JP2007533670A - アントラサイクリン系薬剤及びシチジンアナログのリポソーム製剤 - Google Patents

アントラサイクリン系薬剤及びシチジンアナログのリポソーム製剤 Download PDF

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Abstract

アントラサイクリン系薬剤及びシチジンアナログ剤を含む組成物は、リポソーム担体でカプセル化される。好ましいアントラサイクリン系薬剤は、ダウノルビシン、ドキソルビシン、及びイダルビシンの群から選択され、一方、好ましいシチジンアナログ剤は、シタラビン、ゲムシタビン、又は５−アザシチジンの群から選択される。前記リポソーム担体でカプセル化されたアントラサイクリン系薬剤とシチジンアナログ剤との組み合わせは、各治療薬として、薬剤保持及び保持された薬剤の放出を行うことにおいて有用である。

Description

関連出願の説明
本出願は、２００４年４月２２日に出願した米国仮特許出願第６０／５６５，２１０号についての米国特許法第１１９条（ｅ）項に基づく利益を主張し、この仮特許出願は参照により本出願に組み込まれる。
本発明は、治療薬の組み合わせの送達について改善した組成物及び方法に関する。より詳しくは、本発明は、アントラサイクリン系薬剤及びシチジンアナログ並びにそれらの誘導体の組み合わせを与える送達系に関する。
癌、ＡＩＤＳ、感染症、免疫疾患及び循環器疾患等の生命を脅かす疾患の進行の多くは、複数の分子メカニズムによって影響される。この複雑さゆえに、単一の薬剤を用いて治療を行うことにはその成果において限界があった。したがって、多くの場合、薬剤の組み合わせ（併用）が疾患を撲滅するため、特に癌の治療において用いられている。投与される薬剤の数と急性リンパ性白血病及び転移性結腸直腸癌（metastatic colorectal cancer）等の癌の治癒率との間には強い相関性があると思われる（非特許文献１及び２参照）。
ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン及びそれらの誘導体等のアントラサイクリン系抗生物質は、公知の抗悪性腫瘍薬を含む。塩酸ダウノルビシン等のダウノルビシンベースの薬剤は、ＤＮＡにインカレートして、ＤＮＡ合成やＲＮＡ合成を含むＤＮＡの各種機能に影響を及ぼすため、これらの薬剤が主として用いられる。これらの薬剤は、急性リンパ性白血病、急性顆粒球性白血病（acute granulocytic leukemia）、急性骨髄球性白血病（acute myelocytic leukemia）、急性期の慢性骨髄球性白血病、及び急性非リンパ性白血病（acute nonlymphocytic leukemia）に対して活性を示す。ドキソルビシンは、急性白血病、悪性リンパ腫、及び乳癌腫（breast cancer tumors）等の任意の固形腫瘍（selected solid tumors）の治療において効果的であることが示されている。イダルビシンは、これらの代謝拮抗薬と同様の活性を示し、有害核型（adverse karyotype）、急性骨髄性白血病（acute myeloid leukemia）（ＡＭＬ）に対してシタラビンと共に用いられている。（非特許文献３）。
シタラビン、５−アザシチジン、及びゲムシタビンのような三つの例示を含むシチジンアナログは、公知の抗悪性腫瘍薬である。例えば、これらの化合物は、白血病及び癌細胞におけるＤＮＡ合成を阻害する点で有効性を示している。これらの特性によって、これらの化合物は急性骨髄球性白血病、急性リンパ芽球性白血病（acute lymphoblastic leukemia）及び骨髄異形性症候群、膵癌及び肺癌を効果的に治療することができる。
特許文献１では、異常細胞増殖と付随した疾患の治療のため、単独で又は遊離型薬剤カクテル（free drug cocktail）で、カプセル化されていないＤＮＡメチル化阻害剤（nonencapsulated DNA methylation inhibitor）及びカプセル化されていない抗悪性腫瘍薬（nonencapsulated anti-neoplastic agent）を投与することが論じられている。しかしながら、この公報には、送達を制御することを意図した医薬製剤又は薬剤の半減期は示唆されていなかった。
同様に、特許文献２では、リポソームカプセル化悪性腫瘍薬（liposome encapsulated neoplastic agents）の製造が論じられている。単一及び複数の抗悪性腫瘍薬が同時に又は経時されるものとして検討されているが、シチジンアナログと組み合わせたアントラサイクリン系抗生物質は示唆されていなかった。
米国第２００４／００５２８６４号 米国特許第５，７３６，１５５号公報 Frei, et al., Clin.Cancer Res. (1998) 4:2027-2037 Fisher, M.D.; Clin.Colorectal Cancer (2001) ８月; 1(2):85-6 Giles,F.J.,et al., J.Clin.Oncol (2003) 21(9):1722-7
薬剤カクテルの治療的使用を制限するさまざまな不利益がある。例えば、遊離型薬剤カクテルの投与では、多くの場合、腫瘍部位に達する前に薬剤の一つ又は全てが急速に排除される。この理由のために、多くの薬剤は、ともすれば血流からの送達媒体の排除をもたらすようなメカニズムから送達媒体を「遮蔽する（shield）」ことを意図した送達媒体中に組み込まれている。リポソームがこの「遮蔽（shielding）」効果を付与する能力を有し、それゆえ治療薬の半減期を延長することができることはよく知られている。しかしながら、送達媒体の脂質成分は多くの場合、個々の薬剤の薬物動態に差次的に影響を及ぼすため、送達媒体中への特定の薬剤又は１を超える薬剤の処方は困難であることが証明されている。したがって、ある薬剤の保持及び放出にとって適当である組成（成分）が第二の薬剤の保持及び放出にとっては適当でない可能性がある。
本発明の研究者等は、優れた薬剤保持及び各薬剤の持続的な放出をもたらす、アントラサイクリンとシチジンアナログ（ダウノルビシン及びシタラビンベースの誘導体を含む）との組み合わせを収容するために必要とされる特定の送達媒体製剤を同定した。本発明の研究者等は、更に、これらの薬剤の相乗的な比（割合）が、リポソームでカプセル化された（リポソームに内封された）場合には、ある時間にわたって血液区画（blood compartment）に保持され、その結果、遊離型薬剤カクテル及び個々のリポソーム剤と比較して効力が増大することを示した。
本発明は、少なくとも１つのアントラサイクリン系薬剤及び１つのシチジンアナログベースの薬剤と安定的に会合するリポソーム送達媒体を用いて効果的な量のアントラサイクリン及びシチジンアナログ（例えば、シタラビン、５−アザシチジン又はゲムシタビンとダウノルビシン、ドキソルビシン又はイダルビシン）薬剤の組み合わせを投与するための組成物及び方法に関する。これらの組成物によれば、２以上の薬剤を、連係して働く状態で疾患部位に送達することが可能となり、それによって、薬剤は、望ましい比で疾患部位に確実に存在するであろう。このような結果は、薬剤が、脂質ベースの送達媒体で共カプセル化されようと望ましい比が疾患部位で維持されるよう投与される別個の脂質ベースの送達媒体でカプセル化されようと達成されるであろう。前記組成物の薬物動態（pharmacokinetics）（ＰＫ）は、連係して働く送達が達成されるよう（前記送達系のＰＫが比較できるという前提で）脂質ベースの送達媒体自体により制御される。
したがって、一つの視点において、本発明は、治療上効果的な比、特に非拮抗的な比でリポソームと会合した少なくとも１つのアントラサイクリン系薬剤及び１つのシチジンアナログベースの薬剤を含む非経口投与用リポソーム組成物を提供する。薬剤の治療上効果的かつ非拮抗的な比は、ある濃度範囲にわたって、関連する細胞培養系、又は無細胞系、及び個々の患者の生検（バイオプシー）からの腫瘍ホモジネートに対する薬剤の生物活性又は効果を測定することによって決定される。ダウノルビシン、ドキソルビシン又はそれらの誘導体とその他のシチジンアナログの組み合わせの中で、よくある組み合わせは、シタラビンとダウノルビシンである。同様に、シタラビン（又は別のシチジンアナログ）及び他の公知のアントラサイクリンの中でダウノルビシン、ドキソルビシン又はイダルビシンを含むアントラサイクリンを含む組み合わせもしばしば提供される。望ましい治療効果を維持する薬剤の比の決定をするいかなる方法を用いてもよい。
前記組成物は、培養中の関連細胞、無細胞系又は腫瘍ホモジネートに望ましい生物学的効果を示すアントラサイクリンとシチジン薬剤とのモル比で少なくとも１つのアントラサイクリン及び１つのシチジン薬剤を含む。好ましくは、前記比は、前記薬剤が非拮抗的となるものである。出願人は、望ましい生物学的効果をテストするのに適している少なくとも１つの細胞培養又は細胞株を「関連ないし適切な（relevant）」細胞と呼ぶ。これらの薬剤は、抗悪性腫瘍薬として使用されるので、「関連」細胞は、それらの抗癌剤発見プログラムで有用である米国国立癌研究所（National Cancer Institute）（ＮＣＩ）／米国国立衛生研究所（National Institutes of Health）（ＮＩＨ）の開発途上治療プログラム（Developmental Therapeutics Program）（ＤＴＰ）によって同定された細胞株の細胞である。現在、ＤＴＰ選別では、６０の種々のヒト腫瘍細胞株が利用されている。そのような細胞株の少なくとも１つについて望ましい活性が示される必要があるであろう。出願人は、患者のバイオプシー又は腫瘍のホモジナイゼーションから生じた細胞を「腫瘍ホモジネート（tumor homogenate）」と呼ぶ。全腫瘍又は腫瘍バイオプシーの抽出については、資格のある医師による標準的な医学技術を通じて行うことができ、組織の単細胞へのホモジナイゼーションについては、技術としてよく知られている多数の方法を用いて実験室で行うことができる。
別の視点において、本発明は、本発明の組成物を投与することによって望ましい標的に対して治療上効果的な量のアントラサイクリン：シチジンアナログ（例えば、ダウノルビシン：シタラビン）組み合わせを送達する方法に関する。
本発明は、第一の送達媒体と安定的に会合したアントラサイクリンと第二の送達媒体と安定的に会合したシチジンアナログとを投与することによって治療上効果的な量のアントラサイクリン：シチジンアナログ（例えば、ダウノルビシン：シタラビン）組み合わせを送達する方法にも関する。第一及び第二の送達媒体は別々の容器に含まれてもよく、それらの容器の内容物は患者に対し同時に又は経時的に投与されてもよい。一つの形態において、前記アントラサイクリン及びシチジンアナログの比（割合）は、非拮抗的である。
別の視点において、本発明は、望ましい治療効果を与える、ある比の少なくとも１つのアントラサイクリン及び１つのシチジンアナログを含むリポソームを含む治療組成物を製造する方法に関する。この方法は、少なくとも１つアントラサイクリン及び１つのシチジンアナログのパネル（panel）であって、少なくとも１つ、好ましくは多数の比の前記薬剤を含むパネルを与えること、パネルのメンバーが濃度の範囲にわたって関連細胞培養、無細胞系又は腫瘍ホモジネートに生物学的効果を発揮する能力をテストすること、前記比により濃度の適当な範囲にわたって前記細胞培養、無細胞系又は腫瘍ホモジネートに望ましい治療効果が与えられるパネルのメンバーを選択すること；並びに前記パネルの好結果を示すメンバーによって表される前記比の薬剤を脂質ベースの薬剤送達媒体に安定的に会合させることを含む。好ましい形態において、前記望ましい治療効果は、非拮抗的である。
更に以下に記載されるように、好ましい形態において、前記方法に従って適当な組み合わせをデザインする場合には、非拮抗的な比は、組み合わせ指数（combination index）（ＣＩ）が≦１．１である比として、選択される。更なる形態において、適当なリポソーム製剤は、効果的な量のアントラサイクリン及び：シチジンアナログ組み合わせ（例えば、ダウノルビシン：シタラビン）を安定的に取り込み、かつインビボで両方の薬剤の放出が維持されることが可能となるようにデザインされる。好ましくは、製剤は、ホスファチジルグリセロール等、少なくとも１つの負荷電脂質を含む。
発明を実施するための形態
定義がない限り、本願において使用される全ての技術用語、記号及び他の学術用語又は専門用語は、本発明の属する技術において通常の知識を有する者（当業者）によって一般に理解されているものと同一の意味である。いくつかの場合では、一般に理解されている意味をもつ用語が、明確及び／又は迅速な参照のため、本願において定義されるが、本願におけるそのような定義の挿入を、その技術において一般に理解されていることに対する実質的な相違を表すものと解釈することは、必ずしも当然とは限らない。本願において記載され又は参照される多くの技術及び処置は、当業者により十分理解され、従来の手法を用いて一般に利用される。適宜、市販のキット及び試薬の使用を含む処置が、他に断らない限り製造業者規定のプロトコル及び／又はパラメータに従って一般に行われる。本願において参照した全ての特許、出願、公開された出願及びその他の刊行物は、そっくりそのまま参照により組み込まれる。仮にこのセクションにおいて示した定義が、参照により本願に組み込まれる特許、出願、公開された出願及びその他の刊行物において示されている定義と逆であるか、そうでなくても互いに一致しない場合には、このセクションにおいて示した定義が、参照により本願に組み込まれる定義よりも優先される。
脚注：略語
ＤＳＰＣ：ジステアロイルホスファチジルコリン（distearoylphosphatidylcholine）；
ＰＧ：ホスファチジルグリセロール（phosphatidylglycerol）；
ＤＳＰＧ：ジステアロイルホスファチジルグリセロール（distearoylphosphatidylglycerol）；
ＰＩ：ホスファチジルイノシトール（phosphatidylinositol）；
ＳＭ：スフィンゴミエリン（sphingomyelin）；
Ｃｈｏｌ又はＣＨ：コレステロール（cholesterol）；
ＣＨＥ：コレステリルヘキサデシルエーテル（cholesteryl hexadecyl ether）；
ＳＵＶ：小型単層小胞体（small unilamellar vesicle）；
ＬＵＶ：大型単層小胞体（large unilamellar vesicle）；
ＭＬＶ：多層膜小胞体（multilamellar vesicle）；
ＭＴＴ：３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニル−２Ｈ テトラゾリウムブロマイド（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-2H tetrazolium bromide）；
ＥＤＴＡ：エチレンジアミン四酢酸（ethylenediaminetetraacetic acid）；
ＨＥＰＥＳ：Ｎ−［ヒドロキシエチル］−ピペラジン−Ｎ−［２−エタンスルホン酸］（N-[hydroxylethyl]-pyperazine-N-[2-ethanesulfonic acid]）；
ＨＢＳ：ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水（HEPES buffered saline）（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）；
ＳＨＥ：３００ｍＭ スクロース（sucrose）、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、３０ｍＭ ＥＤＴＡ；
ＴＥＡ：トリエタノールアミン（triethanolamine）；
ＣＩ：組み合わせ指数（combination index）；
ｆａ：影響された画分（fraction affected）。
本明細書において、「a」又は「an」は「少なくとも１つ」又は「１又は２以上」を意味する。
本発明は、少なくとも１つのアントラサイクリン系抗生物質（例えば、ダウノルビシン）及び１つのシチジンアナログ剤（例えば、シタラビン）と安定的に会合したリポソームを含む組成物であって、前記アントラサイクリン系抗生物質及び前記シチジンアナログ剤は、関連細胞又は腫瘍ホモジネートに対して望ましい細胞毒性効果、細胞増殖抑制効果又は生物学的効果を発揮するアントラサイクリン系抗生物質：シチジンアナログ剤（例えば、ダウノルビシン：シタラビン）モル比で存在する組成物を提供する。
好ましくは、本願において提供されるリポソーム組成物は、少なくとも１つのアントラサイクリン及び１つのシチジンアナログと安定的に会合したリポソームを、関連細胞又は腫瘍ホモジネートに対して非拮抗的な効果を発揮する前記アントラサイクリン：シチジンアナログのモル比で含むであろう。
本発明の更なる形態において、前記記載した脂質ベースの送達媒体は、第三又は第四の薬剤を含む。何れの治療薬、診断薬又は化粧用薬を含んでもよい。
本発明の一つの視点において、ホスファチジルコリン、好ましくはジステアロイルホスファチジルコリンを含むリポソームが提供される。本発明の別の視点において、ステロールを含むリポソームが提供される。好ましくは、前記ステロールは、コレステロールである。
本発明の脂質ベースの送達媒体を、非経口投与だけでなく局所送達、経鼻送達、皮下送達、腹腔内送達、筋肉内送達、噴霧送達又は経口送達で、或いは治療目的若しくは医用画像（medical imaging）等のために標的部位に又はその近傍に、天然又は合成の移植可能な手段へ又はその中へ送達媒体を適用することによって使用してもよい。本発明の脂質ベースの送達媒体は、好ましくは非経口投与で、最も好ましくは静脈投与で使用される。
本願において記載した好ましい形態は、網羅されること又は本発明の範囲を開示された詳細な形態に限定することを意図したものではない。それらの記載は、本発明の原理並びにその応用及び実際の使用を、当業者がその技術を完全に理解できるように、最良に説明するために選択、かつ記載されたものである。
シチジンアナログ
代謝拮抗物質又は、より詳しくは、シタラビン、５−アザシチジン、及びゲムシタビン（２’，２’−ジフルオロデオキシシチジン（2',2'-Difluorodeoxycytidine））等のシチジンアナログは、公知の抗悪性腫瘍薬である。シチジンアナログは、その技術においてシトシンヌクレオシドアナログ（cytosine nucleoside analogs）と呼ばれることもある。代謝拮抗物質は、細胞における正常な生化学反応に関与する天然の化学物質（natural chemical）とよく似ているが、細胞の正常な分裂及び機能を妨げるほど異なる化合物である。これらの化合物は、一般に正常な代謝プロセスを阻害する。
シタラビンは、ピリミジンヌクレオシド代謝拮抗物質である。この化合物は、糖の３’−ヒドロキシルに対してトランスの位置に２’−ヒドロキシルをもつ２’−デオキシシチジンのアナログである。シタラビンは、４−アミノ−１−β−ｄ−アラビノフラノシル−２（１Ｈ）−ピリミジノン（4-Amino-1-β-d-arabinofuranosyl-2(1H)-pyrimidinone）、１−β−ｄ−アラビノフラノシルシトシン（1-β-d-arabinofuranosylcytosine）、Ａｒａ−Ｃ、β−シトシンアラビノシド（β-cytosine arabinoside）、アラシチジン（aracytidine）、ＣＨＸ−３３１１、Ｕ−１９９２０、Ａｌｅｘａｎ、Ａｒａｂｉｔｉｎ、Ａｒａｃｙｔｉｎｅ、Ｃｙｔａｒｂｅｌ、Ｃｙｔｏｓａｒ、Ｅｒｐａｌｆａ、Ｉｒｅｔａｎ及びＵｄｉｃｉｌと同等と考えられる。シタラビン等のシチジンアナログにおいて、糖成分は、リボースではなくアラビノースを含む。シタラビンは、急性骨髄球性白血病（acute myelocytic leukemia）（ＡＭＬ）の治療において有用であると認められ、この疾患の寛解において有効であることが分かっている。しかしながら、シタラビンの作用メカニズムは未確認であるが、それにもかかわらずこのヌクレオチドのＤＮＡへの取り込みによって、ストランド合成の終結による重合の阻害が引き起こされる。
シタラビンは、ストランド合成を終結させるため、５−モノリン酸 ヌクレオチド（5-monophosphate nucleotide）（ＡｒａＣＭＰ）の転換を介して「活性化（activated）」されなければならない。ＡｒａＣＭＰは、その後選択されたヌクレオチドキナーゼと反応して二リン酸（diphosphate）及び三リン酸ヌクレオチド（triphosphate）（ＡｒａＣＤＰ及びＡｒａＣＴＰ））を形成することが可能である。ＤＮＡへのシタラビン取り込みは、Ｓ期特異性であり、それゆえ、ＤＮＡ合成の阻害をもたらすように少なくとも１つの完全細胞周期にわたる投薬が、提唱されている。ＤＮＡ合成の阻害は低いＡｒａＣＴＰ濃度で発生し、ＤＮＡ鎖伸長はＡｒａＣの成長ＤＮＡ鎖の末端部分への取り込みによって阻害される。更に、鎖中に取り込まれるＡｒａＣの量とＤＮＡ合成の阻害との間には相関性があると思われる。
患者においては、シタラビンに対する耐性が生じうる。そのような耐性は、一般にＡｒａＣＭＰを生成するデオキシシチジンキナーゼの欠乏による。更に、シチジンデアミナーゼ（ＡｒａＣを脱アミノ化して無毒性のアラウリジン（arauridine）にするもの）及びｄＣＭＰ（ＡｒａＣＭＰを不活性ＡｒａＵＭＰに転換するもの）等の分解酵素も有効性に影響を及ぼす。
シタラビンの欠点は、その毒性である。この化合物は、著しい巨赤芽球性の変化を伴う重篤な白血球減少症、血小板減少症及び貧血症を引き起こす能力がある強力な骨髄抑制剤（myleosuppressive agent）である。より高い用量で投与されるときには、胃腸障害、発熱、結膜炎、肺臓炎、肝機能不全、皮膚炎、及び神経毒性の副作用も一般に確認されている。
５−アザシチジン（アザシチジン（Azacytidine）；５−ＡｚａＣ）は、抗悪性腫瘍活性を示す化合物である。この化合物は、ＡＭＬ、急性リンパ性白血病及び骨髄異形性症候群（myelodysplastic syndrome）の治療にとって有用であるとして知られている。現在の研究では、この化合物のβサラセミア（beta thalassemia）、急性骨髄性白血病、骨髄異形性症候群、進行型又は転移性固形腫瘍、非ホジキンリンパ腫（non-Hodgkin's lymphoma）、多発性骨髄腫（multiple myeloma）、非小細胞型肺癌（non-small cell lung cancer）及び前立腺癌における効果が評価されている。５−ＡｚａＣは、遺伝子の発現に次々に影響を及ぼすＤＮＡメチル化を阻害することが示されている。他の作用の中で、副作用として、白血球及び赤血球並びに血小板数の減少、悪心、嘔吐、疲労、下痢が挙げられる。
ゲムシタビンは、抗腫瘍活性を示すヌクレオシドアナログである。ゲムシタビン ＨＣｌは、２’−デオキシ−２’，２’−ジフルオロシチジン モノ塩酸塩（2'-deoxy-2',2'-difluorocytidine monohydrochloride）（β−異性体）からなり、膵癌及び肺癌を治療することにおいて効果的であるとして知られている。一般的には、ゲムシタビンは、核酸の合成を妨げることによって、ＤＮＡ及びＲＮＡの産生を防止する。この作用は、癌細胞の増殖を停止させて、その細胞を死に至らしめる。他の作用の中で、副作用として、白血球及び赤血球並びに血小板数の減少、悪心、嘔吐、疲労、下痢、インフルエンザ様症状、発疹が挙げられる。
アントラサイクリン系抗生物質
ダウノルビシン及びドキソルビシン並びにそれらの誘導体等のアントラサイクリン系抗生物質は、真菌ストレプトミセス・ペウセティウス（Streptomyces peucetius）によって産生される公知の抗悪性腫瘍薬を含む。イダルビシン（４−デメトキシダウノルビシン（4-demethoxydaunorubicin））は、アグリコン環のＣ４にメトキシ基をもたないダウノルビシンの合成誘導体を含む。これらの化合物は、ＤＮＡにインターカレートして、ＤＮＡ及びＲＮＡ合成を含むＤＮＡの各種機能に影響を及ぼす。ＤＮＡとの相互作用により、一般に一本鎖及び／又は二本鎖切断並びに姉妹染色分体交換が生ずる。ダウノルビシン（塩酸ダウノルビシン）の一つの特定の医薬品形態が、核酸合成を妨げない投与量で細胞分裂を防ぐことが示されている。ＤＮＡが切断されるメカニズムは十分に理解されていないが、トポイソメラーゼＩＩの作用によって又はフリーラジカルの生成によって媒介されると信じられている。更に、アントラサイクリンは、細胞膜と相互に作用し、それらの機能を変化させて抗腫瘍作用心毒性における役割を果たす可能性があるることも知られている。
ダウノルビシン（ダウノマイシン、ルビドマイシン（rubidomycin）、ｌｅｕｋａｅｍｏｍｙｃｉｎ Ｃ、ＲＰ−１３０５７、ＣＥＲＵＢＩＤＩＮＥ（登録商標））は、急性リンパ性白血病、急性顆粒球性白血病、急性骨髄球性白血病、急性期の慢性骨髄球性白血病、及び急性非リンパ性白血病の治療において有用であるとして知られている。更に、この化合物には、固形腫瘍において及びリンパ腫に対して何らかの活性があることが示されている。ダウノルビシンは、四環系のアグリコン−ダウノマイシノンによって形成されるグリコシドであり、アミノ糖−ダウノサミン（daunosamine）である。ダウノルビシンの経口吸収は低く、静脈投与されることが最も多い。ダウノルビシンの半減期は４５分であり、１９時間で消失する。ダウノルビシンは、より小さい活性型、ダウノルビシノールへの転換を経由して消失する。ダウノルビシン及びその誘導体は、骨髄機能低下（bone marrow depression）、口内炎、脱毛症、胃腸障害（gastrointestinal disturbances）、心律動異常（cardiac dysrhythmias）、肺水腫等の一定の毒性を有する。これらの組成物の最も広く認識されている欠点は、直ちに重篤な状態にする急性又は慢性型の心筋症の可能性である。特に、心毒性が、それ自体、治療を行っている患者の１５〜４０％においてうっ血性心不全として発現する。一般に、そのような副作用は利用される投与量によるが、その発現はより高い投与量で増加する。しかしながら、デクスラゾキサン（dexrazoxane）（ＡＤＲ−５２９）又はアミフォスチン（amifostine）（ＷＲ−２７２１又はＷＰ−１０６５）の併用投与はこれらの組成物によって生ずる心臓損傷を減少させるであろうということが認識されている。更に、アントラサイクリン療法の間の心臓損傷をジピリドキシル（dipyridoxyl）及びアミノポリカルボキシル酸（aminopolycarboxylic acid）ベースのキレート薬、及びそれらの金属キレート等の鉄キレート剤の同時投与により減少させることができることを示唆する証拠がある。米国特許第６，１４７，０９４号を参照されたい。
