一定にして水相のｐＨをｐＨ１Ｏ−ｐＨ４に変化させると、 小胞の直径に対しほとんど影響を示さなかった（図１０）。しかし、ｐＨ２，０ において形成された小胞は、より高いｐＨ値において形成された小胞より多少小 さいものであった。

（Ｃ）溶媒混合物の影響 予備的実験では、溶媒混合物中の溶媒の性質および脂質濃度が、脂質懸濁液の性 状および光散乱により測定した小胞直径の両方に影響を与えた。これらの２つの パラメーターの作用は、ＥｔＯＨ注入法により一枚膜小胞ができると報告されて いる最高脂質濃度（４０ｍＭ）　（Ｋｒｅｍｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ 　（１９７７）１６：３９３２−３９３３５）およびその２倍および３倍の脂質 濃度について検討した。ＤＭＳＯ：ＥｔＯＨ比を、８二２から完全ＥｔＯＨまで 変化させても、得られた小胞直径に有意な作用を示さながった（図１１）。

従来のＥｔＯＨ注入法において（Ｂａｔｚｒｉ、上述、にｒｅｌｌ１６ｒ、上述 ）、注入する脂質を一定とした場合の水相中ＥｔＯＨの最終％は、得られた小胞 の直径に影響を与えた。この作用は図１２に示されており、得られた懸濁液中の ＥｔＯＨの％が増加するにつれ、小胞直径が変化する。これに比べ、最終溶媒％ が７．５で、同じ脂質濃度のＤＭＳＯ＋ＥｔＯＨ混合液から形成された小胞は、 直径が９３ｎｍであり、純粋のＥｔＯＨこついては４８３ｎｍであった。上記の とおり、ＤＭＳＯ：ＥｔＯＨ混合液を溶媒として用いた場合、最終溶媒％を５θ ％まで増加させても、小胞直径はほとんど変化しなかった（図５）。

ＤＭＳＯ：ＥｔＯＨ比が２＝１であると脂質がよく溶けるため、高濃度の脂質に おいてアルコールを変えることによる小胞直径に対する作用を検討した（図１３ ）。この脂質濃度において、ＤＭＳＯに混合したＥｔＯＨおよびＭｅＯＨは、そ れぞれ１１４ｎｍおよび１５４ｎｍの最小直径の小胞を形成した。プロパツール およびインプロパツールのＤＭＳＯ混合物では、有意に直径の大きい小胞が得ら れたくそれぞれ、２９５ｎｍおよび２５４ｎｍ）。最後に、３級ブタノール：　 ＤＭＳＯ混合物は、８３２ｎｍである最大直径の小胞を生成した。

後者２種の溶媒混合物は、透析後沈渣をつくる小胞懸濁液を生成した。これら３ 種について顕微鏡下で検査を行うと、従来のＭＬＶの外観（Ａ、　Ｂａｎｇｈａ ｍら、Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、（１９６５）　１３：２３ｇ−２５２）を有 する小さい構造物とより大きな構造物が混ざっているのが認められた。

エタノールを共に用いた非プロント性溶媒も、得られた小胞の直径に対し影響を 及ぼした（図１４）。併用溶媒としてのＤＭＳＯは、最小直径の小胞を生成した （１１３ｎｍ）。ジオキサン、ジメチルホルムアミド、アセトニトリル、１−メ チル−２−ピロリジノンは、１６０〜２００ｎｍの直径の小胞を生成した。テト ラヒドロフラン／ＥｔＯ■および純粋なＥｔＯＨ脂質溶液は、８００ｒｕ＋＋よ り大きな直径の小胞を生成した（図１４）。透析後、これら後者２種のリポソー ム懸濁液は、光学顕微鏡下で見ると過度に凝集した大きなＭＬＶ様構造物からな っていた。

（Ｌ′人下命ｂ） （Ｄ）臘ヌ［・ 元のＢｔＯＨ注射法において重要なパラメーターは、ＥｔＯＨ中の脂質濃度であ った（Ｋｒｅｍｅｒ、上述）。この脂質濃度の影響を、ＥｔＯＨおよび３種のＤ ＭＳＯ：アルコール（２：１）溶媒混合物、即ちＥｔＯＨ，ＭｅＯＨ，およびプ ロパツールにおいて検討した（図１５）。

上記の通り、脂質濃度がＥｔＯＨ中４０ｍＭを超える場合、得られた小胞の直径 はかなり増加した（Ｋｒｅｍｅｒ、上述）。小胞の直径は、４０ｍＭで８３ｎｍ 、　１２１ｍＭで６９０ｎｍであった。以前には示されていなかったが、調製物 の多分散性も、４０ｍＭで０．３３．１２１ｍＭで０．６９と増加する。ＤＭＳ Ｏ／プロパツール混合物でも、脂質ｍ度を１２１ｍＭまで増加させると、調製物 の小胞直径および多分散性（０，２４から０．５９）が有意に増加した。ＤＭＳ Ｑ／Ｅ　ｔＱＩ（およびＤＭＳＯ／ＭｅＯ）ｆ混合物においても、最低脂質濃度 での約５０ｎＩＩ＋から最高脂質濃度での約１５０ｎｍまでの直径の小胞が形成 された（図１５）。これと同じ脂質濃度範囲における小胞調製物の多分散性は、 ＥｔＯＨおよびＭｅＯＨ含ＯＨ媒混合物において、０．２５０から０．３７０ま で変化した。

