CN115414376A - 选择白血病对象的治疗方案的分析和方法 - Google Patents

选择白血病对象的治疗方案的分析和方法 Download PDF

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Abstract

用于鉴定适合用CPX‑351治疗的患有癌症的对象的诊断方法包括对来自候选对象的细胞进行遗传和离体测试。CPX‑351和FLT‑3抑制剂联合治疗可改善CPX‑351摄取和毒性。

Description

选择白血病对象的治疗方案的分析和方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2015年11月11日提交的美国临时申请62/254,109的优先权。该文献的内容通过引用纳入本文。
技术领域
本发明涉及癌症诊断和治疗领域。更具体地说，本发明涉及鉴定最佳地受益于柔红霉素和阿糖胞苷的协同脂质体组合治疗的对象。
背景技术
CPX-351是纳米级(100nm直径)低胆固醇脂质体制剂，其包含以5：1摩尔比率共包封的阿糖胞苷和柔红霉素(美国专利8,022,279和8,431,806)，其显示出离体和体内最佳协同作用。在几项临床前研究中观察到与常规游离药物组合相比的显著功效改善，更重要的是，与临床试验中的标准护理治疗相比，CPX-351提供了更高的完全缓解和存活率；一个在新诊断的老年急性骨髓性白血病(AML)中，另一个在成人第一次复发的AML患者中。目前治疗AML的方法是“标准护理”，或者称为“7+3”治疗。
本发明聚焦于鉴别与目前的“标准护理”相比，用CPX-351治疗是有益的患者群体，并且提供考虑到个体患者中发生的癌症的异质性的分析。
在CPX-351的临床试验中观察到的功效归因于1)以协同比率在循环中维持的升高的阿糖胞苷:柔红霉素浓度持续较长时间(因此避免拮抗比率)，2)CPX351在骨髓中的累积和持久性增加，以及3)与骨髓中正常细胞相比白血病细胞的完整CPX-351脂质体的选择性积累和细胞毒性。已显示CPX-351在高比例的高风险AML患者中从循环和骨髓快速清除白血病细胞是非常有效的，包括那些刚好在CPX-351治疗前对“标准治疗”7+3阿糖胞苷:柔红霉素治疗无效的患者，以及晚期成人急性淋巴细胞白血病(ALL)和骨髓增生异常综合征(MDS)患者。
使用来自血液恶性肿瘤患者的新鲜分离的白血病细胞的短期离体细胞毒性测定有时可用于提供治疗剂对血液恶性肿瘤活性谱的指示。在此背景下，本发明人已经建立了从患有各种血液恶性肿瘤的患者中收集和纯化来自新鲜获得的血液样品的循环胚细胞的过程，所述血液恶性肿瘤包括：急性骨髓性白血病(AML)，ALL，慢性淋巴细胞性白血病(CLL)，慢性骨髓性白血病(CML)，骨髓增殖性肿瘤(MPN)和淋巴瘤，目的是评估个体患者中的抗肿瘤活性。申请人还为许多新的研究药物建立了抗增殖/细胞毒活性概况，根据血液恶性肿瘤的类型以及这些恶性肿瘤内患者亚型的特定表型概况分类。在这样的测定中，分别有50％和90％的生长抑制浓度(IC50和IC90)用于预测治疗敏感性是否反映可接受的药物浓度以及给定类别的患者对临床试验环境中的许可测试足够敏感的比例。因此，药物敏感性和亚群表型之间的相关性确定了通知患者选择的生物标志物。
然而，历史上，纳米颗粒(例如，脂质体和纳米颗粒)药物制剂在离体针对癌细胞的细胞毒性的评估通常还没有进行，因为这样的制剂通常被设计为用作原位药物输注储库，载剂优先在癌症生长部位累积并且一旦到达缓慢释放游离药物，然后由癌细胞摄取。因为离体药物释放速率通常比体内观察到的慢得多，所以包封的抗癌药物的细胞毒性效力通常比它们的游离药物对应物观察到的低多个数量级，并且离体测试在体内预测中不太可靠。
独特的是，就CPX-351而言，申请人已经证明人类白血病细胞通过能量依赖性机制在离体和体内摄取脂质体包封形式的阿糖胞苷和柔红霉素。一旦被吸收到细胞质内的空泡中，脂质体就会产生生物可利用的药物，从而导致细胞杀伤活性。这不仅确保递送协同摩尔比为5:1的阿糖胞苷:柔红霉素，而且还导致CPX-351离体细胞毒性效力(基于IC50值)，这些效力与游离药物相当，并且在一些情况下更有效，如本文所示。
CPX-351对来自各种白血病状态的新鲜白血病胚细胞的离体细胞毒性的试验研究产生的IC50值低至50nM阿糖胞苷:10nM柔红霉素，其中培养基中的脂质体的药物释放是不可检测的(Tyner，J.等，Blood(2010)116：Abstract 2886)。这证实了先前用白血病细胞系记录的完整CPX 351脂质体的直接抗白血病活性与新鲜获自患者的胚细胞相关。这也可以解释基因型/表型细胞特征如何影响胚泡对CPX-351的敏感性，而与PK贡献无关。
因此，与通常纳米颗粒组合物的性能形成对比，检查针对新鲜患者样品的离体CPX-351细胞毒性和/或新鲜患者样品对CPX-351的摄取提供了预测个体患者和群体类型中CPX-351的抗肿瘤活性的方式。
传统的白血病标准治疗方案在40多年以来一直保持不变，并以其游离形式依次使用蒽环类抗生素加阿糖胞苷作为“7+3”疗法。虽然这种治疗是“标准的”，但在一些患者中存在副作用和/或预后不利。CPX-351可能为这类患者提供了一个积极的选择。因此，需要将患有血癌的患者分层，以便他们可以接受CPX-351作为适当的治疗。由于CPX-351和/或常规治疗方案可能并非对每个个体都是有效的，因此需要确定诊断测试、药剂和/或标志物，其可以有助于为血源性癌症的对象选择适当的治疗方案。