ドキソルビシン（アドリアマイシン、ルブレックス（rubrex）、１２−ナフタセンジオン（12-naphthacenedione）、１４−ヒドロキシダウノマイシン（14-hydroxydaunomycin）、ＮＳＣ−１２３１２７）は、８位に、ダウノルビシンにおけるアセチル基の代わりにヒドロキシアセチル基を有することにおいてのみダウノルビシンと相違する。ドキソルビシンが、急性白血病、悪性リンパ腫及び乳癌腫等の任意の固形腫瘍の治療において有効であることが示されている。この組成物は、ホジキン病及び非ホジキンリンパ腫の治療において、シクロホスファミド、ビンクリスチン及びプロカルバジンと共に利用されている。肉腫、プラズマ細胞骨髄腫、転移性甲状腺癌（metastatic thyroid carcinoma）、胃癌（gastric carcinoma）、気管支原性癌（broncheogenic carcinoma）、移行上皮癌、並びに卵巣、子宮内膜、甲状腺、精巣及び頚部の癌に対する更なる治療的利用が、示されている。ドキソルビシンの毒性は上述したダウノルビシンと同様である。エピルビシン（４’−エピドキソルビシン（4'-epidoxorubicin））、モルフォリノ誘導体（morpholino derivatives）及び同類のアントラセンジオンミトキサントロン（anthracenedione mitoxantrone）等のドキソルビシンのアナログでは、臨床活性が高く、心毒性（cardiac toxicity）が少ないことが知られている。
インビトロでの非拮抗的なダウノルビシン：シタラビン比の決定
本発明の更なる視点において、アントラサイクリン系薬剤及びシチジンアナログは、相乗的又は相加的（即ち、非拮抗的）な比（割合）でリポソームでカプセル化されるであろう。相乗的又は相加的な併用（組み合わせ）効果を示す薬剤の比の決定は、以下に記載した実験データのタイプに基づき、各種アルゴリズムを用いて行われる。これらの方法には、アイソボログラム法（Loewe, et al., Arzneim-Forsch (1953) 3: 258-290；Steel, et al., Int. J. Radiol. Oncol. Biol. Phys. (1979) 5: 27-55）、分画産物法（fractional product method）（ウェブ、酵素及び代謝阻害剤（Enzyme and Metabolic Inhibitors）（１９６３）第１巻、ｐｐ．１−５、ニューヨーク：アカデミック出版（Academic Press））、モンテカルロシミュレーション法、ＣｏｍｂｉＴｏｏｌ、ＣｏｍｂｏＳｔａｔ及びChou, J. Theor. Biol. (1976) 39: 253-276；及びChou, Mol. Pharmacol. (1974) 10:235-247に記載された方程式に基づくＣｈｏｕ−Ｔａｌａｌａｙ Ｍｅｄｉａｎ Ｅｆｆｅｃｔ法（Chou-Talalay median-effect method）が含まれる。代替法には、生存画分（surviving fraction）（Zoli, et al., Int. J. Cancer (1999) 80: 413-416）、コントロールと比較した顆粒球／マクロファージ−コロニー形成単位に対する応答率（Pannacciulli, et al., Anticancer Res. (1999) 19: 409-412）、及びその他のもの（Berenbaum, Pharmacol. Rev. (1989) 41: 93-141；Greco, et al., Pharmacol. Rev. (1995) 47: 331-385）が含まれる。
Ｃｈｏｕ−Ｔａｌａｌａｙ Ｍｅｄｉａｎ Ｅｆｆｅｃｔ法が好ましい。分析は、特定の効果、ｆａをもたらす投与量が以下の式により与えられる方程式を利用する：
Ｄ＝Ｄｍ[ｆａ／(１−ｆａ)]１／ｍ
ここで、Ｄは使用した薬剤の投与量であり、ｆａはその投与量によって影響された細胞の画分であり、Ｄｍは効力を示す５０％有効量（dose for median effect）であり、ｍは投与量−効果曲線の形を表す係数である（ｍは一次反応について１である）。
この方程式を更に処理して、Chou及びTalalay, Adv. Enzyme Reg. (1984) 22: 27-55；並びにChouら、化学療法における相乗作用及び拮抗作用（Synergism and Antagonism in Chemotherapy）、Chou及びRideout編、アカデミック出版：ニューヨーク １９９１：２２３−２４４に記載されている多剤効果方程式（multiple drug effect equation）に基づいて組み合わせ指数（combination index）（ＣＩ）を計算することができる。この計算のためのコンピュータプログラム（ＣａｌｃｕＳｙｎ）がＣｈｏｕ及びＣｈｏｕ（「マイクロコンピュータを用いた投与量−効果分析：ＥＤ５０、ＬＤ５０、相乗作用、拮抗作用、低用量リスク、レセプター リガンド結合性及び酵素反応速度論の定量化（Dose-effect analysis with microcomputers: ED50, LD50, synergism, antagonism, low-dose risk, receptor ligand binding and enzyme kinetics）」：ＣａｌｃｕＳｙｎマニュアル及びソフトウェア；ケンブリッジ：バイオソフト（Biosoft） １９８７）に見られる。
組み合わせ指数方程式は、酵素反応速度モデル（enzyme kinetic models）から誘導されたＣｈｏｕ−Ｔａｌａｌａｙの多剤−効果方程式に基づく。方程式により、相乗作用及び拮抗作用ではなく相加作用のみが求められる。しかしながら、ＣａｌｃｕＳｙｎプログラムによれば、相乗作用は期待された相加作用を超えるものと定義され、拮抗作用は相加作用を下回るものと定義される。１９８３年にＣｈｏｕとＴａｌａｌａｙは、ＣＩ＝１を相加作用としたが、それに従って、二つの薬剤の多剤効果方程式から、作用につき同一又は類似の形態を有する相互排他的な薬剤について下記式が得られる：
ＣＩ＝(Ｄ)１／(Ｄｘ)１＋(Ｄ)２／(Ｄｘ)２ ［式１］
更に、作用につき全く無関係の形態を有する相互非排他的な薬剤について下記式が提案される：
ＣＩ＝(Ｄ)１／(Ｄｘ)１＋(Ｄ)２／(Ｄｘ)２＋((Ｄ)１(Ｄ)２)／(Ｄｘ)１(Ｄｘ)２ ［式２］
ＣＩ＜１、＝１、及び＞１は、それぞれ相乗作用、相加作用、及び拮抗作用を示す。式１又は式２では、組み合わせにおける（分子の）薬剤１、(Ｄ)１、及び薬剤２、(Ｄ)２、が実際の実験においてｘ％を阻害すると規定される。したがって、実験的に観察されるｘ％阻害は丸めた数でなくてもよく、最も多くは少数を有する。式１及び２の（分母の）(Ｄｘ)１及び(Ｄｘ)２は、それぞれｘ％を阻害する薬剤１及び薬剤２単独の投与量である。
簡単にするため、二を超える薬剤が組み合わせに含まれるとき、多くの場合、相互排他性と仮定する（ＣａｌｃｕＳｙｎマニュアル及びアオフトウェア；ケンブリッジ：バイオソフト １９８７）。
更に二つの薬剤組み合わせを単一の製薬単位として用いて第三の薬剤との相乗的な又は相加的な相互作用を測定してもよい。更に、三つの薬剤組み合わせを一つの単位として用いて第四の薬剤との非拮抗的な相互作用を測定する等してもよい。
基礎をなす実験データは、培養細胞又は無細胞系を用いてインビトロで一般に測定される。好ましくは、組み合わせ指数（ＣＩ）は、前記説明したように、濃度範囲の代理パラメータである図１Ａ及び１Ｂに示されるような影響された細胞の画分（ｆａ）の関数としてプロットされる。好ましい薬剤の組み合わせは、ｆａ値のかなりの範囲にわたって相乗作用及び相加作用を示すものである。薬剤の組み合わせは、細胞のうち１％を超える細胞に影響を与える、即ちｆａ範囲が０．０１を超える濃度範囲のうち少なくとも５％にわたって非拮抗的であれば、選択される。好ましくは、全体の濃度のうちより高い部分において、好適なＣＩが示される；例えば、０．２〜１．０のｆａ範囲で５％である。より好ましくは、この範囲で１０％が好適なＣＩを示す。組成物において、更に好ましくはこのｆａ範囲で２０％、更に好ましくは５０％以上、最も好ましくは０．２〜１．０のｆａ範囲で少なくとも７０％が利用される。ｆａ値のかなりの範囲にわたって相乗作用を示す組み合わせを種々の薬剤の比で再評価して、非拮抗的な相互作用の強度を高め、かつ相乗作用が認められるｆａの範囲を拡大させる最適な比を規定してもよい。
細胞が影響される濃度の全範囲にわたって相乗作用を有することが好ましいであろうが、多くの場合、実施例１において詳述したＭＴＴ法等の分光光度法を用いたときに０．２〜０．８のｆａ範囲において結果が非常に信頼できることが分かっている。したがって、本発明の組成物によって発揮される相乗作用は０．０１以上の広い範囲内に存在することが示されるが、０．２〜０．８のｆａ範囲において相乗作用が発揮されることが好ましい。しかしながら、例えば、生物発光（バイオルミネッセンス）又はクローン原性法（clonogenecity assays）等、その他感受性がより高い方法を用いて、０．８を超えるｆａ値で相乗作用を評価することができる
最適な組み合わせ比を単一の製薬単位として更に用いて第三の薬剤との相乗的な又は相加的な相互作用を測定してもよい。更に、三つの薬剤組み合わせを一つの単位として用いて第四の薬剤との非拮抗的な相互作用を測定する等してもよい。
前述したように、細胞培養のインビトロ研究は「関連」細胞について行われるであろう。細胞の選択は、薬剤の治療用途に依存するであろう。本発明の範囲に含まれる組成物の基礎を与えるために、ただ一つの関連細胞株又は細胞培養型が、要求された非拮抗作用を発揮しさえすればよい。
例えば、本発明の一つの好ましい形態において、薬剤の前記組成物は、抗癌療法用である。よくある形態において、薬剤の前記組成物は、白血病又はリンパ腫治療用である。その後、テストされるべき細胞及びテストの性質について適当な選択がなされるであろう。特に、腫瘍細胞株が適当な対象であり、細胞死又は細胞静止の測定が適当な指標である。更に以下に議論するように、他の徴候にとって適当である非拮抗的な組み合わせを見出すことを試みることに関しては、他の標的細胞及び細胞毒性又は細胞静止以外の判定基準を用いることができる。
抗腫瘍剤等の判定のため、細胞株を、正常細胞株の貯蔵所から（例えば、ＮＣＩ又はＡＴＣＣ）、学術機関又は民間財源のものを含むその他の団体から入手してもよい。好ましい細胞株には、ＮＣＩ／ＮＩＨの開発途上治療プログラム（Developmental Therapeutics Program）によって同定された細胞株から選択される１以上のものが含まれるであろう。このプログラムによる腫瘍細胞株の選別によって、現在、白血病、メラノーマ、並びに肺、大腸、脳、卵巣、乳房、前立腺及び腎臓の癌の典型を示す６０の種々の腫瘍細胞株が同定されている。望ましい濃度範囲にわたって要求される非拮抗作用は、単細胞型についてさえ示されればよい；しかしながら、この作用は、少なくとも二つの細胞株について示されることが好ましく、より好ましくは、三つの細胞株、より好ましくは五つの細胞株、更に好ましくは十の細胞株について示される。前記細胞株は、樹立腫瘍細胞系（established tumor cell line）又は患者サンプルから得られた初代培養であってもよい。細胞株は如何なる種のものでもよいが、好ましいソースは哺乳類、特にヒトであろう。細胞株を、各種実験室の条件の下選別によって及び／又は外来性遺伝子材料の付加若しくは除去によって遺伝的に変化させてもよい。細胞株は、ウイルス又はプラスミドベースの形質移入法を含むがこれに限定されない任意の遺伝子導入技術によって形質移入されてもよい。修飾には、特定のタンパク質又はペプチドの発現をコードするｃＤＮＡ、プロモーター又はエンハンサーシーケンス等の制御因子（regulatory element）或いはアンチセンスＤＮＡ又はＲＮＡの導入が含まれうる。遺伝子操作された組織培養株には、腫瘍抑制遺伝子、即ちｐ５３、ｐＴＥＮ及びｐ１６等の遺伝子を含む及び含まない系統；並びにドミナントネガティブ法（dominant negative methods）、遺伝子挿入（インターカレーション）法（gene insertion methods）及びその他の選定法の使用により作成された系統が含まれうる。細胞生存度を定量化する、例えば抗腫瘍剤をテストするために使用されうる組織培養細胞株として、好ましくは、Ｐ３８８、Ｌ１２１０、ＨＬ−６０、ＭＯＬＴ−４、ＫＢＭ−３、ＷｅＨｉ−３、Ｈ４６０、ＭＣＦ−７、ＳＦ−２６８、ＨＴ２９、ＨＣＴ−１１６、ＬＳ１８０、Ｂ１６−Ｆ１０、Ａ５４９、Ｃａｐａｎ−１、ＣＡＯＶ−３、ＩＧＲＯＶ１、ＰＣ−３、ＭＸ−１及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１が挙げられるが、これらに限定されない。
一つの好ましい形態において、与えられた効果（ｆａ）は、細胞障害剤の細胞培養への適用後の細胞死又は細胞静止を意味する。細胞死又は生存度を、例えば、下記方法を用いて測定してもよい：

Figure 2007533670
二以上の薬剤の非拮抗的な比を、癌以外の疾患徴候について決定することができ、この知見を使用して、これらの疾患を治療するための二以上の薬剤の治療用製剤を製造することができる。インビトロアッセイに関しては、多くの測定可能な指標を、これらの指標が特定の疾患に対して治療上関連性があるという前提で、薬剤相乗作用を規定するものから選択することができる。
前述したように、細胞培養のインビトロ研究は、「関連」細胞について行われるであろう。細胞の選択は、薬剤の治療用途に依存するであろう。個々の患者のバイオプシー又は全腫瘍のインビトロ研究を、腫瘍サンプル（又は複数の腫瘍サンプル）の単細胞へのホモジナイゼーションから生じた「腫瘍ホモジネート（tumor homogenate）」について行うことができる。
一つの好ましい形態において、与えられた効果（ｆａ）は、細胞障害剤の「関連」細胞培養又は「腫瘍ホモジネート」への適用後の細胞死又は細胞静止を意味する（実施例１参照）。細胞死又は生存度を、多数の技術として公知の方法を用いて測定してもよい。
脂質ベースの送達媒体の調製
本発明において使用される好ましい脂質担体は、リポソームである。リポソームについては、リポソーム：合理的な設計（Liposomes; Rational Design）（Ａ．Ｓ．Ｊａｎｏｆｆ編、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ社、ニューヨーク、ＮＹ）に記載されているように又はその技術において知識を有する者に知られているその他の技術によって製造することができる。本発明において使用される適当なリポソームには、大型単層小胞体（large unilamellar vesicles）（ＬＵＶｓ）、多層膜小胞体（multilamellar vesicles）（ＭＬＶｓ）、小型単層小胞体（small unilamellar vesicles）（ＳＵＶｓ）及び嵌合融合リポソーム（interdigitating fusion liposomes）が含まれる。
本発明において使用されるリポソームは、ジステアリルホスファチジルコリン等のホスファチジルコリン脂質を含むように製造されてもよい。本発明のリポソームはまた、コレステロール等のステロールを含んでもよい。リポソームはまた、治療用脂質を含んでもよく、そのような脂質の例として、エーテル脂質、ホスファチジン酸、ホスホネート、セラミド及びセラミドアナログ、スフィンゴシン及びスフィンゴシンアナログ並びにセリン含有脂質が挙げられる。
リポソームを、ポリエチレングリコール−ＤＳＰＥ等の表面安定化親水性ポリマー−脂質複合物（surface stabilizing hydrophilic polymer-lipid conjugates）を用いて製造して、循環寿命（circulation longevity）を増大させてもよい。同様にホスファチジルグリセロール（phosphatidylglycerol）（ＰＧ）及びホスファチジルイノシトール（phosphatidylinositol）（ＰＩ）等の負荷電脂質の取り込みをリポソーム製剤に追加して、担体の循環寿命を増大させてもよい。これらの脂質は、親水性ポリマー−脂質複合物を交換するため、表面安定化剤として用いられうる。本発明の好ましい形態では、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）又はホスファチジルイノシトール（ＰＩ）を含むリポソームを使用して凝集を防止し、それによって担体の血中滞留時間（blood residence time）を増大させてもよい。
一つの形態において、本発明によるリポソーム組成物は、好ましくは癌を治療するために使用される。カプセル化した薬剤の腫瘍部位への送達は、本発明のリポソームの投与によって行われる。好ましくは、リポソームは３００ｎｍ未満の直径を有する。最も好ましくは、リポソームは２００ｎｍ未満の直径を有する。腫瘍脈管構造は、一般に、内皮における開窓又は間隙により正常な脈管構造よりも漏出性である。これにより、直径２００ｎｍ未満の送達媒体は、不連続内皮細胞層、及びその下にある、腫瘍に血液を供給する血管周囲の基底膜を透過する。血管外遊走後の送達媒体の腫瘍部位への局所的な蓄積により、抗癌剤送達及び治療効果が増大する。
各種方法を利用して、活性剤（active agents）をリポソームでカプセル化（活性剤をリポソームに内封）してもよい。「カプセル化（encapsulation）」には、薬剤の脂質ベースの送達媒体との共有結合又は非共有結合が含まれる。例えば、これを、薬剤のリポソームの外層又は複数の外層との相互作用或いはリポソーム内での薬剤の捕捉によるものとすることができ、そのときリポソームの異なる部分間で平衡状態に達する。したがって、薬剤のカプセル化を、脂質成分との共有結合的又は非共有結合的な相互作用或いはリポソームの水性内部における捕捉を介したリポソームの二分子膜との相互作用による薬剤の会合によるものとし、或いは内部水相と二分子膜との間で平衡状態にあるものとすることができる。「負荷（Loading）」は、１以上の薬剤を送達媒体でカプセル化する行為をいう。
望ましい組み合わせのカプセル化を、別々の送達媒体で又は同一の送達媒体でカプセル化することにより行うことができる。別々のリポソームでのカプセル化を望む場合には、連係して作用する薬物動態（coordinated pharmacokinetics）を見越して、各リポソームの脂質組成物を、全く異なるものとしてもよい。媒体組成物を変更することによって、カプセル化した薬物の放出率を、望ましい比の薬剤が腫瘍部位に送達されるように、合わせることができる。放出率を変更する手段には、脂質を形成する小胞体（vesicle）のアシル鎖長を増加させて薬剤保持時間を改善すること、リポソーム膜外でＰＥＧ等の表面グラフトした親水性ポリマーの交換を調節すること並びにステロール類又はスフィンゴミエリン等の膜硬化剤（membrane-rigidifying agents）を膜に組み込むことが含まれる。仮に第一及び第二の薬剤が特定の薬剤比で投与されることが望ましい場合及び第二の薬剤について第一の薬剤のリポソーム組成物（ＤＭＰＣ／Ｃｈｏｌ）内部での保持が不十分である場合には、第二の薬剤を、アシル鎖張を増大させた脂質を含むリポソーム組成物でカプセル化することによって、その薬物動態が改善されうることは当業者に明瞭であろう。別々のリポソームでカプセル化したとき、最適な治療活性を与えるよう患者別基準に応じて決定されているアントラサイクリン系薬剤対シチジンアナログの比が、投与前に適正量の各リポソームカプセル化剤を組み合わせることによって、個々の患者に対してもたらされうることが容易に認められるべきである。これに代えて、二以上の薬剤を同一のリポソームでカプセル化してもよい。
カプセル化技術は、送達媒体の性質に左右される。例えば、治療剤を、受動的な負荷方法及び能動的な負荷方法の両方を用いて、リポソーム中に負荷してもよい。活性剤をリポソームでカプセル化する受動的な方法には、リポソームの製造中に薬剤をカプセル化することが含まれる。これには、Ｂａｎｇｈａｍらによって記載された受動捕捉法（passive entrapment method）（J. Mol. Biol. (1965) 12: 238）が含まれる。この技術により、放出（extrusion）のすぐ後に大型単層小胞体（ＬＵＶｓ）又は小型単層小胞体（ＳＵＶｓ）に転換されうる多層膜小胞体（ＭＬＶｓ）の形成が結果として生ずる。受動カプセル化の別の適当な方法として、Ｄｅａｍｅｒ及びＢａｎｇｈａｍによって記載されたエーテル注入技術（Biochim. Biophys. Acta (1976) 443: 629）並びにＳｚｏｋａ及びＲａｐｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓによって記載された逆相蒸発（Reverse Phase Evaporation）技術（P.N.A.S. (1978) 75: 4194）が挙げられる。更に、受動的なカプセル化の別の適当な方法として、リポソームの形成後の受動的平衡（passive equilibration）が挙げられる。このプロセスには、条件変化（altered condition）の下で又は非周囲（non-ambient）（温度、圧力等に基づく）条件下で予備形成したリポソームをインキュベートすること並びに治療薬（例えば、シチジンアナログ又はアントラサイクリン系薬剤）をリポソームの外部に加えることが含まれる。その治療薬により、その後、リポソーム膜全体にわたって、リポソーム内部が平衡に達する。リポソームはその後周囲条件に戻され、カプセル化しなかった治療薬が存在する場合には、これが透析法又は別の適当な方法により除去される。
カプセル化の能動的な方法には、米国特許第５，６１６，３４１号、第５，７３６，１５５号及び５，７８５，９８７号に記載されたｐＨ勾配負荷技術（pH gradient loading technique）並びに能動金属負荷（active metal-loading）が含まれる。ｐＨ勾配負荷の一つの方法は、ｐＨ４．０の内部バッファとしてクエン酸及び中性の外部バッファを利用するクエン酸塩基負荷法（citrate-base loading method）である。リポソーム全体にわたってｐＨ勾配を確立し、且つ維持するために用いられる他の方法には、リポソーム膜に挿入することができプロトンと引き換えに膜全体にわたってイオンを輸送することができるイオノフォアの使用が含まれる（米国特許第５，８３７，２８２号参照）。イオノフォアの非存在下、複合体形成を介してリポソームに薬剤を取り込ませるために遷移金属を利用する最近の好ましい技術を使用してもよい。この技術は、薬剤を取り込ませるようｐＨ勾配を確立するのではなく薬剤−金属複合体を形成することによる。
捕捉の受動及び能動法を、１を超えるカプセル化剤を含むリポソーム製剤の製造のため、組み合わせてもよい。
本発明の組成物の生体内（インビボ）投与
前述したように、本発明の送達媒体組成物を、ヒト等の温血動物並びに家禽（domestic avian）種に投与してもよい。ヒトの病気の治療のため、資格のある医師は、確立されたプロトコルを用いて本発明の組成物が投与量、スケジュール及び投与経路に関してどのように利用されるべきか判断するであろう。本発明の送達媒体組成物でカプセル化した薬剤において対象（患者）の健常な組織に対する毒性が緩和されている場合には、そのような投与において、投与量の段階的増大が利用されてもよい。
本発明の医薬組成物は、好ましくは非経口投与、即ち動脈投与、静脈投与、腹腔投与、皮下投与、又は筋肉投与される。より好ましくは、本発明の医薬組成物は、大量瞬時投与（bolus）又は輸液注入（infusional injection）によって静脈投与又は腹腔投与される。例えば、参照により組み込まれるＲａｈｍａｎら、米国特許第３，９９３，７５４号；Ｓｅａｒｓ、米国特許第４，１４５，４１０号；Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓら、米国特許第４，２３５，８７１号；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ、米国特許第４，２２４，１７９号；Ｌｅｎｋら、米国特許第４，５２２，８０３号；及びＦｏｕｎｔａｉｎら、米国特許第４，５８８，５７８号を参照されたい。
他の方法では、本発明の医薬又は化粧用製剤を、標的組織に製剤を直接投与することによって、当該組織と接触させることができる。そのような投与は、局所的な、「開放（open）」又は「閉鎖（closed）」処置によってなされてもよい。「局所的（topical）」とは、多剤製剤（multi-drug preparation）の皮膚、中咽頭、及び外耳道等、環境にさらされた組織への直接投与を意味する。「開放」処置は、患者の皮膚を切開すること並びに医薬製剤が投与される皮下にある組織を直接目で見えるようにすることを含む処置である。これは、一般に、肺に到達するための開胸術、腹部内臓に到達するための開腹術（abdominal laparotomy）又はその他の標的組織への直接的な外科的アプローチ等の外科的な処置によって行われる。「閉鎖」処置は、内部標的組織を直接目で見えるようにしないが、皮膚の小さな傷を通して器具を挿入することによりこれに到達させる観血的な処置である。例えば、製剤を針洗浄（needle lavage）よって腹膜に投与してもよい。これに代えて、製剤を内視鏡装置により投与してもよい。
