PT1744764E - Formulações lipossómicas de agentes antraciclina e análogos de citidina - Google Patents

Description

ΡΕ1744764 1 DESCRIÇÃO "FORMULAÇÕES LIPOSSÓMICAS DE AGENTES ANTRACICLINA E ANÁLOGOS DE CITIDINA"

Campo Técnico A invenção relaciona-se com composições para distribuição melhorada de combinações de agentes terapêuticos. Mais particularmente, a invenção diz respeito a sistemas de distribuição que providenciam combinações do agente antraciclina daunorrubicina e do análogo de citidina citarabina. Técnica Anterior A progressão de muitas doenças que colocam a vida em risco tais como cancro, SIDA, doenças infecciosas, patologias imunológicas e patologias cardiovasculares são influenciadas por mecanismos moleculares múltiplos. Devido a esta complexidade, atingir curas com um único agente tem sido conseguido com sucesso limitado. Assim, as combinações de agentes foram muitas vezes utilizadas para combater a doença, particularmente no tratamento de cancros. Parece que existe uma forte correlação entre o número de agentes administrados e as taxas de cura para cancros tais como a leucemia linfocitica aguda e o cancro colo-rectal 2 ΡΕ1744764 metastático (Frei, et al.f Clin. Câncer Res. (1998) 4:2027-2037; Fisher, M. D.; Clin Colorectal Câncer (2001) Aug; 1(2) :85-6) .

Os antibióticos de antraciclina tais como a daunorrubicina, doxorrubicina, epirubicina e seus derivados compreendem agentes antineoplásicos conhecidos. Os fármacos à base de daunorrubicina, tais como o cloridrato de daunorrubicina, são primariamente empregues porque intercalam com o ADN, afetando várias funções do ADN, incluindo a síntese de ADN e ARN. Exibem atividade contra leucemia linfocítica aguda, leucemia granulocítica aguda, leucemia mielocítica aguda, a fase aguda de leucemia mielocítica crónica, e leucemia não linfocítica aguda. A doxorrubicina demonstrou ser efetiva no tratamento de leucemias agudas, linfomas malignos e tumores sólidos selecionados tais como tumores cancerosos da mama. A idarrubicina exibe atividade semelhante a estes antimetabolitos e foi utilizada conjuntamente com a citarabina para cariotípica adversa, leucemia mieloide aguda (AML) . Giles, F.J., et al., J. Clin. Oncol. (2003) 21(9):1722-7.

Os análogos de citidina, tais como os três exemplos de tais análogos incluindo citarabina, 5-Azacitidina, e gemcitabina, são conhecidos como agentes antineoplásicos. Por exemplo, estes compostos demonstraram eficácia na inibição da síntese de ADN em leucemia e em células cancerosas. Estas propriedades permitiram que estes compostos tratassem efetivamente a leucemia mielocítica 3 ΡΕ1744764 aguda, a leucemia linfoblástica aguda e as síndromas mielodisplásicas, cancro pancreático e cancro do pulmão. A US 2004/0052864 discute a administração de um inibidor de metilação de ADN não encapsulado e de um agente antineoplásico não encapsulado, quer singularmente ou numa mistura de fármacos livres, para o tratamento de doenças associadas a proliferação celular anormal. No entanto, não foram sugeridas nesta publicação preparações farmacêuticas designadas para controlar a distribuição ou os tempos de meia vida dos fármacos.

Semelhantemente, a Patente U.S. N.° 5,736,155 discute a preparação de agentes neoplásicos encapsulados em lipossomas. São contemplados agentes antineoplásicos simples ou múltiplos administrados simultaneamente ou sequencialmente, no entanto, não foi sugerida uma combinação de um antibiótico de antraciclina juntamente com um análogo de citidina. A US 2003/0147945 revela composições que compreendem veículos de distribuição possuindo estavelmente associadas a eles combinações não antagonísticas de dois ou mais agentes que são indicados serem úteis para se conseguirem efeitos não antagonísticos quando são administradas combinações de fármacos.

Existem várias desvantagens que limitam a utilização terapêutica de misturas de fármacos. Por exemplo, a 4 ΡΕ1744764 administração de misturas de fármacos livres resulta frequentemente na depuração rápida de um ou de todos os fármacos antes de atingir o local do tumor. Por esta razão, muitos fármacos foram incorporados em veículos de distribuição designados para os "blindar" de mecanismos que de outro modo resultariam na sua depuração a partir da corrente sanguínea. É bem conhecido que os lipossomas têm a capacidade de providenciar este efeito de "blindagem" e são assim capazes de prolongar o tempo de meia vida de agentes terapêuticos. No entanto, a formulação de fármacos específicos ou de mais do que um fármaco em veículos de distribuição provou ser difícil porque a composição lipídica do veículo muitas vezes afeta diferentemente a farmacocinética de fármacos individuais. Assim, a composição que é adequada para retenção e libertação de um fármaco poderá não ser adequada para a retenção e libertação de um segundo fármaco.

Os investigadores da presente invenção identificaram formulações de veículo de distribuição particulares requeridas para acomodar uma combinação de uma antraciclina e um análogo de citidina (nomeadamente, daunorrubicina e citarabina), que resultam numa superior retenção de fármaco e libertação de fármaco controlada de cada agente. Demonstraram adicionalmente que as razões sinérgicas destes fármacos, quando encapsulados em lipossomas, podem ser mantidas com sucesso no compartimento sanguíneo durante o tempo, resultando numa eficácia aumentada comparada com a mistura de fármacos livres e com fármacos lipossómicos individuais. 5 ΡΕ1744764

Revelação da Invenção A invenção relaciona-se com composições para administrar quantidades efetivas de combinações de fármaco de antraciclina e análogo de citidina (i.e., daunorrubicina com citarabina) utilizando veículos de distribuição lipos-sómica que foram estavelmente associados a estes pelo menos um dos agentes antraciclina atrás mencionados e um dos fármacos à base do análogo citidina atrás mencionado. Estas composições permitem que dois ou mais agentes sejam fornecidos ao local da doença de um modo coordenado, assegurando assim que os agentes estarão presentes no local da doença numa razão desejada. Este resultado será conseguido quer os agentes estejam co-encapsulados num veículo de distribuição à base de lípido, ou estejam encapsulados num veículo de distribuição à base de lípido separado administrado de modo que as razões desejadas sejam mantidas no local da doença. As farmacocinéticas (PK) da composição são controladas pelos próprios veículos de distribuição à base de lípido de modo que a distribuição coordenada seja conseguida (na condição de que as PK dos sistemas de distribuição sejam comparáveis).

Assim, num aspeto, a invenção providencia uma composição lipossómica para administração parentérica compreendendo daunorrubicina e citarabina associada aos lipossomas numa razão terapeuticamente efetiva não antagonística como definido na reivindicação 1. A razão 6 ΡΕ1744764 terapeuticamente efetiva não antagonística dos agentes é determinada através da avaliação da atividade biológica ou dos efeitos dos agentes em culturas celulares relevantes ou em sistemas isentos de células, assim como em homogenados tumorais a partir de biopsias de pacientes individuais, numa gama de concentrações. Poderá ser utilizado qualquer método que resulte na determinação de uma razão de agentes que mantenha um efeito terapêutico desejado. A composição compreende pelo menos uma das antraciclinas atrás mencionadas e um dos agentes de citidina atrás mencionados numa razão molar da antraciclina para o agente citidina que exibe um efeito biológico desejado para células relevantes em cultura, sistemas isentos de células ou homogenados tumorais. A razão é aquela à qual os agentes são não antagonísticos. Por células "relevantes", os requerentes referem-se a pelo menos uma cultura celular ou linha celular que seja adequada para testar o efeito biológico desejado. Como estes agentes são utilizados como agentes antineoplásicos, as células "relevantes" são aquelas de linhas celulares identificadas pelo Programa de Desenvolvimento Terapêutico (DTP) do National Câncer Institute (NCI)/National Institutes of Health (NIH) com úteis no seu programa de descoberta de fármacos anticancerosos. Atualmente o rastreio do DTP utiliza 60 linhas celulares diferentes de tumor humano. A atividade desejada em pelo menos uma de tais linhas celulares necessitará ser demonstrada. Por "homogenado tumoral" o requerente refere-se a células 7 ΡΕ1744764 geradas a partir da homogeneização de biopsias de pacientes ou tumores. A extração da totalidade dos tumores ou das biopsias de tumores pode ser conseguida através de técnicas médicas comuns por um clinico qualificado e a homogeneização do tecido em células únicas pode ser realizada no laboratório utilizando um número de métodos bem conhecidos na técnica.

Aqui é também descrito um método para fornecer uma quantidade terapeuticamente efetiva de uma combinação de daunorrubicina: citarabina a um alvo desejado através da administração das composições da invenção. É também aqui descrito um método para distribuir uma quantidade terapeuticamente efetiva de uma combinação de antraciclina: análogo de citidina através da administração de uma antraciclina estavelmente associada a um primeiro veiculo de distribuição e um análogo de citidina estavelmente associado a um segundo veiculo de distribuição. 0 primeiro e o segundo veiculo de distribuição poderão estar contidos em frascos separados, sendo os conteúdos dos frascos administrados a um paciente simultaneamente ou sequencialmente. Num aspeto, a razão da antraciclina e do análogo de citidina é não antagonistica. É aqui adicionalmente descrito um método para preparar uma composição terapêutica compreendendo liposso-mas contendo uma razão de pelo menos uma antraciclina e um análogo de citidina que providencia um efeito terapêutico ΡΕ1744764 desejado cujo método compreende providenciar um painel de pelo menos uma antraciclina e um análogo de citidina em que o painel compreende pelo menos uma, mas preferencialmente uma multiplicidade de razões dos referidos fármacos, testar a capacidade dos membros do painel para exercer um efeito biológico numa cultura celular relevante, sistema de células livres ou homogenado tumoral numa gama de concentrações, selecionar um membro do painel em que a razão providencia um efeito terapêutico desejado na referida cultura celular, sistema de células livres ou homogenado tumoral numa gama de concentrações adequada; e associar estavelmente a razão de fármacos representada pelo membro do painel bem-sucedido nos veículos de distribuição de fármaco à base de lípidos. 0 efeito terapêutico desejado mencionado acima é não antagonístico.