发明内容
一方面，本发明基于以下离体评估：CPX-351细胞毒性和/或从血液恶性肿瘤患者新鲜收获的各种胚细胞类型的摄取，包括来自主要血液癌症组如AML和CLL以及不同的疾病亚型的细胞。结果与体内治疗后的患者结果相关。
血液癌症包括：急性骨髓性白血病(AML)，急性淋巴细胞性白血病(ALL)，慢性淋巴细胞性白血病(CLL)，慢性粒细胞白血病(CML)，骨髓增殖性肿瘤(MPN)和淋巴瘤。
因此，在这方面，本发明涉及一种预测向人对象给予CPX-351将有效治疗对象中的血液癌症的概率的方法，该方法包括：
在离体细胞培养中使来自所述对象的癌细胞暴露于用CPX-351的处理；和
测量所述细胞对所述处理的响应；
其中，其细胞显示对所述治疗响应的对象被鉴定为用CPX-351治疗可能有效的对象。响应性可以被测量为细胞毒性，例如使用IC50或IC90测定或通过测量CPX-351摄取。
如此鉴定的对象以有效量给予CPX-351。
第二方面，本发明涉及鉴定将从用更昂贵的CPX-351治疗替换标准护理中受益最多的对象，因此可能导致对这些对象使用CPX-351的监管批准。这些对象通过以下描述的某些遗传和表型特征来鉴定。
在具体的实施方案中，用于鉴定的方法包括确定所述对象中Fms样酪氨酸受体激酶3(FLT-3)基因中是否存在突变，由此在所述FLT-3基因中表现出突变的对象被鉴定为受益于用CPX-351治疗的对象，并且在一些实施方案中，进一步包括向所述对象给予有效量的CPX-351和/或确定所述对象中核磷蛋白1(NPM-1)基因中是否存在突变，由此在所述NPM-1基因中表现出突变的对象被鉴定为将受益于CPX-351治疗的对象，并且在一些实施方案中，进一步包括向所述对象给予有效量的CPX-351和/或确定所述对象中的CCAAT增强子结合蛋白α(CEBPα)基因中是否存在突变，由此在所述CEBPα基因中表现出突变的对象被鉴定为将受益于用CPX-351治疗的对象，并且在一些实施方案中，还包括向所述对象给予有效量的CPX-351。
在FLT-3突变的情况下，突变可能是该基因的激活突变，特别是FLT3-IDT损伤。
适用于包含CPX-351的治疗方案的生物标志物之一或生物标志物的组合(例如可指示患者(例如，患有白血病或处于患白血病的风险的那些))包括但不限于：至少一种或多种涉及FLT-3基因的突变，包括FLT3-ITD损伤或FLT3-TKD损伤及其突变的任何组合，或与其他遗传标志物如NPM-1基因和/或CEBPα基因中的突变的组合。一旦被批准，CPX-351可以在没有或存在其他抗癌治疗(例如，放疗、手术)的情况下用于选择携带本文所述的至少一种或多种生物标志物的对象的血源性癌症。在替代实施方案中，一旦被批准，CPX-351可以用作骨髓调理剂，用于治疗选择携带本文所述的至少一种或多种生物标志物的对象中的此类癌症
除了FLT-3、NPM-1和CEBPα标志物之外，根据下文实施例1中所述的欧洲白血病网(ELN)指南，其他核型还可以包含一种或两种CPX351响应性等位基因。
因此，本发明还涉及鉴定将受益于用CPX-351治疗的患有癌症的对象的方法，其中所述方法包括根据ELN系统确定对象的基因型，以便将对象分类为有利风险，中间期I，中间期II或不利风险。中间期II或不利风险的对象被确定为可能从CPX-351治疗中获益，并得到如此治疗。ELN系统基于对标准7+3治疗的响应，并且具有不利风险的患者响应不佳。
应该清楚的是，根据ELN的分类可以与前述遗传标志物组合以确定将从治疗获益的对象。
因此，通常，上述方面中的本发明涉及用于为具有血源性癌症(例如白血病)或血源性癌症(例如白血病)风险的对象选择治疗方案的测定法，方法，系统和试剂盒，治疗患有血源性癌症(例如白血病)的对象，和/或改善推荐用于或给予血源性癌症(例如白血病)或具有血源性癌症(例如白血病)风险的对象的治疗方案的有效性。
用于本文描述的测定法，方法，系统或试剂盒的测试样品可以来源于对象的生物样品，例如来自对象的骨髓或血液样品或血浆或血清样品。
取决于对本文描述的至少一种生物标志物的选择，可以对测试样品进行一种或多种分析，例如包括但不限于基因分型测定，表达测定(例如蛋白质和/或转录物水平)，其他能够鉴定基因型的测定法或其任何组合。本领域已知许多这样的测定，并且许多是可商购的，例如微阵列(例如
Figure BDA0003843448650000051
)和测序(例如Illumina)。
血液癌症包括：急性骨髓性白血病(AML)，急性淋巴细胞性白血病(ALL)，慢性淋巴细胞性白血病(CLL)，慢性粒细胞白血病(CML)，骨髓增殖性肿瘤(MPN)和淋巴瘤。
另一方面，本发明涉及提高FLT-3基因中具有激活突变的患有血液癌症的对象中用CPX-351治疗的有效性的方法，该方法包括与CPX-351组合给予有效量的FLT-3抑制剂。组合可以同时或在相同组合物中给予，或者首先给予CPX-351。
附图说明
图1A是显示AML患者细胞对CPX-351的离体敏感性的图。IC50值与图上注释的更具体的AML风险亚型相关。显示这些风险组中每个患者的CPX-351IC50值。