高い脂質４度において、光散乱により測定した小胞直径の増加はぐ図Ｉ５）、こ の調製物の外観をも反映している。脂質濃ｆ、１２１ｒａＭのＥｔｏＨおよびプ ロパツール／　ＤＭＳＯ混合物については、非常に混濁した懸濁液がみられ、Ｅ ｔＯＢ／ＤＭＳＯおよびＭｅＯＨ／ＤＭＳＯ混合液では、注入後の乳白光のずっ と少ない懸濁液が生じる。

（以下余白） 大ｍ （ドキソルビシンの封入） ドキソルビシンは、癌の化学療法剤として重要な化合物である。多くの研究者に より、この化合物をリポソーム封入製剤として投与すると、動物におけるその毒 性が低下することが証明されている。過去に報告されたドキソルビシンを封入し たリポソーム製剤にはすべて、この薬剤の水溶性がｐＨ７゜４において低いにも かかわらず、乾燥脂質水和工程が用いられてきた。ドキソルビシンは、ＤＭＳＯ に非常によく溶けることから、本発明のＤＭＳＯ注入手順そのものが利用される 。

ドキソルビシンをＤＭＳＯに溶かし、ＥＰＧ：　ＥＰＣ：　Ｃｈｏｌ　（７：　 ３：　６）のエタノール溶液に加え、ＤＭＳ　Ｏ：ＥｔＯＨ（７：　３）溶媒混 合液中のドキソルビシン最終濃度を６．２ｍＭ、最終総脂質濃度を９６．４ｍＭ をする。　１ｍＬのｎ旨賀−ドキソルビシン混合液を、１４０ｍＭ　ＮａＣｌ− １０ｍＭ　Ｔｒｆｓ−ＨＣＩ　ｐＨ４，０，３０℃からなる２ｍＬの水相に注入 することにより、脂質小胞を形成した。

脂質懸濁液は、１４０ｍＭ　ＮａＣ１−１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ。

ｐＨ４，Ｏ（ＮａＣＩ−Ｔｒｉｓ）の１００倍容に対して、室温で２時間透析を 行った。リポソームに封入されたドキソルビシンは、ｌＸ４０ｃｍセフアゾ・ノ クスＲＧ−５０カラムによるカラムクロマトグラフィーをＮａＣ１−ＴｒｉＳで 容出することにより、封入されていない物質から分離した。小胞ビーク中に回収 されたドキソルビシン量は、手順の間の体積の変化により補正し、注入された最 初の量と比較することにより封入効率を得た。ドキソルビシン濃度は、リポソー ム／ドキソルビシン調整物をＴｒ　ｆ　ｔｏｎＲＸ−１００を加え加熱すること により可溶化した後、４８０ｎｍにおいて、分光測光的に測定した。

得られた小胞の直径は、２２７ｎｍであり、ドキソルビシンの４１．２％が小胞 内に封入されていた。

炙１匠主 （ポリ系脂質複合体のＨ製） （Ａ）アンホテリシンＢリポソームまたは脂質小胞の調製には（Ｒ，Ｎｅｗら、 Ａｎｔｆｍｆｃｒｏｂ　Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐ　（１９８７）８：　３７１− ３８１；Ｇ、Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎら、　”Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ　 ｔ。

Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ’　（Ｍ、０ｓｔｒｏ編　１９８７）２５３−７６； Ｆ、５ＺＯｋａら、ＡｎｔｉｍｉｃｒｏｂＡｇ　Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐ　（１ ９８７）３１：　４２１−４２９）、ポリエン系抗生物質が多くの溶媒に対して 溶解度が低いことから、常に技術上の問題が存在した（Ｎ、ＲａＪａｇｏｐａｌ ａｎら、Ｊ、Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ　５ｅｔＴｅｃｈ　（１９８８）４２：９７ ：　１０２）ｏ　ポリエン系抗生物質が多くの溶媒にあまり溶けないため、この 製剤の初期の調製では、メタノールのような溶媒を大量に必要とした（Ｌｏｐｅ ｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｌｎ、１９８７）ｏ　この調製に使用する溶媒量を減らすた め、アンホテリシンＢリポソームを形成するのにＤＭＳＯ中のアンホテリシンＢ を脂質の乾燥フィルムに加えた（Ｓｚｏｋａ、上述）。この方法では、小さな直 径の調製物が得られず、動物への使用に適する製剤を得るためには超音波処理の ような、かなりの追加の調製工程が必要であった。

本発明の方法の開発により、これらの処方の蘭単な調製が可能となった。ＤＭＳ Ｏによく溶けるのは、ポリエン系抗生物質だけではなく、ＣｈｅｍｓおよびＣｈ ｏｌＳＯ４も同様である。コレステロールは、ｌ−メチル−２ピロルジノンに非 常によく溶ける。従って、溶媒注入法は、ポリエン／ステロール複合体の調製に 用いられた。アンホテリシンＢを５ｍＭまで含有する調製物は、多くの処方によ って容易に調製されたく表１−４）。ポリエン系抗生物質については、非結合薬 物の除去のための大量透析を行った後、調製物中に９０％以上のポリエンが回収 された。これらの組成は、ポリエン：脂質が１：１または１：２の比であったた め、この製剤中の活性成分の重量％は極めて高い。直径１０００　ｎｍ未満の小 胞の複合体は、コレステロール、ＣｈｅｍｓおよびＣｈｏ　Ｉ　ＳＯ４から形成 された（表１）。ＤＰＰＣおよびＣｈ　ｅ　ｍ　ｓまたはＣｈｏ　ｌを含む３種 の適当な成分の複合体も形成された（表２）。