Como descrito adicionalmente adiante, no planeamento de uma combinação adequada de acordo com o método descrito acima, as razões não antagonísticas são selecionadas como aquelas que possuem um índice de combinação (Cl) de < 1.1. As formulações lipossómicas adequadas são designadas de modo que incorporem estavelmente uma quantidade efetiva de uma combinação de antraciclina: análogo de citidina (i.e., daunorrubicina: citarabina) e permitam a libertação controlada de ambos os fármacos in vivo. As formulações preferidas contêm pelo menos um lípido carregado negativamente, tal como o fosfatidilglicerol. 9 ΡΕ1744764

Breve Descrição dos Desenhos A Figura IA é um gráfico que exibe o índice de combinação (Cl) representado como uma função da fração de células de leucemia linfocítica murina P388 afetadas (fa) por combinações de daunorrubicina: citarabina (ou Ara-C) a várias razões molares: 10:1 (quadrados), 5:1 (triângulos), 1:1 (circunferências), 1:5 (triângulos invertidos) e 1:10 (círculos cheios). A FIGURA 1B é um gráfico que exibe a combinação (Cl) representada como uma função da fração de células de leucemia linfocítica murina L1210 afetadas (fa) por combinações de daunorrubicina: citarabina (ou Ara-C) a várias razões molares: 10:1 (quadrados), 5:1 (triângulos), 1:1 (losangos), 1:5 (triângulos invertidos) e 1:10 (círculos) . A FIGURA 1C é um gráfico que exibe a Cl versus várias razões molares de daunorrubicina: citarabina (10:1, 5:1, 1:1, 1:5, 1:10) em células de leucemia linfocítica murina P388. Os valores de Cl a concentrações de fármaco suficientes para provocar 75% (ED75) e 90% (ED90) de inibição de crescimento tumoral são comparados às diferentes razões molares de daunorrubicina: citarabina. A FIGURA 1D é um gráfico que exibe a Cl versus várias razões molares de daunorrubicina: citarabina (10:1, 5:1, 1:1, 1:5, 1:10) em células de leucemia linfocítica 10 ΡΕ1744764 murina L1210. Os valores de Cl a concentrações de fármaco suficientes para provocar 75% (ED75) e 90% (ED90) de inibição de crescimento tumoral são comparados às diferentes razões molares de daunorrubicina: citarabina. A FIGURA 2A é um gráfico que exibe as curvas de eliminação de plasma para a daunorrubicina e a citarabina a vários pontos de tempo após a administração intravenosa a murganhos BDF-1 em lipossomas DSPC:DSPG:CHOL (numa razão molar 7:2:1). A FIGURA 2B é um gráfico da razão daunorrubicina: citarabina (mol:mol) no plasma como uma função do tempo após a administração intravenosa de daunorrubicina: citarabina (numa razão molar de cerca de 1:5) em lipossomas de carga dual de DSPC:DSPG:CHOL (numa razão molar 7:2:1). Os pontos dos dados representam as razões molares de daunorrubicina: citarabina determinadas em plasma (+/desvio padrão) em pontos de tempo especificados. A FIGURA 3A é um gráfico que exibe a eficácia de daunorrubicina: citarabina co-introduzida e retida em lipossomas (numa razão molar de cerca de 1:5) comparada com fármacos encapsulados em lipossomas individuais e mistura de fármacos livres administrada via i.v. (Q3DX3) contra o modelo de leucemia linfocitica P388 em murganhos. Os murganhos foram organizados em grupos de tratamento adequados consistindo de controlo e grupos de tratamento incluindo solução salina (circulos), daunorrubicina lipos- 11 ΡΕ1744764 sómica (triângulos), citarabina lipossómica (quadrados), mistura de daunorrubicina: citarabina livres (9:600 mg/kg) (triângulos invertidos) e daunorrubicina: citarabina co-introduzida em lipossomas DSPC:DSPG:Chol (7:2:1, mol:mol) resultando numa razão molar final de daunorrubicina: citarabina de cerca de 1:5 (losangos). A FIGURA 3B é um gráfico que exibe a eficácia de daunorrubicina: citarabina co-introduzida e retida em lipossomas (numa razão molar de cerca de 1:5) comparada com fármacos encapsulados em lipossomas individuais e mistura de fármacos livres administrada por via i.v. (Q3DX3) contra o modelo de leucemia linfocitica L1210 em murganhos. Os murganhos foram organizados em grupos de tratamento adequados consistindo de grupos de controlo e de tratamento incluindo solução salina (círculos), daunorrubicina lipossómica (triângulos), citarabina lipossómica (quadrados), mistura de daunorrubicina: citarabina livres (12:30 mg/kg) (losangos abertos) e daunorrubicina: citarabina co-introduzida em lipossomas DSPC:DSPG:Chol (7:2:1, mol:mol) resultando numa razão molar final de daunorrubicina: citarabina de cerca de 1:5 (losangos preenchidos).

Modos de Realizar a Invenção1 1 Abreviaturas DSPC: distearoilfosfatidilcolina; PG: fosfatidilglicerol; 12 ΡΕ1744764 DSPG: distearoilfosfatidilglicerol; PI: fosfatidilinositol; SM: esfingomielina;

Chol ou CH: colesterol; CHE: éter colesterilhexadecilo; SUV: vesiculo unilamelar pequeno; LUV: vesiculo unilamelar grande; MLV: vesiculo multilamelar; MTT: brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil-2H tetrazólio; EDTA: ácido etilenodiaminotetraacético; HEPES: N-[2-hidroxiletil]-piperazina-N-[ácido 2-etanossul-fónico]; HBS: solução salina tamponada com HEPES (HEPES 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4); SHE: 300 mM sacarose, HEPES 20 mM, EDTA 30 mM; TEA: trietanolamina;

Cl: indice de combinação; fa: fração afetada. A menos que seja definido de outro modo, todos os termos da técnica, notações e outros termos científicos ou terminologia utilizada aqui possuem o mesmo significado que é comummente entendido por um perito comum na técnica à qual esta invenção pertence. Em alguns casos, os termos com significados entendidos comummente são definidos aqui por uma questão de clareza e/ou para referência pronta, e a inclusão de tais definições aqui não deverá ser necessariamente construída para representar uma diferença 13 ΡΕ1744764 substancial relativamente ao que é geralmente entendido na técnica. Muitas das técnicas e procedimentos descritos ou referenciados aqui são bem entendidos e comummente empregues utilizando a metodologia convencional por aqueles peritos na técnica. Quando adequado, os procedimentos que envolvem a utilização de kits (conjuntos) e reagentes comercialmente disponíveis são geralmente levados a cabo de acordo com protocolos definidos pelo fabricante e/ou parâmetros a menos que seja indicado o contrário.

Como utilizado aqui, "o" ou "o" significa "pelo menos um" ou "um ou mais". A invenção providencia composições compreendendo lipossomas que encapsulam pelo menos um antibiótico antraciclina (i.e., daunorrubicina) e um agente análogo de citosina (i.e., citarabina), em que o antibiótico antraciclina e o agente análogo de citosina estão presentes numa razão molar de antibiótico antraciclina: análogo de agente citosina (i.e., daunorrubicina: citarabina) de cerca de 1:5. A razão molar atrás mencionada da antraciclina: análogo de citidina exibe um efeito não antagonistico para células relevantes ou homogenados tumorais.

Em formas de realização adicionais da invenção, os veiculos de distribuição à base de lipidos descritos acima compreendem um terceiro ou um quarto agente. Poderá 14 ΡΕ1744764 ser incluído qualquer agente terapêutico, de diagnóstico ou cosmético.

Os veículos de distribuição à base de lípidos da presente invenção poderão ser utilizados não apenas em administração parentérica mas também em distribuição tópica, nasal, subcutânea, intraperitoneal, intramuscular, aerossol ou oral ou através da aplicação do veículo de distribuição sobre ou dentro de um dispositivo implantável natural ou sintético no ou perto do local alvo para propósitos terapêuticos ou imagiologia médica e semelhantes. Preferencialmente, os veículos de distribuição à base de lípidos da invenção são utilizados em administração parentérica, mais preferencialmente, administração intravenosa.