图1B显示了风险类别与离体应答IC50的相关性。如所见，虽然中间期I，中间期II和不利风险组中的大多数对象显示有利的IC50值；大多数情况下，有利风险组的对象没有。在每种情况下，都有一些异常值，指出了个别响应的重要性。
图1C显示了离体测定的IC50对标准治疗7+3方案的临床响应与响应性之间的相关性。在对7+3标准护理治疗的响应中，在显示出低范围离体IC50的组之间似乎没有什么区别。
图2A-2C分别显示了ALL，MDS/MPN和CLL患者细胞对CPX-351的离体敏感性。分析了来自127名患有ALL，MDS/MPN或CLL患者的外周血或骨髓标本的白血病细胞。这些病例的IC50值会显示特定的诊断注释。
图3A是显示具有FLT3-ITD的AML细胞表现出对CPX-351诱导的细胞毒性的增加的敏感性的图。14名患者中FLT3-ITD阳性，28名阴性。图3B和3C分别显示具有突变的NPM-1和CEBPα的对象的结果。13例患者中鉴定NPM-1插入，29例中未发现；在4名患者中观察到CEBPα的插入/缺失，34例中未检测到。每个图表上显示的值代表平均值±s.e.m.和p值。
图4A-4C显示了CPX-351药物摄取的流式细胞术分析，结果表明获得了药物摄取与细胞毒性之间的相关性。
图5A至5C显示与正常骨髓细胞相比骨髓中白血病细胞对完整CPX-351的摄取；图5A和5B分别显示来自CPX-351的阿糖胞苷和柔红霉素的摄取，图5C显示脂质的摄取。
图6显示与标准7+3治疗相比，临床试验中用CPX-351治疗的FLT-3，NPM-1和CEBPα突变患者的响应率。
图7A至7C分别显示与标准7+3治疗的具有FLT-3，NPM-1和CEBPα突变的患者相比，CPX-351治疗的患者的存活率的比较。
图8A和8B显示各种细胞系(包括具有和不具有FLT3突变的细胞系)的IC50值(图8A)和CPX-351摄取的标准化测量值(图8B)的比较。
图9A-9D显示了对于具有FLT3突变的两种不同细胞系，在存在和不存在用喹扎替尼(quizartinib)预处理的情况下CPX-351摄取的比较。
图10A-10C显示了测定CPX-351与喹扎替尼或米哚妥林之间的协同相互作用的结果。图10A显示了基于如所示的这些药物的各种浓度将创建的图的性质。图10B显示了根据EOBA(Excess Over Bliss Additivity)算法(Berenbaum，M.C.，Adv.Cancer Res.(1981)35：269 335)的协同作用的描述。图10C显示单个细胞系的生存力结果和给予该组合的各种方案以及EOBA分析的结果。
图11A-11D显示了使用Chou-Talalay算法(Chou和Talalay，Adv.Enzyme Reg.(1984)22：2755)确定协同作用的结果。图11A显示了受分析的药物浓度的各种组合的多孔板中的位置。图11B示出了用于绘制每个组合的结果的图表的示例。图11C和11D显示了测试组合的结果。
本发明的实施方式
由于血源性癌症是异质的，即不是所有的AML患者或其他血液癌症患者具有相同的预后或基本的基因型，重要的是测试个体人类样本以确定针对特定个体的有益治疗。
如上所述，不同于使用脂质体和纳米颗粒药物制剂的先前经验，CPX-351成功地被白血病细胞(优先于正常骨髓细胞)摄取，并且包封的阿糖胞苷和柔红霉素以给药比率被摄取(Lim,W.S.等人,Leuk.Res.(2010)34:1214 1223)。这使得能够离体检测个体血液癌症对用CPX-351治疗的敏感性。该测定可以包括细胞摄取大量的CPX-351的能力和/或CPX-351对患者样品的细胞毒性。这一点很重要，因为个体患者一般对治疗响应的异质性，以及事先确定用CPX-351治疗对特定个体是否有利的优点。通常，这种离体测试限于游离药物，并不适用于纳米颗粒制剂中递送的药物，因为这些制剂被设计为在血流中积聚并释放治疗剂的内容物，使得只有药剂本身进入癌细胞。
因此，本发明的一个方面是提供离体测定以确定个体患者是否将成功地响应CPX-351。因此癌细胞从患有血液癌症的患者中获取用于离体测试，通过使细胞与CPX-351接触并测定细胞毒性，例如通过测定相对于这些细胞的IC50或IC90和/或通过任何方便的手段测量脂质体系统的摄取。如下所示，CPX-351完整地递送至白血病细胞，从而为该离体测试提供可靠性。CPX-351对新鲜AML胚细胞和来自急性淋巴细胞白血病(ALL)，淋巴瘤和骨髓增殖性肿瘤患者的胚细胞的离体细胞毒性与获得胚细胞样品的患者的基因型和表型特征以及临床结果相关。
还发现某些基因，特别是FLT-3，NPM-1和CEBPα中的突变增强了表现出这些突变的对象中血液癌症对CPX-351的易感性，特别是与标准7+3治疗相比。因此，不同于标准的7+3方案，这些突变可以用作能够使用CPX-351进行体内成功治疗的癌症的标志物。这些突变的存在可以通过测定该基因直接测量，或者通过利用下游表达产物评估指示突变的标志物来测量。例如，激活FLT-3的突变可以通过对象或癌细胞中增强的FLT-3活性来鉴定。用于这些测定的合适的底物包括血液，血浆，血清和唾液。
例如，在一些实施方案中，合适的测定可以包括将来自被诊断为患有白血病或具有白血病风险的人对象的测试样品进行至少一种基因分型测定以适于确定FLT-3基因突变的基因型(例如，FLT3-ITD)，以及向人对象任选地给予包含有效量的CPX-351的治疗方案。