（以下余白） 脂質＆比−溶媒ｂ　水相　直径’　（ｎｍ）Ｃｈｏｌ　１：ｌ　ＤＭＳＯ：Ｅｔ ＯＨ７：３　１０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ　４５１Ｃｈｏｌ　Ｌ：Ｉ　ＤＭＳＯ：ＭＰ 　Ｌ：Ｉ　ＮａＣ１−Ｈｅｐｅｓ　＞１５００Ｃｈｅｍｓ　ｌ：Ｉ　ＤＭＳＯＮ ａＣ１−Ｈｅｐｅｓ　＞　１５００Ｃｈｅｗｓ　１：ｌ　ＤＭＳＯ１０ｍＭ　Ｈ ｅｐｅｓ　９０Ｃｈｅｗｓ　１：ｌ’　ＤＭＳＯ１０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ　１６０ ＣｈｏｌＳＯ４１：Ｉ　ＤＭＳＯＮａＣ１−Ｈｅｐｅｓ　＞１５００ＣｈｏｌＳ Ｏ４１：Ｌ　ＤＭＳＯｔｏ　ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ　１４３ＤＰＰＣ１：Ｉ　ＤＭＳ Ｏ：ＥｔＯＨ７：３　ＮａＣＩ−Ｈｅｐｅｓ　＞１５００ＤＰＰＣ１：Ｌ　ＤＭ ＳＯ：ＥｔＯＨ７二３　１０　ａ＋Ｍ　Ｈｅｐｅｓ　＞１５００ＤＰＰＣ１：２ 　ＤＭＳＯ：ＥｔＯＨ７：３　ＮａＣ１−Ｅｌｅｐｅｓ　＞１５００ａ、アンホ テリシンＢ：脂質比 す、溶媒体積０．２５ｍＬを、表示緩衝液３．０＋ｍＬ中に３０°Ｃで注入した 。

緩衝液のｐＨは７．４とした。

Ｃ１粒子直径は、形成緩衝液で透析後測定した。値が１５００ａｍを越える場合 は、動的光散乱により正確に測定できない大きな直径の粒子が存在することを示 している。直径が１５００ａｍを越える場合はすべて、透析バックの中に調製物 の大きな凝集及び沈澱がみられた。

ｄ、溶媒体積１．０ｍｌ、を、表示緩衝液３．０ｔａＬ中に注入した。

表主 、溶媒注入によるアンホテリシンＢ／ 複数脂質複合体の調製 Ｃｈｏｌ：ＤＰＰＣ１：Ｌ：Ｉ　ＤＭＳＯ：ＥｔＯＨ７：３　ＮａＣ１−Ｈｅｐ ｅｓ　＞１５００Ｃｈｅｍｓ：ＥＰＣ１：１：Ｉ　ＤＭＳＯ：ＥｔＯＨ７＋３　 ＮａＣ１−Ｈｅｐｅｓ　＞１５００ＣｈｅＩＩＩｓ：ＤＰＰＣ１：１：１’　Ｄ ＭＳＯ：ＥｔＯＨ７：３　１０　ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ　９２Ｃｈｅｗｓ：ＤＰＰＣ １：１：１’　ＤＭＳＯ：ＥｔＯＨ７：３　ＮａＣ１−Ｈｅｐｅｓ　＞１５００ ａ、アンホテリシンＢ：脂質比 す、溶媒体積０．２５ｍＬを、表示緩衝液３．　ＯｍＬ中に６０℃で注入した。

緩衝液のｐＨは７．４とした。

Ｃ３粒子直径は、形成緩衝液で透析後測定した。値が１５００ａｍを越える場合 は、動的光散乱により正確に測定できない大きな直径の粒子が存在することを示 している。直径が１５００ｒ＋ｍを越える場合はすべて、透析バ・ツクの中に調 製物の大きな凝集及び沈澱がみられた。

ｄ、水相の温度は、３０℃とした。

ポリエン系抗生物質であるアンホテリシンＢ（３０ｍＭ）およびナイスクチン（ ５０ｍＭ）の溶液は、ＤＭＳＯ中に調製した。！５ｉｇｍａから入手したプリマ リシン水性懸濁液は、凍結乾燥品であり、種々の溶媒で再懸濁した。ブリマリシ ンは、ＤＭＳＯに極めてよく溶けたが、室温で２時間放置すると、加熱しても溶 液中に再懸濁しない沈降物が生成した。ＤＭＳＯ：　ＭＰが１＝１溶媒溶媒液を 用いると、安定で黄色のブリマリシン溶液を調製することができた。ポリエン系 抗生物質は、ＤＭＳＯｌＤＭＳＯ：　ＭＰ、またはＤＭＳＯ：ＥｔＯＨ（７：３ ）のいずれかの溶媒混合液中で、種々の脂質と組合わせた後、水相中に注入した 。形成された調製物を透析バックに写し、１００倍容の蒸留水に対して透析を行 い、特に指示のない限り蒸留水を２回交換した。成分比及び正確な溶媒混合液、 さらに他の条件については、結果に示す。調製物の試料は、メタノールに溶かし 、そのポリエン濃度を分光測光的にアンホテリシンＢｓ　４０６　ｎ　ｍ、ナイ スタチン、３０６ｎｍ、ブリマリシン、３１８ｎｍで測定した。　（Ｓｚ。