Análogos de Citidina

Os antimetabolitos ou, mais particularmente, os análogos de citidina tais como citarabina, 5-Azacitidina, e gemcitabina (2',2'-Difluorodesoxicitidina) são agentes antineoplásicos conhecidos. Os análogos de citidina poderão também ser referidos na técnica como análogos de nucleósido de citosina. Os antimetabolitos são compostos que são suficientemente semelhantes a uma química natural para participar numa reação bioquímica normal em células mas suficientemente diferentes para interferir com as normais funções e divisão das células. Estes compostos geralmente inibem um processo metabólico normal. 15 ΡΕ1744764 A citarabina é um antimetabolito nucleósido de pirimidina. Este composto é um análogo de 2'-desoxicitidina com o grupo 2'-hidroxilo numa posição trans ao grupo 3'-hidroxilo do açúcar. A citarabina é considerada equivalente a 4-Amino-l-p-d-arabinofuranosil-2(1H)-pirimidinona, Ι-β-d-arabinofuranosilcitosina, Ara-C, (3-citosina arabinosida, aracitidina, CHX-3311, U-19920, Alexan, Arabitin, Aracy- tine, Cytarbel, Cytosar, Erpalfa, Iretan e Udicil. Em análogos de citidina tais como a citarabina, a unidade açúcar compreende uma arabinose em vez de uma ribose. A citarabina é reconhecida como útil na terapia de leucemia mielocitica aguda (AML) e foi provada a sua eficácia na remissão desta patologia. No entanto, o mecanismo de ação da citarabina é incerto, apesar da incorporação desta nucleotidase no ADN conduzir a uma inibição de polime-rização por terminação da sintese de cadeia. A citarabina tem que ser "ativada" através da conversão do nucleótido 5-monofosfato (AraCMP) para terminar a sintese de cadeia. A AraCMP é em seguida capaz de reagir com nucleótido quinases selecionadas para formar nucleótidos difosfato e trifosfato (AraCDP e AraCTP). A incorporação de citarabina em ADN é especifica para a fase S, assim a dosagem foi defendida por pelo menos um ciclo celular completo para se obter a inibição da sintese de ADN. A inibição da sintese de ADN ocorre a baixas concentrações de AraCTP e inibe a elongação da cadeia de ADN através da incorporação de AraC na porção terminal de uma cadeia de ADN em crescimento. Além disso, parece 16 ΡΕ1744764 existir uma correlação entre a quantidade de AraC incorporada na cadeia e a inibição de sintese de ADN.

Os sujeitos podem desenvolver resistência à cita-rabina. Tal resistência é geralmente devida a uma deficiência de desoxicitidina quinase, que produz AraCMP. Em adição, as enzimas degradadoras tais como a citidina desaminase (que desamina AraC a arauridina não tóxica) e a dCMP (que converte AraCMP para inativar AraUMP) também afetam a eficácia.

Uma desvantagem da citarabina é a sua toxicidade. Este composto é um agente mileossupressor potente capaz de produzir leucopenia, trombocitopenia e anemia grave com variações megaloblásticas notáveis. Foram também notadas perturbações gastrointestinais, febre, conjuntivite, pneu-monite, disfunção hepática, dermatite, e efeitos secundários neurotóxicos geralmente quando são administradas doses superiores.

A 5-azacitidina (Azacitidina; 5-AzaC) é um composto que exibe atividade antineoplásica. Este composto é conhecido como útil para o tratamento de AML, leucemia linfoblástica aguda e síndromas mielodisplásicos. Os estudos atuais estão a avaliar os efeitos deste composto em beta talassemia, leucemia mieloide aguda, síndroma mielo-displásico, tumores sólidos avançados ou metastáticos, linfoma não de Hodgkin, mieloma múltiplo, cancro do pulmão não de célula pequena e cancro da próstata. A 5-AzaC 17 ΡΕ1744764 demonstrou inibir a metilação de ADN, que por sua vez afeta a expressão de gene. Os efeitos secundários incluem uma diminuição na contagem de células sanguíneas brancas e vermelhas e de plaquetas, náuseas, vómitos, fadiga, diarreia, entre outros efeitos. A gemcitabina é um nucleósido análogo que exibe atividade antitumoral. A gemcitabina HCl consiste de monocloridrato de 2'-desoxi2',2'-diflourocitidina ( (3-isó-mero) e é conhecida como efetiva no tratamento de cancro pancreático e cancro do pulmão. Em geral, a gemcitabina previne as células de formarem ADN e ARN por interferência na sintese de ácidos nucleicos. Esta ação pára o crescimento de células cancerosas, provocando que as células morram. Os efeitos secundários incluem uma diminuição na contagem de células sanguíneas brancas e vermelhas e de plaquetas, náuseas, vómitos, fadiga, diarreia, sintomas semelhantes a gripe, pruridos, entre outros efeitos.

Antibióticos de Antraciclina

Os antibióticos antraciclina tais como a daunor-rubicina e a doxorrubicina e seus derivados compreendem agentes antineoplásicos conhecidos produzidos pelos fungos Streptomyces peucetius. A idarrubicina (4-demetoxidaunor-rubicina) compreende um derivado sintético de daunorrubi-cina sem o grupo metoxi em C4 do anel aglicona. Estes compostos intercalam com ADN, afetando várias funções do ADN, incluindo a sintese de ADN e ARN. A interação com ADN 18 ΡΕ1744764 provoca geralmente quebras de cadeia simples e/ou dupla e troca de cromátides irmãs. Uma forma farmacêutica particular de daunorrubicina (cloridrato de daunorrubicina) demonstrou prevenir a divisão celular em doses que não interferem com a sintese de ácidos nucleicos. 0 mecanismo através do qual a cisão do ADN é conseguida não está completamente compreendida, mas crê-se que é mediado pela ação da topoisomerase II ou pela geração e radicais livres. Além disso, as antraciclinas são também conhecidas por interatuar com membranas celulares e alterarem as suas funções, que poderão desempenhar um papel nas suas ações antitumorais e toxicidade cardiaca. A daunorrubicina (daunomicina, rubidomicina, leucemomicina C, RP-13057, CERUBIDINE®) é conhecida como útil no tratamento de leucemia linfocitica aguda, leucemia granulocitica aguda, leucemia mielocitica aguda, a fase aguda de leucemia mielocitica crónica, e leucemia não linfocitica aguda. Em adição, este composto demonstrou possuir alguma atividade em tumores sólidos e contra linfomas. A daunorrubicina é um glicósido formado por uma agicona tatrasisclica-daunomicinona, e uma amino açúcar-daunosamina. A absorção oral da daunorrubicina é baixa, e é muito frequentemente administrada intravenosamente. A meia-vida de distribuição é 45 minutos e 19 horas para eliminação. A daunorrubicina é eliminada através da conversão para uma forma menos ativa, o daunorubicinol. A daunorrubicina e os seus derivados possuem certas toxicidades tais como depressão da medula óssea, estomatite, 19 ΡΕ1744764 alopecia, perturbações gastrointestinais, arritmias cardíacas, edema pulmonar. A desvantagem mais vastamente reconhecida destas composições é o potencial para cardio-miopatia em forma aguda ou crónica que podem rapidamente tornar-se numa situação ameaçadora da vida. A toxicidade cardíaca, em particular, manifesta-se ela própria como insuficiência cardíaca congestiva em 15-40% dos pacientes sujeitos a terapia. Geralmente, tais efeitos secundários são devidos à dosagem utilizada, com a ocorrência crescente a doses mais elevadas. Foi reconhecido, no entanto, que a administração concomitante de dexrazoxane (ADR-529) ou de amifostina (WR-2721 ou WP-1065) irá reduzir a lesão cardíaca provocada por estas composições. Além disso, existe evidência para sugerir que a lesão cardíaca durante a terapia com antraciclina pode ser reduzida através da administração simultânea dos quelantes de ferro tais como os agentes quelantes à base de dipiridoxilo e de ácido aminopolicarboxílico, e os seus quelatos metálicos. Ver Patente U.S. N.° 6,147,094. A doxorrubicina (adriamicina, rubrex, 12-naftacenodiona, 14-hidroxidaunomicina, NSC-123127) difere da daunorrubicina apenas na posse de um grupo hidroxi-acetilo em vez do grupo acetilo na daunorrubicina, na posição 8. A doxorrubicina demonstrou ser efetiva no tratamento de leucemias agudas, linfomas malignos e tumores sólidos selecionados tais como tumores cancerosos da mama. Esta composição foi utilizada juntamente com ciclofos-famida, vincristina e procarbazina no tratamento da doença 20 ΡΕ1744764 de Hodgkin e linfoma de não Hodgkin. Foram demonstradas utilizações terapêuticas Adicionais para sarcomas, mieloma de célula plasmática, carcinoma da tiroide metastático, carcinoma gástrico, carcinoma broncogénico, carcinoma celular transicional, e carcinomas do ovário, endométrio, tiroide, testículos e cerviz. As toxicidades de doxorru-bicina são semelhantes às da daunorrubicina enunciadas acima. Os análogos de doxorrubicina, tais como a epirubicina (4'-epidoxo-rubicina) , derivados morfolino e antracenodiona mitoxantrona relacionáveis, demonstraram possuir menor toxicidade cardíaca com elevada atividade clínica

Determinação de Razões Daunorrubicina: Citarabina Não Antagonísticas In Vitro

Os agentes antraciclina e análogos de citidina atrás mencionados serão encapsulados em lipossomas a razões sinérgicas ou aditivas (i.e. não antagonísticas). A determinação de razões de agentes que exibem efeitos de combinação sinérgicos ou aditivos poderá ser levada a cabo utilizando vários algoritmos, baseados nos tipos de dados experimentais descritos adiante. Estes métodos incluem métodos isobolograma (Loewe, et al., Arzneim-Forsch (1953) 3:285-290; Steel, et al., Int. J. Radiol. Oncol. Biol. Phys. (1979) 5:27-55), o método do produto fracionai (Webb, Enzyme and Metabolic Inhibitors (1963) Vol. 1, pp. 1-5. New York: Academic Press), o método de simulação de Monte Cario, CombiTool, ComboStat e o método de efeito mediano de 21 ΡΕ1744764

Chou-Talalay baseado numa equação descrita em Chou, J. Theor. Biol. (1976) 39:253-276; e Chou, Mol. Pharmacol. (1974) 10:235-247). As alternativas incluem fração sobrevivente (Zoli, et al., Int. J. Câncer (1999) 80:413- 416), resposta em percentagem à unidade de formação de granulócito/ colónia de macrófago comparada com controlos (Pannacciulli, et al., Anticancer Res. (1999) 19:409-412) e outros (Berenbaum, Pharmacol. Rev. (1989) 41:93-141; Greco, et al., Pharmacol. Rev. (1995) 47:331-385). É preferido o método de efeito mediano de Chou-Talalay. A análise utiliza uma equação em que a dose que provoca um efeito particular, fa, é dada por: D=Dm[fa/ (l-fa) ]1/m em que D é a dose do fármaco utilizado, fa é a fração de células afetadas por essa dose, Dm é a dose para o efeito mediano significando a potência e m é um coeficiente representando a forma da curva dose-efeito (m é 1 para reações de primeira ordem).