本発明の送達媒体を含む医薬組成物は、標準技術に従って製造され、また、アルブミン、リポタンパク質、及びグロブリン等の安定性を高めるための糖タンパク質を含め、水、緩衝水（buffered water）、０．９％生理食塩水、０．３％グリシン、５％デキストロース、及び等浸透圧性スクロース液等を含んでもよい。これらの組成物を、従来公知の滅菌技術によって滅菌してもよい。結果として生じた水溶液を、使用のため包装し又は無菌条件下で濾過し、凍結乾燥してもよく、その凍結乾燥した製剤を投与前に滅菌した水溶液と混合してもよい。前記組成物は、例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、及び塩化カルシウム等、ｐＨ調整剤及び緩衝剤、並びに張度調整剤（tonicity adjusting agents）等の医薬的に許容し得る補助物質を、適当な生理条件のために必要に応じて、含んでもよい。更に、送達媒体懸濁液は、貯蔵におけるフリーラジカル及び脂質過酸化損傷に対抗して脂質を保護する脂質保護剤を含んでもよい。αトコフェロール及びフェロキサミン等の水溶性鉄特異性キレート剤（water-soluble iron-specific chelators）等の親油性フリーラジカル失活剤が適している。
送達媒体の医薬製剤中の濃度は、例えば約０．０５重量％から、１０〜３０重量％程度まで幅広く変化させることができるが、通常は約２〜５重量％又は少なくとも約２〜５重量％であり、選択される投与の特定の形態に応じて、主として液量及び粘度等によって選択されるであろう。例えば、治療と付随した液負荷（fluid load）を低減させるために、前記濃度を増加させてもよい。これに代えて、刺激性の脂質で構成された送達媒体を低濃度まで希釈して、投与部位での炎症を小さくしてもよい。診断のため、投与される送達媒体の量は、用いられる特定の標識、診断されている病状及び臨床医の判断に依存するであろう。
本発明の医薬組成物は、好ましくは静脈投与される。送達媒体製剤の投与量は、薬剤と脂質の比（割合）並びに投与する医師の患者の年齢、体重及び体調に基づく見解に依存するであろう。
医薬組成物の他、獣医学的使用にとって適当な製剤を製造し、対象（被検体）に適した方法で投与してもよい。好ましい獣医学的対象には、哺乳類種、例えば、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、及び家禽（domesticated fowl）が含まれる。対象には、実験動物、例えば、特にラット、ウサギ、マウス、及びモルモットも含まれる。
キット
本発明の組成物中の治療薬を、各治療薬が適当な送達媒体と安定的に会合されている個々の組成物に切り離して処方してもよい。投与される治療薬の比が治療の標的で維持されるよう送達媒体の薬物動態が連係して作用される限り、これらの組成物を、対象（患者）に別々に投与することができる。したがって、独立したコンテナに、少なくとも第一の治療薬と安定的に会合した送達媒体を含む第一の組成物と、第二のコンテナに、少なくとも第二の治療薬と安定的に会合した送達媒体を含む第二の組成物とを含むキットを作成することは有用である。前記コンテナを、その後キットに包装することができる。
前記キットには、投与されるべき各組成物の量の比についての記述を少なくとも含む、組成物の対象への投与形態に関する指示書も含まれるであろう。これに代えて、又は更に、一方のコンテナの内容物が他方のコンテナの内容物と組み合わせて適正な比を表すようコンテナ毎に組成物の量を予め測定して、前記キットは作成される。これに代えて、又は更に、前記コンテナには、目に見える目盛りに従って適当量の投与を可能にする計量線（measuring scale）が付されてもよい。前記コンテナはそれ自体、投与に使用できてもよい；例えば、前記キットは、別々のシリンジに封入された適当量の各組成物を含むかもしれない。予め処方した正確な比の治療薬を含む製剤を、同様にこの方法で包装してもよく、その結果、当該製剤はキット内に包装されたシリンジから直接投与される。
下記実施例により本発明を更に説明する。当該実施例は、単に特定の形態に関して本発明を詳細に説明するために与えられる。これらの具体例により、本発明のある特定の視点について詳細に説明されるが、限定がなされるものではなく、或いは開示された発明の範囲に限定されるものではない。
［実施例１］薬剤比依存性であるインビトロでのダウノルビシン:シタラビン相乗作用
２以上の薬剤の組み合わせの多くは、相乗効果を発揮する能力を有する。同様に、その同じ２以上の薬剤の組み合わせはまた、相加的又は拮抗的相互作用を示す場合もある。相乗的であるダウノルビシンとシタラビン（Ａｒａ−Ｃとしても知られている）との比を同定するため、ダウノルビシンとシタラビンとの各種組み合わせについて、インビトロで細胞毒性効果をテストした。より具体的には、薬剤濃度の広い範囲にわたって相乗作用を示す薬剤比を同定した。
相加、相乗又は拮抗作用の測定を、Ｐ３８８及びＬ１２１０マウスリンパ性白血病細胞について、ダウノルビシン：シタラビン（ＤＮ：Ａｒａ−Ｃ）を１０：１、５：１、１：１、１：５及び１：１０のモル比で用いて、行った。標準テトラゾリウムベース比色ＭＴＴ細胞毒性測定プロトコル（standard tetrazolium-based colorimetric MTT cytotoxicity assay protocol）（Mosmann, et al., J. Immunol Methods (1983) 5(1-2): 55-63）を利用して、影響された細胞の画分の読み取り値を測定した。簡単には、生細胞により、テトラゾリウム塩、３−（４，５−ジエチルチアゾイル−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロマイド（3-(4,5-diethylthiazoyl-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide）（ＭＴＴ）が分光測定で読み取ることができる青いホルマザンに還元される。ここで用いられるＰ３８８又はＬ１２１０マウスリンパ性白血病細胞等の細胞は、ＢＤＦ−１マウスで継代（培養）され、必要に応じて、除去され、新鮮な細胞培養培地を含む７５ｃｍ２フラスコに移され、ウェル当たり１００μＬの中にそれぞれ１０，０００若しくは６，０００個のＰ３８８又はＬ１２１０細胞の濃度で、９６ウェル細胞培養プレートに添加される。その細胞を、その後、細胞接着を促進させるため、３７℃、５％ＣＯ２、及び＞７５％湿度で２４時間インキュベートしておく。その翌日、段階薬剤希釈（serial drug dilution）を、１２ウェル細胞培養プレートにおいて作成する。各種溶液について予め作成した薬剤を、新鮮な細胞培養培地で希釈する。薬剤を、単一の薬剤（２０μＬ）及び特定の固定した比の２種薬剤組み合わせ（２０μＬずつ）に対応するウェルに投与する。全ウェル体積を新鮮培地で２００μＬまでにする。薬剤の曝露は、７２時間の期間である。
薬剤の曝露後、ＭＴＴ試薬（１ｍｇ／ｍＬリン酸緩衝塩溶液）を、ウェル当たり５０μＬの体積で各ウェルに添加し、４時間インキュベートする。ウェルの内容物をその後吸引し、１５０μＬのジメチルスルホキシド（dimethylsulfoxide）（ＤＭＳＯ）を各ウェルに添加して、細胞を分裂させ、細胞内部でホルマザン沈殿物を可溶化する。９６ウェルプレートを最低２分間プレート振盪機（plate shaker）で振盪させ、５７０ｎｍの波長に設定したマイクロプレート分光光度計（microplate spectrophotometer）で読み取る。読み取る光学密度（optical density）（ＯＤ）を記録し、培地を単独で含むブランクウェルのＯＤ値を、細胞を含む全てのウェルから引き算する。薬剤への曝露後の細胞生存は、薬剤の曝露のないコントロールウェルの細胞の百分率として基礎づけられる。全ウェルについて三回行い、平均値を計算する。
組み合わせ指数を、その後、薬剤−効果分析のＣｈｏｕ及びＴａｌａｌａｙの理論に基づくＣａｌｃｕｓｙｎを用いて、各ダウノルビシン；シタラビン剤について求める。なお、「Ｍｅｄｉａｎ−Ｅｆｆｅｃｔ方程式（median-effect equation）」を用いて、その技術において広く用いられている多数の生化学的方程式が計算されている。この方程式の導出により、組み合わせ指数（ＣＩ）を計算するために用いられる方程式等、より高い次数の方程式が得られている。以前に述べたように、ＣＩを用いて、１以上の薬剤の組み合わせ及び各組み合わせの各種比が拮抗的（ＣＩ＞１．１）であるか、相加的（０．９≦ＣＩ≧１．１）であるか又は相乗的（ＣＩ＜０．９）であるかを判定することができる。ＣＩプロットは、典型的にはｘ軸の影響された細胞の割合又は影響された画分（ｆａ）に対してｙ軸を表すＣＩを用いて図示される。影響されたＰ３８８又はＬ１２１０マウスリンパ性白血病細胞の画分に対するＣＩとしてプロットされた図１Ａ及び１Ｂのデータは、それぞれ、ダウノルビシンとシタラビンとの特定の組み合わせが拮抗的である一方、その他のものは相乗的又は相加的であることを図示する。１：１０、１：５及び１：１のダウノルビシン：シタラビン（ＤＮ：Ａｒａ−Ｃ）比では、０．７５以上のｆａ値でＰ３８８細胞について相乗作用が認められる（図１Ａ）。これにより、１：１、１：１０及び１：５の比は、著しい腫瘍細胞死を引き起こすのに十分な濃度で相乗的であることが示される。ダウノルビシン：シタラビンの１：５及び１：１０の比も、ｆａ値の適当な範囲にわたってＬ１２１０細胞について非拮抗的である（図１Ｂ）。逆に、ダウノルビシン：シタラビンの５：１及び１０：１の比は、ｆａ値の広い範囲にわたってＰ３８８及びＬ１２１０細胞について拮抗的である。図１Ｃ及び１Ｄでは、７５％（ＥＤ７５）及び９０％（ＥＤ９５）腫瘍細胞増殖阻害を引き起こすのに十分な薬剤濃度でのＣＩ値が、Ｐ３８８及びＬ１２１０細胞について異なるダウノルビシン：シタラビンモル比で比較されているが、ＣＩのダウノルビシン：シタラビン比への依存は、この図１Ｃ及び１Ｄにおいても示される。これらの結果に基づき、１：５ダウノルビシン：シタラビンのモル比を、固定した薬剤比のリポソーム担体で処方するために、選択した。
［実施例２］リポソーム中に２種負荷されうる（dual-loaded）ダウノルビシン及びシタラビン
ダウノルビシン及びシタラビンの両方を含むリポソームを、ダウノルビシンを能動的に負荷した受動捕捉シタラビン（passively entrapped cytarabine）を含むＤＳＰＣ／ＤＳＰＧ／コレステロール（７：２：１ モル比）リポソームを用いて得ることができた。簡単には、１００ｍｇ脂質／ｍｌ最終濃度の濃度で混合した脂質（ＤＳＰＣ：ＤＳＰＧ：ＣＨＯＬ（７：２；１ モル比））をクロロホルム：メタノール：Ｈ２Ｏ混合物（９５：４：１ ｖｏｌ／ｖｏｌ）中に溶解させることによって、脂質発泡体を、調製した。溶媒を、その後真空蒸発（vacuum evaporation）により除去し、生じた脂質発泡体を、７０℃で、１００ｍＭ Ｃｕ（グルコネート）２、２２０ｍＭトリエタノールアミン（triethanolamine）（ＴＥＡ）、ｐＨ７．４及び５０ｍｇ／ｍＬ（２０３ｍＭ）シタラビン（３Ｈ−シタラビンをトレーサーとして含むもの）からなる溶液で水和させた。生じたＭＬＶを、７０℃で１０分間押し出して、大型単層小胞体を得た。生じたリポソームの平均直径を、ＱＥＬＳ（準弾性光散乱（quasi-elastic light scattering））分析によって測定したところ、約１００ｎｍ＋／−２０ｎｍであった。次いで、リポソームを、タンジェンシャルフロー透析法（tangential flow dialysis）を用いて３００ｍＭ スクロース、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１ｍＭ ＥＤＴＡ（ＳＨＥ）、ｐＨ７．４中へ、バッファ交換し、それによってカプセル化（内封）されなかったシタラビン及びＣｕ（グルコネート）２／ＴＥＡを除去した。シタラビン対脂質モル比を脂質シンチレーションカウンティング（lipid scintillation counting）を用いて測定して、脂質濃度（１４Ｃ−ＤＰＰＣ）及びシタラビン濃度（３Ｈ−シタラビン）を求めた。
ダウノルビシンを、１：５の最終目標ダウノルビシン：シタラビンモル比になるまで、これらのリポソームに添加した。ダウノルビシンのリポソーム中への負荷を、５０℃で３０分間サンプルをインキュベートすることによって促進させた。負荷後、そのサンプルを室温まで冷却した。セファデックス（Sephadex）Ｇ−５０スピンカラムによるリポソーム溶出後、薬剤カプセル化効率（drug encapsulation efficiency）を評価した。
ダウノルビシン負荷効率（daunorubicin loading efficiency）を、標準曲線に対する４８０ｎｍでの吸収を用いて測定した。ダウノルビシン測定のため４８０ｎｍでの吸収を用いて及び脂質濃度を測定するため脂質シンチレーションカウンティングを用いて、各時点での薬剤対脂質比を測定した。表１は、薬剤カプセル化及び遊離型薬剤の除去後の平均ダウノルビシン／脂質比及びシタラビン／脂質比を示す。表１から、０．０４２：１の初期ダウノルビシン対脂質比で添加されたダウノルビシンを、受動捕捉シタラビンを０．２３４の薬剤対脂質比で含むＤＳＰＣ／ＤＳＰＧ／Ｃｈｏｌ（７：２：１ モル比）リポソーム中に有効に負荷することができることは明らかである。
Figure 2007533670
［実施例３］インビボでの薬剤比の維持
ダウノルビシン及びシタラビンがインビボで相乗作用の範囲において１：５の薬剤：薬剤比で維持されうるかどうかを測定するため、カプセル化したダウノルビシン及びシタラビンを含むＤＳＰＣ／ＤＳＰＧ／Ｃｈｏｌ（７：２：１ ｍｏｌ：ｍｏｌ）リポソームを、マウスに静脈投与し、血漿（プラズマ）薬剤／薬剤比を、経時でモニターした。
簡単には、１００ｍｇ脂質／ｍｌ最終濃度の濃度の脂質混合物（ＤＳＰＣ：ＤＳＰＧ：ＣＨＯＬ（７：２：１ モル比））をクロロホルム：メタノール：Ｈ２Ｏ混合物（９５：４：１ ｖｏｌ／ｖｏｌ）中に溶解させることによって、脂質発泡体を、調製した。溶媒を、その後真空蒸発（vacuum evaporation）により除去し、生じた脂質発泡体を、７０℃で、１００ｍＭ Ｃｕ（グルコネート）２、２２０ｍＭ トリエタノールアミン（triethanolamine）（ＴＥＡ）、ｐＨ７．４及び５０ｍｇ／ｍＬ（２０３ｍＭ）シタラビン（微量（trace amounts）の３Ｈ−シタラビンを含むもの）からなる溶液で水和させた。生じたＭＬＶを、７０℃で押し出して、大型単層小胞体を得た。生じたリポソームの平均直径を、ＱＥＬＳ（準弾性光散乱（quasi-elastic light scattering））分析によって測定したところ、約１００ｎｍ＋／−２０ｎｍであった。次いで、リポソームを、タンジェンシャルフロー透析法（tangential flow dialysis）を用いて３００ｍＭ スクロース、２０ｍＭ リン酸ナトリウム、１０ｍＭ ＥＤＴＡ（ＳＨＥ）、ｐＨ７．４中へ、バッファ交換し、それによってカプセル化（内封）されなかったシタラビン及びＣｕ（グルコネート）２／ＴＥＡを除去した。
ダウノルビシンを、ダウノルビシン対シタラビン最終モル比が約１：５になるよう、これらのリポソームに添加した。リポソーム中へのダウノルビシン負荷を、５０℃で３０分間サンプルをインキュベートすることによって促進させた。負荷後、そのサンプルを室温まで冷却した。セファデックス（Sephadex）Ｇ−５０スピンカラムによるリポソーム溶出後、薬剤カプセル化効率（drug encapsulation efficiency）を評価した。シタラビン対脂質モル比を脂質シンチレーションカウンティング（lipid scintillation counting）を用いて測定して、脂質濃度（１４Ｃ−ＤＰＰＣ）及びシタラビン濃度（３Ｈ−シタラビン）を求めた。ダウノルビシン負荷効率（daunorubicin loading efficiency）を、標準曲線に対する４８０ｎｍでの吸収を用いて測定した。ダウノルビシン測定のため４８０ｎｍでの吸収を用いて並びに脂質及びシタラビン濃度を測定するため脂質シンチレーションカウンティングを用いて、薬剤対脂質比を測定した。
前記製剤をその後、ＢＤＦ−１マウスに尾静脈を介して静脈注射した。リポソーム製剤の投与量を、ダウノルビシンにつき５ｍｇ／ｋｇ、シタラビンにつき１２．５ｍｇ／ｋｇとした。静脈投与後の望ましい時点で、血液を、心臓穿刺（時点につき３マウス）によって採取し、ＥＤＴＡ被覆マイクロコンテナ（EDTA coated micro containers）に入れた。それらのサンプルを、遠心分離して血漿を分離し、血漿を別のチューブに移した。ダウノルビシン及びシタラビン血漿（プラズマ）レベルを、高速液体クロマトグラフィー（High Performance Liquid Chromatography）（ＨＰＬＣ）を用いて定量化した。
図２Ａは、ダウノルビシン及びシタラビンが前記記載したリポソームによって送達されたときにＢＤＦ−１マウスへの静脈投与後の各種時点におけるダウノルビシン及びシタラビンの血漿消失曲線を示す。静脈注射１時間後、ダウノルビシン血漿濃度は１６７ｎｍｏｌ／ｍｌとなり、８７２ｎｍｏｌシタラビン／ｍｌの血漿濃度が観察された。注射４時間後、ダウノルビシン血漿濃度は１４３ｎｍｏｌ／ｍｌとなり、シタラビン濃度は７８１ｎｍｏｌ／ｍｌとなった。
図２Ｂは、ダウノルビシン及びシタラビンが前記記載したリポソームに同時送達されたときにＢＤＦ−１マウスへの静脈投与後の長期間にわたって相乗的な範囲でダウノルビシン及びシタラビンの血漿レベルが有効に維持されることを示す。データポイントは、特定の時点で血漿について測定したダウノルビシン：シタラビンのモル比（＋／− 標準偏差）を表す。それゆえ、リポソーム等の適当にデザインした送達媒体により、望ましい比のダウノルビシン及びシタラビンが、インビボで送達されるうる。
［実施例４］相乗的な比でリポソーム中に同時に処方されたダウノルビシン及びシタラビンが示す優れた抗腫瘍効率（有効性）
薬剤組み合わせの治療活性を最大にするため及びインビトロで認められる相乗的な利益を得るため、薬剤組み合わせは、最適な薬剤対薬剤比で腫瘍部位に送達される必要がある。組織培養において相乗的であるとわかった固定した比で、二つの薬剤を含む単一のリポソーム製剤を、実施例３において示したのと同様にインビボでの薬剤放出を連係して行うことができるように、開発した。この製剤の抗腫瘍活性を、その後Ｐ３８８及びＬ１２１０マウスリンパ性白血病モデルで評価した。
約１：５の相乗的なモル比でダウノルビシン及びシタラビンと共カプセル化されたＤＳＰＣ／ＤＳＰＧ／Ｃｈｏｌ（７：２：１ モル比）リポソームを、実施例３において記載したのと同様に調製した。
マウスの腫瘍研究を行うため、動物には、１×１０６のＰ３８８又はＬ１２１０腫瘍細胞を腹腔内（ｉｐ）接種し、その後この腫瘍細胞を、治療開始前に２４時間増殖させておいた。マウスは、生理食塩水、リポソームダウノルビシン、リポソームシタラビン、遊離型薬剤カクテル及び結果として約１：５の最終ダウノルビシン：シタラビンモル比となるようＤＳＰＣ：ＤＳＰＧ：Ｃｈｏｌ（７：２：１、ｍｏｌ；ｍｏｌ）リポソームに共負荷したダウノルビシン：シタラビンを含むコントロール並びに治療群からなる適当な治療群に分けた。マウスについては、腫瘍細胞接種後１、４及び７日に個々のマウスの体重に基づき前記処方した一回分がこの動物に投与されるように、必要とする体積のサンプルを静脈注入した。動物の体重を測定し、更に動物の生存についてモニターした。体重測定の時に実生活内での観察（in-life observations）を行う。図３は、これらの実験の結果を図示する。
図３Ａが示すように、約１：５モル比で共負荷したダウノルビシン：シタラビンを含むリポソーム製剤の抗腫瘍活性が、リポソーム中に個々に処方された各単一の薬剤並びに最大耐容量（maximum tolerated dose）（ＭＴＤ）で投与した遊離型薬剤カクテルと比較して著しく増大することが観察された。バッファコントロール群では、５０％生存期間（median survival time）は８日であった。５ｍｇ／ｋｇの投与量のリポソームダウノルビシンを用いて治療した動物では、１００％の生存期間の増大に相当する、１６日の５０％生存期間が示された。１２．５ｍｇ／ｋｇの投与量のリポソームシタラビンを用いて治療したマウスでは、１７５％の生存期間の増大に相当する、２２日の５０％生存期間が示され、そしてＤＳＰＣ：ＤＳＰＧ：Ｃｈｏｌ（７：２：１ ｍｏｌ：ｍｏｌ）リポソーム内部に約１：５モルの薬剤比で共負荷したダウノルビシン及びシタラビンを用いて治療した動物では、＞６０日の５０％生存期間及び９／１０の長期間生存に加え＞６５０％の寿命の増大が示された。比較して、ＭＴＤ（両方の遊離型薬剤の最大投与量（maximizing dose）に基づく）のダウノルビシン：シタラビンを遊離型薬剤カクテルとして用いて治療したマウスでは、２７日の５０％生存期間及び２３７％に相当する寿命の増大によって反映されるように、抗腫瘍治療にも応答しなかった。
同様に、図３Ｂに示されるように、対応する遊離型薬剤カクテル又はリポソーム中に個々に負荷した各薬剤と比較すると、約１：５のモル比で共負荷したダウノルビシン及びシタラビンを含むリポソーム製剤については、優れた抗腫瘍活性が得られた。バッファコントロール群では、５０％生存期間は７日であった。リポソームカプセル化ダウノルビシン又はリポソームカプセル化シタラビンを用いて治療したマウスでは、５０％生存期間は、それぞれ、２０日及び４３．５日であった。比較して、ＤＳＰＣ：ＤＳＰＧ：Ｃｈｏｌ（７：２：１ ｍｏｌ比）リポソーム中に約１：５のモル比で共負荷したダウノルビシン及びシタラビンを用いて治療した動物では、６０日を超える５０％生存期間が示された。
これらの結果から、固定した相乗作用を示すダウノルビシン：シタラビン比は、適当に設計されたリポソームの内部にダウノルビシン：シタラビンを封入することによって抗腫瘍活性を著しく改善することができるということが示される。
上記実施例は、詳細な説明のためにのみ含まれるものであり、本発明の範囲を限定することを意図したものではない。前記実施例に対する多くの変形が可能である。前記実施例の改良及び変形は当業者に自明であろうから、本発明が添付した請求の範囲によってのみ制限されることを意図している。
上記公報又は文献の引用は、上述のもの全てが関連する先行技術であると認めるものではなく、これらの公報又は文献の内容及び日付に関して何ら承認を構成するものでもない。
図１Ａは、各種モル比：１０：１（四角形）、５：１（三角形）、１：１（中抜きの丸）、１：５（逆三角形）及び１：１０（塗りつぶした丸）のダウノルビシン：シタラビン（又はＡｒａ−Ｃ）の組み合わせによって影響されたＰ３８８マウスリンパ性白血病細胞の画分（ｆａ）の関数としてプロットされた組み合わせ指数（ＣＩ）を示すグラフである。 図１Ｂは、各種モル比：１０：１（四角形）、５：１（三角形）、１：１（中抜きの丸）、１：５（逆三角形）及び１：１０（塗りつぶした丸）のダウノルビシン：シタラビン（又はＡｒａ−Ｃ）の組み合わせによって影響されたＬ１２１０マウスリンパ性白血病細胞の画分（ｆａ）の関数としてプロットされた組み合わせ指数（ＣＩ）を示すグラフである。 図１Ｃは、Ｐ３８８マウスリンパ性白血病細胞におけるＣＩ対ダウノルビシン：シタラビン（１０：１、５：１、１：１、１：５、１：１０）各種モル比を示すグラフである。７５％（ＥＤ７５）及び９０％（ＥＤ９０）腫瘍細胞増殖阻害を引き起こすために十分な薬剤濃度でのＣＩ値が、異なるダウノルビシン：シタラビンモル比で比較されている。 図１Ｄは、Ｌ１２１０マウスリンパ性白血病細胞におけるＣＩ対ダウノルビシン：シタラビン（１０：１、５：１、１：１、１：５、１：１０）各種モル比を示すグラフである。７５％（ＥＤ７５）及び９０％（ＥＤ９０）腫瘍細胞増殖阻害を引き起こすために十分な薬剤濃度でのＣＩ値が、異なるダウノルビシン：シタラビンモル比で比較されている。 図２Ａは、ＤＳＰＣ：ＤＳＰＧ：ＣＨＯＬ（７：２：１ モル比）リポソームでＢＤＦ−１マウスに静脈投与した後の各種時点でのダウノルビシン：シタラビンの血漿（プラスマ）消失曲線（plasma elimination curve）を示すグラフである。 図２Ｂは、ダウノルビシン：シタラビン（約１：５モル比）２種負荷したＤＳＰＣ：ＤＳＰＧ：Ｃｈｏｌ（７：２：１ モル比）リポソームの静脈投与後の時間の関数として血漿中のダウノルビシン：シタラビンの比（ｍｏｌ：ｍｏｌ）のグラフである。データポイントは、特定の時点で血漿において測定したダウノルビシン：シタラビンのモル比（＋／− 標準偏差）を表す。 図３Ａは、マウスのＰ３８８リンパ性白血病モデルに対して静脈（i.v.）（Ｑ３ＤＸ３）を介して投与された個々のリポソームカプセル化剤及び遊離型薬剤カクテルと比較した、共負荷したリポソーム捕捉ダウノルビシン：シタラビン（約１：５ モル比）の有効性を示すグラフである。マウスは、生理食塩水（丸）、リポソームダウノルビシン（三角形）、リポソームシタラビン（四角形）、ダウノルビシン：シタラビンの遊離型カクテル（９：６００ｍｇ／ｋｇ）（逆三角形）及び約１：５の最終ダウノルビシン：シタラビンモル比を結果として与えるＤＳＰＣ：ＤＳＰＧ：Ｃｈｏｌ（７：２：１、ｍｏｌ：ｍｏｌ）リポソームで共負荷したダウノルビシン：シタラビン（菱形）を含むコントロール並びに治療群からなる適当な治療群に分けて構成した。 図３Ｂは、マウスのＬ１２１０リンパ性白血病モデルに対して静脈（i.v.）（Ｑ３ＤＸ３）を介して投与された個々のリポソームカプセル化剤及び遊離型カクテルと比較した共負荷したリポソーム捕捉ダウノルビシン：シタラビン（約１：５ モル比）の有効性を示すグラフである。マウスは、生理食塩水（丸）、リポソームダウノルビシン（三角形）、リポソームシタラビン（四角形）、ダウノルビシン：シタラビンの遊離型カクテル（１２：３０ｍｇ／ｋｇ）（中抜きの菱形）及び約１：５の最終ダウノルビシン：シタラビンモル比を結果として与えるＤＳＰＣ：ＤＳＰＧ：Ｃｈｏｌ（７：２：１、ｍｏｌ：ｍｏｌ）リポソームで共負荷したダウノルビシン：シタラビン（塗りつぶした菱形）を含むコントロール並びに治療群からなる適当な治療群に分けて構成した。
関連出願の説明
本出願は、２００４年４月２２日に出願した米国仮特許出願第６０／５６５，２１０号についての米国特許法第１１９条（ｅ）項に基づく利益を主張し、この仮特許出願は参照により本出願に組み込まれる。
本発明は、治療薬の組み合わせの送達について改善した組成物及び方法に関する。より詳しくは、本発明は、アントラサイクリン系薬剤及びシチジンアナログ並びにそれらの誘導体の組み合わせを与える送達系に関する。