ｋａら、上述）。

ポリエン系抗生物質を含有する調製物は、調製物中のイオン強度、ｐＨ１水相に 対する溶媒の比に感受性を示した（表１．３．４）。例えば、イオン強度が低い と（１０ｍＭ緩衝液）直径７００ｎｍ未満の粒子が得られた。この水性緩衝液に Ｏ，ＩＭ　ＮａＣ１を加えると、他の条件はすべて同一な場合、粒子サイズが、 １５００ｎｍを超え、大きな凝集がみられた。多（の脂質について、ＮａＣ１− Ｈｅｐｅｓ緩衝液られることがら、これはポリエンの作用であるといえる。

受容相のｐＨも、粒子サイズを決定づける上で重要であった。Ｃｈｅｍｓ：ポリ エン複合体の場合、最小粒子サイズは、ｐＨ≧７で得られ、ＣｈＯＩＳＯａ：ポ リエン複合体の場合、ｐＨ４，０およびｐＨ＞５において小さな直径が得られた （表３．４）。

（以下余白） 表１ 成分＆比ｓ　ｐ　Ｈｂ　水相　直径’（ｎｍ）Ａ：Ｃｈｅｍｓ　１：１：１　４ ．０　１０ｍＭ酢酸　＞　１５００Ａ：Ｃｈｅｍｓ　１：１：Ｌ　７．０　１０ ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ　１１１Ａ：Ｃｈｅｍｓ　１：１：１　ｇ、０　１０ｍＭ　Ｈ ｅｐｅｓ　１２１Ａ：ＣｈｏｌＳＯ４１：Ｌ：１　２．０　１０ｍＭグリシン〉 １５ｏ。

Ａ＋ＣｈｏｌＳＯ４１：１：１　４．０　１０ｍＭ酢酸　８６．４Ａ：Ｃｈｏｌ Ｓ０４Ｌ：１：１　５．０　１０ｍＭクエン酸　＞　１５００Ａ：ＣｈｏｌＳＯ ４１：１：１　７．０　１０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ　４５６Ａ：ＣｈｏｌＳＯ４１： １：１　８．０　１０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ　５３９Ａ：ＣｈｏｌＳＯ４１：１：１ １０．０　１０ｍＭグリシン　６１５Ａ：ＣｈｏｌＳＯ４１：１：１　７．０　 １０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ：８Ｍ尿素　６４．８ａ、アンホテリシンＢ：脂質比 す、溶媒容量０．３ｍＬを３０℃で緩衝液に注入した。

Ｃ１粒子直径は蒸留水で透析した後測定した。

値が１５００ｎｍを超える場合は、動的光散乱により正確に測定できない大きな 直径の粒子が存在していることを示している。直径が１５００ｎｍを超える場合 は、すべて、透析バッグの中に調製物の大きな凝集および沈澱がみられた。

これらの複合体において、溶媒と水相との比を変化させると、成分の濃度も増加 したが、Ｎｙ：ｃｈｏｉｓｏ＆の場合にみられた通り（表４）、粒子直径の増加 が認められ得た。

（以下余白） 表土 成分＆比ａ　ｐＨｂ　水相　直径’（ｎｍ）Ｎｙ：ＣｈｏｌＳＯ４１：ｌ：ｌ　 ４．０　１０ｍＭ酢酸　５５２Ｎｙ：ＣｈｏｌＳＯ４１：１：１　８．０　１０ ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ　３６４Ｎｙ：ＣｈｏｌＳＯ４１：１：１’　８．０　１０ａ ＋Ｍ　Ｈｅｐｅｓ　＞１５０ＯＮｙ：Ｃｈｏｌ　１：１　４．０　１０ｍＭ酢酸 　＞　１５０ＯＮｙ：Ｃｈｏｌ　ｌ：１　８．０　１０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ　＞１ ５０ＯＮｙ：Ｃｈｅｍｓ　１：１　４．０　１０ｍＭ酢酸　＞　１５０ＯＮｙ＋ Ｃｈｅｍｓ　１：１　７．０　１０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ　４５Ｎｙ：Ｃｈｅｍｓ　 ｉ：ｌ　８．０　１０＋ｎＭ　Ｈｅｐｅｓ　４７７°す７リゾン：Ｃｈｏｌ　１ ：１　７．４　１０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ　１０５２ａ、ポリエン：脂質比　ＮＹ＝ ナイスクチン。

ｂ、溶媒体積０．３ｍＬを、表示緩衝液の３．０ｍＬ中に３０℃で注入した。

Ｃ９粒子直径は、蒸留水で透析した後測定した。

値が１５００ｎｍを超える場合は、動的光散乱により正確に測定できない大きな 直径の粒子が存在していることを示している。直径が１５００ｎｍを超える場合 は、すべて、透析バッグの中に調製物の大きな凝集および沈澱がみられた。