Esta equação pode ser adicionalmente manipulada para calcular o indice de combinação (Cl) com base na equação do efeito de fármaco múltiplo como descrito por Chou e Talalay, Adv. Enzyme Reg. (1984) 22:27-55; e por

Chou, et al., em: Synergism and Antagonism in Chemotherapy, Chou and Rideout, eds., Academic Press: New York 1991:223- 22 ΡΕ1744764 244. Um programa de computador (CalcuSyn) para este cálculo é encontrado em Chou and Chou ("Dose-effect analysis with microcomputers: quantitation of ED50, LD50, synergism, antagonism, low-dose risk, receptor ligand binding and enzyme kinetics": CalcuSyn Manual and Software; Cambridge: Biosoft 1987) . A equação do indice de combinação é baseada na equação de efeito de fármaco múltiplo de Chou-Talalay derivada a partir de modelos cinéticos de enzima. Uma equação determina apenas o efeito aditivo em vez de sinergia e antagonismo. No entanto, de acordo com o programa CalcuSyn, a sinergia é definida como um efeito maior que o efeito aditivo esperado, e antagonismo como um efeito menor que o efeito aditivo esperado. Chou e Talalay em 1983 propuseram a designação de CI = 1 como o efeito aditivo, assim a partir da equação de efeito de fármaco múltiplo de dois fármacos, obtemos: CI=(D)1/(Dx)1+(D)2/(Dx)2 [Eq. 1] para fármacos mutuamente exclusivos que possuem o mesmo ou semelhantes modos de ação, e é adicionalmente proposto que CI= (D) J (Dx) !+ (D) 2/ (Dx) 2+ ( (D) ! (D) J (Dx) x (Dx) 2 [Eq. 2] para fármacos mutuamente não exclusivos que possuem modos de ação totalmente independentes. Cl <1, =1 e >1 indica 23 ΡΕ1744764 sinergia, efeito aditivo, e antagonismo, respetivamente. A equação 1 ou a equação 2 impõe que o fármaco 1, (D)i, e fármaco 2, (D)2, (nos numeradores) em combinação inibem x % na experiência atual. Assim, a x % de inibição observada experimentalmente poderá não ser um número arredondado mas muito frequentemente possui uma fração decimal. (Dx)i e (Dx) 2 (nos denominadores) de equações 1 e 2 são as doses de fármaco 1 e fármaco 2 sozinhos, respetivamente, inibem x %.

Para simplicidade, a exclusividade mútua é usualmente assumida quando estão envolvidos mais do que dois fármacos em combinações (CalcuSyn Manual and Software; Cambridge: Biosoft 1987).

Uma combinação de dois fármacos poderá ser adicionalmente utilizada como uma unidade farmacêutica única para determinar interações sinérgicas ou aditivas com um terceiro agente. Em adição, poderá ser utilizada uma combinação três agentes como uma unidade para determinar interações não antagonisticas com um quarto agente, e assim por diante.

Os dados experimentais subjacentes são geralmente determinados in vitro utilizando células em cultura ou sistemas isentos de células. Preferencialmente, o indice de combinação (Cl) é representado como uma função da fração de células afetadas (fa) como ilustrado nas Figuras IA e 1B que, como explicado anteriormente, parâmetro de substi- 24 ΡΕ1744764 tuição para a gama de concentração. As combinações de agentes preferidas são aquelas que exibem sinergia ou aditividade numa gama substancial de valores de fa. As combinações de agentes são selecionadas se não antagonís-ticas em pelo menos 5% da gama de concentração em que mais que 1 % das células são afetadas, i.e., uma gama de fa superior a 0,01. Preferencialmente, uma porção maior da concentração total exibe um Cl favorável; por exemplo, 5% de uma gama de fa de 0,2 - 1,0. Mais preferencialmente 10% desta gama exibe um Cl favorável. Ainda mais preferencialmente, 20 % da gama de fa, preferencialmente mais de 50 % e mais preferencialmente mais de pelo menos 70 % da gama de fa de 0,2 a 1,0 é utilizada nas composições. As combinações que exibem sinergia numa gama substancial de valores de fa poderão ser reavaliadas relativamente a uma variedade de razões de agente para se definir a razão ótima para aumentar a força da interação não antagonistica e aumentar a gama de fa na qual é observada a sinergia.

Enquanto seria desejável possuir sinergia na gama inteira de concentrações na qual as células são afetadas, foi observado que em muitos casos, os resultados são consideravelmente mais fidedignos numa gama de fa de 0,2-0,8 quando se utiliza um método espetrofotométrico tal como o ensaio MTT detalhado no Exemplo 1. Assim, embora a sinergia exibida por combinações da invenção seja estabelecida para existir numa gama vasta de 0,01 ou superior, é preferível que a sinergia seja estabelecida na gama de fa 25 ΡΕ1744764 de 0,2-0,8. Outros ensaios mais sensíveis, no entanto, podem ser utilizados para avaliar a sinergia a valores de fa superiores a 0,8, por exemplo, ensaios de biolumines-cência ou de clonogenecidade. A razão de combinação ótima poderá ser utilizada adicionalmente como uma unidade farmacêutica única para determinar interações sinérgicas ou aditivas com um terceiro agente. Em adição, poderá ser utilizada uma combinação de três agentes como uma unidade para determinar interações não antagonísticas com um quarto agente, e assim por diante.

Como referido acima, os estudos in vitro em culturas celulares irão ser conduzidos com células "relevantes". A escolha das células irá depender da utilização terapêutica pretendida para o agente. Apenas uma linha celular relevante ou tipo de cultura celular necessita exibir o efeito não antagonístico requerido de modo a providenciar uma base para que as composições pertençam ao âmbito da invenção.

Por exemplo, numa forma de realização preferida da invenção, a combinação de agentes é pretendida para terapia anticancerosa. Numa forma de realização adicional, a combinação de agentes é pretendida para terapia de leucemia ou linfoma. Serão então feitas escolhas adequadas das células a serem testadas e da natureza do teste. Em particular, as linhas de células tumorais são sujeitos 26 ΡΕ1744764 adequados e a medição de morte celular ou de estase celular é um marcador adequado. Como irá adicionalmente ser discutido adiante, no contexto de se tentar encontrar combinações não antagonisticas adequadas para outras indicações, poderão ser empregues outras células alvo e critérios para além da citotoxicidade ou estase celular.

Para determinações envolvendo agentes antitumo-rais, poderão ser obtidas linhas celulares a partir de repositórios de linhas celulares padrão (NCI ou ATCC por exemplo), a partir de instituições académicas ou outras organizações incluindo fontes comerciais. As linhas celulares preferidas incluirão uma ou mais linhas celulares selecionadas a partir de linhas celulares identificadas pelo Programa de Desenvolvimento Terapêutico do NCI/NIH. 0 rastreio de linhas celulares tumorais utilizado por este programa identifica atualmente 60 linhas celulares tumorais diferentes representando leucemia, melanoma, e cancros do pulmão, cólon, cérebro, ovário, mama, próstata e rim. O efeito não antagonistico requerido numa gama de concentração desejada tem que ser exibido apenas num único tipo de célula; no entanto, é preferido que pelo menos duas linhas celulares exibam este efeito, mais preferencialmente três linhas celulares, mais preferencialmente cinco linhas celulares, e mais preferencialmente 10 linhas celulares. As linhas celulares poderão ser linhas celulares tumorais estabelecidas ou culturas primárias obtidas a partir de amostras de pacientes. As linhas celulares poderão ser de qualquer espécie mas a fonte preferida será mamífera e em 27 ΡΕ1744764 particular humana. As linhas celulares poderão ser geneticamente alteradas através de seleção sob várias condições laboratoriais, e/ou pela adição ou deleção de material genético exógeno. As linhas celulares poderão ser transfectadas através de qualquer técnica de transferência de gene, incluindo mas limitadas a, métodos de transfecção virai ou à base de plasmídeo. As modificações poderão incluir a transferência de cADN que codifica a expressão de uma proteina ou um péptido especifico, um elemento regulador tal como uma sequência promotor ou estimulador ou ADN ou ARN antisentido. As linhas celulares de cultura de tecido geneticamente concebidas poderão incluir linhas com e sem genes supressores de tumor, isto é, genes tais como p53, pTEN e pl6; e linhas criadas através da utilização de métodos negativos dominantes, métodos de inserção de gene e outros métodos de seleção. As linhas celulares cultura de tecido preferidas que poderão ser utilizadas para quantificar a viabilidade celular, e.g., para testar agentes antitumorais, incluem, mas não estão limitadas a, P388, L1210, HL-60, MOLT-4, KBM3, WeHi-3, H460, MCF-7, SF-268, HT2 9, HCT-116, LS180, B16-F10, A549, Capan-1, CAOV-3, IGR0V1, PC-3, MX-1 e MDA-MB-231.