癌、ＡＩＤＳ、感染症、免疫疾患及び循環器疾患等の生命を脅かす疾患の進行の多くは、複数の分子メカニズムによって影響される。この複雑さゆえに、単一の薬剤を用いて治療を行うことにはその成果において限界があった。したがって、多くの場合、薬剤の組み合わせ（併用）が疾患を撲滅するため、特に癌の治療において用いられている。投与される薬剤の数と急性リンパ性白血病及び転移性結腸直腸癌（metastatic colorectal cancer）等の癌の治癒率との間には強い相関性があると思われる（非特許文献１及び２参照）。
ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン及びそれらの誘導体等のアントラサイクリン系抗生物質は、公知の抗悪性腫瘍薬を含む。塩酸ダウノルビシン等のダウノルビシンベースの薬剤は、ＤＮＡにインカレートして、ＤＮＡ合成やＲＮＡ合成を含むＤＮＡの各種機能に影響を及ぼすため、これらの薬剤が主として用いられる。これらの薬剤は、急性リンパ性白血病、急性顆粒球性白血病（acute granulocytic leukemia）、急性骨髄球性白血病（acute myelocytic leukemia）、急性期の慢性骨髄球性白血病、及び急性非リンパ性白血病（acute nonlymphocytic leukemia）に対して活性を示す。ドキソルビシンは、急性白血病、悪性リンパ腫、及び乳癌腫（breast cancer tumors）等の任意の固形腫瘍（selected solid tumors）の治療において効果的であることが示されている。イダルビシンは、これらの代謝拮抗薬と同様の活性を示し、有害核型（adverse karyotype）、急性骨髄性白血病（acute myeloid leukemia）（ＡＭＬ）に対してシタラビンと共に用いられている。（非特許文献３）。
シタラビン、５−アザシチジン、及びゲムシタビンのような三つの例示を含むシチジンアナログは、公知の抗悪性腫瘍薬である。例えば、これらの化合物は、白血病及び癌細胞におけるＤＮＡ合成を阻害する点で有効性を示している。これらの特性によって、これらの化合物は急性骨髄球性白血病、急性リンパ芽球性白血病（acute lymphoblastic leukemia）及び骨髄異形性症候群、膵癌及び肺癌を効果的に治療することができる。
特許文献１では、異常細胞増殖と付随した疾患の治療のため、単独で又は遊離型薬剤カクテル（free drug cocktail）で、カプセル化されていないＤＮＡメチル化阻害剤（nonencapsulated DNA methylation inhibitor）及びカプセル化されていない抗悪性腫瘍薬（nonencapsulated anti-neoplastic agent）を投与することが論じられている。しかしながら、この公報には、送達を制御することを意図した医薬製剤又は薬剤の半減期は示唆されていなかった。
同様に、特許文献２では、リポソームカプセル化悪性腫瘍薬（liposome encapsulated neoplastic agents）の製造が論じられている。単一及び複数の抗悪性腫瘍薬が同時に又は経時されるものとして検討されているが、シチジンアナログと組み合わせたアントラサイクリン系抗生物質は示唆されていなかった。
米国第２００４／００５２８６４号 米国特許第５，７３６，１５５号公報 Frei, et al., Clin.Cancer Res. (1998) 4:2027-2037 Fisher, M.D.; Clin.Colorectal Cancer (2001) ８月; 1(2):85-6 Giles,F.J.,et al., J.Clin.Oncol (2003) 21(9):1722-7
薬剤カクテルの治療的使用を制限するさまざまな不利益がある。例えば、遊離型薬剤カクテルの投与では、多くの場合、腫瘍部位に達する前に薬剤の一つ又は全てが急速に排除される。この理由のために、多くの薬剤は、ともすれば血流からの送達媒体の排除をもたらすようなメカニズムから送達媒体を「遮蔽する（shield）」ことを意図した送達媒体中に組み込まれている。リポソームがこの「遮蔽（shielding）」効果を付与する能力を有し、それゆえ治療薬の半減期を延長することができることはよく知られている。しかしながら、送達媒体の脂質成分は多くの場合、個々の薬剤の薬物動態に差次的に影響を及ぼすため、送達媒体中への特定の薬剤又は１を超える薬剤の処方は困難であることが証明されている。したがって、ある薬剤の保持及び放出にとって適当である組成（成分）が第二の薬剤の保持及び放出にとっては適当でない可能性がある。
本発明の研究者等は、優れた薬剤保持及び各薬剤の持続的な放出をもたらす、アントラサイクリンとシチジンアナログ（ダウノルビシン及びシタラビンベースの誘導体を含む）との組み合わせを収容するために必要とされる特定の送達媒体製剤を同定した。本発明の研究者等は、更に、これらの薬剤の相乗的な比（割合）が、リポソームでカプセル化された（リポソームに内封された）場合には、ある時間にわたって血液区画（blood compartment）に保持され、その結果、遊離型薬剤カクテル及び個々のリポソーム剤と比較して効力が増大することを示した。
本発明は、少なくとも１つのアントラサイクリン系薬剤及び１つのシチジンアナログベースの薬剤と安定的に会合するリポソーム送達媒体を用いて効果的な量のアントラサイクリン及びシチジンアナログ（例えば、シタラビン、５−アザシチジン又はゲムシタビンとダウノルビシン、ドキソルビシン又はイダルビシン）薬剤の組み合わせを投与するための組成物及び方法に関する。これらの組成物によれば、２以上の薬剤を、連係して働く状態で疾患部位に送達することが可能となり、それによって、薬剤は、望ましい比で疾患部位に確実に存在するであろう。このような結果は、薬剤が、脂質ベースの送達媒体で共カプセル化されようと望ましい比が疾患部位で維持されるよう投与される別個の脂質ベースの送達媒体でカプセル化されようと達成されるであろう。前記組成物の薬物動態（pharmacokinetics）（ＰＫ）は、連係して働く送達が達成されるよう（前記送達系のＰＫが比較できるという前提で）脂質ベースの送達媒体自体により制御される。
したがって、一つの視点において、本発明は、治療上効果的な比、特に非拮抗的な比でリポソームと会合した少なくとも１つのアントラサイクリン系薬剤及び１つのシチジンアナログベースの薬剤を含む非経口投与用リポソーム組成物を提供する。薬剤の治療上効果的かつ非拮抗的な比は、ある濃度範囲にわたって、関連する細胞培養系、又は無細胞系、及び個々の患者の生検（バイオプシー）からの腫瘍ホモジネートに対する薬剤の生物活性又は効果を測定することによって決定される。ダウノルビシン、ドキソルビシン又はそれらの誘導体とその他のシチジンアナログの組み合わせの中で、よくある組み合わせは、シタラビンとダウノルビシンである。同様に、シタラビン（又は別のシチジンアナログ）及び他の公知のアントラサイクリンの中でダウノルビシン、ドキソルビシン又はイダルビシンを含むアントラサイクリンを含む組み合わせもしばしば提供される。望ましい治療効果を維持する薬剤の比の決定をするいかなる方法を用いてもよい。
前記組成物は、培養中の関連細胞、無細胞系又は腫瘍ホモジネートに望ましい生物学的効果を示すアントラサイクリンとシチジン薬剤とのモル比で少なくとも１つのアントラサイクリン及び１つのシチジン薬剤を含む。好ましくは、前記比は、前記薬剤が非拮抗的となるものである。出願人は、望ましい生物学的効果をテストするのに適している少なくとも１つの細胞培養又は細胞株を「関連ないし適切な（relevant）」細胞と呼ぶ。これらの薬剤は、抗悪性腫瘍薬として使用されるので、「関連」細胞は、それらの抗癌剤発見プログラムで有用である米国国立癌研究所（National Cancer Institute）（ＮＣＩ）／米国国立衛生研究所（National Institutes of Health）（ＮＩＨ）の開発途上治療プログラム（Developmental Therapeutics Program）（ＤＴＰ）によって同定された細胞株の細胞である。現在、ＤＴＰ選別では、６０の種々のヒト腫瘍細胞株が利用されている。そのような細胞株の少なくとも１つについて望ましい活性が示される必要があるであろう。出願人は、患者のバイオプシー又は腫瘍のホモジナイゼーションから生じた細胞を「腫瘍ホモジネート（tumor homogenate）」と呼ぶ。全腫瘍又は腫瘍バイオプシーの抽出については、資格のある医師による標準的な医学技術を通じて行うことができ、組織の単細胞へのホモジナイゼーションについては、技術としてよく知られている多数の方法を用いて実験室で行うことができる。
別の視点において、本発明は、本発明の組成物を投与することによって望ましい標的に対して治療上効果的な量のアントラサイクリン：シチジンアナログ（例えば、ダウノルビシン：シタラビン）組み合わせを送達する方法に関する。
本発明は、第一の送達媒体と安定的に会合したアントラサイクリンと第二の送達媒体と安定的に会合したシチジンアナログとを投与することによって治療上効果的な量のアントラサイクリン：シチジンアナログ（例えば、ダウノルビシン：シタラビン）組み合わせを送達する方法にも関する。第一及び第二の送達媒体は別々の容器に含まれてもよく、それらの容器の内容物は患者に対し同時に又は経時的に投与されてもよい。一つの形態において、前記アントラサイクリン及びシチジンアナログの比（割合）は、非拮抗的である。
本発明の他の形態では、送達媒体を含む組成物を製造する方法であって、前記送達媒体は、非拮抗的なモル比でそれと安定的に会合して少なくとも１つのアントラサイクリン及び１つのシチジンアナログを有するリポソーム及び／又は脂質含有粒子状媒体を含み、前記方法は、
（ａ）生物活性に対する関連細胞培養法、無細胞法又は腫瘍ホモジネート法で、薬剤の前記比が細胞のうち１％を超える細胞に影響を与える前記モル比で維持される濃度範囲の少なくとも５％にわたって非拮抗的である前記アントラサイクリン系薬剤及びシチジンアナログのモル比を決定すること、並びに
（ｂ）前記工程（ａ）で非拮抗的であると決定したモル比のアントラサイクリン系薬剤対シチジンアナログを前記送達媒体を用いてカプセル化すること
を含む方法が提供される。
別の視点において、本発明は、望ましい治療効果を与える、ある比の少なくとも１つのアントラサイクリン及び１つのシチジンアナログを含むリポソームを含む治療組成物を製造する方法に関する。この方法は、少なくとも１つアントラサイクリン及び１つのシチジンアナログのパネル（panel）であって、少なくとも１つ、好ましくは多数の比の前記薬剤を含むパネルを与えること、パネルのメンバーが濃度の範囲にわたって関連細胞培養、無細胞系又は腫瘍ホモジネートに生物学的効果を発揮する能力をテストすること、前記比により濃度の適当な範囲にわたって前記細胞培養、無細胞系又は腫瘍ホモジネートに望ましい治療効果が与えられるパネルのメンバーを選択すること；並びに前記パネルの好結果を示すメンバーによって表される前記比の薬剤を脂質ベースの薬剤送達媒体に安定的に会合させることを含む。好ましい形態において、前記望ましい治療効果は、非拮抗的である。
更に以下に記載されるように、好ましい形態において、前記方法に従って適当な組み合わせをデザインする場合には、非拮抗的な比は、組み合わせ指数（combination index）（ＣＩ）が≦１．１である比として、選択される。更なる形態において、適当なリポソーム製剤は、効果的な量のアントラサイクリン及び：シチジンアナログ組み合わせ（例えば、ダウノルビシン：シタラビン）を安定的に取り込み、かつインビボで両方の薬剤の放出が維持されることが可能となるようにデザインされる。好ましくは、製剤は、ホスファチジルグリセロール等、少なくとも１つの負荷電脂質を含む。
発明を実施するための形態
定義がない限り、本願において使用される全ての技術用語、記号及び他の学術用語又は専門用語は、本発明の属する技術において通常の知識を有する者（当業者）によって一般に理解されているものと同一の意味である。いくつかの場合では、一般に理解されている意味をもつ用語が、明確及び／又は迅速な参照のため、本願において定義されるが、本願におけるそのような定義の挿入を、その技術において一般に理解されていることに対する実質的な相違を表すものと解釈することは、必ずしも当然とは限らない。本願において記載され又は参照される多くの技術及び処置は、当業者により十分理解され、従来の手法を用いて一般に利用される。適宜、市販のキット及び試薬の使用を含む処置が、他に断らない限り製造業者規定のプロトコル及び／又はパラメータに従って一般に行われる。本願において参照した全ての特許、出願、公開された出願及びその他の刊行物は、そっくりそのまま参照により組み込まれる。仮にこのセクションにおいて示した定義が、参照により本願に組み込まれる特許、出願、公開された出願及びその他の刊行物において示されている定義と逆であるか、そうでなくても互いに一致しない場合には、このセクションにおいて示した定義が、参照により本願に組み込まれる定義よりも優先される。
脚注：略語
ＤＳＰＣ：ジステアロイルホスファチジルコリン（distearoylphosphatidylcholine）；
ＰＧ：ホスファチジルグリセロール（phosphatidylglycerol）；
ＤＳＰＧ：ジステアロイルホスファチジルグリセロール（distearoylphosphatidylglycerol）；
ＰＩ：ホスファチジルイノシトール（phosphatidylinositol）；
ＳＭ：スフィンゴミエリン（sphingomyelin）；
Ｃｈｏｌ又はＣＨ：コレステロール（cholesterol）；
ＣＨＥ：コレステリルヘキサデシルエーテル（cholesteryl hexadecyl ether）；
ＳＵＶ：小型単層小胞体（small unilamellar vesicle）；
ＬＵＶ：大型単層小胞体（large unilamellar vesicle）；
ＭＬＶ：多層膜小胞体（multilamellar vesicle）；
ＭＴＴ：３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニル−２Ｈ テトラゾリウムブロマイド（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-2H tetrazolium bromide）；
ＥＤＴＡ：エチレンジアミン四酢酸（ethylenediaminetetraacetic acid）；
ＨＥＰＥＳ：Ｎ−［ヒドロキシエチル］−ピペラジン−Ｎ−［２−エタンスルホン酸］（N-[hydroxylethyl]-pyperazine-N-[2-ethanesulfonic acid]）；
ＨＢＳ：ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水（HEPES buffered saline）（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）；
ＳＨＥ：３００ｍＭ スクロース（sucrose）、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、３０ｍＭ ＥＤＴＡ；
ＴＥＡ：トリエタノールアミン（triethanolamine）；
ＣＩ：組み合わせ指数（combination index）；
ｆａ：影響された画分（fraction affected）。
本発明は、少なくとも１つのアントラサイクリン系抗生物質（例えば、ダウノルビシン）及び１つのシチジンアナログ剤（例えば、シタラビン）と安定的に会合したリポソームを含む組成物であって、前記アントラサイクリン系抗生物質及び前記シチジンアナログ剤は、関連細胞又は腫瘍ホモジネートに対して望ましい細胞毒性効果、細胞増殖抑制効果又は生物学的効果を発揮するアントラサイクリン系抗生物質：シチジンアナログ剤（例えば、ダウノルビシン：シタラビン）モル比で存在する組成物を提供する。
好ましくは、本願において提供されるリポソーム組成物は、少なくとも１つのアントラサイクリン及び１つのシチジンアナログと安定的に会合したリポソームを、関連細胞又は腫瘍ホモジネートに対して非拮抗的な効果を発揮する前記アントラサイクリン：シチジンアナログのモル比で含むであろう。
本発明の更なる形態において、前記記載した脂質ベースの送達媒体は、第三又は第四の薬剤を含む。何れの治療薬、診断薬又は化粧用薬を含んでもよい。
本発明の一つの視点において、ホスファチジルコリン、好ましくはジステアロイルホスファチジルコリンを含むリポソームが提供される。本発明の別の視点において、ステロールを含むリポソームが提供される。好ましくは、前記ステロールは、コレステロールである。
本発明の脂質ベースの送達媒体を、非経口投与だけでなく局所送達、経鼻送達、皮下送達、腹腔内送達、筋肉内送達、噴霧送達又は経口送達で、或いは治療目的若しくは医用画像（medical imaging）等のために標的部位に又はその近傍に、天然又は合成の移植可能な手段へ又はその中へ送達媒体を適用することによって使用してもよい。本発明の脂質ベースの送達媒体は、好ましくは非経口投与で、最も好ましくは静脈投与で使用される。
本願において記載した好ましい形態は、網羅されること又は本発明の範囲を開示された詳細な形態に限定することを意図したものではない。それらの記載は、本発明の原理並びにその応用及び実際の使用を、当業者がその技術を完全に理解できるように、最良に説明するために選択、かつ記載されたものである。
シチジンアナログ
代謝拮抗物質又は、より詳しくは、シタラビン、５−アザシチジン、及びゲムシタビン（２’，２’−ジフルオロデオキシシチジン（2',2'-Difluorodeoxycytidine））等のシチジンアナログは、公知の抗悪性腫瘍薬である。シチジンアナログは、その技術においてシトシンヌクレオシドアナログ（cytosine nucleoside analogs）と呼ばれることもある。代謝拮抗物質は、細胞における正常な生化学反応に関与する天然の化学物質（natural chemical）とよく似ているが、細胞の正常な分裂及び機能を妨げるほど異なる化合物である。これらの化合物は、一般に正常な代謝プロセスを阻害する。
シタラビンは、ピリミジンヌクレオシド代謝拮抗物質である。この化合物は、糖の３’−ヒドロキシルに対してトランスの位置に２’−ヒドロキシルをもつ２’−デオキシシチジンのアナログである。シタラビンは、４−アミノ−１−β−ｄ−アラビノフラノシル−２（１Ｈ）−ピリミジノン（4-Amino-1-β-d-arabinofuranosyl-2(1H)-pyrimidinone）、１−β−ｄ−アラビノフラノシルシトシン（1-β-d-arabinofuranosylcytosine）、Ａｒａ−Ｃ、β−シトシンアラビノシド（β-cytosine arabinoside）、アラシチジン（aracytidine）、ＣＨＸ−３３１１、Ｕ−１９９２０、Ａｌｅｘａｎ、Ａｒａｂｉｔｉｎ、Ａｒａｃｙｔｉｎｅ、Ｃｙｔａｒｂｅｌ、Ｃｙｔｏｓａｒ、Ｅｒｐａｌｆａ、Ｉｒｅｔａｎ及びＵｄｉｃｉｌと同等と考えられる。シタラビン等のシチジンアナログにおいて、糖成分は、リボースではなくアラビノースを含む。シタラビンは、急性骨髄球性白血病（acute myelocytic leukemia）（ＡＭＬ）の治療において有用であると認められ、この疾患の寛解において有効であることが分かっている。しかしながら、シタラビンの作用メカニズムは未確認であるが、それにもかかわらずこのヌクレオチドのＤＮＡへの取り込みによって、ストランド合成の終結による重合の阻害が引き起こされる。
シタラビンは、ストランド合成を終結させるため、５−モノリン酸 ヌクレオチド（5-monophosphate nucleotide）（ＡｒａＣＭＰ）の転換を介して「活性化（activated）」されなければならない。ＡｒａＣＭＰは、その後選択されたヌクレオチドキナーゼと反応して二リン酸（diphosphate）及び三リン酸ヌクレオチド（triphosphate）（ＡｒａＣＤＰ及びＡｒａＣＴＰ））を形成することが可能である。ＤＮＡへのシタラビン取り込みは、Ｓ期特異性であり、それゆえ、ＤＮＡ合成の阻害をもたらすように少なくとも１つの完全細胞周期にわたる投薬が、提唱されている。ＤＮＡ合成の阻害は低いＡｒａＣＴＰ濃度で発生し、ＤＮＡ鎖伸長はＡｒａＣの成長ＤＮＡ鎖の末端部分への取り込みによって阻害される。更に、鎖中に取り込まれるＡｒａＣの量とＤＮＡ合成の阻害との間には相関性があると思われる。
患者においては、シタラビンに対する耐性が生じうる。そのような耐性は、一般にＡｒａＣＭＰを生成するデオキシシチジンキナーゼの欠乏による。更に、シチジンデアミナーゼ（ＡｒａＣを脱アミノ化して無毒性のアラウリジン（arauridine）にするもの）及びｄＣＭＰ（ＡｒａＣＭＰを不活性ＡｒａＵＭＰに転換するもの）等の分解酵素も有効性に影響を及ぼす。
シタラビンの欠点は、その毒性である。この化合物は、著しい巨赤芽球性の変化を伴う重篤な白血球減少症、血小板減少症及び貧血症を引き起こす能力がある強力な骨髄抑制剤（myleosuppressive agent）である。より高い用量で投与されるときには、胃腸障害、発熱、結膜炎、肺臓炎、肝機能不全、皮膚炎、及び神経毒性の副作用も一般に確認されている。
５−アザシチジン（アザシチジン（Azacytidine）；５−ＡｚａＣ）は、抗悪性腫瘍活性を示す化合物である。この化合物は、ＡＭＬ、急性リンパ性白血病及び骨髄異形性症候群（myelodysplastic syndrome）の治療にとって有用であるとして知られている。現在の研究では、この化合物のβサラセミア（beta thalassemia）、急性骨髄性白血病、骨髄異形性症候群、進行型又は転移性固形腫瘍、非ホジキンリンパ腫（non-Hodgkin's lymphoma）、多発性骨髄腫（multiple myeloma）、非小細胞型肺癌（non-small cell lung cancer）及び前立腺癌における効果が評価されている。５−ＡｚａＣは、遺伝子の発現に次々に影響を及ぼすＤＮＡメチル化を阻害することが示されている。他の作用の中で、副作用として、白血球及び赤血球並びに血小板数の減少、悪心、嘔吐、疲労、下痢が挙げられる。
ゲムシタビンは、抗腫瘍活性を示すヌクレオシドアナログである。ゲムシタビン ＨＣｌは、２’−デオキシ−２’，２’−ジフルオロシチジン モノ塩酸塩（2'-deoxy-2',2'-difluorocytidine monohydrochloride）（β−異性体）からなり、膵癌及び肺癌を治療することにおいて効果的であるとして知られている。一般的には、ゲムシタビンは、核酸の合成を妨げることによって、ＤＮＡ及びＲＮＡの産生を防止する。この作用は、癌細胞の増殖を停止させて、その細胞を死に至らしめる。他の作用の中で、副作用として、白血球及び赤血球並びに血小板数の減少、悪心、嘔吐、疲労、下痢、インフルエンザ様症状、発疹が挙げられる。
アントラサイクリン系抗生物質
ダウノルビシン及びドキソルビシン並びにそれらの誘導体等のアントラサイクリン系抗生物質は、真菌ストレプトミセス・ペウセティウス（Streptomyces peucetius）によって産生される公知の抗悪性腫瘍薬を含む。イダルビシン（４−デメトキシダウノルビシン（4-demethoxydaunorubicin））は、アグリコン環のＣ４にメトキシ基をもたないダウノルビシンの合成誘導体を含む。これらの化合物は、ＤＮＡにインターカレートして、ＤＮＡ及びＲＮＡ合成を含むＤＮＡの各種機能に影響を及ぼす。ＤＮＡとの相互作用により、一般に一本鎖及び／又は二本鎖切断並びに姉妹染色分体交換が生ずる。ダウノルビシン（塩酸ダウノルビシン）の一つの特定の医薬品形態が、核酸合成を妨げない投与量で細胞分裂を防ぐことが示されている。ＤＮＡが切断されるメカニズムは十分に理解されていないが、トポイソメラーゼＩＩの作用によって又はフリーラジカルの生成によって媒介されると信じられている。更に、アントラサイクリンは、細胞膜と相互に作用し、それらの機能を変化させて抗腫瘍作用心毒性における役割を果たす可能性があるることも知られている。
ダウノルビシン（ダウノマイシン、ルビドマイシン（rubidomycin）、ｌｅｕｋａｅｍｏｍｙｃｉｎ Ｃ、ＲＰ−１３０５７、ＣＥＲＵＢＩＤＩＮＥ（登録商標））は、急性リンパ性白血病、急性顆粒球性白血病、急性骨髄球性白血病、急性期の慢性骨髄球性白血病、及び急性非リンパ性白血病の治療において有用であるとして知られている。更に、この化合物には、固形腫瘍において及びリンパ腫に対して何らかの活性があることが示されている。ダウノルビシンは、四環系のアグリコン−ダウノマイシノンによって形成されるグリコシドであり、アミノ糖−ダウノサミン（daunosamine）である。ダウノルビシンの経口吸収は低く、静脈投与されることが最も多い。ダウノルビシンの半減期は４５分であり、１９時間で消失する。ダウノルビシンは、より小さい活性型、ダウノルビシノールへの転換を経由して消失する。ダウノルビシン及びその誘導体は、骨髄機能低下（bone marrow depression）、口内炎、脱毛症、胃腸障害（gastrointestinal disturbances）、心律動異常（cardiac dysrhythmias）、肺水腫等の一定の毒性を有する。これらの組成物の最も広く認識されている欠点は、直ちに重篤な状態にする急性又は慢性型の心筋症の可能性である。特に、心毒性が、それ自体、治療を行っている患者の１５〜４０％においてうっ血性心不全として発現する。一般に、そのような副作用は利用される投与量によるが、その発現はより高い投与量で増加する。しかしながら、デクスラゾキサン（dexrazoxane）（ＡＤＲ−５２９）又はアミフォスチン（amifostine）（ＷＲ−２７２１又はＷＰ−１０６５）の併用投与はこれらの組成物によって生ずる心臓損傷を減少させるであろうということが認識されている。更に、アントラサイクリン療法の間の心臓損傷をジピリドキシル（dipyridoxyl）及びアミノポリカルボキシル酸（aminopolycarboxylic acid）ベースのキレート薬、及びそれらの金属キレート等の鉄キレート剤の同時投与により減少させることができることを示唆する証拠がある。米国特許第６，１４７，０９４号を参照されたい。