ｄ、溶媒体積１．０ｍＬを緩衝液２．０ｍＬ中に注入した。

化学療法の研究のためのキＩＪエン：脂質複合体を作製するうえで、：　（Ｔ、 　Ｐａｔｔｅｒｓｏｎら、Ｊ、　Ｉｎｆｅｃｔ　Ｄｉｓ（１９８９）投稿中）、 この注入法の利点は、一度注入条件が確立されると、容易に生産規模を拡大でき ることである。アンホテリシンＢ：　Ｃｈ。

１ｓＯ４調製の規模を、３ｍＬから５０ｍＬに拡大する場合、より大規模な調製 により同じ粒子サイズが得られた。２番目の利点は、この方法では、２ＱＯｎｍ 未満の粒子サイズを得ることができることである。これにより、得られた製剤の フィルター滅菌が可能となる。

（Ｂ）アンホテリシンＢ−脂質粒子を調製するために他のコレステロール誘導体 が用いられ得る。例えば、リン酸コレステロール、フタル酸コレステロール、コ レステロールフオスフォリルコリン、３．　６．　９−トリオキサオクタン−１ −オール−ニレステリル−３ｅ−オール、および他の水酸化またはアミン化コレ ステロール誘導体ｉｔ、ＤＭＳＯ，Ｅ　ｔＯＨ。

メチルピロリン、またはＭＰに溶かすことができ、ＤＭＳＯに溶かしたアンホテ リシンＢと組合せて、直径７００ｎｍ未満のアンホテリシンＢ脂質粒子を形成す るために緩衝液中に注入され得る。

脂質溶液は、ＤＭＳＯＳＤＭＳＯ／ＥｔＯＨ，およびＤＭＳＯ／メチルビロリン 中に溶かしたジミリスチルフオスファチジルフリン：ジミリスチルフオスファチ ジルグリセロール（ＤＭＰＣ：　ＤＭＰＧ、７：　３）　、コレステロールフオ スフォコリン、オレイン酸コレステロール、リン酸コレステロール、フタル酸コ レステロール、およヒ硫酸コレステロールヲ用いて調製し、各成分（脂質および 抗生物質ｌｚｌ比）が１２．５ｍＭの溶液となるよう、ＤＭＳＯ中のアンホテリ シンＢに組合せた。ＤＭＳＯ／メチルピロリン混合物は２相を形成し、注入直前 に懸濁した。

各混合物の一部分（０，３ｍＬ）をとり、アンホテリシンＢ脂質粒子を形成する ために、３０℃で１０ｍＭトリス／乳酸緩衝液（ｐＨ７，０，０，１ｍＭ　ＥＤ ＴＡ）の２．７ｍＬ中に注入した。注入後、この混合液を５分間攪拌し、透析バ ッグに移し、１００倍容の１　ｍ　Ｍ　トリス／乳酸（ｐＨ７゜０〉を２回交換 し、これに対して４８時間透析した。これらの条件下、アンホテリシンＢは粒子 内に量的に保持された。

脂質粒子の直径は、レーザー光散乱により測定し、その平均値を以下の表５に報 告した。

（以下余白） 表１ アンホテリシンＢ脂質粒子 脂質組成・　溶媒　粒子直径（ｎｍ） オレイン酸　ＤＭＳＯ／メｆル　４３１コレステα−ル　ビロリン コレステリルフタレート　ＤＭＳＯ１２６ａ　各組成は、アンホテリシンＢを、 抗生物質：脂質　１：１の割合で含有した。

支立匹土 （シス−プラチナの封入） シス−プラチナ（シスプラチン）は、癌の化学療法に広く使用されている別の化 合物である。これは、ＤＭＳＯに極めてよく溶け、シス−プラチナ含有リポソー ムの形成は、ＤＭＳＯ注入法により容易に行われた。直径１００〜２２０ｎｍの リポソームは、種々の脂質組成を用いて、形成された（表６）。ここに使用され た条件下では、リポソーム懸濁液中のシス−プラチナの最終濃度は約１００μｇ 　／　ｍ　Ｌであった。

シス−プラチナは、４５ｍｇ／ｍＬ濃度でＤＭＳＯ中に溶かし、これを、ＤＭＳ Ｏ：　Ｅ　ｔＯＨ混合物７：３中の脂質濃度９０〜１３５ｍＭの中に最終濃度が ７．５ｍｇ／ｍＬ　（２５ｍＭ）となるよう種々の脂質組成物に添加した。試験 した脂質組成は、ＥＰＣ：　Ｃｈｅｍｓ　（２：　１）１３５ｍＭ、ＥＰＣ：　 ＥＰＧ　（７：　３）９０ｍＭ、およびＥＰＣ：　ＥＰＧ：Ｃｈｏｌ　（７：３ ：６）９６．４ｍＭを含む。室温において、脂質−薬物混合液は少し濁っていた 。この混合液は、水浴中６０″Ｃに少し加熱すると透明な溶液となった。脂質− 薬物溶液１ｍＬは、３０℃で、１５０ｍＭ　ＮａＣ１−１０ＮａＣ１−１Ｏ，ｐ Ｈ７，４（ＮａＣ１−Ｈｅｐｅｓ）２ｍＬ中へ注入した。このリポソームを１０ ０倍容のＮａＣ１−Ｈｅｐｅｓに対して室温で２時間透析した後、Ｉ　Ｘ４０　 ｃｍセファデックス・Ｇ−５０カラムクロマトフラフイーを用いて。