NPM-1基因突变，CEBPα基因突变和癌症属于ELN系统的中间期II和不利风险类别的个体显示类似的结果。
如上所述，可以使用以任何适当方式测量的突变组合来改善测定。具体而言，已知某些核型与这些基因的突变状态组合可用于根据对标准7+3治疗的响应对患者进行分组。这种分类由Rollig，C.等人，J.Clin.ONCOL.(2011)29：17m描述，并于2011年5月31日在线公布为10.1200/JCO.210.32.8500。该分类系统称为欧洲白血病网(ELN)系统，其中AML对象被归类为有利风险，中间期I，中期期II和不利风险。根据定义，被归类为中间期II或不利风险的患者对7+3标准治疗方案响应不佳。相反，本申请人已经发现这些患者在临床试验中对CPX-351有响应。因此，将特定患者的癌细胞鉴定为代表中间期II或不利风险清楚地表明希望用CPX-351治疗患者。考虑到标准治疗的经验，申请人显示的结果是意料之外的。
在所有上述情况下，根据批准的这些试验方案，适当地确定合适的对象，然后给予CPX-351。结果，可以以有效量给予CPX-351以减少至少一种与血液癌症相关的症状。如上所述，血液癌症可能是许多此类癌症之一，包括急性骨髓性白血病(AML)，ALL，慢性淋巴细胞性白血病(CLL)，慢性粒细胞白血病(CML)，骨髓增殖性肿瘤(MPN)和淋巴瘤。
有效量的CPX-351可以基于CPX-351给药方案通过合适的给药途径(例如，静脉注射)给予选定的人对象。在通过引用并入本文的美国专利8,092,828中描述了使用CPX-351的治疗方案。
本发明的另一方面是设计一种用于治疗具有FLT-3突变的个体的血液癌症的增强系统，例如使用CPX-351与FLT-3的抑制剂的组合的ITD。FLT-3抑制剂可用于本领域并且包括喹扎替尼，米哚妥林，坦度替尼，索拉非尼，舒尼替尼，来他替尼，克雷拉尼布，吉列替尼，AST487，多伏替尼和利尼法尼。然而，意外地发现给药时间是重要的：两种药物应该同时给药，在某些情况下应该在同一组合物中，或者CPX-351应该在给予抑制剂之前给药─包括在给予CPX-351之前10-24小时或中间时间。已显示给予CPX-351之前长期暴露于FLT-3抑制剂会起反作用。
还提供了用于本文描述的测定法和/或方法的任何方面的计算机系统。例如，这里提供的一个实施例是用于从至少一个对象获得的至少一个测试样品获得数据的计算机系统。
在一些实施方案中，计算机系统的确定模块可以被配置为分析至少一个测试样品以确定是否存在以上提供的至少两个病症。
在一些实施方案中，确定模块还可以包括比较模块，其适于将从确定模块输出的数据与存储在存储装置上的参考数据进行比较。
在一些实施方案中，存储装置可以进一步配置为存储至少一个对象的身体信息，例如包括测定测试对象是否携带FLT-3基因和/或NPM-1基因和/或CEBPα基因和/或ELN核型的一个或多个突变。
本文描述的测定法，方法，系统和/或试剂盒可以在委任和管理这些功能的单个指导者的指导下由多于一个的实体执行和/或使用。这样的实体可以对所提供的服务收费以确定本文中描述的至少一种病症是否存在于人对象的测试样品中，例如便于选择患有血液癌症的人对象的治疗方案作为选择人对象的治疗方案的方法中的一个元素。在一个实施例中，适当的测定包括(a)从诊断为患有AML或具有AML风险的人对象获得测试样品；(b)使测试样品经历至少一个生物标志物分析(例如，包括但不限于基因分型测定，表达测定(例如，蛋白质和/或转录物水平)，能够鉴定激活的FLT-3的其他测定或任何组合，以确定本文所述的至少一种生物标志物的参数(例如但不限于FLT3-ITD)；(c)从所选择的生物标志物的参数确定至少一种所声称的病症的存在；和(d)提供结果输出(例如但不限于FLT3基因突变的列表)，其阐述在测试样品中是否检测到至少一种所声称的病症。如果存在至少一种病症，那么指导者可以进一步选择和给予包含有效量的CPX-351的治疗方案给人对象。
在一些实施例中，上述方法的一个或多个步骤由非人机器执行。
本文中的出版物或文献的引用并非旨在承认上述任何内容是相关的现有技术，也不构成对这些出版物或文献的内容或日期的任何承认。本文引用的所有文件都通过引用结合于此。
实施例
以下实施例用于说明但非限制本发明。
制备A
CPX-351制剂和简单制备
CPX-351(注射用阿糖胞苷:柔红霉素脂质体)作为无菌无热原紫色冻干产品在50mL小瓶中供应。每个小瓶包含100个单位，其中1个单位等于1.0mg阿糖胞苷加0.44mg柔红霉素(作为基础)。该材料用19mL注射用水重建，并在室温下轻轻涡旋10分钟。将工作等分的重建产品在-20℃下冷冻保存不超过12个月。
用于患者标本收集和准备；治疗前从诊断患有AML，ALL，MPN或CLL的患者获得外周血(PB)或骨髓(BM)标本。所有标本均经俄勒冈健康与科学大学机构审查委员会批准的协议获得知情同意。在Ficoll梯度上分离血液或骨髓标本，然后用氯化铵钾(ACK)缓冲液溶解红细胞。
实施例1
CPX-351对患者白血病细胞离体细胞毒性的测定
药物敏感性测试通过标准的已知方法进行。简言之，将来自患者骨髓样本的单核细胞在R10中培养(补充有10％FBS(佐治亚州劳伦斯维尔的AB公司(Atlanta Biologicals，Lawrenceville，GA))，L-谷氨酰胺，青霉素/链霉素(加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司(Invitrogen，Carlsbad，CA))的RPMI-1640培养基和补充有10-4M 2-巯基乙醇(西格玛公司(Sigma))的