ドキソルビシン（アドリアマイシン、ルブレックス（rubrex）、１２−ナフタセンジオン（12-naphthacenedione）、１４−ヒドロキシダウノマイシン（14-hydroxydaunomycin）、ＮＳＣ−１２３１２７）は、８位に、ダウノルビシンにおけるアセチル基の代わりにヒドロキシアセチル基を有することにおいてのみダウノルビシンと相違する。ドキソルビシンが、急性白血病、悪性リンパ腫及び乳癌腫等の任意の固形腫瘍の治療において有効であることが示されている。この組成物は、ホジキン病及び非ホジキンリンパ腫の治療において、シクロホスファミド、ビンクリスチン及びプロカルバジンと共に利用されている。肉腫、プラズマ細胞骨髄腫、転移性甲状腺癌（metastatic thyroid carcinoma）、胃癌（gastric carcinoma）、気管支原性癌（broncheogenic carcinoma）、移行上皮癌、並びに卵巣、子宮内膜、甲状腺、精巣及び頚部の癌に対する更なる治療的利用が、示されている。ドキソルビシンの毒性は上述したダウノルビシンと同様である。エピルビシン（４’−エピドキソルビシン（4'-epidoxorubicin））、モルフォリノ誘導体（morpholino derivatives）及び同類のアントラセンジオンミトキサントロン（anthracenedione mitoxantrone）等のドキソルビシンのアナログでは、臨床活性が高く、心毒性（cardiac toxicity）が少ないことが知られている。
インビトロでの非拮抗的なダウノルビシン：シタラビン比の決定
本発明の更なる視点において、アントラサイクリン系薬剤及びシチジンアナログは、相乗的又は相加的（即ち、非拮抗的）な比（割合）でリポソームでカプセル化されるであろう。相乗的又は相加的な併用（組み合わせ）効果を示す薬剤の比の決定は、以下に記載した実験データのタイプに基づき、各種アルゴリズムを用いて行われる。これらの方法には、アイソボログラム法（Loewe, et al., Arzneim-Forsch (1953) 3: 258-290；Steel, et al., Int. J. Radiol. Oncol. Biol. Phys. (1979) 5: 27-55）、分画産物法（fractional product method）（ウェブ、酵素及び代謝阻害剤（Enzyme and Metabolic Inhibitors）（１９６３）第１巻、ｐｐ．１−５、ニューヨーク：アカデミック出版（Academic Press））、モンテカルロシミュレーション法、ＣｏｍｂｉＴｏｏｌ、ＣｏｍｂｏＳｔａｔ及びChou, J. Theor. Biol. (1976) 39: 253-276；及びChou, Mol. Pharmacol. (1974) 10:235-247に記載された方程式に基づくＣｈｏｕ−Ｔａｌａｌａｙ Ｍｅｄｉａｎ Ｅｆｆｅｃｔ法（Chou-Talalay median-effect method）が含まれる。代替法には、生存画分（surviving fraction）（Zoli, et al., Int. J. Cancer (1999) 80: 413-416）、コントロールと比較した顆粒球／マクロファージ−コロニー形成単位に対する応答率（Pannacciulli, et al., Anticancer Res. (1999) 19: 409-412）、及びその他のもの（Berenbaum, Pharmacol. Rev. (1989) 41: 93-141；Greco, et al., Pharmacol. Rev. (1995) 47: 331-385）が含まれる。
Ｃｈｏｕ−Ｔａｌａｌａｙ Ｍｅｄｉａｎ Ｅｆｆｅｃｔ法が好ましい。分析は、特定の効果、ｆａをもたらす投与量が以下の式により与えられる方程式を利用する：
Ｄ＝Ｄｍ[ｆａ／(１−ｆａ)]１／ｍ
ここで、Ｄは使用した薬剤の投与量であり、ｆａはその投与量によって影響された細胞の画分であり、Ｄｍは効力を示す５０％有効量（dose for median effect）であり、ｍは投与量−効果曲線の形を表す係数である（ｍは一次反応について１である）。
この方程式を更に処理して、Chou及びTalalay, Adv. Enzyme Reg. (1984) 22: 27-55；並びにChouら、化学療法における相乗作用及び拮抗作用（Synergism and Antagonism in Chemotherapy）、Chou及びRideout編、アカデミック出版：ニューヨーク １９９１：２２３−２４４に記載されている多剤効果方程式（multiple drug effect equation）に基づいて組み合わせ指数（combination index）（ＣＩ）を計算することができる。この計算のためのコンピュータプログラム（ＣａｌｃｕＳｙｎ）がＣｈｏｕ及びＣｈｏｕ（「マイクロコンピュータを用いた投与量−効果分析：ＥＤ５０、ＬＤ５０、相乗作用、拮抗作用、低用量リスク、レセプター リガンド結合性及び酵素反応速度論の定量化（Dose-effect analysis with microcomputers: ED50, LD50, synergism, antagonism, low-dose risk, receptor ligand binding and enzyme kinetics）」：ＣａｌｃｕＳｙｎマニュアル及びソフトウェア；ケンブリッジ：バイオソフト（Biosoft） １９８７）に見られる。
組み合わせ指数方程式は、酵素反応速度モデル（enzyme kinetic models）から誘導されたＣｈｏｕ−Ｔａｌａｌａｙの多剤−効果方程式に基づく。方程式により、相乗作用及び拮抗作用ではなく相加作用のみが求められる。しかしながら、ＣａｌｃｕＳｙｎプログラムによれば、相乗作用は期待された相加作用を超えるものと定義され、拮抗作用は相加作用を下回るものと定義される。以前にＣｈｏｕとＴａｌａｌａｙは、ＣＩ＝１を相加作用としたが、それに従って、二つの薬剤の多剤効果方程式から、作用につき同一又は類似の形態を有する相互排他的な薬剤について下記式が得られる：
ＣＩ＝(Ｄ)１／(Ｄｘ)１＋(Ｄ)２／(Ｄｘ)２ ［式１］
更に、作用につき全く無関係の形態を有する相互非排他的な薬剤について下記式が提案される：
ＣＩ＝(Ｄ)１／(Ｄｘ)１＋(Ｄ)２／(Ｄｘ)２＋((Ｄ)１(Ｄ)２)／(Ｄｘ)１(Ｄｘ)２ ［式２］
ＣＩ＜１、＝１、及び＞１は、それぞれ相乗作用、相加作用、及び拮抗作用を示す。式１又は式２では、組み合わせにおける（分子の）薬剤１、(Ｄ)１、及び薬剤２、(Ｄ)２、が実際の実験においてｘ％を阻害すると規定される。したがって、実験的に観察されるｘ％阻害は丸めた数でなくてもよく、最も多くは少数を有する。式１及び２の（分母の）(Ｄｘ)１及び(Ｄｘ)２は、それぞれｘ％を阻害する薬剤１及び薬剤２単独の投与量である。
簡単にするため、二を超える薬剤が組み合わせに含まれるとき、多くの場合、相互排他性と仮定する（ＣａｌｃｕＳｙｎマニュアル及びアオフトウェア；ケンブリッジ：バイオソフト １９８７）。
更に二つの薬剤組み合わせを単一の製薬単位として用いて第三の薬剤との相乗的な又は相加的な相互作用を測定してもよい。更に、三つの薬剤組み合わせを一つの単位として用いて第四の薬剤との非拮抗的な相互作用を測定する等してもよい。
基礎をなす実験データは、培養細胞又は無細胞系を用いてインビトロで一般に測定される。好ましくは、組み合わせ指数（ＣＩ）は、前記説明したように、濃度範囲の代理パラメータである図１Ａ及び１Ｂに示されるような影響された細胞の画分（ｆａ）の関数としてプロットされる。好ましい薬剤の組み合わせは、ｆａ値のかなりの範囲にわたって相乗作用及び相加作用を示すものである。薬剤の組み合わせは、細胞のうち１％を超える細胞に影響を与える、即ちｆａ範囲が０．０１を超える濃度範囲のうち少なくとも５％にわたって非拮抗的であれば、選択される。好ましくは、全体の濃度のうちより高い部分において、好適なＣＩが示される；例えば、０．２〜１．０のｆａ範囲で５％である。より好ましくは、この範囲で１０％が好適なＣＩを示す。組成物において、更に好ましくはこのｆａ範囲で２０％、更に好ましくは５０％以上、最も好ましくは０．２〜１．０のｆａ範囲で少なくとも７０％が利用される。ｆａ値のかなりの範囲にわたって相乗作用を示す組み合わせを種々の薬剤の比で再評価して、非拮抗的な相互作用の強度を高め、かつ相乗作用が認められるｆａの範囲を拡大させる最適な比を規定してもよい。
細胞が影響される濃度の全範囲にわたって相乗作用を有することが好ましいであろうが、多くの場合、実施例１において詳述したＭＴＴ法等の分光光度法を用いたときに０．２〜０．８のｆａ範囲において結果が非常に信頼できることが分かっている。したがって、本発明の組成物によって発揮される相乗作用は０．０１以上の広い範囲内に存在することが示されるが、０．２〜０．８のｆａ範囲において相乗作用が発揮されることが好ましい。しかしながら、例えば、生物発光（バイオルミネッセンス）又はクローン原性法（clonogenecity assays）等、その他感受性がより高い方法を用いて、０．８を超えるｆａ値で相乗作用を評価することができる
最適な組み合わせ比を単一の製薬単位として更に用いて第三の薬剤との相乗的な又は相加的な相互作用を測定してもよい。更に、三つの薬剤組み合わせを一つの単位として用いて第四の薬剤との非拮抗的な相互作用を測定する等してもよい。
前述したように、細胞培養のインビトロ研究は「関連」細胞について行われるであろう。細胞の選択は、薬剤の治療用途に依存するであろう。本発明の範囲に含まれる組成物の基礎を与えるために、ただ一つの関連細胞株又は細胞培養型が、要求された非拮抗作用を発揮しさえすればよい。
例えば、本発明の一つの好ましい形態において、薬剤の前記組成物は、抗癌療法用である。よくある形態において、薬剤の前記組成物は、白血病又はリンパ腫治療用である。その後、テストされるべき細胞及びテストの性質について適当な選択がなされるであろう。特に、腫瘍細胞株が適当な対象であり、細胞死又は細胞静止の測定が適当な指標である。更に以下に議論するように、他の徴候にとって適当である非拮抗的な組み合わせを見出すことを試みることに関しては、他の標的細胞及び細胞毒性又は細胞静止以外の判定基準を用いることができる。
抗腫瘍剤等の判定のため、細胞株を、正常細胞株の貯蔵所から（例えば、ＮＣＩ又はＡＴＣＣ）、学術機関又は民間財源のものを含むその他の団体から入手してもよい。好ましい細胞株には、ＮＣＩ／ＮＩＨの開発途上治療プログラム（Developmental Therapeutics Program）によって同定された細胞株から選択される１以上のものが含まれるであろう。このプログラムによる腫瘍細胞株の選別によって、現在、白血病、メラノーマ、並びに肺、大腸、脳、卵巣、乳房、前立腺及び腎臓の癌の典型を示す６０の種々の腫瘍細胞株が同定されている。望ましい濃度範囲にわたって要求される非拮抗作用は、単細胞型についてさえ示されればよい；しかしながら、この作用は、少なくとも二つの細胞株について示されることが好ましく、より好ましくは、三つの細胞株、より好ましくは五つの細胞株、更に好ましくは十の細胞株について示される。前記細胞株は、樹立腫瘍細胞系（established tumor cell line）又は患者サンプルから得られた初代培養であってもよい。細胞株は如何なる種のものでもよいが、好ましいソースは哺乳類、特にヒトであろう。細胞株を、各種実験室の条件の下選別によって及び／又は外来性遺伝子材料の付加若しくは除去によって遺伝的に変化させてもよい。細胞株は、ウイルス又はプラスミドベースの形質移入法を含むがこれに限定されない任意の遺伝子導入技術によって形質移入されてもよい。修飾には、特定のタンパク質又はペプチドの発現をコードするｃＤＮＡ、プロモーター又はエンハンサーシーケンス等の制御因子（regulatory element）或いはアンチセンスＤＮＡ又はＲＮＡの導入が含まれうる。遺伝子操作された組織培養株には、腫瘍抑制遺伝子、即ちｐ５３、ｐＴＥＮ及びｐ１６等の遺伝子を含む及び含まない系統；並びにドミナントネガティブ法（dominant negative methods）、遺伝子挿入（インターカレーション）法（gene insertion methods）及びその他の選定法の使用により作成された系統が含まれうる。細胞生存度を定量化する、例えば抗腫瘍剤をテストするために使用されうる組織培養細胞株として、好ましくは、Ｐ３８８、Ｌ１２１０、ＨＬ−６０、ＭＯＬＴ−４、ＫＢＭ−３、ＷｅＨｉ−３、Ｈ４６０、ＭＣＦ−７、ＳＦ−２６８、ＨＴ２９、ＨＣＴ−１１６、ＬＳ１８０、Ｂ１６−Ｆ１０、Ａ５４９、Ｃａｐａｎ−１、ＣＡＯＶ−３、ＩＧＲＯＶ１、ＰＣ−３、ＭＸ−１及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１が挙げられるが、これらに限定されない。
一つの好ましい形態において、与えられた効果（ｆａ）は、細胞障害剤の細胞培養への適用後の細胞死又は細胞静止を意味する。細胞死又は生存度を、例えば、下記方法を用いて測定してもよい：

Figure 2007533670
二以上の薬剤の非拮抗的な比を、癌以外の疾患徴候について決定することができ、この知見を使用して、これらの疾患を治療するための二以上の薬剤の治療用製剤を製造することができる。インビトロアッセイに関しては、多くの測定可能な指標を、これらの指標が特定の疾患に対して治療上関連性があるという前提で、薬剤相乗作用を規定するものから選択することができる。
前述したように、細胞培養のインビトロ研究は、「関連」細胞について行われるであろう。細胞の選択は、薬剤の治療用途に依存するであろう。個々の患者のバイオプシー又は全腫瘍のインビトロ研究を、腫瘍サンプル（又は複数の腫瘍サンプル）の単細胞へのホモジナイゼーションから生じた「腫瘍ホモジネート（tumor homogenate）」について行うことができる。
一つの好ましい形態において、与えられた効果（ｆａ）は、細胞障害剤の「関連」細胞培養又は「腫瘍ホモジネート」への適用後の細胞死又は細胞静止を意味する（実施例１参照）。細胞死又は生存度を、多数の技術として公知の方法を用いて測定してもよい。
脂質ベースの送達媒体の調製
本発明において使用される好ましい脂質担体は、リポソームである。リポソームについては、リポソーム：合理的な設計（Liposomes; Rational Design）（Ａ．Ｓ．Ｊａｎｏｆｆ編、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ社、ニューヨーク、ＮＹ）に記載されているように又はその技術において知識を有する者に知られているその他の技術によって製造することができる。本発明において使用される適当なリポソームには、大型単層小胞体（large unilamellar vesicles）（ＬＵＶｓ）、多層膜小胞体（multilamellar vesicles）（ＭＬＶｓ）、小型単層小胞体（small unilamellar vesicles）（ＳＵＶｓ）及び嵌合融合リポソーム（interdigitating fusion liposomes）が含まれる。
本発明において使用されるリポソームは、ジステアリルホスファチジルコリン等のホスファチジルコリン脂質を含むように製造されてもよい。本発明のリポソームはまた、コレステロール等のステロールを含んでもよい。リポソームはまた、治療用脂質を含んでもよく、そのような脂質の例として、エーテル脂質、ホスファチジン酸、ホスホネート、セラミド及びセラミドアナログ、スフィンゴシン及びスフィンゴシンアナログ並びにセリン含有脂質が挙げられる。
リポソームを、ポリエチレングリコール−ＤＳＰＥ等の表面安定化親水性ポリマー−脂質複合物（surface stabilizing hydrophilic polymer-lipid conjugates）を用いて製造して、循環寿命（circulation longevity）を増大させてもよい。同様にホスファチジルグリセロール（phosphatidylglycerol）（ＰＧ）及びホスファチジルイノシトール（phosphatidylinositol）（ＰＩ）等の負荷電脂質の取り込みをリポソーム製剤に追加して、担体の循環寿命を増大させてもよい。これらの脂質は、親水性ポリマー−脂質複合物を交換するため、表面安定化剤として用いられうる。本発明の好ましい形態では、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）又はホスファチジルイノシトール（ＰＩ）を含むリポソームを使用して凝集を防止し、それによって担体の血中滞留時間（blood residence time）を増大させてもよい。
一つの形態において、本発明によるリポソーム組成物は、好ましくは癌を治療するために使用される。カプセル化した薬剤の腫瘍部位への送達は、本発明のリポソームの投与によって行われる。好ましくは、リポソームは３００ｎｍ未満の直径を有する。最も好ましくは、リポソームは２００ｎｍ未満の直径を有する。腫瘍脈管構造は、一般に、内皮における開窓又は間隙により正常な脈管構造よりも漏出性である。これにより、直径２００ｎｍ未満の送達媒体は、不連続内皮細胞層、及びその下にある、腫瘍に血液を供給する血管周囲の基底膜を透過する。血管外遊走後の送達媒体の腫瘍部位への局所的な蓄積により、抗癌剤送達及び治療効果が増大する。
各種方法を利用して、活性剤（active agents）をリポソームでカプセル化（活性剤をリポソームに内封）してもよい。「カプセル化（encapsulation）」には、薬剤の脂質ベースの送達媒体との共有結合又は非共有結合が含まれる。例えば、これを、薬剤のリポソームの外層又は複数の外層との相互作用或いはリポソーム内での薬剤の捕捉によるものとすることができ、そのときリポソームの異なる部分間で平衡状態に達する。したがって、薬剤のカプセル化を、脂質成分との共有結合的又は非共有結合的な相互作用或いはリポソームの水性内部における捕捉を介したリポソームの二分子膜との相互作用による薬剤の会合によるものとし、或いは内部水相と二分子膜との間で平衡状態にあるものとすることができる。「負荷（Loading）」は、１以上の薬剤を送達媒体でカプセル化する行為をいう。
望ましい組み合わせのカプセル化を、別々の送達媒体で又は同一の送達媒体でカプセル化することにより行うことができる。別々のリポソームでのカプセル化を望む場合には、連係して作用する薬物動態（coordinated pharmacokinetics）を見越して、各リポソームの脂質組成物を、全く異なるものとしてもよい。媒体組成物を変更することによって、カプセル化した薬物の放出率を、望ましい比の薬剤が腫瘍部位に送達されるように、合わせることができる。放出率を変更する手段には、脂質を形成する小胞体（vesicle）のアシル鎖長を増加させて薬剤保持時間を改善すること、リポソーム膜外でＰＥＧ等の表面グラフトした親水性ポリマーの交換を調節すること並びにステロール類又はスフィンゴミエリン等の膜硬化剤（membrane-rigidifying agents）を膜に組み込むことが含まれる。仮に第一及び第二の薬剤が特定の薬剤比で投与されることが望ましい場合及び第二の薬剤について第一の薬剤のリポソーム組成物（ＤＭＰＣ／Ｃｈｏｌ）内部での保持が不十分である場合には、第二の薬剤を、アシル鎖張を増大させた脂質を含むリポソーム組成物でカプセル化することによって、その薬物動態が改善されうることは当業者に明瞭であろう。別々のリポソームでカプセル化したとき、最適な治療活性を与えるよう患者別基準に応じて決定されているアントラサイクリン系薬剤対シチジンアナログの比が、投与前に適正量の各リポソームカプセル化剤を組み合わせることによって、個々の患者に対してもたらされうることが容易に認められるべきである。これに代えて、二以上の薬剤を同一のリポソームでカプセル化してもよい。
カプセル化技術は、送達媒体の性質に左右される。例えば、治療剤を、受動的な負荷方法及び能動的な負荷方法の両方を用いて、リポソーム中に負荷してもよい。活性剤をリポソームでカプセル化する受動的な方法には、リポソームの製造中に薬剤をカプセル化することが含まれる。これには、Ｂａｎｇｈａｍらによって記載された受動捕捉法（passive entrapment method）（J. Mol. Biol. (1965) 12: 238）が含まれる。この技術により、放出（extrusion）のすぐ後に大型単層小胞体（ＬＵＶｓ）又は小型単層小胞体（ＳＵＶｓ）に転換されうる多層膜小胞体（ＭＬＶｓ）の形成が結果として生ずる。受動カプセル化の別の適当な方法として、Ｄｅａｍｅｒ及びＢａｎｇｈａｍによって記載されたエーテル注入技術（Biochim. Biophys. Acta (1976) 443: 629）並びにＳｚｏｋａ及びＲａｐｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓによって記載された逆相蒸発（Reverse Phase Evaporation）技術（P.N.A.S. (1978) 75: 4194）が挙げられる。更に、受動的なカプセル化の別の適当な方法として、リポソームの形成後の受動的平衡（passive equilibration）が挙げられる。このプロセスには、条件変化（altered condition）の下で又は非周囲（non-ambient）（温度、圧力等に基づく）条件下で予備形成したリポソームをインキュベートすること並びに治療薬（例えば、シチジンアナログ又はアントラサイクリン系薬剤）をリポソームの外部に加えることが含まれる。その治療薬により、その後、リポソーム膜全体にわたって、リポソーム内部が平衡に達する。リポソームはその後周囲条件に戻され、カプセル化しなかった治療薬が存在する場合には、これが透析法又は別の適当な方法により除去される。
カプセル化の能動的な方法には、米国特許第５，６１６，３４１号、第５，７３６，１５５号及び５，７８５，９８７号に記載されたｐＨ勾配負荷技術（pH gradient loading technique）並びに能動金属負荷（active metal-loading）が含まれる。ｐＨ勾配負荷の一つの方法は、ｐＨ４．０の内部バッファとしてクエン酸及び中性の外部バッファを利用するクエン酸塩基負荷法（citrate-base loading method）である。リポソーム全体にわたってｐＨ勾配を確立し、且つ維持するために用いられる他の方法には、リポソーム膜に挿入することができプロトンと引き換えに膜全体にわたってイオンを輸送することができるイオノフォアの使用が含まれる（米国特許第５，８３７，２８２号参照）。イオノフォアの非存在下、複合体形成を介してリポソームに薬剤を取り込ませるために遷移金属を利用する最近の好ましい技術を使用してもよい。この技術は、薬剤を取り込ませるようｐＨ勾配を確立するのではなく薬剤−金属複合体を形成することによる。
捕捉の受動及び能動法を、１を超えるカプセル化剤を含むリポソーム製剤の製造のため、組み合わせてもよい。
本発明の組成物の生体内（インビボ）投与
前述したように、本発明の送達媒体組成物を、ヒト等の温血動物並びに家禽（domestic avian）種に投与してもよい。ヒトの病気の治療のため、資格のある医師は、確立されたプロトコルを用いて本発明の組成物が投与量、スケジュール及び投与経路に関してどのように利用されるべきか判断するであろう。本発明の送達媒体組成物でカプセル化した薬剤において対象（患者）の健常な組織に対する毒性が緩和されている場合には、そのような投与において、投与量の段階的増大が利用されてもよい。
本発明の医薬組成物は、好ましくは非経口投与、即ち動脈投与、静脈投与、腹腔投与、皮下投与、又は筋肉投与される。より好ましくは、本発明の医薬組成物は、大量瞬時投与（bolus）又は輸液注入（infusional injection）によって静脈投与又は腹腔投与される。例えば、参照により組み込まれるＲａｈｍａｎら、米国特許第３，９９３，７５４号；Ｓｅａｒｓ、米国特許第４，１４５，４１０号；Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓら、米国特許第４，２３５，８７１号；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ、米国特許第４，２２４，１７９号；Ｌｅｎｋら、米国特許第４，５２２，８０３号；及びＦｏｕｎｔａｉｎら、米国特許第４，５８８，５７８号を参照されたい。
他の方法では、本発明の医薬又は化粧用製剤を、標的組織に製剤を直接投与することによって、当該組織と接触させることができる。そのような投与は、局所的な、「開放（open）」又は「閉鎖（closed）」処置によってなされてもよい。「局所的（topical）」とは、多剤製剤（multi-drug preparation）の皮膚、中咽頭、及び外耳道等、環境にさらされた組織への直接投与を意味する。「開放」処置は、患者の皮膚を切開すること並びに医薬製剤が投与される皮下にある組織を直接目で見えるようにすることを含む処置である。これは、一般に、肺に到達するための開胸術、腹部内臓に到達するための開腹術（abdominal laparotomy）又はその他の標的組織への直接的な外科的アプローチ等の外科的な処置によって行われる。「閉鎖」処置は、内部標的組織を直接目で見えるようにしないが、皮膚の小さな傷を通して器具を挿入することによりこれに到達させる観血的な処置である。例えば、製剤を針洗浄（needle lavage）よって腹膜に投与してもよい。これに代えて、製剤を内視鏡装置により投与してもよい。
本発明の送達媒体を含む医薬組成物は、標準技術に従って製造され、また、アルブミン、リポタンパク質、及びグロブリン等の安定性を高めるための糖タンパク質を含め、水、緩衝水（buffered water）、０．９％生理食塩水、０．３％グリシン、５％デキストロース、及び等浸透圧性スクロース液等を含んでもよい。これらの組成物を、従来公知の滅菌技術によって滅菌してもよい。結果として生じた水溶液を、使用のため包装し又は無菌条件下で濾過し、凍結乾燥してもよく、その凍結乾燥した製剤を投与前に滅菌した水溶液と混合してもよい。前記組成物は、例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、及び塩化カルシウム等、ｐＨ調整剤及び緩衝剤、並びに張度調整剤（tonicity adjusting agents）等の医薬的に許容し得る補助物質を、適当な生理条件のために必要に応じて、含んでもよい。更に、送達媒体懸濁液は、貯蔵におけるフリーラジカル及び脂質過酸化損傷に対抗して脂質を保護する脂質保護剤を含んでもよい。αトコフェロール及びフェロキサミン等の水溶性鉄特異性キレート剤（water-soluble iron-specific chelators）等の親油性フリーラジカル失活剤が適している。