ＮａＣ１−Ｈｅｐｅｓで溶出させた。シス−プラチナ濃度は、原子吸光スペクト ル法によりプラチナ量を測定することによりめた。

紅 成分　封入効率（％）Ｓ　直径（ｎｍ）”ＥＰＣ：ＥＰＧ　７：３　７．４　１ ６９ＥＰＣ：ＥＰＧ：Ｃｈｏｌ　７：３：８　６．９　１０９ＥＰＣ：Ｃｈｅｍ ｓ　２：Ｉ　Ｌ４．５　２１６ａ　封入効率は、カラム分離後リポソーム調製物 中に残存したシス−プラチナ量の最初の量に対する％として算出した。

カラム分離後、水相中の脂質の最終総量は、約２０ｍＭであった。

ｂ　粒子直径は、Ｏ，ＩＭ　ＮａＣ１−１０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７，４に対 する透析の後測定した。

（以下余白） 実上り引ｉ （アンホテリシンＢの投与） 実施例３に示すように、アンホテリシンＢおよび硫酸）　ｌ／ステロールを用い てリポソームを調製した。この脂質粒子製剤と、遊離のアンホテリシンＢを比較 するために、侵入性アスペルギルス症の免疫抑制好中球減少ウサギモデルを用い た。

２８匹のウサギに、シクロフォスフアミドおよびトリアムシノロンを投与するこ とにより免疫を抑制した。次にこのウサギに１０６個のＡ、　ｔｕｍｉｇａｔｕ ｓを投与した。２４時間後、ウサギを３投与群に分けた：遊離アンホテリシン８ 　４．５ｍｇ／ｋｇ／日投与のウサギ８匹；遊離アンホテリシン８　７．５ｍｇ ／ｋｇ／　Ｅｌ投与のウサギ４匹；アンホテリシンＢ脂質粒子６〜９　ｍｇ／ｋ ｇ／日（アンホテリシン８３〜４．５ｍｇ／ｋｇ／日に相当）投与ウサギ５匹； アンホテリシン脂質粒子１５ｍｇ／ｋｇ／日（アンホテリシン８７．５ｍｇ／ｋ ｇＺ日に相当）投与のウサギ３匹；対照ウサギ８匹。

急性致死率（薬物投与２４時間以内の死亡）は、遊離アンホテリシン８　７．５ ｍｇ／ｋｇ投与動物の４／４および遊離アンホテリシン８　４．５ｍｇ／ｋｇ投 与動物３／８にみられた。脂質粒子製剤を投与した群に急性致死はみられなかっ た。遊離アンホテリシン８　４．５ｍｇ／ｋｇおよび脂質粒子６〜９　ｍｇ／ｋ ｇ投与群については、投与を３０日間続けた。

投与期間終了時、動物を層殺し、肝、腎、肺、および脳について、器官培養によ りＡｓｐｅｒｇｉ　１ｌｉｓ生園を調べた。この結果は、金側に対する無菌器官 （Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｉｓの無い器官）の数として表７に報告している。

アスペルギルス症の治療 群　肝　腎　肺　脳 対照　０／８　０／８　０／８　１／３遊離ＡｍｐＢ＠Ｓ／Ｓ　５１５　３１５ 　１１５脂質−ＡｍｐＢｂ４１５　４１５　４１５　３１５ａ　４．５ｍｇ／ｋ ｇ／日 ｂ６〜９ｍｇ／ｋｇ／日 この結果から、脂質粒子製剤は、遊離アンホテリシンＢ製剤と同等の有効性を示 し、毒性は有意に低かった。

爽五五旦 （水溶性化合物の封入） （Ａ）規定されたサイズのリポソームの中へのフォスフォノギ酸ナトリウムの封 入は、本発明の方法を用いて行うことができる。フォスフォノギ酸３ナトリウム の８ｈ＋Ｍ溶液（Ｓｉｇ＋＋ａ　ＣＨｅｍ１ｃａｌ　Ｃｏ、）を受容相として用 いる。ＤＭＳＯ：ＥｔＯＨ（７：３）中の９ｋＭの脂肪混合物ＥＰＣ／ＥＰＧ／ Ｃｈｏｌ　（７＋３：６）の１ｍＬを、フォスフォノギ酸溶液の２ｍＬ中に注入 する。得られるリポソームは、１００倍容の１４０ｍＭ　ＮａＣ１−１０ｍＭ　 Ｈｅｐｅｓ緩衝液（ｐＨ７，４）に対して４℃で透析し、この緩衝液は２４時間 の間に２回交換する。

最終産物中の薬物二脂質比は、当技術分野に周知の方法を用いて測定する（例え ば、Ｆ、　５ｚｏｋａら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ、　Ａｇｅｎｔｓ　Ｃｈｅｍｏ ｔｈｅｒ、　（１９８８）　３２：　８５８−６４を参照されたい）。直径≦２ ００１ｍのリポソームが形成される。