Figure BDA0003843448650000111
(英杰公司(Invitrogen)))。将来自淋巴细胞性白血病的细胞在R20中培养(补充有20％FBS(佐治亚州劳伦斯维尔的AB公司(Atlanta Biologicals，Lawrenceville，GA))，L-谷氨酰胺，青霉素/链霉素(加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司(Invitrogen，Carlsbad，CA))的RPMI-1640培养基和补充有10-4M 2-巯基乙醇(西格玛公司(Sigma))的
Figure BDA0003843448650000112
(英杰公司(Invitrogen)))。
细胞在96-孔板中培养(50,000个细胞/孔)，暴露于分级浓度的CPX-351持续3天，此时使用基于四唑的MTS测定法(
Figure BDA0003843448650000113
水性单一溶液细胞增殖测定(
Figure BDA0003843448650000114
AQueous OneSolution Cell Proliferation Assay),普洛麦格公司(Promega))来评估每个孔中活细胞的相对数量。将不存在任何药物的情况下铺板的细胞的细胞活力读数设定为100％存活力，并且将CPX-351剂量响应曲线的每个点标准化至该无药物条件的细胞存活力值。使用三阶多项式曲线拟合来生成每个样本的IC50值。
由于AML目前是CPX-351的靶向指征，在多组临床研究中证实了对具有不同临床特征的AML患者组的多项临床研究的有效性，来自53名AML患者的外周血或骨髓标本的AML胚细胞用梯度浓度CPX-351(10：2μM；1：0.2μM；0.1：0.02μM；0.01：0.002μM)或不加药培养3天，并且用基于四唑的MTS测定评估活细胞的相对数目。将不存在药物时培养的细胞的MTS值设定为100％，并且将每个剂量点的MTS值标准化为这些未处理的细胞的MTS值。使用三阶多项式曲线拟合来计算每个样本的IC50值。完整的人口统计学和临床数据可用于42例这些病例中，并且总结在表1中。用于评估AML风险组的完整细胞遗传学数据可用于40名患者，其中，使用欧洲白血病网(ELN)指南进行分类，3名，21名，12名和4名患者分别落入有利风险、中间期I，中间期II和不利风险组。
有利风险包括t(8；21)(q22；q22),inv(16)(p13.1q22)或t(16；16)(p13.1q22)，正常核型的突变NPM1以及正常核型的突变CEBPα。
中间期I风险包括具有FLT3-ITD和正常核型的突变NPM1，具有FLT3-ITD和正常核型的野生型NPM1，没有FLT3-ITD和正常核型的野生型NPM1。
中间期II风险包括t(9；11)(p22；q23)和任何未分类为有利或不利的细胞遗传学。
不利风险包括inv(3)(q21q26.2)或t(3；3)(q21q26.2),t(6；9)(p23；q34),t(v；11)(v；q23),单体性5或del(5q),单体性7,异常17p和复杂核型(≥3异常)。
大多数标本来自新诊断的初治AML患者(34/42；81％)，大多数患者在样本采集后接受7+3治疗方案(32/42；76％)。研究中的35名(35)AML患者在采集标本后采用7+3方案治疗。这些患者中的24位(24)达到了初始完全缓解，而11位患者表现出进行性疾病。显示患者呈现完全响应或进行性疾病的CPX-351IC50值。基本人口统计学特征的比例以及临床参数，如白细胞计数和遗传-细胞遗传学风险分层是AML患者总体人群的代表。
如图1A和表2中的数据所示，原发性AML白血病胚细胞对离体CPX-351细胞毒性通常敏感。IC50值范围为0.035:0.007μM至9.77:1.95μM。除了一个样品外，所有样品(98％)在给药(60:12μM阿糖胞苷：柔红霉素)后72小时显示低于1/10人血浆CPX-351浓度的IC50，这表明用CPX-351处理在这些患者中可能会实现临床响应。
如图1B所示，在中间期II或不利细胞遗传学异常的细胞中观察到对离体CPX-351治疗的有效抗增殖响应(低IC50)，其通常与较差的预后和对常规形式的化疗的耐药性相关。
如表2所示，总共从中间期II或不利细胞遗传学风险类别患者中获得了17个样品。如图1B所示，该患者亚组的总体离体CPX-351响应类似于中间期II和有利风险患者，在四个风险组中对CPX-351的离体响应没有显著差异。这些离体响应与观察到的CPX-351的临床活性密切相关，其中在广泛的不同亚组AML患者中观察到完全响应的激发，而不管常规的危险分层如何。
对常规7+3阿糖胞苷:柔红霉素治疗的临床响应与35名接受7+3治疗方案的AML患者之间对CPX-351的离体响应进行了比较，这些患者在收集其胚细胞之后也进行了评估。在这35例患者中，24例获得完全响应(CR)，11例显示进行性疾病(PD)，如图1C所示。来自这些患者的白血病胚细胞对离体CPX-351细胞毒性表现出类似的敏感性，而不管它们是否最初对7+3有响应。