Num aspeto, o efeito dado (fa) refere-se a morte celular ou estase celular após aplicação de um agente citotóxico a uma cultura celular. A morte ou a viabilidade celular poderá ser medida, por exemplo, utilizando os métodos seguintes: 28 ΡΕ1744764 _ENSAIO DE CITOTQXICIDADE_

Ensaio MTT

Exclusão de corante azul de tripano

Ensaio de incorporação de tritio (3H)-timidina radioativo ou intercalação de

ADN

Ensaio de libertação de crómio-51 radioativo

Perda de enzima glutamato piruvato transaminase, creatina fosfoquinase e lactato desidrogenase Absorção de vermelho neutro

Atividade de fosfatase alcalina

Manchamento com iodeto de propidio

Retenção de bis-carboxietil-carboxifluoresceína (BCECF)

Potencial de membrana mitocondrial

Ensaios clonogénicos VIDA/MORTE Viabilidade/Citotoxicidade ensaio Sulforodamina Ensaios B (SRB)

REFERENCIA

Mosmann, J. Immunol. Methods (1983) 65(1-2):55-63.

Bhuyan, et al., Experimental Cell Research (1976) 97:275-280.

Senik, et al., Int. J. Câncer (1975) 16(6):946-959.

Brunner, et al., Immunology (1968) 14:181-196.

Mitchell, et al., J. of Tissue Culture Methods (1980) 6(3&4):113-116.

Borenfreund and Puerner, Toxicol. Lett. (1985) 39:119-124.

Kyle, et al., J. Toxicol. Environ. Health (1983) 12:99-117.

Nieminen, et al., Toxicol. Appl. Pharmacol. (1992) 115:147-155.

Kolber, et al., J. Immunol. Methods (1988) 108:255-264.

Johnson, et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1980) 77:990-994.

Puck, et al., J. of Experimental Medicine (1956) 103:273-283.

Morris, Biotechniques (1990) 8:296-308.

Rubinstein, et al., J. Natl. Câncer Instit. (1990) 82:1113-1118._

As razões não antagoní sticas de dois ou mais agentes podem ser determinadas para indicações de doença para além de cancro e esta informação pode ser utilizada para preparar formulações terapêuticas de dois ou mais fármacos para o tratamento destas doenças. Com respeito a 29 ΡΕ1744764 ensaios in vitro, podem ser selecionados muitos marcadores mensuráveis a partir dos quais se define a sinergia do fármaco, na condição de que esses marcadores são terapeu-ticamente relevantes para a doença especifica.

Como estabelecido acima, os estudos in vitro em culturas celulares serão conduzidos com células "relevantes". A escolha de células irá depender da utilização terapêutica pretendida para o agente. Os estudos in vitro em biopsias de pacientes individuais ou tumores inteiros podem ser conduzidos com "homogenado tumoral" gerado a partir da homogeneização da(s) amostra(s) tumoral(is) em células simples.

Como mencionado aqui acima, o efeito dado (fa) poderá referir-se a morte celular ou a estase celular após aplicação de um agente citotóxico a uma cultura de células "relevantes" ou "homogenado tumoral" (ver Exemplo 1) . A morte ou viabilidade celular poderá ser medida utilizando um número de métodos conhecidos na técnica.

Preparação de Veículos de Distribuição à Base de Lipidos

Os veículos lipídicos para utilizar nesta invenção são os lipossomas. Os lipossomas podem ser preparados como descrito em Liposomes: Rational Design (A.S. Janoff, ed., Mareei Dekker, Inc., New York, NY) , ou através de técnicas adicionais conhecidas daqueles conhecedores da técnica. Os lipossomas adequados para utilizar nesta 30 ΡΕ1744764 invenção incluem vesiculos unilamelares grandes (LUVs), vesiculos multilamelares (MLVs), vesiculos unilamelares pequenos (SUVs) e lipossomas de fusão interdigitantes.

Os lipossomas para utilizar nesta invenção são preparados para conter um lípido fosfatidilcolina, nomeadamente distearilfosfatidilcolina (DSPC). Os lipossomas da invenção também contêm um esterol, nomeadamente o colesterol. Os lipossomas poderão também conter lipidos terapêuticos, cujos exemplos incluem lipidos etéreos, ácido fosfa-tídico, fosfonatos, ceramida e análogos de ceramida, esfin-gosina e análogos de esfingosina e lipidos contendo serina.

Os lipossomas poderão também ser preparados com conjugados de lípido polimérico com superfície estabili-zante hidrofílica tais como polietilenoglicol-DSPE, para aumentar a longevidade circulatória. Os lipossomas para utilizar na invenção incorporam o lípido distearoílo fosfa-tidilglicerol carregado negativamente (DSPG) para aumentar a longevidade circulatória do veículo. Os lipossomas para utilizar na invenção compreendem DSPC, DSPG e colesterol numa razão molar de cerca de 7:2:1.

Numa forma de realização, as composições lipos-sómicas de acordo com esta invenção são utilizadas preferencialmente para tratar cancro. A distribuição de fármacos encapsulados a um local de tumor é conseguida através da administração de lipossomas da invenção. Preferencialmente os lipossomas têm um diâmetro inferior a 300 nm. Mais 31 ΡΕ1744764 preferencialmente os lipossomas possuem um diâmetro inferior a 200 nm. A vasculatura tumoral tem geralmente mais perdas que a vasculatura normal devido a fenestrações ou lacunas nos endotélios. Isto permite que os veiculos de distribuição com diâmetro de 200 nm ou inferior penetrem a camada celular endotelial e a membrana basal subjacente que circunda os vasos que fornecem sangue a um tumor. A acumulação seletiva dos veiculos de distribuição nos locais do tumor após a extravasação conduz a uma distribuição de fármaco anticancro e eficácia terapêutica aumentadas.

Poderão ser utilizados vários métodos para encapsular os agentes ativos em lipossomas. A "encapsu-lação" inclui a associação covalente ou não covalente de um agente com o veiculo de distribuição à base de lípido. Por exemplo, isto pode ser feito por interação do agente com a camada ou camadas exteriores do lipossoma ou por retenção de um agente no interior do lipossoma, sendo atingido o equilíbrio entre porções diferentes do lipossoma. Assim a encapsulação de um agente pode ser por associação do agente por interação com a bicamada dos lipossomas através de interação covalente ou não covalente com os componentes do lípido ou por retenção no interior aquoso do lipossoma, ou em equilíbrio entre a fase aquosa interna e a bicamada. "Introdução" refere-se ao ato de encapsular um ou mais agentes num veículo de distribuição. A encapsulação da combinação desejada pode ser conseguida quer através de encapsulação em veículos de distribuição separados ou no mesmo veículo de distribuição. 32 ΡΕ1744764

As técnicas para encapsulação são dependentes da natureza dos veículos de distribuição. Por exemplo, os agentes terapêuticos poderão ser introduzidos nos liposso-mas utilizando ambos os métodos de introdução passivo e ativo. Os métodos passivos de encapsular os agentes ativos em lipossomas envolvem encapsular o agente durante a preparação dos lipossomas. Isto inclui um método de retenção passivo descrito por Bangham, et al. (J. Mol. Biol. (1965) 12:238). Esta técnica resulta na formação de vesí-culos multilamelares (MLVs) que podem ser convertidos em vesículos unilamelares grandes (LUVs) ou vesículos unilame-lares pequenos (SUVs) por extrusão. Outro método adequado de encapsulação passiva inclui uma técnica de injeção de éter descrita por Deamer e Bangham (Biochim. Biophys. Acta (1976) 443:629) e a técnica de Evaporação de Fase Reversa como descrito por Szoka e Paphadjopoulos (P.N.A.S. (1978) 75:4194). Em adição, outro método adequado de encapsulação passiva envolve o equilíbrio passivo após a formação de lipossomas. Este processo envolve incubar lipossomas pré-formados sob condições alteradas ou não ambientais (baseadas em temperatura, pressão, etc.) e adicionar um agente terapêutico (e.g., um análogo de citidina ou agente antraciclina) ao exterior dos lipossomas. 0 agente terapêutico equilibra-se em seguida no interior dos lipossomas, através da membrana lipossómica. Os lipossomas são em seguida colocados novamente nas condições ambientais e o agente terapêutico não encapsulado, se presente, é removido através de diálise ou outro método adequado. 33 ΡΕ1744764

Os métodos de encapsulação ativos incluem a técnica de introdução de gradiente de pH descrita nas patentes U.S. N.° 5,616,341, 5,736,155 e 5,785,987 e introdução de metal ativo. Um método de introdução de gradiente de pH é o método de introdução de citrato-base utilizando citrato como o tampão interno a um pH de 4,0 e um tampão exterior neutro. Outros métodos empregues para estabelecer e manter um gradiente de pH através de um lipossoma envolvem a utilização de um ionóforo que se pode inserir na membrana do lipossoma e transportar iões através de membranas em troca para protões (ver patente U.S. N.° 5,837,282). Poderá também ser utilizada uma técnica recente e preferida que utiliza metais de transição para conduzir a absorção de fármacos nos lipossomas através de complexação na ausência de um ionóforo. Esta técnica baseia-se na formação de um complexo fármaco-metal em vez do estabelecimento de um gradiente de pH para conduzir a absorção de fármaco.