（Ｂン上記実施例１　（Ｂ）に示すとおり、リポソーム形成に対する有害な作用 を示すことなく多種の溶質を有する受容相を用いることができる。受容相中に存 在するいかなる溶質も、リポソーム形成に際し封入される。従って、弱酸、弱塩 基、アミノ酸、およびキレート剤等を封入することができる。１４０ｍＭの炭酸 ナトリウム、重炭酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、ギ酸ナトリウム、コハク酸ナ トリウム、クエン酸ｌ、２．　３ナトリウム、安息香酸ナトリウム、サリチル酸 ナトリウム、Ｅ　ＤＴＡ、およびデスフェロキサミン等の溶液を調製し、受容相 として用いる。この受容相２ｍＬ中に、ＤＭＳＯ：　ＥｔＯＨ７：３中の脂質溶 液（ＥＰＣ，１２０ｍＭ）の１ｎＬを注入する。得られるリポソーム懸濁液は、 １００倍容の２８０ｍＭ乳酸溶液により２回交換して透析を行い、封入された緩 衝液を得る。

（Ｃ）アミノ酸は、以下のように封入する。アルギニン、グリシン、グルタミン 酸、リジン、ヒスチジン、プロリン、または他のアミノ酸は、水溶液中で、望ま しい濃度およびｐＨに調製する。ＤＭＳＯ：ＥｔＯ）Ｉ　７：３中の脂質溶液（ ＥＰＣ，１２Ｏｎ＋Ｍ）の１ｍＬを、このアミノ酸溶液ｚＩＩＩＬ中に注入する 。得られたリポソーム懸濁液は、１００倍容の２８ｈ＋Ｍ乳酸溶液により２回交 換して透析を行い、封入されたアミノ酸を得る。

（以下余白） （Ｄ）数種類の化合物を同時に封入することもできる。この化合物は、水溶性で も腸溶でもよく、水溶性および脂溶性化合物の混合物であってもよい。例えば、 グリシン、アルギニン、オルニチンまたは他のアミノ酸の中から選択された化合 物１つを含む水溶性アミノ酸溶液を約１００ｍＭに調製し、ｐＨを７．４に調製 する。ＥＰＣ（１２０ｍＭ）および内毒素リピドＡ　（１ｍＭ　；　Ｊ、Ｄｉｊ ｋｓｔｒａら、Ｊ、Ｉｉａｍｕｎｏｌ、（１９８７）１３８：２６６３−７１） を含む脂質混合液（１ｍｌ）を水相２ｍｌ中に注入し、得られるリポソーム懸濁 液を１００倍量の０．１４ＭＮａＣ１で透析する。このリポソームは、水相中に １つのアミノ酸を含み、脂質相にリビドＡを含んでおり、直径は≦２００ｎｍで ある。

（Ｅ）本発明の方法を用いると、広い範囲の化合物を封入することができる。適 当な化合物としては、蛍光分子、放射標識薬剤、放射性同位元素および化合物、 常磁性化合物、スピン標本化合物、フラビン含有化合物、アミノグリコシドのよ うな抗生物質、アジドチミジンまたはデオキシシチジンのような抗ウイルス性化 合物およびそのリン酸化誘導体、ヌクレオチドおよびそのリン酸化誘導体、炭水 化物、バソプレッシン、オキシトシン、黄体ホルモン放出ホルモン、ムラミルペ プチド誘導体およびアナログのようなペプチド、カルシトニン、インスリン、カ プトプリル、ロイペプチンのようなプロテアーゼ阻害物質、レニン阻害物質、オ リゴヌクレオチドとその誘導体（例えば、Ｇ、Ｚｏｎ、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ、 　Ｒｅｓ、　（１９８８）５：５３９−４９参照）、リボ核酸、デオキシリボ核 酸、修飾された核酸、スーパーオキサイドシムスムターゼのようなタンパク、ヒ ト成長ホルモン、インターフェロン、ＩＬ−１およびＩ　Ｌ−２のようなインタ ーロイキン等があげられ、この限りではない。

本発明の方法は、ずれの低い条件で、十分サイズのそろった高濃度の、リポソー ムまたは脂質粒子を生成する上で有利である。

日Ｇ、　Ｉ ＦＩＧ、　２ 注入Ｊ痕　（ｍｌ／＃） 日０３ 日Ｇ、　４ ．９窒４不秩（而） 日Ｇ、　５ ＦＩＧ、　６ 日Ｇ、　７ ＦＩＧ、　８ ２１り和 ＦＩＧ、　９ ＦＩＧ、　１０ Ｈ ＦＩＧ、１１ ＦＩＧ、　１２ ＦＩＧ、　１３ ＦＩＧ、　１４ ＦＩＧ、　１５ １￥′を宋戊 国際調査報告

Claims (23)