表1
AML患者的人口统计学和临床特征
Figure BDA0003843448650000131
样品收集的WBC计数
Figure BDA0003843448650000132
遗传-细胞遗传学风险(ELN)
Figure BDA0003843448650000133
Figure BDA0003843448650000141
表2
AML患者的CPX-351细胞毒性，核型和分子病变
Figure BDA0003843448650000142
Figure BDA0003843448650000151
Figure BDA0003843448650000161
Figure BDA0003843448650000171
CPX-351离体敏感性也在不同亚型的恶性血液病中表征。使用包括ALL(38)，MPN/MDS(18)和淋巴瘤(71)的另外一百二十七(127)个患者标本。通过IC50估计的CPX-351的细胞毒性效力是针对离体的每个个体患者样品确定的，并呈现于图2A-2C中。在每个诊断类别内观察到广泛的IC50值(0.03/0.006μM-10/2μM)。所有180例患者样品检测(包括53例AML病例)的中位IC50值为0.558:0.112uM，绝大多数(153/180，85％)IC50值低于2.0:0.4uM，比报道的在白血病患者中观察到的72小时血浆药物浓度60:12uM低30倍(Gordon，M.等人，Proceedings of the AACR(2016年4月)57：摘要#287)。观察到CPX-351相对于循环药物浓度的低中值IC50表明CPX-351通常具有潜在地抑制来自广泛诊断的白血病细胞的增殖或存活的高效力。
实施例2
基因突变的影响
在具有FLT3-ITD表型的AML患者胚细胞中观察到更强的CPX-351效力：FMS样酪氨酸受体激酶(FLT3)在正常造血和白血病发生中起重要作用，并且在大多数AML胚细胞中表达。在20％到25％的AML患者中，FLT3基因在FLT3的近膜结构域(FLT3-ITD)中获得内部串联重复，并且与不利患者预后相关。在具有已知FLT3-ITD状态的实施例1的研究中的42位AML患者中，14位患者被鉴定为FLT3-ITD突变的携带者，其余28位患者是FLT3-ITD阴性。离体细胞毒性结果表明，FLT3-ITD阳性惊人地与对CPX-351诱导的细胞毒性的更高敏感性相关联(如图3A所示)。具体而言，与FLT3-ITD阴性患者胚细胞样品(IC50＝1.32:0.26μmol)相比，展示FLT3-ITD的白血病胚细胞显示出显著较低的IC50值(0.29:0.058μmol)。FLT3-ITD阳性和阴性样品之间对CPX 351细胞毒性的响应差异有统计学意义(p＝0.047)。还有人指出，诊断时FLT3-ITD阳性患者的白细胞计数(WBC)显著较高，91,000/mm3相对于29,000/mm3，p＝0.0002。
其他常见突变包括核磷蛋白(NPM1)和CCAAT/增强子结合蛋白α(CEBPα)也分别在13例和4例患者中发现。然而，这两种常见的突变都没有显示出在离体CPX-351治疗响应中的显著影响，尽管在CEBPα阳性的情况下存在更大灵敏度的趋势。(图3B和3C)。
实施例3
患者白血病胚细胞中离体敏感性与CPX-351摄取的相关性
临床前白血病动物模型表明，在注射CPX-351后，这些动物中植入的骨髓中的白血病细胞可以快速摄取阿糖胞苷和柔红霉素，主要以完整的脂质体形式维持协同药物比率，导致与游离药物混合物给药相比，药物在白血病细胞中累积的增加和延长。以下数据显示与游离药物相比，CPX-351的摄取增强。因此，可以采用CPX-351离体摄取和细胞毒性来预测临床CPX-351的成功。
将来自先前针对离体CPX-351敏感性筛选的患者标本的经冷冻的活细胞暴露于最大测试浓度的CPX-351(10:2μM阿糖胞苷：柔红霉素)24小时。然后用PBS洗涤细胞3次，并使用BD FACSAria流式细胞仪分析柔红霉素荧光的摄取。
使用柔红霉素的固有荧光作为细胞内生物可利用药物的半定量指示剂，如上所述对12个患者样品进行流式细胞术分析。样品具有6个AML和6个CLL，并且在初始离体筛选时表现出宽范围的IC50值。在BD FACSAria流式细胞仪上分析细胞摄取柔红霉素之前，将细胞暴露于梯度浓度的CPX-351 24小时。在FSC对SSC的散点图中鉴定出活细胞，并定量总荧光强度(图4A，左图)。使用暴露于CPX 351的细胞相对于未处理的细胞的平均荧光强度的比率来产生药物摄取指数，指数1表示没有摄取，数目大于1表明柔红霉素的摄取。
统计学分析：使用具有单尾p值的未配对t检验比较突变与野生型FLT3(ITD)，NPM1和CEBPα组中的CPX-351活性。P值<0.05时认为有显著性。使用单向ANOVA分析来比较多个遗传-细胞遗传学风险组之间的结果。使用Prism软件版本5.0a进行统计分析。
与未处理的细胞相比，用CPX-351处理的细胞显示细胞内荧光强度的量显著增加，表明随着包封在CPX-351内的柔红霉素的荧光完全淬灭，存在游离的柔红霉素。在柔红霉素摄取中处理和未处理的细胞样品之间的差异显示为平均荧光强度(MFI)的倍数移位(图4A，右)。图4B显示摄取和细胞毒性的比较。当将这12个样品上的CPX-351IC50值与相应的MFI值作图时，显示细胞对CPX-351的敏感性(IC50)与CPX-351摄取效率(MFI)之间的强相关性，相关系数为0.703(图4C)。