Poderão também ser acoplados métodos de retenção passivos e ativos de modo a preparar uma formulação de lipossoma contendo mais do que um agente encapsulado.

Administração de Composições da Invenção In Vivo

Como mencionado acima, as composições de veiculo de distribuição da presente invenção poderão ser administradas a animais de sangue quente, incluindo seres humanos 34 ΡΕ1744764 assim como a espécies de aves domésticas. Para o tratamento de doenças humanas, um clinico qualificado irá determinar como é que as composições da presente invenção deverão ser utilizadas com respeito à dose, horário e via de administração utilizando protocolos estabelecidos. Tais aplicações poderão também utilizar incremento da dose se os agentes encapsulados nas composições de veiculo de distribuição da presente invenção exibirem toxicidade reduzida para os tecidos saudáveis do sujeito.

Preferencialmente, as composições farmacêuticas da presente invenção são administradas parentericamente, i.e., intra-arterialmente, intravenosamente, intraperito-nealmente, subcutaneamente, ou intramuscularmente. Mais preferencialmente, as composições farmacêuticas são administradas intravenosamente ou intraperitonealmente através de um bolo ou injeção infusional. Por exemplo, ver Rahman, et al., patente U.S. N.° 3,993,754; Sears, patente U.S. N.° 4,145,410; Papahadjopoulos, et al., patente U.S. N.° 4,235,871; Schneider, patente U.S. N.° 4,224,179; Lenk, et al., patente U.S. N°. 4,522,803; e Fountain, et al., patente U.S. N.° 4,588,578.

Noutros métodos, as preparações farmacêuticas ou cosméticas da presente invenção podem ser contactadas com o tecido alvo por aplicação direta da preparação ao tecido. A aplicação poderá ser feita através de procedimentos tópicos, "abertos" ou "fechados". Por "tópico", é entendida a aplicação direta da preparação multi-fármaco a um tecido 35 ΡΕ1744764 exposto ao ambiente, tal como a pela, orofaringe, canal auditivo externo, e semelhantes. Os procedimentos "abertos" são aqueles procedimentos que incluem fazer uma incisão na pele de um paciente e visualizar diretamente o tecido subjacente ao qual as preparações farmacêuticas são aplicadas. Isto é geralmente conseguido através de um procedimento cirúrgico, tal como uma toracotomia para se aceder aos pulmões, laparotomia abdominal para se aceder às visceras abdominais, ou outra abordagem cirúrgica direta ao tecido alvo. Os procedimentos "fechados" são procedimentos invasivos nos quais os tecidos alvo internos não são diretamente visualizados, mas acedidos através da inserção de instrumentos através de pequenos buracos na pele. Por exemplo, as preparações poderão se administradas ao peritoneu por lavado da agulha. Alternativamente, as preparações poderão ser administradas através de dispositivos endoscópicos. As composições farmacêuticas compreendendo os veículos de distribuição da invenção são preparadas de acordo com técnicas comuns e poderão compreender água, água tamponada, solução salina a 0,9%, glicina a 0,3%, dextrose a 5%, soluções de sacarose iso-osmóticas e semelhantes, incluindo glicoproteínas para estabilidade aumentada, tais como albumina, lipoproteínas, globulina, e semelhantes. Estas composições poderão ser esterilizadas por técnicas de esterilização convencionais, bem conhecidas. As soluções aquosas resultantes poderão ser embaladas para utilizar ou filtradas sob condições asséticas e liofilizadas, sendo a preparação liofilizada combinada com uma solução aquosa estéril antes da administração. As composições poderão conter substâncias 36 ΡΕ1744764 auxiliares farmaceuticamente aceitáveis como requerido para se aproximarem das condições fisiológicas, tais como agentes de ajuste de pH e tampões, agentes de ajuste de tonicidade e semelhantes, por exemplo, acetato de sódio, lactato de sódio, cloreto de sódio, cloreto de potássio, cloreto de cálcio, e semelhantes. Adicionalmente, a suspensão de veiculo de distribuição poderá incluir agentes lipido-protetores que protegem os lípidos contra lesões por radicais livres e peroxidativas de lipidos durante a armazenagem. São adequados os agentes de extinção de radicais livres lipofilicos, tais como o alfa-tocoferol e quelantes específicos para o ferro solúveis em água, tais como a ferrioxamina. A concentração de veículos de distribuição nas formulações farmacêuticas pode variar vastamente, tal como desde menos de cerca de 0,05%, usualmente a ou pelo menos cerca de 2-5% até tanto como 10 a 30% em peso e irá ser selecionada primariamente por volumes de fluido, viscosidades, e semelhantes, de acordo com o modo particular de administração selecionado. Por exemplo, a concentração poderá ser aumentada para diminuir a introdução de fluido associado ao tratamento. Alternativamente, os veículos de distribuição compostos por lípidos irritantes poderão ser diluídos para concentrações baixas para to reduzir a inflamação no local de administração. Para diagnóstico, a quantidade de veículos de distribuição administrada irá depender do rótulo específico utilizado, do estado de doença a ser diagnosticado e da decisão do clínico. 37 ΡΕ1744764

Preferencialmente, as composições farmacêuticas da presente invenção são administradas intravenosamente. A dosagem para as formulações de veiculos de distribuição irá depender da razão de fármaco para lipido e da opinião do clinico que prescreve a administração baseada na idade, peso, e estado do paciente.

Em adição a composições farmacêuticas, poderão ser preparadas formulações adequadas para utilização veterinária e administradas de um modo adequado ao sujeito. Os sujeitos veterinários preferidos incluem espécies mamíferas, por exemplo, primatas não humanos, cães, gatos, gado, cavalos, ovelhas, e aves domesticadas. Os sujeitos poderão também incluir animais de laboratório, por exemplo, em particular, ratos, coelhos, murganhos, e porquinhos-da-índia.

Kits (conjuntos)

Os agentes terapêuticos nas composições da invenção poderão ser formulados separadamente em composições individuais em que cada agente terapêutico está estavelmente associado a veiculos de distribuição adequados. Estas composições podem ser administradas separadamente a sujeitos desde que a farmacocinética dos veiculos de distribuição seja coordenada de modo que a razão de agentes terapêuticos administrados seja mantida no alvo para tratamento. Assim, é útil construir kits (conjuntos) que incluem, em recipientes separados, uma 38 ΡΕ1744764 primeira composição compreendendo veículos de distribuição estavelmente associados a pelo menos um primeiro agente terapêutico e, num segundo recipiente, uma segunda composição compreendendo veículos de distribuição estavelmente associados a pelo menos um segundo agente terapêutico. Os recipientes podem então ser embalados no kit (conjunto). 0 kit (conjunto) irá também incluir instruções tais como o modo de administração das composições a um sujeito, pelo menos incluindo uma descrição da razão de quantidades de cada composição a ser administrada. Alternativamente, ou em adição, o kit (conjunto) é construído de modo que as quantidades de composições em cada recipiente seja pré-medida de modo que os conteúdos de um recipiente em combinação com os conteúdos do outro representem a razão correta. Alternativamente, ou em adição, os recipientes poderão ser marcados com um escala de medida permitindo a dispensa de quantidades adequadas de acordo com as escalas visíveis. Os recipientes poderão eles próprios ser utilizáveis na administração; por exemplo, o kit (conjunto) poderá conter as quantidades adequadas de cada composição em seringas separadas. As formulações que compreendem a razão correta pré-formulada de agentes terapêuticos poderão também ser embaladas desta forma de modo que a formulação seja administrada diretamente a partir de uma seringa pré-embalada no kit (conjunto). A presente invenção é adicionalmente descrita através dos exemplos seguintes. Os exemplos são provi- 39 ΡΕ1744764 denciados unicamente para ilustrar a invenção por referência a formas de realização especificas. Estas exemplificações, enquanto ilustram certos aspetos específicos da invenção, não retratam as limitações ou delimitam o âmbito da invenção revelada.

Exemplos

Exemplo 1 A sinergia de Daunorrubicina: Citarabina in vitro é dependente da razão de fármaco

Muitas das combinações de dois ou mais fármacos possuem a capacidade de exibir efeitos sinérgicos. Semelhantemente, as combinações dos mesmos dois ou mais fármacos poderão também exibir interações aditivas ou anta-gonisticas. De modo a identificar as razões de daunorrubicina e citarabina (também conhecidas como Ara-C) que são sinérgicas, foram testadas várias combinações de daunorrubicina e citarabina relativamente aos seus efeitos citotóxicos in vitro. Mais especificamente, foram identificadas as razões de fármaco que demonstram sinergia sobre uma vasta gama de concentrações de fármaco. A medição de efeitos aditivos, sinérgicos ou antagonisticos foi realizada utilizando daunorrubicina: citarabina (DN:Ara-C) a razões molares de 10:1, 5:1, 1:1, 1:5 e 1:10 em células de leucemia linfocitica murina P388 e 40 ΡΕ1744764 L1210. Foi utilizado o protocolo de ensaio de citotoxicidade MTT colorimétrico à base de tetrazólio padrão (Mosmann, et al., J. Iinmunol Methods (1983) 65(1-2): 55-63) para determinar a leitura para a fração de células afetadas. Resumidamente, as células viáveis reduzem o sal de tetrazólio, brometo de 3-(4,5-dietiltiazoil-2-il)-2,5-difeniltetrazólio (MTT) a um formazano azul que pode ser lido espectrofotometricamente. As células, tais como as células de leucemia linfocitica murina P388 ou L1210 utilizadas aqui, são passadas em murganhos BDF1 e são removidas, como requerido, e transferidas para balões de 75 cm3 em meio de cultura celular fresco e adicionadas a placas de cultura celular de 96 poços a uma concentração de 10, 000 ou 6, 000 células P388 ou L1210 por poço, respetivamente, em 100 μ]1 por poço. As células são em seguida deixadas a incubar durante 24 horas a 37 °C, 5% de CO2 e humidade >75% para promover a adesão celular. No dia seguinte, são preparadas diluições de fármaco em série em placas de cultura celular de 12 poços. Os agentes, previamente preparados em várias soluções, são diluidos em meios de cultura celular frescos. Os agentes são administrados aos poços apropriados para agentes únicos (20 μ]1) e a uma razão fixa especifica de combinações de agente dual (incrementos de 20 μ]1) . Os volumes totais por poço são prefeitos até 200 μ]1 com meios frescos. A exposição ao fármaco é para uma duração de 72 horas.