送達媒体の医薬製剤中の濃度は、例えば約０．０５重量％から、１０〜３０重量％程度まで幅広く変化させることができるが、通常は約２〜５重量％又は少なくとも約２〜５重量％であり、選択される投与の特定の形態に応じて、主として液量及び粘度等によって選択されるであろう。例えば、治療と付随した液負荷（fluid load）を低減させるために、前記濃度を増加させてもよい。これに代えて、刺激性の脂質で構成された送達媒体を低濃度まで希釈して、投与部位での炎症を小さくしてもよい。診断のため、投与される送達媒体の量は、用いられる特定の標識、診断されている病状及び臨床医の判断に依存するであろう。
本発明の医薬組成物は、好ましくは静脈投与される。送達媒体製剤の投与量は、薬剤と脂質の比（割合）並びに投与する医師の患者の年齢、体重及び体調に基づく見解に依存するであろう。
医薬組成物の他、獣医学的使用にとって適当な製剤を製造し、対象（被検体）に適した方法で投与してもよい。好ましい獣医学的対象には、哺乳類種、例えば、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、及び家禽（domesticated fowl）が含まれる。対象には、実験動物、例えば、特にラット、ウサギ、マウス、及びモルモットも含まれる。
キット
本発明の組成物中の治療薬を、各治療薬が適当な送達媒体と安定的に会合されている個々の組成物に切り離して処方してもよい。投与される治療薬の比が治療の標的で維持されるよう送達媒体の薬物動態が連係して作用される限り、これらの組成物を、対象（患者）に別々に投与することができる。したがって、独立したコンテナに、少なくとも第一の治療薬と安定的に会合した送達媒体を含む第一の組成物と、第二のコンテナに、少なくとも第二の治療薬と安定的に会合した送達媒体を含む第二の組成物とを含むキットを作成することは有用である。前記コンテナを、その後キットに包装することができる。
前記キットには、投与されるべき各組成物の量の比についての記述を少なくとも含む、組成物の対象への投与形態に関する指示書も含まれるであろう。これに代えて、又は更に、一方のコンテナの内容物が他方のコンテナの内容物と組み合わせて適正な比を表すようコンテナ毎に組成物の量を予め測定して、前記キットは作成される。これに代えて、又は更に、前記コンテナには、目に見える目盛りに従って適当量の投与を可能にする計量線（measuring scale）が付されてもよい。前記コンテナはそれ自体、投与に使用できてもよい；例えば、前記キットは、別々のシリンジに封入された適当量の各組成物を含むかもしれない。予め処方した正確な比の治療薬を含む製剤を、同様にこの方法で包装してもよく、その結果、当該製剤はキット内に包装されたシリンジから直接投与される。
下記実施例により本発明を更に説明する。当該実施例は、単に特定の形態に関して本発明を詳細に説明するために与えられる。これらの具体例により、本発明のある特定の視点について詳細に説明されるが、限定がなされるものではなく、或いは開示された発明の範囲に限定されるものではない。
［実施例１］薬剤比依存性であるインビトロでのダウノルビシン:シタラビン相乗作用
２以上の薬剤の組み合わせの多くは、相乗効果を発揮する能力を有する。同様に、その同じ２以上の薬剤の組み合わせはまた、相加的又は拮抗的相互作用を示す場合もある。相乗的であるダウノルビシンとシタラビン（Ａｒａ−Ｃとしても知られている）との比を同定するため、ダウノルビシンとシタラビンとの各種組み合わせについて、インビトロで細胞毒性効果をテストした。より具体的には、薬剤濃度の広い範囲にわたって相乗作用を示す薬剤比を同定した。
相加、相乗又は拮抗作用の測定を、Ｐ３８８及びＬ１２１０マウスリンパ性白血病細胞について、ダウノルビシン：シタラビン（ＤＮ：Ａｒａ−Ｃ）を１０：１、５：１、１：１、１：５及び１：１０のモル比で用いて、行った。標準テトラゾリウムベース比色ＭＴＴ細胞毒性測定プロトコル（standard tetrazolium-based colorimetric MTT cytotoxicity assay protocol）（Mosmann, et al., J. Immunol Methods (1983) 5(1-2): 55-63）を利用して、影響された細胞の画分の読み取り値を測定した。簡単には、生細胞により、テトラゾリウム塩、３−（４，５−ジエチルチアゾイル−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロマイド（3-(4,5-diethylthiazoyl-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide）（ＭＴＴ）が分光測定で読み取ることができる青いホルマザンに還元される。ここで用いられるＰ３８８又はＬ１２１０マウスリンパ性白血病細胞等の細胞は、ＢＤＦ−１マウスで継代（培養）され、必要に応じて、除去され、新鮮な細胞培養培地を含む７５ｃｍ２フラスコに移され、ウェル当たり１００μＬの中にそれぞれ１０，０００若しくは６，０００個のＰ３８８又はＬ１２１０細胞の濃度で、９６ウェル細胞培養プレートに添加される。その細胞を、その後、細胞接着を促進させるため、３７℃、５％ＣＯ２、及び＞７５％湿度で２４時間インキュベートしておく。その翌日、段階薬剤希釈（serial drug dilution）を、１２ウェル細胞培養プレートにおいて作成する。各種溶液について予め作成した薬剤を、新鮮な細胞培養培地で希釈する。薬剤を、単一の薬剤（２０μＬ）及び特定の固定した比の２種薬剤組み合わせ（２０μＬずつ）に対応するウェルに投与する。全ウェル体積を新鮮培地で２００μＬまでにする。薬剤の曝露は、７２時間の期間である。
薬剤の曝露後、ＭＴＴ試薬（１ｍｇ／ｍＬリン酸緩衝塩溶液）を、ウェル当たり５０μＬの体積で各ウェルに添加し、４時間インキュベートする。ウェルの内容物をその後吸引し、１５０μＬのジメチルスルホキシド（dimethylsulfoxide）（ＤＭＳＯ）を各ウェルに添加して、細胞を分裂させ、細胞内部でホルマザン沈殿物を可溶化する。９６ウェルプレートを最低２分間プレート振盪機（plate shaker）で振盪させ、５７０ｎｍの波長に設定したマイクロプレート分光光度計（microplate spectrophotometer）で読み取る。読み取る光学密度（optical density）（ＯＤ）を記録し、培地を単独で含むブランクウェルのＯＤ値を、細胞を含む全てのウェルから引き算する。薬剤への曝露後の細胞生存は、薬剤の曝露のないコントロールウェルの細胞の百分率として基礎づけられる。全ウェルについて三回行い、平均値を計算する。
組み合わせ指数を、その後、薬剤−効果分析のＣｈｏｕ及びＴａｌａｌａｙの理論に基づくＣａｌｃｕｓｙｎを用いて、各ダウノルビシン；シタラビン剤について求める。なお、「Ｍｅｄｉａｎ−Ｅｆｆｅｃｔ方程式（median-effect equation）」を用いて、その技術において広く用いられている多数の生化学的方程式が計算されている。この方程式の導出により、組み合わせ指数（ＣＩ）を計算するために用いられる方程式等、より高い次数の方程式が得られている。以前に述べたように、ＣＩを用いて、１以上の薬剤の組み合わせ及び各組み合わせの各種比が拮抗的（ＣＩ＞１．１）であるか、相加的（０．９≦ＣＩ≧１．１）であるか又は相乗的（ＣＩ＜０．９）であるかを判定することができる。ＣＩプロットは、典型的にはｘ軸の影響された細胞の割合又は影響された画分（ｆａ）に対してｙ軸を表すＣＩを用いて図示される。影響されたＰ３８８又はＬ１２１０マウスリンパ性白血病細胞の画分に対するＣＩとしてプロットされた図１Ａ及び１Ｂのデータは、それぞれ、ダウノルビシンとシタラビンとの特定の組み合わせが拮抗的である一方、その他のものは相乗的又は相加的であることを図示する。１：１０、１：５及び１：１のダウノルビシン：シタラビン（ＤＮ：Ａｒａ−Ｃ）比では、０．７５以上のｆａ値でＰ３８８細胞について相乗作用が認められる（図１Ａ）。これにより、１：１、１：１０及び１：５の比は、著しい腫瘍細胞死を引き起こすのに十分な濃度で相乗的であることが示される。ダウノルビシン：シタラビンの１：５及び１：１０の比も、ｆａ値の適当な範囲にわたってＬ１２１０細胞について非拮抗的である（図１Ｂ）。逆に、ダウノルビシン：シタラビンの５：１及び１０：１の比は、ｆａ値の広い範囲にわたってＰ３８８及びＬ１２１０細胞について拮抗的である。図１Ｃ及び１Ｄでは、７５％（ＥＤ７５）及び９０％（ＥＤ９５）腫瘍細胞増殖阻害を引き起こすのに十分な薬剤濃度でのＣＩ値が、Ｐ３８８及びＬ１２１０細胞について異なるダウノルビシン：シタラビンモル比で比較されているが、ＣＩのダウノルビシン：シタラビン比への依存は、この図１Ｃ及び１Ｄにおいても示される。これらの結果に基づき、１：５ダウノルビシン：シタラビンのモル比を、固定した薬剤比のリポソーム担体で処方するために、選択した。
［実施例２］リポソーム中に２種負荷されうる（dual-loaded）ダウノルビシン及びシタラビン
ダウノルビシン及びシタラビンの両方を含むリポソームを、ダウノルビシンを能動的に負荷した受動捕捉シタラビン（passively entrapped cytarabine）を含むＤＳＰＣ／ＤＳＰＧ／コレステロール（７：２：１ モル比）リポソームを用いて得ることができた。簡単には、１００ｍｇ脂質／ｍｌ最終濃度の濃度で混合した脂質（ＤＳＰＣ：ＤＳＰＧ：ＣＨＯＬ（７：２；１ モル比））をクロロホルム：メタノール：Ｈ２Ｏ混合物（９５：４：１ ｖｏｌ／ｖｏｌ）中に溶解させることによって、脂質発泡体を、調製した。溶媒を、その後真空蒸発（vacuum evaporation）により除去し、生じた脂質発泡体を、７０℃で、１００ｍＭ Ｃｕ（グルコネート）２、２２０ｍＭトリエタノールアミン（triethanolamine）（ＴＥＡ）、ｐＨ７．４及び５０ｍｇ／ｍＬ（２０３ｍＭ）シタラビン（３Ｈ−シタラビンをトレーサーとして含むもの）からなる溶液で水和させた。生じたＭＬＶを、７０℃で１０分間押し出して、大型単層小胞体を得た。生じたリポソームの平均直径を、ＱＥＬＳ（準弾性光散乱（quasi-elastic light scattering））分析によって測定したところ、約１００ｎｍ＋／−２０ｎｍであった。次いで、リポソームを、タンジェンシャルフロー透析法（tangential flow dialysis）を用いて３００ｍＭ スクロース、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１ｍＭ ＥＤＴＡ（ＳＨＥ）、ｐＨ７．４中へ、バッファ交換し、それによってカプセル化（内封）されなかったシタラビン及びＣｕ（グルコネート）２／ＴＥＡを除去した。シタラビン対脂質モル比を脂質シンチレーションカウンティング（lipid scintillation counting）を用いて測定して、脂質濃度（１４Ｃ−ＤＰＰＣ）及びシタラビン濃度（３Ｈ−シタラビン）を求めた。
ダウノルビシンを、１：５の最終目標ダウノルビシン：シタラビンモル比になるまで、これらのリポソームに添加した。ダウノルビシンのリポソーム中への負荷を、５０℃で３０分間サンプルをインキュベートすることによって促進させた。負荷後、そのサンプルを室温まで冷却した。セファデックス（Sephadex）Ｇ−５０スピンカラムによるリポソーム溶出後、薬剤カプセル化効率（drug encapsulation efficiency）を評価した。
ダウノルビシン負荷効率（daunorubicin loading efficiency）を、標準曲線に対する４８０ｎｍでの吸収を用いて測定した。ダウノルビシン測定のため４８０ｎｍでの吸収を用いて及び脂質濃度を測定するため脂質シンチレーションカウンティングを用いて、各時点での薬剤対脂質比を測定した。表１は、薬剤カプセル化及び遊離型薬剤の除去後の平均ダウノルビシン／脂質比及びシタラビン／脂質比を示す。表１から、０．０４２：１の初期ダウノルビシン対脂質比で添加されたダウノルビシンを、受動捕捉シタラビンを０．２３４の薬剤対脂質比で含むＤＳＰＣ／ＤＳＰＧ／Ｃｈｏｌ（７：２：１ モル比）リポソーム中に有効に負荷することができることは明らかである。
Figure 2007533670
［実施例３］インビボでの薬剤比の維持
ダウノルビシン及びシタラビンがインビボで相乗作用の範囲において１：５の薬剤：薬剤比で維持されうるかどうかを測定するため、カプセル化したダウノルビシン及びシタラビンを含むＤＳＰＣ／ＤＳＰＧ／Ｃｈｏｌ（７：２：１ ｍｏｌ：ｍｏｌ）リポソームを、マウスに静脈投与し、血漿（プラズマ）薬剤／薬剤比を、経時でモニターした。
簡単には、１００ｍｇ脂質／ｍｌ最終濃度の濃度の脂質混合物（ＤＳＰＣ：ＤＳＰＧ：ＣＨＯＬ（７：２：１ モル比））をクロロホルム：メタノール：Ｈ２Ｏ混合物（９５：４：１ ｖｏｌ／ｖｏｌ）中に溶解させることによって、脂質発泡体を、調製した。溶媒を、その後真空蒸発（vacuum evaporation）により除去し、生じた脂質発泡体を、７０℃で、１００ｍＭ Ｃｕ（グルコネート）２、２２０ｍＭ トリエタノールアミン（triethanolamine）（ＴＥＡ）、ｐＨ７．４及び５０ｍｇ／ｍＬ（２０３ｍＭ）シタラビン（微量（trace amounts）の３Ｈ−シタラビンを含むもの）からなる溶液で水和させた。生じたＭＬＶを、７０℃で押し出して、大型単層小胞体を得た。生じたリポソームの平均直径を、ＱＥＬＳ（準弾性光散乱（quasi-elastic light scattering））分析によって測定したところ、約１００ｎｍ＋／−２０ｎｍであった。次いで、リポソームを、タンジェンシャルフロー透析法（tangential flow dialysis）を用いて３００ｍＭ スクロース、２０ｍＭ リン酸ナトリウム、１０ｍＭ ＥＤＴＡ（ＳＨＥ）、ｐＨ７．４中へ、バッファ交換し、それによってカプセル化（内封）されなかったシタラビン及びＣｕ（グルコネート）２／ＴＥＡを除去した。
ダウノルビシンを、ダウノルビシン対シタラビン最終モル比が約１：５になるよう、これらのリポソームに添加した。リポソーム中へのダウノルビシン負荷を、５０℃で３０分間サンプルをインキュベートすることによって促進させた。負荷後、そのサンプルを室温まで冷却した。セファデックス（Sephadex）Ｇ−５０スピンカラムによるリポソーム溶出後、薬剤カプセル化効率（drug encapsulation efficiency）を評価した。シタラビン対脂質モル比を脂質シンチレーションカウンティング（lipid scintillation counting）を用いて測定して、脂質濃度（１４Ｃ−ＤＰＰＣ）及びシタラビン濃度（３Ｈ−シタラビン）を求めた。ダウノルビシン負荷効率（daunorubicin loading efficiency）を、標準曲線に対する４８０ｎｍでの吸収を用いて測定した。ダウノルビシン測定のため４８０ｎｍでの吸収を用いて並びに脂質及びシタラビン濃度を測定するため脂質シンチレーションカウンティングを用いて、薬剤対脂質比を測定した。
前記製剤をその後、ＢＤＦ−１マウスに尾静脈を介して静脈注射した。リポソーム製剤の投与量を、ダウノルビシンにつき５ｍｇ／ｋｇ、シタラビンにつき１２．５ｍｇ／ｋｇとした。静脈投与後の望ましい時点で、血液を、心臓穿刺（時点につき３マウス）によって採取し、ＥＤＴＡ被覆マイクロコンテナ（EDTA coated micro containers）に入れた。それらのサンプルを、遠心分離して血漿を分離し、血漿を別のチューブに移した。ダウノルビシン及びシタラビン血漿（プラズマ）レベルを、高速液体クロマトグラフィー（High Performance Liquid Chromatography）（ＨＰＬＣ）を用いて定量化した。
図２Ａは、ダウノルビシン及びシタラビンが前記記載したリポソームによって送達されたときにＢＤＦ−１マウスへの静脈投与後の各種時点におけるダウノルビシン及びシタラビンの血漿消失曲線を示す。静脈注射１時間後、ダウノルビシン血漿濃度は１６７ｎｍｏｌ／ｍｌとなり、８７２ｎｍｏｌシタラビン／ｍｌの血漿濃度が観察された。注射４時間後、ダウノルビシン血漿濃度は１４３ｎｍｏｌ／ｍｌとなり、シタラビン濃度は７８１ｎｍｏｌ／ｍｌとなった。
図２Ｂは、ダウノルビシン及びシタラビンが前記記載したリポソームに同時送達されたときにＢＤＦ−１マウスへの静脈投与後の長期間にわたって相乗的な範囲でダウノルビシン及びシタラビンの血漿レベルが有効に維持されることを示す。データポイントは、特定の時点で血漿について測定したダウノルビシン：シタラビンのモル比（＋／− 標準偏差）を表す。それゆえ、リポソーム等の適当にデザインした送達媒体により、望ましい比のダウノルビシン及びシタラビンが、インビボで送達されるうる。
［実施例４］相乗的な比でリポソーム中に同時に処方されたダウノルビシン及びシタラビンが示す優れた抗腫瘍効率（有効性）
薬剤組み合わせの治療活性を最大にするため及びインビトロで認められる相乗的な利益を得るため、薬剤組み合わせは、最適な薬剤対薬剤比で腫瘍部位に送達される必要がある。組織培養において相乗的であるとわかった固定した比で、二つの薬剤を含む単一のリポソーム製剤を、実施例３において示したのと同様にインビボでの薬剤放出を連係して行うことができるように、開発した。この製剤の抗腫瘍活性を、その後Ｐ３８８及びＬ１２１０マウスリンパ性白血病モデルで評価した。
約１：５の相乗的なモル比でダウノルビシン及びシタラビンと共カプセル化されたＤＳＰＣ／ＤＳＰＧ／Ｃｈｏｌ（７：２：１ モル比）リポソームを、実施例３において記載したのと同様に調製した。
マウスの腫瘍研究を行うため、動物には、１×１０６のＰ３８８又はＬ１２１０腫瘍細胞を腹腔内（ｉｐ）接種し、その後この腫瘍細胞を、治療開始前に２４時間増殖させておいた。マウスは、生理食塩水、リポソームダウノルビシン、リポソームシタラビン、遊離型薬剤カクテル及び結果として約１：５の最終ダウノルビシン：シタラビンモル比となるようＤＳＰＣ：ＤＳＰＧ：Ｃｈｏｌ（７：２：１、ｍｏｌ；ｍｏｌ）リポソームに共負荷したダウノルビシン：シタラビンを含むコントロール並びに治療群からなる適当な治療群に分けた。マウスについては、腫瘍細胞接種後１、４及び７日に個々のマウスの体重に基づき前記処方した一回分がこの動物に投与されるように、必要とする体積のサンプルを静脈注入した。動物の体重を測定し、更に動物の生存についてモニターした。体重測定の時に実生活内での観察（in-life observations）を行う。図３は、これらの実験の結果を図示する。
図３Ａが示すように、約１：５モル比で共負荷したダウノルビシン：シタラビンを含むリポソーム製剤の抗腫瘍活性が、リポソーム中に個々に処方された各単一の薬剤並びに最大耐容量（maximum tolerated dose）（ＭＴＤ）で投与した遊離型薬剤カクテルと比較して著しく増大することが観察された。バッファコントロール群では、５０％生存期間（median survival time）は８日であった。５ｍｇ／ｋｇの投与量のリポソームダウノルビシンを用いて治療した動物では、１００％の生存期間の増大に相当する、１６日の５０％生存期間が示された。１２．５ｍｇ／ｋｇの投与量のリポソームシタラビンを用いて治療したマウスでは、１７５％の生存期間の増大に相当する、２２日の５０％生存期間が示され、そしてＤＳＰＣ：ＤＳＰＧ：Ｃｈｏｌ（７：２：１ ｍｏｌ：ｍｏｌ）リポソーム内部に約１：５モルの薬剤比で共負荷したダウノルビシン及びシタラビンを用いて治療した動物では、＞６０日の５０％生存期間及び９／１０の長期間生存に加え＞６５０％の寿命の増大が示された。比較して、ＭＴＤ（両方の遊離型薬剤の最大投与量（maximizing dose）に基づく）のダウノルビシン：シタラビンを遊離型薬剤カクテルとして用いて治療したマウスでは、２７日の５０％生存期間及び２３７％に相当する寿命の増大によって反映されるように、抗腫瘍治療にも応答しなかった。
同様に、図３Ｂに示されるように、対応する遊離型薬剤カクテル又はリポソーム中に個々に負荷した各薬剤と比較すると、約１：５のモル比で共負荷したダウノルビシン及びシタラビンを含むリポソーム製剤については、優れた抗腫瘍活性が得られた。バッファコントロール群では、５０％生存期間は７日であった。リポソームカプセル化ダウノルビシン又はリポソームカプセル化シタラビンを用いて治療したマウスでは、５０％生存期間は、それぞれ、２０日及び４３．５日であった。比較して、ＤＳＰＣ：ＤＳＰＧ：Ｃｈｏｌ（７：２：１ ｍｏｌ比）リポソーム中に約１：５のモル比で共負荷したダウノルビシン及びシタラビンを用いて治療した動物では、６０日を超える５０％生存期間が示された。
これらの結果から、固定した相乗作用を示すダウノルビシン：シタラビン比は、適当に設計されたリポソームの内部にダウノルビシン：シタラビンを封入することによって抗腫瘍活性を著しく改善することができるということが示される。
上記実施例は、詳細な説明のためにのみ含まれるものであり、本発明の範囲を限定することを意図したものではない。前記実施例に対する多くの変形が可能である。前記実施例の改良及び変形は当業者に自明であろうから、本発明が添付した請求の範囲によってのみ制限されることを意図している。
上記公報又は文献の引用は、上述のもの全てが関連する先行技術であると認めるものではなく、これらの公報又は文献の内容及び日付に関して何ら承認を構成するものでもない。
図１Ａは、各種モル比：１０：１（四角形）、５：１（三角形）、１：１（中抜きの丸）、１：５（逆三角形）及び１：１０（塗りつぶした丸）のダウノルビシン：シタラビン（又はＡｒａ−Ｃ）の組み合わせによって影響されたＰ３８８マウスリンパ性白血病細胞の画分（ｆａ）の関数としてプロットされた組み合わせ指数（ＣＩ）を示すグラフである。 図１Ｂは、各種モル比：１０：１（四角形）、５：１（三角形）、１：１（中抜きの丸）、１：５（逆三角形）及び１：１０（塗りつぶした丸）のダウノルビシン：シタラビン（又はＡｒａ−Ｃ）の組み合わせによって影響されたＬ１２１０マウスリンパ性白血病細胞の画分（ｆａ）の関数としてプロットされた組み合わせ指数（ＣＩ）を示すグラフである。 図１Ｃは、Ｐ３８８マウスリンパ性白血病細胞におけるＣＩ対ダウノルビシン：シタラビン（１０：１、５：１、１：１、１：５、１：１０）各種モル比を示すグラフである。７５％（ＥＤ７５）及び９０％（ＥＤ９０）腫瘍細胞増殖阻害を引き起こすために十分な薬剤濃度でのＣＩ値が、異なるダウノルビシン：シタラビンモル比で比較されている。 図１Ｄは、Ｌ１２１０マウスリンパ性白血病細胞におけるＣＩ対ダウノルビシン：シタラビン（１０：１、５：１、１：１、１：５、１：１０）各種モル比を示すグラフである。７５％（ＥＤ７５）及び９０％（ＥＤ９０）腫瘍細胞増殖阻害を引き起こすために十分な薬剤濃度でのＣＩ値が、異なるダウノルビシン：シタラビンモル比で比較されている。 図２Ａは、ＤＳＰＣ：ＤＳＰＧ：ＣＨＯＬ（７：２：１ モル比）リポソームでＢＤＦ−１マウスに静脈投与した後の各種時点でのダウノルビシン：シタラビンの血漿（プラスマ）消失曲線（plasma elimination curve）を示すグラフである。 図２Ｂは、ダウノルビシン：シタラビン（約１：５モル比）２種負荷したＤＳＰＣ：ＤＳＰＧ：Ｃｈｏｌ（７：２：１ モル比）リポソームの静脈投与後の時間の関数として血漿中のダウノルビシン：シタラビンの比（ｍｏｌ：ｍｏｌ）のグラフである。データポイントは、特定の時点で血漿において測定したダウノルビシン：シタラビンのモル比（＋／− 標準偏差）を表す。 図３Ａは、マウスのＰ３８８リンパ性白血病モデルに対して静脈（i.v.）（Ｑ３ＤＸ３）を介して投与された個々のリポソームカプセル化剤及び遊離型薬剤カクテルと比較した、共負荷したリポソーム捕捉ダウノルビシン：シタラビン（約１：５ モル比）の有効性を示すグラフである。マウスは、生理食塩水（丸）、リポソームダウノルビシン（三角形）、リポソームシタラビン（四角形）、ダウノルビシン：シタラビンの遊離型カクテル（９：６００ｍｇ／ｋｇ）（逆三角形）及び約１：５の最終ダウノルビシン：シタラビンモル比を結果として与えるＤＳＰＣ：ＤＳＰＧ：Ｃｈｏｌ（７：２：１、ｍｏｌ：ｍｏｌ）リポソームで共負荷したダウノルビシン：シタラビン（菱形）を含むコントロール並びに治療群からなる適当な治療群に分けて構成した。 図３Ｂは、マウスのＬ１２１０リンパ性白血病モデルに対して静脈（i.v.）（Ｑ３ＤＸ３）を介して投与された個々のリポソームカプセル化剤及び遊離型カクテルと比較した共負荷したリポソーム捕捉ダウノルビシン：シタラビン（約１：５ モル比）の有効性を示すグラフである。マウスは、生理食塩水（丸）、リポソームダウノルビシン（三角形）、リポソームシタラビン（四角形）、ダウノルビシン：シタラビンの遊離型カクテル（１２：３０ｍｇ／ｋｇ）（中抜きの菱形）及び約１：５の最終ダウノルビシン：シタラビンモル比を結果として与えるＤＳＰＣ：ＤＳＰＧ：Ｃｈｏｌ（７：２：１、ｍｏｌ：ｍｏｌ）リポソームで共負荷したダウノルビシン：シタラビン（塗りつぶした菱形）を含むコントロール並びに治療群からなる適当な治療群に分けて構成した。
関連出願の説明
本出願は、２００４年４月２２日に出願した米国仮特許出願第６０／５６５，２１０号についての米国特許法第１１９条（ｅ）項に基づく利益を主張し、この仮特許出願は参照により本出願に組み込まれる。
本発明は、治療薬の組み合わせの送達について改善した組成物及び方法に関する。より詳しくは、本発明は、アントラサイクリン系薬剤及びシチジンアナログ並びにそれらの誘導体の組み合わせを与える送達系に関する。
癌、ＡＩＤＳ、感染症、免疫疾患及び循環器疾患等の生命を脅かす疾患の進行の多くは、複数の分子メカニズムによって影響される。この複雑さゆえに、単一の薬剤を用いて治療を行うことにはその成果において限界があった。したがって、多くの場合、薬剤の組み合わせ（併用）が疾患を撲滅するため、特に癌の治療において用いられている。投与される薬剤の数と急性リンパ性白血病及び転移性結腸直腸癌（metastatic colorectal cancer）等の癌の治癒率との間には強い相関性があると思われる（非特許文献１及び２参照）。
ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン及びそれらの誘導体等のアントラサイクリン系抗生物質は、公知の抗悪性腫瘍薬を含む。塩酸ダウノルビシン等のダウノルビシンベースの薬剤は、ＤＮＡにインカレートして、ＤＮＡ合成やＲＮＡ合成を含むＤＮＡの各種機能に影響を及ぼすため、これらの薬剤が主として用いられる。これらの薬剤は、急性リンパ性白血病、急性顆粒球性白血病（acute granulocytic leukemia）、急性骨髄球性白血病（acute myelocytic leukemia）、急性期の慢性骨髄球性白血病、及び急性非リンパ性白血病（acute nonlymphocytic leukemia）に対して活性を示す。ドキソルビシンは、急性白血病、悪性リンパ腫、及び乳癌腫（breast cancer tumors）等の任意の固形腫瘍（selected solid tumors）の治療において効果的であることが示されている。イダルビシンは、これらの代謝拮抗薬と同様の活性を示し、有害核型（adverse karyotype）、急性骨髄性白血病（acute myeloid leukemia）（ＡＭＬ）に対してシタラビンと共に用いられている。（非特許文献３）。
シタラビン、５−アザシチジン、及びゲムシタビンのような三つの例示を含むシチジンアナログは、公知の抗悪性腫瘍薬である。例えば、これらの化合物は、白血病及び癌細胞におけるＤＮＡ合成を阻害する点で有効性を示している。これらの特性によって、これらの化合物は急性骨髄球性白血病、急性リンパ芽球性白血病（acute lymphoblastic leukemia）及び骨髄異形性症候群、膵癌及び肺癌を効果的に治療することができる。
特許文献１では、異常細胞増殖と付随した疾患の治療のため、単独で又は遊離型薬剤カクテル（free drug cocktail）で、カプセル化されていないＤＮＡメチル化阻害剤（nonencapsulated DNA methylation inhibitor）及びカプセル化されていない抗悪性腫瘍薬（nonencapsulated anti-neoplastic agent）を投与することが論じられている。しかしながら、この公報には、送達を制御することを意図した医薬製剤又は薬剤の半減期は示唆されていなかった。
同様に、特許文献２では、リポソームカプセル化悪性腫瘍薬（liposome encapsulated neoplastic agents）の製造が論じられている。単一及び複数の抗悪性腫瘍薬が同時に又は経時されるものとして検討されているが、シチジンアナログと組み合わせたアントラサイクリン系抗生物質は示唆されていなかった。
米国第２００４／００５２８６４号 米国特許第５，７３６，１５５号公報 Frei, et al., Clin.Cancer Res. (1998) 4:2027-2037 Fisher, M.D.; Clin.Colorectal Cancer (2001) ８月; 1(2):85-6 Giles,F.J.,et al., J.Clin.Oncol (2003) 21(9):1722-7
薬剤カクテルの治療的使用を制限するさまざまな不利益がある。例えば、遊離型薬剤カクテルの投与では、多くの場合、腫瘍部位に達する前に薬剤の一つ又は全てが急速に排除される。この理由のために、多くの薬剤は、ともすれば血流からの送達媒体の排除をもたらすようなメカニズムから送達媒体を「遮蔽する（shield）」ことを意図した送達媒体中に組み込まれている。リポソームがこの「遮蔽（shielding）」効果を付与する能力を有し、それゆえ治療薬の半減期を延長することができることはよく知られている。しかしながら、送達媒体の脂質成分は多くの場合、個々の薬剤の薬物動態に差次的に影響を及ぼすため、送達媒体中への特定の薬剤又は１を超える薬剤の処方は困難であることが証明されている。したがって、ある薬剤の保持及び放出にとって適当である組成（成分）が第二の薬剤の保持及び放出にとっては適当でない可能性がある。
本発明の研究者等は、優れた薬剤保持及び各薬剤の持続的な放出をもたらす、アントラサイクリンとシチジンアナログ（ダウノルビシン及びシタラビンベースの誘導体を含む）との組み合わせを収容するために必要とされる特定の送達媒体製剤を同定した。本発明の研究者等は、更に、これらの薬剤の相乗的な比（割合）が、リポソームでカプセル化された（リポソームに内封された）場合には、ある時間にわたって血液区画（blood compartment）に保持され、その結果、遊離型薬剤カクテル及び個々のリポソーム剤と比較して効力が増大することを示した。
本発明は、少なくとも１つのアントラサイクリン系薬剤及び１つのシチジンアナログベースの薬剤と安定的に会合するリポソーム送達媒体を用いて効果的な量のアントラサイクリン及びシチジンアナログ（例えば、シタラビン、５−アザシチジン又はゲムシタビンとダウノルビシン、ドキソルビシン又はイダルビシン）薬剤の組み合わせを投与するための組成物及び方法に関する。これらの組成物によれば、２以上の薬剤を、連係して働く状態で疾患部位に送達することが可能となり、それによって、薬剤は、望ましい比で疾患部位に確実に存在するであろう。このような結果は、薬剤が、脂質ベースの送達媒体で共カプセル化されようと望ましい比が疾患部位で維持されるよう投与される別個の脂質ベースの送達媒体でカプセル化されようと達成されるであろう。前記組成物の薬物動態（pharmacokinetics）（ＰＫ）は、連係して働く送達が達成されるよう（前記送達系のＰＫが比較できるという前提で）脂質ベースの送達媒体自体により制御される。
本発明の各種形態では、送達媒体を含む組成物であって、前記送達媒体は、投与経路に依存した寸法のリポソーム及び／又は脂質含有粒子状媒体を含み、かつそれと安定的に会合して少なくとも１つのアントラサイクリン系薬剤及び１つのシチジンアナログを有し、前記アントラサイクリン系薬剤は、ダウノルビシン、ドキソルビシン又はイダルビシンであり；前記シチジンアナログは、シタラビン、ゲムシタビン又は５−アザシチジンであり；前記アントラサイクリン系薬剤及びシチジンアナログは、非拮抗的な細胞毒性効果（作用）又は細胞増殖抑制効果（作用）を発揮するモル比で存在し、かつ投与後に血中において非拮抗的な比を維持するよう前記送達媒体と安定的に会合される組成物が提供される。非拮抗作用は、細胞の２０％から８０％が前記作用を受けるような濃度範囲であって、前記モル比で維持される濃度範囲の少なくとも５％にわたっていてもよい；或いは、前記作用は、細胞の２０％から１００％が前記作用を受けるような濃度範囲であって、前記モル比で維持される濃度範囲の少なくとも２０％にわたって非拮抗的である。前記送達媒体は、リポソーム、脂質ミセル、ブロック共重合体ミセル、マイクロパーティクル、ナノパーティクル、ポリマー脂質ハイブリッド系及び／又は誘導体化した単鎖ポリマーを含んでもよい。
したがって、一つの視点において、本発明は、治療上効果的な比、特に非拮抗的な比でリポソームと会合した少なくとも１つのアントラサイクリン系薬剤及び１つのシチジンアナログベースの薬剤を含む非経口投与用リポソーム組成物を提供する。薬剤の治療上効果的かつ非拮抗的な比は、ある濃度範囲にわたって、関連する細胞培養系、又は無細胞系、及び個々の患者の生検（バイオプシー）からの腫瘍ホモジネートに対する薬剤の生物活性又は効果を測定することによって決定される。ダウノルビシン、ドキソルビシン又はそれらの誘導体とその他のシチジンアナログの組み合わせの中で、よくある組み合わせは、シタラビンとダウノルビシンである。同様に、シタラビン（又は別のシチジンアナログ）及び他の公知のアントラサイクリンの中でダウノルビシン、ドキソルビシン又はイダルビシンを含むアントラサイクリンを含む組み合わせもしばしば提供される。望ましい治療効果を維持する薬剤の比の決定をするいかなる方法を用いてもよい。
前記組成物は、培養中の関連細胞、無細胞系又は腫瘍ホモジネートに望ましい生物学的効果を示すアントラサイクリンとシチジン薬剤とのモル比で少なくとも１つのアントラサイクリン及び１つのシチジン薬剤を含む。好ましくは、前記比は、前記薬剤が非拮抗的となるものである。出願人は、望ましい生物学的効果をテストするのに適している少なくとも１つの細胞培養又は細胞株を「関連ないし適切な（relevant）」細胞と呼ぶ。これらの薬剤は、抗悪性腫瘍薬として使用されるので、「関連」細胞は、それらの抗癌剤発見プログラムで有用である米国国立癌研究所（National Cancer Institute）（ＮＣＩ）／米国国立衛生研究所（National Institutes of Health）（ＮＩＨ）の開発途上治療プログラム（Developmental Therapeutics Program）（ＤＴＰ）によって同定された細胞株の細胞である。現在、ＤＴＰ選別では、６０の種々のヒト腫瘍細胞株が利用されている。そのような細胞株の少なくとも１つについて望ましい活性が示される必要があるであろう。出願人は、患者のバイオプシー又は腫瘍のホモジナイゼーションから生じた細胞を「腫瘍ホモジネート（tumor homogenate）」と呼ぶ。全腫瘍又は腫瘍バイオプシーの抽出については、資格のある医師による標準的な医学技術を通じて行うことができ、組織の単細胞へのホモジナイゼーションについては、技術としてよく知られている多数の方法を用いて実験室で行うことができる。
別の視点において、本発明は、本発明の組成物を投与することによって望ましい標的に対して治療上効果的な量のアントラサイクリン：シチジンアナログ（例えば、ダウノルビシン：シタラビン）組み合わせを送達する方法に関する。
本発明は、第一の送達媒体と安定的に会合したアントラサイクリンと第二の送達媒体と安定的に会合したシチジンアナログとを投与することによって治療上効果的な量のアントラサイクリン：シチジンアナログ（例えば、ダウノルビシン：シタラビン）組み合わせを送達する方法にも関する。第一及び第二の送達媒体は別々の容器に含まれてもよく、それらの容器の内容物は患者に対し同時に又は経時的に投与されてもよい。一つの形態において、前記アントラサイクリン及びシチジンアナログの比（割合）は、非拮抗的である。
本発明の他の形態では、送達媒体を含む組成物を製造する方法であって、前記送達媒体は、非拮抗的なモル比でそれと安定的に会合して少なくとも１つのアントラサイクリン及び１つのシチジンアナログを有するリポソーム及び／又は脂質含有粒子状媒体を含み、前記方法は、
（ａ）生物活性に対する関連細胞培養法、無細胞法又は腫瘍ホモジネート法で、薬剤の前記比が細胞のうち１％を超える細胞に影響を与える前記モル比で維持される濃度範囲の少なくとも５％にわたって非拮抗的である前記アントラサイクリン系薬剤及びシチジンアナログのモル比を決定すること、並びに
（ｂ）前記工程（ａ）で非拮抗的であると決定したモル比のアントラサイクリン系薬剤対シチジンアナログを前記送達媒体を用いてカプセル化すること
を含む方法が提供される。
別の視点において、本発明は、望ましい治療効果を与える、ある比の少なくとも１つのアントラサイクリン及び１つのシチジンアナログを含むリポソームを含む治療組成物を製造する方法に関する。この方法は、少なくとも１つアントラサイクリン及び１つのシチジンアナログのパネル（panel）であって、少なくとも１つ、好ましくは多数の比の前記薬剤を含むパネルを与えること、パネルのメンバーが濃度の範囲にわたって関連細胞培養、無細胞系又は腫瘍ホモジネートに生物学的効果を発揮する能力をテストすること、前記比により濃度の適当な範囲にわたって前記細胞培養、無細胞系又は腫瘍ホモジネートに望ましい治療効果が与えられるパネルのメンバーを選択すること；並びに前記パネルの好結果を示すメンバーによって表される前記比の薬剤を脂質ベースの薬剤送達媒体に安定的に会合させることを含む。好ましい形態において、前記望ましい治療効果は、非拮抗的である。
更に以下に記載されるように、好ましい形態において、前記方法に従って適当な組み合わせをデザインする場合には、非拮抗的な比は、組み合わせ指数（combination index）（ＣＩ）が≦１．１である比として、選択される。更なる形態において、適当なリポソーム製剤は、効果的な量のアントラサイクリン及び：シチジンアナログ組み合わせ（例えば、ダウノルビシン：シタラビン）を安定的に取り込み、かつインビボで両方の薬剤の放出が維持されることが可能となるようにデザインされる。好ましくは、製剤は、ホスファチジルグリセロール等、少なくとも１つの負荷電脂質を含む。
発明を実施するための形態
定義がない限り、本願において使用される全ての技術用語、記号及び他の学術用語又は専門用語は、本発明の属する技術において通常の知識を有する者（当業者）によって一般に理解されているものと同一の意味である。いくつかの場合では、一般に理解されている意味をもつ用語が、明確及び／又は迅速な参照のため、本願において定義されるが、本願におけるそのような定義の挿入を、その技術において一般に理解されていることに対する実質的な相違を表すものと解釈することは、必ずしも当然とは限らない。本願において記載され又は参照される多くの技術及び処置は、当業者により十分理解され、従来の手法を用いて一般に利用される。適宜、市販のキット及び試薬の使用を含む処置が、他に断らない限り製造業者規定のプロトコル及び／又はパラメータに従って一般に行われる。本願において参照した全ての特許、出願、公開された出願及びその他の刊行物は、そっくりそのまま参照により組み込まれる。仮にこのセクションにおいて示した定義が、参照により本願に組み込まれる特許、出願、公開された出願及びその他の刊行物において示されている定義と逆であるか、そうでなくても互いに一致しない場合には、このセクションにおいて示した定義が、参照により本願に組み込まれる定義よりも優先される。
脚注：略語
ＤＳＰＣ：ジステアロイルホスファチジルコリン（distearoylphosphatidylcholine）；
ＰＧ：ホスファチジルグリセロール（phosphatidylglycerol）；
ＤＳＰＧ：ジステアロイルホスファチジルグリセロール（distearoylphosphatidylglycerol）；
ＰＩ：ホスファチジルイノシトール（phosphatidylinositol）；
ＳＭ：スフィンゴミエリン（sphingomyelin）；
Ｃｈｏｌ又はＣＨ：コレステロール（cholesterol）；
ＣＨＥ：コレステリルヘキサデシルエーテル（cholesteryl hexadecyl ether）；
ＳＵＶ：小型単層小胞体（small unilamellar vesicle）；
ＬＵＶ：大型単層小胞体（large unilamellar vesicle）；
ＭＬＶ：多層膜小胞体（multilamellar vesicle）；
ＭＴＴ：３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニル−２Ｈ テトラゾリウムブロマイド（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-2H tetrazolium bromide）；
ＥＤＴＡ：エチレンジアミン四酢酸（ethylenediaminetetraacetic acid）；
ＨＥＰＥＳ：Ｎ−［ヒドロキシエチル］−ピペラジン−Ｎ−［２−エタンスルホン酸］（N-[hydroxylethyl]-pyperazine-N-[2-ethanesulfonic acid]）；
ＨＢＳ：ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水（HEPES buffered saline）（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）；
ＳＨＥ：３００ｍＭ スクロース（sucrose）、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、３０ｍＭ ＥＤＴＡ；
ＴＥＡ：トリエタノールアミン（triethanolamine）；
ＣＩ：組み合わせ指数（combination index）；
ｆａ：影響された画分（fraction affected）。
本発明は、少なくとも１つのアントラサイクリン系抗生物質（例えば、ダウノルビシン）及び１つのシチジンアナログ剤（例えば、シタラビン）と安定的に会合したリポソームを含む組成物であって、前記アントラサイクリン系抗生物質及び前記シチジンアナログ剤は、関連細胞又は腫瘍ホモジネートに対して望ましい細胞毒性効果、細胞増殖抑制効果又は生物学的効果を発揮するアントラサイクリン系抗生物質：シチジンアナログ剤（例えば、ダウノルビシン：シタラビン）モル比で存在する組成物を提供する。
好ましくは、本願において提供されるリポソーム組成物は、少なくとも１つのアントラサイクリン及び１つのシチジンアナログと安定的に会合したリポソームを、関連細胞又は腫瘍ホモジネートに対して非拮抗的な効果を発揮する前記アントラサイクリン：シチジンアナログのモル比で含むであろう。
本発明の更なる形態において、前記記載した脂質ベースの送達媒体は、第三又は第四の薬剤を含む。何れの治療薬、診断薬又は化粧用薬を含んでもよい。
本発明の一つの視点において、ホスファチジルコリン、好ましくはジステアロイルホスファチジルコリンを含むリポソームが提供される。本発明の別の視点において、ステロールを含むリポソームが提供される。好ましくは、前記ステロールは、コレステロールである。
本発明の脂質ベースの送達媒体を、非経口投与だけでなく局所送達、経鼻送達、皮下送達、腹腔内送達、筋肉内送達、噴霧送達又は経口送達で、或いは治療目的若しくは医用画像（medical imaging）等のために標的部位に又はその近傍に、天然又は合成の移植可能な手段へ又はその中へ送達媒体を適用することによって使用してもよい。本発明の脂質ベースの送達媒体は、好ましくは非経口投与で、最も好ましくは静脈投与で使用される。
本願において記載した好ましい形態は、網羅されること又は本発明の範囲を開示された詳細な形態に限定することを意図したものではない。それらの記載は、本発明の原理並びにその応用及び実際の使用を、当業者がその技術を完全に理解できるように、最良に説明するために選択、かつ記載されたものである。
シチジンアナログ
代謝拮抗物質又は、より詳しくは、シタラビン、５−アザシチジン、及びゲムシタビン（２’，２’−ジフルオロデオキシシチジン（2',2'-Difluorodeoxycytidine））等のシチジンアナログは、公知の抗悪性腫瘍薬である。シチジンアナログは、その技術においてシトシンヌクレオシドアナログ（cytosine nucleoside analogs）と呼ばれることもある。代謝拮抗物質は、細胞における正常な生化学反応に関与する天然の化学物質（natural chemical）とよく似ているが、細胞の正常な分裂及び機能を妨げるほど異なる化合物である。これらの化合物は、一般に正常な代謝プロセスを阻害する。
シタラビンは、ピリミジンヌクレオシド代謝拮抗物質である。この化合物は、糖の３’−ヒドロキシルに対してトランスの位置に２’−ヒドロキシルをもつ２’−デオキシシチジンのアナログである。シタラビンは、４−アミノ−１−β−ｄ−アラビノフラノシル−２（１Ｈ）−ピリミジノン（4-Amino-1-β-d-arabinofuranosyl-2(1H)-pyrimidinone）、１−β−ｄ−アラビノフラノシルシトシン（1-β-d-arabinofuranosylcytosine）、Ａｒａ−Ｃ、β−シトシンアラビノシド（β-cytosine arabinoside）、アラシチジン（aracytidine）、ＣＨＸ−３３１１、Ｕ−１９９２０、Ａｌｅｘａｎ、Ａｒａｂｉｔｉｎ、Ａｒａｃｙｔｉｎｅ、Ｃｙｔａｒｂｅｌ、Ｃｙｔｏｓａｒ、Ｅｒｐａｌｆａ、Ｉｒｅｔａｎ及びＵｄｉｃｉｌと同等と考えられる。シタラビン等のシチジンアナログにおいて、糖成分は、リボースではなくアラビノースを含む。シタラビンは、急性骨髄球性白血病（acute myelocytic leukemia）（ＡＭＬ）の治療において有用であると認められ、この疾患の寛解において有効であることが分かっている。しかしながら、シタラビンの作用メカニズムは未確認であるが、それにもかかわらずこのヌクレオチドのＤＮＡへの取り込みによって、ストランド合成の終結による重合の阻害が引き起こされる。
シタラビンは、ストランド合成を終結させるため、５−モノリン酸 ヌクレオチド（5-monophosphate nucleotide）（ＡｒａＣＭＰ）の転換を介して「活性化（activated）」されなければならない。ＡｒａＣＭＰは、その後選択されたヌクレオチドキナーゼと反応して二リン酸（diphosphate）及び三リン酸ヌクレオチド（triphosphate）（ＡｒａＣＤＰ及びＡｒａＣＴＰ））を形成することが可能である。ＤＮＡへのシタラビン取り込みは、Ｓ期特異性であり、それゆえ、ＤＮＡ合成の阻害をもたらすように少なくとも１つの完全細胞周期にわたる投薬が、提唱されている。ＤＮＡ合成の阻害は低いＡｒａＣＴＰ濃度で発生し、ＤＮＡ鎖伸長はＡｒａＣの成長ＤＮＡ鎖の末端部分への取り込みによって阻害される。更に、鎖中に取り込まれるＡｒａＣの量とＤＮＡ合成の阻害との間には相関性があると思われる。
患者においては、シタラビンに対する耐性が生じうる。そのような耐性は、一般にＡｒａＣＭＰを生成するデオキシシチジンキナーゼの欠乏による。更に、シチジンデアミナーゼ（ＡｒａＣを脱アミノ化して無毒性のアラウリジン（arauridine）にするもの）及びｄＣＭＰ（ＡｒａＣＭＰを不活性ＡｒａＵＭＰに転換するもの）等の分解酵素も有効性に影響を及ぼす。
シタラビンの欠点は、その毒性である。この化合物は、著しい巨赤芽球性の変化を伴う重篤な白血球減少症、血小板減少症及び貧血症を引き起こす能力がある強力な骨髄抑制剤（myleosuppressive agent）である。より高い用量で投与されるときには、胃腸障害、発熱、結膜炎、肺臓炎、肝機能不全、皮膚炎、及び神経毒性の副作用も一般に確認されている。
５−アザシチジン（アザシチジン（Azacytidine）；５−ＡｚａＣ）は、抗悪性腫瘍活性を示す化合物である。この化合物は、ＡＭＬ、急性リンパ性白血病及び骨髄異形性症候群（myelodysplastic syndrome）の治療にとって有用であるとして知られている。現在の研究では、この化合物のβサラセミア（beta thalassemia）、急性骨髄性白血病、骨髄異形性症候群、進行型又は転移性固形腫瘍、非ホジキンリンパ腫（non-Hodgkin's lymphoma）、多発性骨髄腫（multiple myeloma）、非小細胞型肺癌（non-small cell lung cancer）及び前立腺癌における効果が評価されている。５−ＡｚａＣは、遺伝子の発現に次々に影響を及ぼすＤＮＡメチル化を阻害することが示されている。他の作用の中で、副作用として、白血球及び赤血球並びに血小板数の減少、悪心、嘔吐、疲労、下痢が挙げられる。
ゲムシタビンは、抗腫瘍活性を示すヌクレオシドアナログである。ゲムシタビン ＨＣｌは、２’−デオキシ−２’，２’−ジフルオロシチジン モノ塩酸塩（2'-deoxy-2',2'-difluorocytidine monohydrochloride）（β−異性体）からなり、膵癌及び肺癌を治療することにおいて効果的であるとして知られている。一般的には、ゲムシタビンは、核酸の合成を妨げることによって、ＤＮＡ及びＲＮＡの産生を防止する。この作用は、癌細胞の増殖を停止させて、その細胞を死に至らしめる。他の作用の中で、副作用として、白血球及び赤血球並びに血小板数の減少、悪心、嘔吐、疲労、下痢、インフルエンザ様症状、発疹が挙げられる。
アントラサイクリン系抗生物質
ダウノルビシン及びドキソルビシン並びにそれらの誘導体等のアントラサイクリン系抗生物質は、真菌ストレプトミセス・ペウセティウス（Streptomyces peucetius）によって産生される公知の抗悪性腫瘍薬を含む。イダルビシン（４−デメトキシダウノルビシン（4-demethoxydaunorubicin））は、アグリコン環のＣ４にメトキシ基をもたないダウノルビシンの合成誘導体を含む。これらの化合物は、ＤＮＡにインターカレートして、ＤＮＡ及びＲＮＡ合成を含むＤＮＡの各種機能に影響を及ぼす。ＤＮＡとの相互作用により、一般に一本鎖及び／又は二本鎖切断並びに姉妹染色分体交換が生ずる。ダウノルビシン（塩酸ダウノルビシン）の一つの特定の医薬品形態が、核酸合成を妨げない投与量で細胞分裂を防ぐことが示されている。ＤＮＡが切断されるメカニズムは十分に理解されていないが、トポイソメラーゼＩＩの作用によって又はフリーラジカルの生成によって媒介されると信じられている。更に、アントラサイクリンは、細胞膜と相互に作用し、それらの機能を変化させて抗腫瘍作用心毒性における役割を果たす可能性があるることも知られている。
ダウノルビシン（ダウノマイシン、ルビドマイシン（rubidomycin）、ｌｅｕｋａｅｍｏｍｙｃｉｎ Ｃ、ＲＰ−１３０５７、ＣＥＲＵＢＩＤＩＮＥ（登録商標））は、急性リンパ性白血病、急性顆粒球性白血病、急性骨髄球性白血病、急性期の慢性骨髄球性白血病、及び急性非リンパ性白血病の治療において有用であるとして知られている。更に、この化合物には、固形腫瘍において及びリンパ腫に対して何らかの活性があることが示されている。ダウノルビシンは、四環系のアグリコン−ダウノマイシノンによって形成されるグリコシドであり、アミノ糖−ダウノサミン（daunosamine）である。ダウノルビシンの経口吸収は低く、静脈投与されることが最も多い。ダウノルビシンの半減期は４５分であり、１９時間で消失する。ダウノルビシンは、より小さい活性型、ダウノルビシノールへの転換を経由して消失する。ダウノルビシン及びその誘導体は、骨髄機能低下（bone marrow depression）、口内炎、脱毛症、胃腸障害（gastrointestinal disturbances）、心律動異常（cardiac dysrhythmias）、肺水腫等の一定の毒性を有する。これらの組成物の最も広く認識されている欠点は、直ちに重篤な状態にする急性又は慢性型の心筋症の可能性である。特に、心毒性が、それ自体、治療を行っている患者の１５〜４０％においてうっ血性心不全として発現する。一般に、そのような副作用は利用される投与量によるが、その発現はより高い投与量で増加する。しかしながら、デクスラゾキサン（dexrazoxane）（ＡＤＲ−５２９）又はアミフォスチン（amifostine）（ＷＲ−２７２１又はＷＰ−１０６５）の併用投与はこれらの組成物によって生ずる心臓損傷を減少させるであろうということが認識されている。更に、アントラサイクリン療法の間の心臓損傷をジピリドキシル（dipyridoxyl）及びアミノポリカルボキシル酸（aminopolycarboxylic acid）ベースのキレート薬、及びそれらの金属キレート等の鉄キレート剤の同時投与により減少させることができることを示唆する証拠がある。米国特許第６，１４７，０９４号を参照されたい。