白血病骨髓细胞的选择性摄取，留下完整的CPX-351，如下所示：给药后18小时收集用1剂CPX-351处理的CCRF CEM(白血病)移植小鼠的股骨骨髓细胞。通过人CD45特异性磁珠分离白血病和正常骨髓细胞并分析CPX-351摄取。阿糖胞苷和脂质体脂质分别用3H和14C标记，并通过液体闪烁定量。通过HPLC分析柔红霉素。结果显示在图5A-5C中。每个柱子代表每个重复10个股骨(5只小鼠)3次重复的平均值±SE。
如图5C所示，每106个细胞中约225pmol脂质体标记的脂质被白血病细胞摄取，但正常骨髓仅摄取约110pmol/106个细胞。包含在脂质体中的药物水平也优选被白血病细胞摄取，其中对于白血病细胞而言，阿糖胞苷显示摄取24pmol/106个细胞，柔红霉素约16pmol/106个细胞，并且在每种情况下正常骨髓中的水平均较低(阿糖胞苷约3pmol/106个细胞，柔红霉素约7pmol/106个细胞)。脂质体脂质与其中所含药物的摩尔比约为10:1，因此这些结果表明当这些细胞摄取时药物保留在脂质体中。
实施例4
CPX-351在FLT3-ITD+AML患者中表现出卓越的抗肿瘤功效
在该实施例中，进行了3期临床试验，其中筛选AML患者以确定它们是否在FLT-3基因中携带激活性突变。发现具有激活突变AML-ITD+的AML患者在由第1天的第1次给药步骤，第3天的第2次给药步骤和第5天的第3次给药步骤组成的给药周期中给予3剂CPX-351。采用美国专利8,092,828中描述的治疗方案。测量和监测患者响应，包括血浆和/或骨髓样品分析，测量响应率和存活率。还包括NPM1和/或CEBPα突变阳性的患者亚组。最初的研究集中在FLT-3突变，也包括NPM-1和CEBPα突变的个体。参与研究的患者见表3。
表3
Figure BDA0003843448650000201
Figure BDA0003843448650000211
*低甲基化试剂
表4列出了有和没有FLT－3突变的对象的响应。
表4
响应(响应者/患者数量)
Figure BDA0003843448650000212
图6显示了这些突变携带者对CPX-351和7+3治疗的响应率的比较。如图6所示，FLT-3中ITD或TKD突变携带者对CPX-351的响应率为68.2％，但对7+3的响应率仅为25.0％。NPM-1突变患者的响应率为92.3％CPX-351但对7+3的响应率仅为58.3％。对于CEBPα突变的个体，CPX-351的响应率为33.3％，而7+3的响应率为20.0％。
表5显示了本研究中FLT-3突变阳性和FLT-3突变阴性参与者的存活率。
表5
存活率
Figure BDA0003843448650000213
Figure BDA0003843448650000221
图7A-7C还显示了各种组的存活率。在所有情况下，突变携带者的存活率都大大提高；特别是25％的具有CEBPα突变的对象用CPX-351治疗后存活时间超过27个月，而用7+3治疗的患者都没有存活超过3个月。
实施例5
FLT-3突变细胞对CPX-351以及联合治疗：CPX-351+FLT-3抑制剂的敏感性
在该实施例中，如实施例1和3所述测量通过流式细胞术测定的基于柔红霉素荧光的细胞活力和细胞内摄取。
A.确定AML细胞系(包括含有FLT-3-ITD和ME-1(包含突变体，活化的FLT-3)的MOLM-13和MOLM-14)对CPX-351的敏感性以及这些细胞对CPX-351的摄取。也比较了不包含FLT-3突变的细胞，包括U937，HL60，KG1和GDM-1。这些细胞的培养物用CPX-351处理并测定IC50和CPX-351的摄取。图8A显示了通过基于CPX-351的nM浓度对百分细胞活力作图，获得了关于IC50的结果。如图8A所示，FLT-3突变细胞具有比非FLT-3突变细胞更低的IC50值。图8B显示了摄取结果；绘制了nM浓度的CPX-351相对于考虑到固有荧光的标准化的平均荧光强度(MFI)的图。包含FLT-3突变的细胞比不含FLT-3突变的细胞在CPX-351摄取方面更有效。
B.为了确定与FLT-3抑制剂联合治疗的效果，将细胞暴露于CPX-351，使用或不使用喹唑替尼或米哚妥林(FLT-3抑制剂)治疗。在一个方案中，将ME-1和MOLM-14细胞暴露于用10nM喹唑替尼预处理0,2,8,16和24小时，之后加入100μM的CPX-351 2小时。CPX-351的摄取通过柔红霉素荧光测量，如通过流式细胞术对未处理的对照标准化所测定的。结果显示在图9A-9D中。图中的x轴描绘了标准单位的荧光表示的CPX-351的摄取，y轴表示标准化的细胞计数。如图9A和9B所示，所有未处理的细胞均未表现出摄取，而用CPX-351处理的细胞最终分选为两种细胞群，其中一种CPX-351摄取比另一种更有效。从图9A和9B清楚的是，随着预处理时间的延长，一些细胞吸收CPX-351的能力减弱。图9C和9D中的结果是多达24小时的各种时间点的组合。
C.为了确定协同作用，将细胞系接种到384孔板上并暴露于定制剂量递增浓度的CPX-351和FLT-3抑制剂。CPX-351和FLT-3抑制剂(a)同时(C+Q或C+M)，(b)24小时CPX-351预处理(C→Q或C→M)或(c)24小时FLT-3抑制剂预处理(Q→C或M→C)。为了确定每种药物组合的协同作用，采用了EOBA算法。