Após a exposição ao fármaco, é adicionado reagente MTT (1 mg/mL de solução salina tamponada com 41 ΡΕ1744764 fosfato) a cada poço a um volume de 50 μύ por poço e incubados durante 4 horas. Os conteúdos dos poços são em seguida aspirados e são adicionados 150 μύ de dimetil-sulfóxido (DMSO) a cada poço para quebrar as células e para solubilizar o precipitado de formazano no interior das células. As placas de 96-poços são agitadas num agitador de placas durante um minimo de 2 minutos, e lidas num espetrofotómetro de microplacas regulado para um comprimento de onda de 57 0 nm. As leituras de densidade ótica (OD) são registadas e os valores de OD dos poços brancos que contêm apenas os meios são subtraídas a todos os poços que contêm células. A sobrevivência celular após a exposição a agentes é baseada como uma percentagem das células dos poços de controlo não expostos ao fármaco. Todos os poços são realizados em triplicado e são calculados os valores médios.

Em seguida é determinado um índice de combinação para cada dose de daunorrubicina :citarabina utilizando o Calcusyn que é baseado na teoria de Chou e Talalay de análise dose-efeito, em que foi utilizada uma "equação mediana-efeito" para calcular um número de equações bioquímicas que são extensivamente utilizadas na técnica. As derivações desta equação deram origem a equações de ordem superior tais como aquelas utilizadas para calcular o índice de Combinação (Cl) . Como mencionado previamente, o Cl pode ser utilizado para determinar se as combinações de mais que um fármaco e várias razões de cada combinação são antagonísticas (Cl > 1,1), aditivas (0,9 < Cl ã 1,1) ou 42 ΡΕ1744764 sinérgicas (Cl < 0,9). Os gráficos são tipicamente ilustradas com Cl representando o eixo dos yy versus a proporção de células afetadas, ou fração afetada (fa) , no eixo dos xx. Os dados nas Figuras IA e 1B, representados como Cl versus a fração de células de leucemia linfocitica murina P388 ou L1210 afetadas (fa) , respetivamente, ilustram que as combinações particulares de daunorrubicina e citarabina são antagonisticas enquanto que outras são sinérgicas ou aditivas. A razões de daunorrubicina: citarabina (DN:Ara-C) de 1:10, 1:5 e 1:1, é observada sinergia em células P388 a valores de fa de 0,75 e superiores (Figura IA) . Isto demonstra que as razões de 1:1, 1:10 e 1:5 são sinérgicas a concentrações suficientes para provocar morte celular tumoral significativa. As razões 1:5 e 1:10 ou daunorrubicina :citarabina são também não antagonisticas em células L1210 numa gama adequada de valores fa (Figura 1B) . Em contraste, as razões de 5:1 e 10:1 de daunorrubicina: citarabina são antagonisticas em células P388 e L1210 numa vasta gama de valores de fa. A dependência de Cl da razão de daunorrubicina :citarabina é também apresentada nas Figuras 1C e 1D em que os valores de Cl a concentrações de fármacos suficientes para provocar 75% (ED75) e 90% (ED90) de inibição de crescimento de células tumorais são comparados a diferentes razões molares de daunorrubicina: citarabina em células P388 e L1210. Com base nestes resultados, foi selecionada uma razão molar de daunorrubicina: citarabina de 1:5 para formulação em veiculos lipossomas de razão de fármaco fixa. 43 ΡΕ1744764

Exemplo 2 A Daunorrubicina e a Citarabina podem ser introduzidas dualmente em lipossomas

Os lipossomas contendo ambas a daunorrubicina e a citarabina poderão ser gerados utilizando lipossomas DSPC/DSPG/Colesterol (numa razão molar 7:2:1) contendo citarabina retida passivamente que foi introduzida ativamente com a daunorrubicina. Resumidamente, as espumas de lipido foram preparadas por dissolução de lipidos (DSPC:DSPG:CHOL (numa razão molar 7:2:1) misturadas a uma concentração de 100 mg de lípido/mL de concentração final numa mistura de clorofórmio: metanol: H2O (95:4:1 vol/vol). O solvente foi em seguida removido por evaporação sob vácuo e as espumas de lipido resultantes foram hidratadas com uma solução que consiste em Cu(gluconato)2 100 mM, tri-etanolamina (TEA) 220 mM, pH 7,4 e citarabina (contendo 3H-citarabina como um marcador) 50 mg/mL (203 mM) a 70 °C. Os MLVs resultantes foram sujeitos a extrusão 10 vezes a 70 °C para gerar vesiculos unilamelares grandes. O diâmetro médio dos lipossomas resultantes foi determinado por análise de QELS (dispersão de luz quasi-elástica) como sendo aproximadamente 100 nm +/- 20 nm. Subsequentemente, os lipossomas sofrerem permuta de tampão em sacarose 300 mM, HEPES 20 mM, EDTA 1 mM (SHE), pH 7,4, utilizando diálise de fluxo tangencial, removendo assim qualquer citarabina não encapsulada e Cu(gluconato)2/TEA. As razões molares de Citarabina para lipido foram determinadas utilizando 44 ΡΕ1744764 contagem de cintilação liquida para determinar a concentração de lipido (14C-DPPC) e a concentração de citarabina (3H-Citarabina) . A Daunorrubicina foi adicionada a estes lipos-somas até uma razão molar final alvo de daunorrubicina: citarabina de 1:5. A introdução de Daunorrubicina nos lipossomas foi facilitada através da incubação das amostras a 50 °C durante 30 minutos. Após a introdução, a amostra foi arrefecida até à temperatura ambiente. A eficiência de encapsulação de fármaco foi avaliada após eluição do lipos-soma através de uma coluna de centrifugação sephadex G-50. A eficiência de introdução de Daunorrubicina foi determinada utilizando uma curva de absorvância a 480 nm contra um padrão. Foi determinada uma razão de fármaco para lipido a cada ponto de tempo utilizando a absorvância a 480 nm para a medição de daunorrubicina e contagem de cintilação liquida para determinar as concentrações de lipido. A Tabela 1 apresenta a razão média de daunorrubicina/lipido e a razão de citarabina/lipido após encapsulação do fármaco e remoção do fármaco livre. É aparente a partir da Tabela 1 que a daunorrubicina, adicionada a uma razão inicial de daunorrubicina para lipido de 0,042:1, pode ser eficientemente introduzida em lipossomas DSPC/DSPG/Chol (numa razão molar 7:2:1), contendo citarabina passivamente retida a uma razão de fármaco para lipido de 0,234. 45 ΡΕ1744764

Tabela 1: Daunorrubicina :Citarabina co-introduzida em lipossomas DSPC:DSPG:CHOL (7:2:1 mol: mol).

Razão molar Daunor- Razão molar Citara- Razão Daunorrubici- rubicina:lipido bina: lipido na: citarabina 0,0418 + /- 0,0041 0,234 + /- 0,0239 0,178 +/- 0,013 - Os Dados representam a média + /- desvio padrão, n= 10.

Exemplo 3

Manutenção das razões de fármacos in vivo

Para determinar se a daunorrubicina e a citara-bina poderiam ser mantidas à razão fármaco: fármaco de 1:5 na gama sinérgica in vivo, foram administrados lipossomas DSPC/DSPG/Chol (7:2:1 mol:mol), contendo daunorrubicina e citarabina encapsuladas intravenosamente a murganhos e a razão fármaco/fármaco no plasma foi monitorizada em função do tempo.