【特許請求の範囲】
1. １．有用な化合物を封入する規定された粒子サイズの脂質懸濁液を調製する方法 であって、該方法は以下の工程を包含する：非ハロゲン化炭化水素の非プロトン 性溶媒を含む溶媒混合液の十分な量の中に、該有用な化合物および封入するに適 量な脂質を溶かして化合物／脂質溶液を得る工程；核化合物／脂質溶液を、適当 なサイズの開口部から水溶液中に押し出して規定された粒子サイズの脂質−化合 物懸濁液を生成する工程。
2. ２．前記有用な化合物が、水、アルコール、およびハロゲン化炭化水素の溶媒に 難溶性である、請求項１に記載の方法。
3. ３．規定された粒子サイズの前記脂質懸濁液が、リボソームの懸濁液を有する請 求項２に記載の方法。
4. ４．前記非プロトン性溶媒が、ジメチルスルホキシド、ジオキサン、ジメチルホ ルムアミド、アセトニトリル、ジメチルラセタミド、スルホレイン、γ−ブチロ ラクトン、１−メチル−２−ピロリジノン、およびメチルピロリンからなる群が ら選択される請求項３に記載の方法。
5. ５．前記有用な化合物が、シスプラチン、ドキソルビシン、エピネフリン、メベ ンダゾール、およびニリダゾールからなる群から選択される請求項３に記載の方 法。
6. ６．前記溶媒混合液が、さらに、低級アルカノールの脂質可溶化量を含む、請求 項１に記載の方法。
7. ７．前記低級アルカノールがエタノールである、請求項６に記載の方法。
8. ８．規定されたサイズの前記脂質懸濁液が、脂質粒子の懸濁液を有する請求項２ に記載の方法。
9. ９．前記有用な化合物が、アンホテリシンＢ、ナイスタチン、およびプリマリシ ンからなる群から選択される請求項８に記載の方法。
10. １０．前記脂質および前記難溶性化合物が、約１：１〜１：５の比率で存在する 請求項９に記載の方法。
11. １１．前記適当な脂質が、卵フォスファチジルコリン、卵フォスファチジルグリ セロール、ジパルミトイルフォスファチジルコリン、コレステロール、硫酸コレ ステロールおよびその塩、ヘミコハク酸コレステロールおよびその塩、フタル酸 コレステロールおよびその塩、リン酸コレステロールおよびその塩、コレステリ ルフォスフォリルコリン、３，６，９−トリオキサオクタン−１−オールーコレ ステリル−３ｅ−オール、ジミニリストイルフォスファチジルグリセロール、シ ミリストイルフォスファチジルコリン、および水素添加大豆フォスファチジルコ リンからなる群から選択される請求項１に記載の方法。
12. １２．規定された粒子サイズの前記脂質懸濁液を、さらに濃縮液とすることを包 含する請求項１に記載の方法。
13. １３．有用な水溶性化合物を封入する規定された粒子サイズの脂質懸濁液を調製 する方法であって、該方法は、以下の工程を包含する：非ハロゲン化炭化水素の 非プロトン性溶媒を含む溶媒混合液の十分な量の中に、封入するに適量な脂質を 溶かして、脂質溶液を得る工程；および該脂質溶液を、適当なサイズの開口部か ら、該有用な化合物の水溶液中に押し出して、規定された粒子サイズの脂質−化 合物懸濁液を生成する工程。
14. １４．前記有用な化合物が、弱酸、弱塩基、キレート剤、アミノ酸、蛍光分子、 放射標識薬剤、放射性同位元素および化合物、常磁性化合物、スピン標識化合物 、水溶性抗生物質、抗ウィルス性化合物、ヌクレオチドおよびそのリン酸化誘導 体、炭水化物、ペプチド、オキシトシン、黄体ホルモン放出ホルモン、ムラミル ペプチド誘導体および同族体、カルシトニン、インスリン、プロテアーゼ阻害物 質、レニン阻害物質、オリゴヌクレオチドおよびその誘導体、リボ核酸、デオキ シリボ核酸、修飾された核酸、スーパーオキサイドジスムターゼ、ヒト成長ホル モン、インターフェロン、コロニー刺激因子、神経成長因子、形質転換成長因子 αおよびβ、上皮成長因子、ＩＬ−１、およびＩＬ−２からなる群から選択され る、請求項１３に記載の方法。
15. １５．規定された粒子サイズの前記脂質懸濁液が、リポソーム懸濁液を有する、 請求項１３に記載の方法。
16. １６．前記非プロトン性溶媒が、ジメチルスルホキシド、ジオキサン、ジメチル ホルムアミド、アセトニトリル、ジメチルラセタミド、スルホレイン、γ−ブチ ロラクトン、１−メチル−２−ピロリジノンおよびメチルピロリンからなる群か ら選択される請求項１５に記載の方法。
17. １７．前記溶媒混合液が、さらに、低級アルカノールの脂質可溶化量からなる、 請求項１５に記載の方法。
18. １８．前記低級アルカノールがエタノールまたはメタノールである請求項１７に 記載の方法。
19. １９．前記脂質が、卵フォスファチジルコワン、卵フォスファチジルグリセロー ル、ジパルミトイルフォスファチジルコリン、コレステロール、硫酸コレステロ ールおよびその塩、ヘミコハク酸コレステロールおよびその塩、フタル酸コレス テロールおよびその塩、リン酸コレステロールおよびその塩、コレステリルフォ スフォリルコリン、３，６，９−トリオキサオククン−１−オールーコレステリ ル−３ｅ−オール、ジミリストイルフォスファチジルグリセロール、ジミリスト イルフォファチジルコリンおよび水素添加大豆フォスファチジルコリンからなる 群から選択される、請求項１３に記載の方法。
20. ２０．請求項１の方法による製造物。
21. ２１．請求項５の方法による製造物。
22. ２２．請求項９の方法による製造物。
23. ２３．請求項１３の方法による製造物。