图10A显示了方案的概要以及以nM为单位的CPX-351或FLT-3抑制剂相关浓度的数值。图10B显示通过使用EOBA算法测量所采用的两种药物的各种浓度的存活力而获得的拮抗作用，累加作用或协同作用的结果。图10C显示了作为上述各种浓度组合和各种方案的结果的生存力的实验结果以及基于EOBA算法得到的协同作用的确定结果。针对上述方案，KG-1，ME-1，MOLM-13和MOLM-14的结果如图10C所示。如图所示，CPX-351与喹唑替尼或米哚妥林的某些组合在给予FLT-3抑制剂之前给予CPX-351或当它们同时给予时显示出高协同性。
D.还采用了确定协同作用的另一种方法，在两种细胞系中比较了FLT-3抑制剂和方案的各种组合。执行C段的实验程序，在这种情况下使用Chou-Talalay算法分析结果。如图11A所示，在由阴影框表示的孔中测试了各种CPX-351和FLT-3抑制剂的组合。图11B示出了对于上述所有三种方案对于图11A中所示的每种浓度绘制Chou-Talalay分析的结果─即组合指数(CI)─的等效线图的样本。图11C显示了这三种方案以及图11A所示的浓度水平的GDM-1细胞和MOLM-14细胞的结果。每个图上的圆圈代表图11A中所示的每个正方形的浓度组合。正图所示，对于MOLM-14细胞，CPX-351或者在喹唑替尼或者米哚妥林的同时或者之前给药导致显示协同作用的大量孔，而在CPX-351之前给予这些药物显示出更多的拮抗结果。GDM-1细胞的结果没有显著差异。图11D是一系列图，其显示了基于如图11C所示的每种方案的组合指数(CI)值落入各种类别的数据点的数量。
E.总之，含有FLT3-ITD或FLT-3激活突变的细胞系对CPX-351更敏感，并且与其他遗传异常的细胞系相比，CPX-351的摄取增加。
用喹扎替尼预处理16小时导致约50％的细胞总群显示柔红霉素荧光下降，表明延长的先前暴露于FLT-3抑制可能降低该亚群中的CPX-351摄取。
然而，当同时提供CPX-351和FLT-3抑制剂或在FLT-3抑制剂暴露前24小时将细胞暴露于CPX-351时观察到强大的协同作用。

Claims (13)

1.一种含有以5:1摩尔比共包封的阿糖胞苷和柔红霉素的纳米级低胆固醇脂质体制剂，用于治疗对象的血液癌症，其中：
(a)所述脂质体制剂施用于在Fms样酪氨酸受体激酶3(FLT 3)基因中具有突变的对象；和/或
(b)所述脂质体制剂施用于在核磷蛋白1(NPM 1)基因中具有突变的对象；和/或
(c)所述脂质体制剂施用于在CCAAT增强子结合蛋白α(CEBPα)基因中具有突变的对象。
2.如权利要求1所述的脂质体制剂，其中，所述血液癌症选自：急性骨髓性白血病(AML)，急性淋巴细胞性白血病(ALL)，慢性淋巴细胞性白血病(CLL)，慢性粒细胞白血病(CML)，骨髓增殖性肿瘤(MPN)和淋巴瘤。
3.如权利要求1所述的脂质体制剂，其中，所述(a)的突变是FLT 3激活突变。
4.如权利要求3所述的脂质体制剂，其中，所述突变是FLT 3ITD或FLT 3TKD突变。
5.含有以5:1摩尔比共包封的阿糖胞苷和柔红霉素的纳米级低胆固醇脂质体制剂在制备用于治疗对象的血液癌症的药物中的应用，其中：
(a)所述药物施用于在Fms样酪氨酸受体激酶3(FLT 3)基因中具有突变的对象；和/或
(b)所述药物施用于在核磷蛋白1(NPM 1)基因中具有突变的对象；和/或
(c)所述药物施用于在CCAAT增强子结合蛋白α(CEBPα)基因中具有突变的对象。
6.如权利要求5所述的应用，其中，所述血液癌症选自：急性骨髓性白血病(AML)，急性淋巴细胞性白血病(ALL)，慢性淋巴细胞性白血病(CLL)，慢性粒细胞白血病(CML)，骨髓增殖性肿瘤(MPN)和淋巴瘤。
7.如权利要求5所述的应用，其中，所述(a)的突变是FLT 3激活突变。
8.如权利要求7所述的应用，其中，所述突变是FLT 3ITD或FLT 3TKD突变。
9.一种确定接受用含有以5:1摩尔比共包封的阿糖胞苷和柔红霉素的纳米级低胆固醇脂质体制剂治疗的患有血液癌症的人对象的易感性的方法，所述方法包括测定所述对象的生物样品以确定：
a)所述对象中Fms样酪氨酸受体激酶3(FLT 3)基因是否存在突变；和/或
b)所述对象中核磷蛋白1(NPM 1)基因是否存在突变；和/或
c)所述对象中CCAAT增强子结合蛋白α(CEBPα)基因是否存在突变；和/或
d)所述对象的基因型为有利风险、中间期I、中间期II或不利风险。
10.如权利要求9所述的方法，其中，所述血液癌症选自：急性骨髓性白血病(AML)，急性淋巴细胞性白血病(ALL)，慢性淋巴细胞性白血病(CLL)，慢性粒细胞白血病(CML)，骨髓增殖性肿瘤(MPN)和淋巴瘤。
11.如权利要求9所述的方法，其中，所述(a)的突变是FLT 3激活突变。
12.如权利要求11所述的方法，其中，所述突变是FLT 3ITD或FLT 3TKD突变。
13.如权利要求9-12中任一项所述的方法，其中，所述生物样品包括血液、血清、血浆、唾液或胚细胞。
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