Resumidamente, as espumas de lipido foram preparadas através da dissolução da mistura de lipidos (DSPC:DSPG:CHOL (numa razão molar 7:2:1)) a uma concentração de 100 mg de lipido /ml de concentração final numa mistura clorofórmio: metanol: H20 (95:4:1 vol/vol). O solvente foi em seguida removido por evaporação sob vácuo e as espumas de lipido resultantes foram hidratadas com uma solução consistindo de Cu (gluconato)2 100 mM, trieta-nolamina (TEA) 220 mM, pH 7,4 e de citarabina (contendo quantidades vestigiárias de 3H-citarabina) 50 mg/mL (203 46 ΡΕ1744764 mM) a 70 °C. Os MLVs resultantes foram sujeitos a extrusão a 70 °C para gerar vesículos unilamelares grandes. O diâmetro médio dos lipossomas resultantes foi determinado por análise de QELS (dispersão de luz quasi-elástica) como sendo aproximadamente 100 nm +/- 20 nm. Subsequentemente, os lipossomas sofrerem permuta de tampão em sacarose 300 mM, fosfato de sódio 20 mM, EDTA 10 mM, pH 7,4, utilizando diálise de fluxo tangencial, removendo assim qualquer citarabina não encapsulada e Cu(gluconato)2/TEA. A Daunorrubicina foi adicionada a estes lipossomas de modo que a razão molar final de daunorrubicina para citarabina fosse de cerca de 1:5. A introdução de Daunorrubicina nos lipossomas foi facilitada através da incubação das amostras a 50 °C durante 30 minutos. Após a introdução, a amostra foi arrefecida até à temperatura ambiente. A eficiência da encapsulação de fármaco foi avaliada após eluição de lipossoma através de uma coluna de centrifugação Sephadex G-50. As razões de Citarabina para lipido foram determinadas utilizando contagem de cintilação liquida para determinar as concentrações de lipido (14C-DPPC) e de citarabina (3H-Citarabina) . A eficiência de introdução de Daunorrubicina foi medida utilizando uma curva de absorvância a 480 nm contra um padrão. A razão de fármaco para lipido foi determinada utilizando a medição de absorvância a 480 nm para a daunorrubicina e a contagem de cintilação liquida para determinar as concentrações de lipido e de citarabina. 47 ΡΕ1744764 A preparação foi em seguida injetada intravenosamente através da veia da cauda em murganhos BDF-1. As doses das formulações lipossómicas foram de 5 mg/kg de daunorrubicina e 12,5 mg/kg de citarabina. Aos pontos de tempo indicados após a administração intravenosa, foi recolhido sangue através de punctura cardiaca (3 murganhos por ponto de tempo) e colocado em micro recipientes revestidos com EDTA. As amostras foram centrifugadas até separar o plasma, e o plasma foi transferido para outro tubo. Os niveis de Daunorrubicina e citarabina no plasma foram quantificados através de Cromatografia Liquida de Alta Eficiência (HPLC). A Figura 2A mostra as curvas de eliminação no plasma para a daunorrubicina e a citarabina a vários pontos de tempo após administração intravenosa a murganhos BDF-1 quando foram distribuídos nos lipossomas descritos acima Uma hora após a injeção iv a concentração de daunorrubicina no plasma foi de 167 nmol/mL e foi observada uma concentração de 872 nmol de citarabina/mL de plasma. A quatro horas após a injeção a concentração de daunorrubicina foi de 143 nmol/mL e a concentração de citarabina foi de 781 nmol/mL. A Figura 2B mostra que os níveis de daunorrubicina e de citarabina no plasma foram efetivamente mantidos numa gama sinérgica durante um período de tempo prolongado após a administração intravenosa a murganhos BDF-1 quando os fármacos foram distribuídos simultaneamente 48 ΡΕ1744764 nos lipossomas descritos acima. Os pontos de dados representam as razões molares de daunorrubicina: citarabina determinados em plasma (+/- desvio padrão) aos pontos de tempo especificados. Consequentemente, os veículos de distribuição adequadamente concebidos tais como os lipossomas podem providenciar a razão de daunorrubicina e de citarabina desejada in vivo.

Exemplo 4 A Daunorrubicina e a Citarabina co-formuladas em lipossomas a uma razão sinérgica demonstram uma eficácia antitumoral superior

Para maximizar a atividade terapêutica de combinações de fármaco e para capturar os benefícios sinérgicos observados in vitro, a combinação de fármaco necessita ser distribuída aos locais tumorais à razão ótima de fármaco para fármaco. Foi desenvolvida uma formulação lipossoma única contendo os dois fármacos a razões fixas conhecidas como sendo sinérgicas em cultura de tecido permitindo coordenar a libertação de fármaco in vivo como ilustrado no exemplo 3. A atividade antitumoral desta formulação foi então avaliada em modelos de leucemia linfocítica murina P388 e L1210.

Os lipossomas DSPC/DSPG/Chol (numa razão molar 7:2:1) co-encapsulados com daunorrubicina e citarabina a uma razão molar sinérgica de aproximadamente 1:5 foram preparados como descrito no Exemplo 3. 49 ΡΕ1744764

De modo a se realizarem estudos tumorais em murganhos, os animais foram inoculados ip com células tumorais 1 x ΙΟ6 P388 ou L1210 que foram em seguida deixadas crescer durante 24 h antes do inicio do tratamento. Os murganhos foram organizados em grupos de tratamento adequados consistindo de grupos de controlo e de tratamento incluindo solução salina, Daunorrubicina lipossómica, Cita-rabina lipossómica, mistura de fármacos livres e daunorrubicina: citarabina co-introduzidas em lipossomas DSPC:DSPG:Chol (7:2:1, mol:mol) resultando numa razão molar final de daunorrubicina: citarabina de aproximadamente 1:5. Os murganhos foram injetados intravenosamente com o volume de amostra requerido para administrar a dose prescrita para os animais com base em pesos de murganho individual aos dias 1, 4 e 7 após as inoculações com as células tumorais. Os animais foram pesados e monitorizados relativamente à sobrevivência e as observações na vida são recolhidas na altura da medição de peso. A Figura 3 ilustra os resultados destas experiências.

Como a Figura 3A indica, foi observada uma atividade antitumoral significativamente intensificada para a formulação de lipossoma contendo daunorrubicina: citarabina co-introduzida a uma razão molar de cerca de 1:5 comparada com cada agente único formulado individualmente nos lipossomas, assim como mistura de fármacos livres administrados na sua dose tolerada máxima (MTD). 0 grupo de controlo tampão possuía um tempo de sobrevivência mediano 50 ΡΕ1744764 de 8 dias. Os animais tratados com daunorrubicina lipossó-mica a uma dose de 5 mg/kg exibiram um tempo de sobrevivência mediano de 16 dias correspondendo a um aumento no tempo de sobrevivência de 100%. Os murganhos tratados com citarabina lipossómica a 12,5 mg/kg exibiram um tempo de sobrevivência mediano de 22 dias correspondendo a um aumento no tempo de sobrevivência de 175% e os murganhos tratados com daunorrubicina e citarabina co-introduzidas a uma razão molar de fármaco de cerca de 1:5 no interior de lipossomas DSPC:DSPG:Chol (7:2:1, mol:mol) exibiram um tempo de sobrevivência mediano de >60 dias e aumento no tempo de vida de >650% com 9/10 sobreviventes de longo termo. Em comparação, os murganhos tratados com a mistura de daunorrubicina: citarabina como a mistura de fármacos livres a sua MTD (baseado na dose maximizante de ambos os fármacos livres) não respondeu assim como à terapia antitumoral como refletido pelo tempo de sobrevivência mediano de 27 dias e o aumento correspondente no tempo de vida de 237%. Semelhantemente, como observado na Figura 3B, foi conseguida uma atividade antitumoral superior para a formulação de lipossoma com daunorrubicina e citarabina co-introduzida a uma razão molar de cerca de 1:5 como comparada quer com a mistura de fármacos livres correspondente ou com cada fármaco introduzido individualmente num lipossoma. O grupo de controlo de tampão possui um tempo de sobrevivência mediano de 7 dias.

Os murganhos tratados quer com daunorrubicina encapsulada em lipossomas ou com citarabina encapsulada em 51 ΡΕ1744764 lipossomas possuem um tempo de sobrevivência mediano de 20 e 43,5 dias, respetivamente. Em comparação, os animais tratados com daunorrubicina e citarabina co-introduzidas a uma razão molar de cerca de 1:5 em lipossomas DSPC/DSPG/Chol (7:2:1 mol razão) exibiram um tempo de sobrevivência mediano superior a 60 dias.

Estes resultados demonstram que a fixação de razões sinérgicas de daunorrubicina: citarabina através da sua encapsulação no interior de lipossomas adequadamente concebidos pode melhorar dramaticamente a atividade antitumoral.

Os exemplos acima são incluidos apenas com propósitos ilustrativos e não pretendem limitar o âmbito da invenção. São possíveis muitas variações àquelas descritas acima. Uma vez que as modificações e as variações aos exemplos descritos acima serão aparentes para aqueles peritos na técnica, pretende-se que esta invenção seja limitada apenas pelo âmbito das reivindicações anexas. A citação das publicações ou documentos acima não pretende ser encarada como um reconhecimento de que qualquer um dos precedentes é técnica antecedente pertinente, nem constitui qualquer reconhecimento dos conteúdos ou dados destas publicações ou destes documentos.

Lisboa, 24 de Agosto de 2012

Claims (4)

1. ΡΕ1744764 1 REIVINDICAÇÕES 1. Uma composição adequada para administração parentérica a um sujeito, cuja composição compreende daunorrubicina e citarabina encapsulada em lipossomas numa razão molar de daunorrubicina: citarabina de cerca de 1:5, e em que os lipossomas compreendem distearoilfosfati-dilcolina (DSPC), distearoilfosfatidil-glicerol (DSPG) e colesterol numa razão molar de cerca de 7:2:1.
2. 2. A composição da reivindicação 1, em que a daunorrubicina e a citarabina estão co-encapsuladas.
3. 3. A composição da reivindicação 1 ou 2 for utilizar num método de tratar uma leucemia num sujeito.
4. 4. A composição da reivindicação 3, em que o sujeito é um ser humano. Lisboa, 24 de Agosto de 2012