ドキソルビシン（アドリアマイシン、ルブレックス（rubrex）、１２−ナフタセンジオン（12-naphthacenedione）、１４−ヒドロキシダウノマイシン（14-hydroxydaunomycin）、ＮＳＣ−１２３１２７）は、８位に、ダウノルビシンにおけるアセチル基の代わりにヒドロキシアセチル基を有することにおいてのみダウノルビシンと相違する。ドキソルビシンが、急性白血病、悪性リンパ腫及び乳癌腫等の任意の固形腫瘍の治療において有効であることが示されている。この組成物は、ホジキン病及び非ホジキンリンパ腫の治療において、シクロホスファミド、ビンクリスチン及びプロカルバジンと共に利用されている。肉腫、プラズマ細胞骨髄腫、転移性甲状腺癌（metastatic thyroid carcinoma）、胃癌（gastric carcinoma）、気管支原性癌（broncheogenic carcinoma）、移行上皮癌、並びに卵巣、子宮内膜、甲状腺、精巣及び頚部の癌に対する更なる治療的利用が、示されている。ドキソルビシンの毒性は上述したダウノルビシンと同様である。エピルビシン（４’−エピドキソルビシン（4'-epidoxorubicin））、モルフォリノ誘導体（morpholino derivatives）及び同類のアントラセンジオンミトキサントロン（anthracenedione mitoxantrone）等のドキソルビシンのアナログでは、臨床活性が高く、心毒性（cardiac toxicity）が少ないことが知られている。
インビトロでの非拮抗的なダウノルビシン：シタラビン比の決定
本発明の更なる視点において、アントラサイクリン系薬剤及びシチジンアナログは、相乗的又は相加的（即ち、非拮抗的）な比（割合）でリポソームでカプセル化されるであろう。相乗的又は相加的な併用（組み合わせ）効果を示す薬剤の比の決定は、以下に記載した実験データのタイプに基づき、各種アルゴリズムを用いて行われる。これらの方法には、アイソボログラム法（Loewe, et al., Arzneim-Forsch (1953) 3: 258-290；Steel, et al., Int. J. Radiol. Oncol. Biol. Phys. (1979) 5: 27-55）、分画産物法（fractional product method）（ウェブ、酵素及び代謝阻害剤（Enzyme and Metabolic Inhibitors）（１９６３）第１巻、ｐｐ．１−５、ニューヨーク：アカデミック出版（Academic Press））、モンテカルロシミュレーション法、ＣｏｍｂｉＴｏｏｌ、ＣｏｍｂｏＳｔａｔ及びChou, J. Theor. Biol. (1976) 39: 253-276；及びChou, Mol. Pharmacol. (1974) 10:235-247に記載された方程式に基づくＣｈｏｕ−Ｔａｌａｌａｙ Ｍｅｄｉａｎ Ｅｆｆｅｃｔ法（Chou-Talalay median-effect method）が含まれる。代替法には、生存画分（surviving fraction）（Zoli, et al., Int. J. Cancer (1999) 80: 413-416）、コントロールと比較した顆粒球／マクロファージ−コロニー形成単位に対する応答率（Pannacciulli, et al., Anticancer Res. (1999) 19: 409-412）、及びその他のもの（Berenbaum, Pharmacol. Rev. (1989) 41: 93-141；Greco, et al., Pharmacol. Rev. (1995) 47: 331-385）が含まれる。
Ｃｈｏｕ−Ｔａｌａｌａｙ Ｍｅｄｉａｎ Ｅｆｆｅｃｔ法が好ましい。分析は、特定の効果、ｆａをもたらす投与量が以下の式により与えられる方程式を利用する：
Ｄ＝Ｄｍ[ｆａ／(１−ｆａ)]１／ｍ
ここで、Ｄは使用した薬剤の投与量であり、ｆａはその投与量によって影響された細胞の画分であり、Ｄｍは効力を示す５０％有効量（dose for median effect）であり、ｍは投与量−効果曲線の形を表す係数である（ｍは一次反応について１である）。
この方程式を更に処理して、Chou及びTalalay, Adv. Enzyme Reg. (1984) 22: 27-55；並びにChouら、化学療法における相乗作用及び拮抗作用（Synergism and Antagonism in Chemotherapy）、Chou及びRideout編、アカデミック出版：ニューヨーク １９９１：２２３−２４４に記載されている多剤効果方程式（multiple drug effect equation）に基づいて組み合わせ指数（combination index）（ＣＩ）を計算することができる。この計算のためのコンピュータプログラム（ＣａｌｃｕＳｙｎ）がＣｈｏｕ及びＣｈｏｕ（「マイクロコンピュータを用いた投与量−効果分析：ＥＤ５０、ＬＤ５０、相乗作用、拮抗作用、低用量リスク、レセプター リガンド結合性及び酵素反応速度論の定量化（Dose-effect analysis with microcomputers: ED50, LD50, synergism, antagonism, low-dose risk, receptor ligand binding and enzyme kinetics）」：ＣａｌｃｕＳｙｎマニュアル及びソフトウェア；ケンブリッジ：バイオソフト（Biosoft） １９８７）に見られる。
組み合わせ指数方程式は、酵素反応速度モデル（enzyme kinetic models）から誘導されたＣｈｏｕ−Ｔａｌａｌａｙの多剤−効果方程式に基づく。方程式により、相乗作用及び拮抗作用ではなく相加作用のみが求められる。しかしながら、ＣａｌｃｕＳｙｎプログラムによれば、相乗作用は期待された相加作用を超えるものと定義され、拮抗作用は相加作用を下回るものと定義される。以前にＣｈｏｕとＴａｌａｌａｙは、ＣＩ＝１を相加作用としたが、それに従って、二つの薬剤の多剤効果方程式から、作用につき同一又は類似の形態を有する相互排他的な薬剤について下記式が得られる：
ＣＩ＝(Ｄ)１／(Ｄｘ)１＋(Ｄ)２／(Ｄｘ)２ ［式１］
更に、作用につき全く無関係の形態を有する相互非排他的な薬剤について下記式が提案される：
ＣＩ＝(Ｄ)１／(Ｄｘ)１＋(Ｄ)２／(Ｄｘ)２＋((Ｄ)１(Ｄ)２)／(Ｄｘ)１(Ｄｘ)２ ［式２］
ＣＩ＜１、＝１、及び＞１は、それぞれ相乗作用、相加作用、及び拮抗作用を示す。式１又は式２では、組み合わせにおける（分子の）薬剤１、(Ｄ)１、及び薬剤２、(Ｄ)２、が実際の実験においてｘ％を阻害すると規定される。したがって、実験的に観察されるｘ％阻害は丸めた数でなくてもよく、最も多くは少数を有する。式１及び２の（分母の）(Ｄｘ)１及び(Ｄｘ)２は、それぞれｘ％を阻害する薬剤１及び薬剤２単独の投与量である。
簡単にするため、二を超える薬剤が組み合わせに含まれるとき、多くの場合、相互排他性と仮定する（ＣａｌｃｕＳｙｎマニュアル及びアオフトウェア；ケンブリッジ：バイオソフト １９８７）。
更に二つの薬剤組み合わせを単一の製薬単位として用いて第三の薬剤との相乗的な又は相加的な相互作用を測定してもよい。更に、三つの薬剤組み合わせを一つの単位として用いて第四の薬剤との非拮抗的な相互作用を測定する等してもよい。
基礎をなす実験データは、培養細胞又は無細胞系を用いてインビトロで一般に測定される。好ましくは、組み合わせ指数（ＣＩ）は、前記説明したように、濃度範囲の代理パラメータである図１Ａ及び１Ｂに示されるような影響された細胞の画分（ｆａ）の関数としてプロットされる。好ましい薬剤の組み合わせは、ｆａ値のかなりの範囲にわたって相乗作用及び相加作用を示すものである。薬剤の組み合わせは、細胞のうち１％を超える細胞に影響を与える、即ちｆａ範囲が０．０１を超える濃度範囲のうち少なくとも５％にわたって非拮抗的であれば、選択される。好ましくは、全体の濃度のうちより高い部分において、好適なＣＩが示される；例えば、０．２〜１．０のｆａ範囲で５％である。より好ましくは、この範囲で１０％が好適なＣＩを示す。組成物において、更に好ましくはこのｆａ範囲で２０％、更に好ましくは５０％以上、最も好ましくは０．２〜１．０のｆａ範囲で少なくとも７０％が利用される。ｆａ値のかなりの範囲にわたって相乗作用を示す組み合わせを種々の薬剤の比で再評価して、非拮抗的な相互作用の強度を高め、かつ相乗作用が認められるｆａの範囲を拡大させる最適な比を規定してもよい。
細胞が影響される濃度の全範囲にわたって相乗作用を有することが好ましいであろうが、多くの場合、実施例１において詳述したＭＴＴ法等の分光光度法を用いたときに０．２〜０．８のｆａ範囲において結果が非常に信頼できることが分かっている。したがって、本発明の組成物によって発揮される相乗作用は０．０１以上の広い範囲内に存在することが示されるが、０．２〜０．８のｆａ範囲において相乗作用が発揮されることが好ましい。しかしながら、例えば、生物発光（バイオルミネッセンス）又はクローン原性法（clonogenecity assays）等、その他感受性がより高い方法を用いて、０．８を超えるｆａ値で相乗作用を評価することができる
最適な組み合わせ比を単一の製薬単位として更に用いて第三の薬剤との相乗的な又は相加的な相互作用を測定してもよい。更に、三つの薬剤組み合わせを一つの単位として用いて第四の薬剤との非拮抗的な相互作用を測定する等してもよい。
前述したように、細胞培養のインビトロ研究は「関連」細胞について行われるであろう。細胞の選択は、薬剤の治療用途に依存するであろう。本発明の範囲に含まれる組成物の基礎を与えるために、ただ一つの関連細胞株又は細胞培養型が、要求された非拮抗作用を発揮しさえすればよい。
例えば、本発明の一つの好ましい形態において、薬剤の前記組成物は、抗癌療法用である。よくある形態において、薬剤の前記組成物は、白血病又はリンパ腫治療用である。その後、テストされるべき細胞及びテストの性質について適当な選択がなされるであろう。特に、腫瘍細胞株が適当な対象であり、細胞死又は細胞静止の測定が適当な指標である。更に以下に議論するように、他の徴候にとって適当である非拮抗的な組み合わせを見出すことを試みることに関しては、他の標的細胞及び細胞毒性又は細胞静止以外の判定基準を用いることができる。
抗腫瘍剤等の判定のため、細胞株を、正常細胞株の貯蔵所から（例えば、ＮＣＩ又はＡＴＣＣ）、学術機関又は民間財源のものを含むその他の団体から入手してもよい。好ましい細胞株には、ＮＣＩ／ＮＩＨの開発途上治療プログラム（Developmental Therapeutics Program）によって同定された細胞株から選択される１以上のものが含まれるであろう。このプログラムによる腫瘍細胞株の選別によって、現在、白血病、メラノーマ、並びに肺、大腸、脳、卵巣、乳房、前立腺及び腎臓の癌の典型を示す６０の種々の腫瘍細胞株が同定されている。望ましい濃度範囲にわたって要求される非拮抗作用は、単細胞型についてさえ示されればよい；しかしながら、この作用は、少なくとも二つの細胞株について示されることが好ましく、より好ましくは、三つの細胞株、より好ましくは五つの細胞株、更に好ましくは十の細胞株について示される。前記細胞株は、樹立腫瘍細胞系（established tumor cell line）又は患者サンプルから得られた初代培養であってもよい。細胞株は如何なる種のものでもよいが、好ましいソースは哺乳類、特にヒトであろう。細胞株を、各種実験室の条件の下選別によって及び／又は外来性遺伝子材料の付加若しくは除去によって遺伝的に変化させてもよい。細胞株は、ウイルス又はプラスミドベースの形質移入法を含むがこれに限定されない任意の遺伝子導入技術によって形質移入されてもよい。修飾には、特定のタンパク質又はペプチドの発現をコードするｃＤＮＡ、プロモーター又はエンハンサーシーケンス等の制御因子（regulatory element）或いはアンチセンスＤＮＡ又はＲＮＡの導入が含まれうる。遺伝子操作された組織培養株には、腫瘍抑制遺伝子、即ちｐ５３、ｐＴＥＮ及びｐ１６等の遺伝子を含む及び含まない系統；並びにドミナントネガティブ法（dominant negative methods）、遺伝子挿入（インターカレーション）法（gene insertion methods）及びその他の選定法の使用により作成された系統が含まれうる。細胞生存度を定量化する、例えば抗腫瘍剤をテストするために使用されうる組織培養細胞株として、好ましくは、Ｐ３８８、Ｌ１２１０、ＨＬ−６０、ＭＯＬＴ−４、ＫＢＭ−３、ＷｅＨｉ−３、Ｈ４６０、ＭＣＦ−７、ＳＦ−２６８、ＨＴ２９、ＨＣＴ−１１６、ＬＳ１８０、Ｂ１６−Ｆ１０、Ａ５４９、Ｃａｐａｎ−１、ＣＡＯＶ−３、ＩＧＲＯＶ１、ＰＣ−３、ＭＸ−１及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１が挙げられるが、これらに限定されない。
一つの好ましい形態において、与えられた効果（ｆａ）は、細胞障害剤の細胞培養への適用後の細胞死又は細胞静止を意味する。細胞死又は生存度を、例えば、下記方法を用いて測定してもよい：

Figure 2007533670
二以上の薬剤の非拮抗的な比を、癌以外の疾患徴候について決定することができ、この知見を使用して、これらの疾患を治療するための二以上の薬剤の治療用製剤を製造することができる。インビトロアッセイに関しては、多くの測定可能な指標を、これらの指標が特定の疾患に対して治療上関連性があるという前提で、薬剤相乗作用を規定するものから選択することができる。
前述したように、細胞培養のインビトロ研究は、「関連」細胞について行われるであろう。細胞の選択は、薬剤の治療用途に依存するであろう。個々の患者のバイオプシー又は全腫瘍のインビトロ研究を、腫瘍サンプル（又は複数の腫瘍サンプル）の単細胞へのホモジナイゼーションから生じた「腫瘍ホモジネート（tumor homogenate）」について行うことができる。
一つの好ましい形態において、与えられた効果（ｆａ）は、細胞障害剤の「関連」細胞培養又は「腫瘍ホモジネート」への適用後の細胞死又は細胞静止を意味する（実施例１参照）。細胞死又は生存度を、多数の技術として公知の方法を用いて測定してもよい。
脂質ベースの送達媒体の調製
本発明において使用される好ましい脂質担体は、リポソームである。リポソームについては、リポソーム：合理的な設計（Liposomes; Rational Design）（Ａ．Ｓ．Ｊａｎｏｆｆ編、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ社、ニューヨーク、ＮＹ）に記載されているように又はその技術において知識を有する者に知られているその他の技術によって製造することができる。本発明において使用される適当なリポソームには、大型単層小胞体（large unilamellar vesicles）（ＬＵＶｓ）、多層膜小胞体（multilamellar vesicles）（ＭＬＶｓ）、小型単層小胞体（small unilamellar vesicles）（ＳＵＶｓ）及び嵌合融合リポソーム（interdigitating fusion liposomes）が含まれる。
本発明において使用されるリポソームは、ジステアリルホスファチジルコリン等のホスファチジルコリン脂質を含むように製造されてもよい。本発明のリポソームはまた、コレステロール等のステロールを含んでもよい。リポソームはまた、治療用脂質を含んでもよく、そのような脂質の例として、エーテル脂質、ホスファチジン酸、ホスホネート、セラミド及びセラミドアナログ、スフィンゴシン及びスフィンゴシンアナログ並びにセリン含有脂質が挙げられる。
リポソームを、ポリエチレングリコール−ＤＳＰＥ等の表面安定化親水性ポリマー−脂質複合物（surface stabilizing hydrophilic polymer-lipid conjugates）を用いて製造して、循環寿命（circulation longevity）を増大させてもよい。同様にホスファチジルグリセロール（phosphatidylglycerol）（ＰＧ）及びホスファチジルイノシトール（phosphatidylinositol）（ＰＩ）等の負荷電脂質の取り込みをリポソーム製剤に追加して、担体の循環寿命を増大させてもよい。これらの脂質は、親水性ポリマー−脂質複合物を交換するため、表面安定化剤として用いられうる。本発明の好ましい形態では、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）又はホスファチジルイノシトール（ＰＩ）を含むリポソームを使用して凝集を防止し、それによって担体の血中滞留時間（blood residence time）を増大させてもよい。
一つの形態において、本発明によるリポソーム組成物は、好ましくは癌を治療するために使用される。カプセル化した薬剤の腫瘍部位への送達は、本発明のリポソームの投与によって行われる。好ましくは、リポソームは３００ｎｍ未満の直径を有する。最も好ましくは、リポソームは２００ｎｍ未満の直径を有する。腫瘍脈管構造は、一般に、内皮における開窓又は間隙により正常な脈管構造よりも漏出性である。これにより、直径２００ｎｍ未満の送達媒体は、不連続内皮細胞層、及びその下にある、腫瘍に血液を供給する血管周囲の基底膜を透過する。血管外遊走後の送達媒体の腫瘍部位への局所的な蓄積により、抗癌剤送達及び治療効果が増大する。
各種方法を利用して、活性剤（active agents）をリポソームでカプセル化（活性剤をリポソームに内封）してもよい。「カプセル化（encapsulation）」には、薬剤の脂質ベースの送達媒体との共有結合又は非共有結合が含まれる。例えば、これを、薬剤のリポソームの外層又は複数の外層との相互作用或いはリポソーム内での薬剤の捕捉によるものとすることができ、そのときリポソームの異なる部分間で平衡状態に達する。したがって、薬剤のカプセル化を、脂質成分との共有結合的又は非共有結合的な相互作用或いはリポソームの水性内部における捕捉を介したリポソームの二分子膜との相互作用による薬剤の会合によるものとし、或いは内部水相と二分子膜との間で平衡状態にあるものとすることができる。「負荷（Loading）」は、１以上の薬剤を送達媒体でカプセル化する行為をいう。
望ましい組み合わせのカプセル化を、別々の送達媒体で又は同一の送達媒体でカプセル化することにより行うことができる。別々のリポソームでのカプセル化を望む場合には、連係して作用する薬物動態（coordinated pharmacokinetics）を見越して、各リポソームの脂質組成物を、全く異なるものとしてもよい。媒体組成物を変更することによって、カプセル化した薬物の放出率を、望ましい比の薬剤が腫瘍部位に送達されるように、合わせることができる。放出率を変更する手段には、脂質を形成する小胞体（vesicle）のアシル鎖長を増加させて薬剤保持時間を改善すること、リポソーム膜外でＰＥＧ等の表面グラフトした親水性ポリマーの交換を調節すること並びにステロール類又はスフィンゴミエリン等の膜硬化剤（membrane-rigidifying agents）を膜に組み込むことが含まれる。仮に第一及び第二の薬剤が特定の薬剤比で投与されることが望ましい場合及び第二の薬剤について第一の薬剤のリポソーム組成物（ＤＭＰＣ／Ｃｈｏｌ）内部での保持が不十分である場合には、第二の薬剤を、アシル鎖張を増大させた脂質を含むリポソーム組成物でカプセル化することによって、その薬物動態が改善されうることは当業者に明瞭であろう。別々のリポソームでカプセル化したとき、最適な治療活性を与えるよう患者別基準に応じて決定されているアントラサイクリン系薬剤対シチジンアナログの比が、投与前に適正量の各リポソームカプセル化剤を組み合わせることによって、個々の患者に対してもたらされうることが容易に認められるべきである。これに代えて、二以上の薬剤を同一のリポソームでカプセル化してもよい。
カプセル化技術は、送達媒体の性質に左右される。例えば、治療剤を、受動的な負荷方法及び能動的な負荷方法の両方を用いて、リポソーム中に負荷してもよい。活性剤をリポソームでカプセル化する受動的な方法には、リポソームの製造中に薬剤をカプセル化することが含まれる。これには、Ｂａｎｇｈａｍらによって記載された受動捕捉法（passive entrapment method）（J. Mol. Biol. (1965) 12: 238）が含まれる。この技術により、放出（extrusion）のすぐ後に大型単層小胞体（ＬＵＶｓ）又は小型単層小胞体（ＳＵＶｓ）に転換されうる多層膜小胞体（ＭＬＶｓ）の形成が結果として生ずる。受動カプセル化の別の適当な方法として、Ｄｅａｍｅｒ及びＢａｎｇｈａｍによって記載されたエーテル注入技術（Biochim. Biophys. Acta (1976) 443: 629）並びにＳｚｏｋａ及びＲａｐｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓによって記載された逆相蒸発（Reverse Phase Evaporation）技術（P.N.A.S. (1978) 75: 4194）が挙げられる。更に、受動的なカプセル化の別の適当な方法として、リポソームの形成後の受動的平衡（passive equilibration）が挙げられる。このプロセスには、条件変化（altered condition）の下で又は非周囲（non-ambient）（温度、圧力等に基づく）条件下で予備形成したリポソームをインキュベートすること並びに治療薬（例えば、シチジンアナログ又はアントラサイクリン系薬剤）をリポソームの外部に加えることが含まれる。その治療薬により、その後、リポソーム膜全体にわたって、リポソーム内部が平衡に達する。リポソームはその後周囲条件に戻され、カプセル化しなかった治療薬が存在する場合には、これが透析法又は別の適当な方法により除去される。
カプセル化の能動的な方法には、米国特許第５，６１６，３４１号、第５，７３６，１５５号及び５，７８５，９８７号に記載されたｐＨ勾配負荷技術（pH gradient loading technique）並びに能動金属負荷（active metal-loading）が含まれる。ｐＨ勾配負荷の一つの方法は、ｐＨ４．０の内部バッファとしてクエン酸及び中性の外部バッファを利用するクエン酸塩基負荷法（citrate-base loading method）である。リポソーム全体にわたってｐＨ勾配を確立し、且つ維持するために用いられる他の方法には、リポソーム膜に挿入することができプロトンと引き換えに膜全体にわたってイオンを輸送することができるイオノフォアの使用が含まれる（米国特許第５，８３７，２８２号参照）。イオノフォアの非存在下、複合体形成を介してリポソームに薬剤を取り込ませるために遷移金属を利用する最近の好ましい技術を使用してもよい。この技術は、薬剤を取り込ませるようｐＨ勾配を確立するのではなく薬剤−金属複合体を形成することによる。
捕捉の受動及び能動法を、１を超えるカプセル化剤を含むリポソーム製剤の製造のため、組み合わせてもよい。
本発明の組成物の生体内（インビボ）投与
前述したように、本発明の送達媒体組成物を、ヒト等の温血動物並びに家禽（domestic avian）種に投与してもよい。ヒトの病気の治療のため、資格のある医師は、確立されたプロトコルを用いて本発明の組成物が投与量、スケジュール及び投与経路に関してどのように利用されるべきか判断するであろう。本発明の送達媒体組成物でカプセル化した薬剤において対象（患者）の健常な組織に対する毒性が緩和されている場合には、そのような投与において、投与量の段階的増大が利用されてもよい。
本発明の医薬組成物は、好ましくは非経口投与、即ち動脈投与、静脈投与、腹腔投与、皮下投与、又は筋肉投与される。より好ましくは、本発明の医薬組成物は、大量瞬時投与（bolus）又は輸液注入（infusional injection）によって静脈投与又は腹腔投与される。例えば、参照により組み込まれるＲａｈｍａｎら、米国特許第３，９９３，７５４号；Ｓｅａｒｓ、米国特許第４，１４５，４１０号；Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓら、米国特許第４，２３５，８７１号；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ、米国特許第４，２２４，１７９号；Ｌｅｎｋら、米国特許第４，５２２，８０３号；及びＦｏｕｎｔａｉｎら、米国特許第４，５８８，５７８号を参照されたい。
他の方法では、本発明の医薬又は化粧用製剤を、標的組織に製剤を直接投与することによって、当該組織と接触させることができる。そのような投与は、局所的な、「開放（open）」又は「閉鎖（closed）」処置によってなされてもよい。「局所的（topical）」とは、多剤製剤（multi-drug preparation）の皮膚、中咽頭、及び外耳道等、環境にさらされた組織への直接投与を意味する。「開放」処置は、患者の皮膚を切開すること並びに医薬製剤が投与される皮下にある組織を直接目で見えるようにすることを含む処置である。これは、一般に、肺に到達するための開胸術、腹部内臓に到達するための開腹術（abdominal laparotomy）又はその他の標的組織への直接的な外科的アプローチ等の外科的な処置によって行われる。「閉鎖」処置は、内部標的組織を直接目で見えるようにしないが、皮膚の小さな傷を通して器具を挿入することによりこれに到達させる観血的な処置である。例えば、製剤を針洗浄（needle lavage）よって腹膜に投与してもよい。これに代えて、製剤を内視鏡装置により投与してもよい。
本発明の送達媒体を含む医薬組成物は、標準技術に従って製造され、また、アルブミン、リポタンパク質、及びグロブリン等の安定性を高めるための糖タンパク質を含め、水、緩衝水（buffered water）、０．９％生理食塩水、０．３％グリシン、５％デキストロース、及び等浸透圧性スクロース液等を含んでもよい。これらの組成物を、従来公知の滅菌技術によって滅菌してもよい。結果として生じた水溶液を、使用のため包装し又は無菌条件下で濾過し、凍結乾燥してもよく、その凍結乾燥した製剤を投与前に滅菌した水溶液と混合してもよい。前記組成物は、例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、及び塩化カルシウム等、ｐＨ調整剤及び緩衝剤、並びに張度調整剤（tonicity adjusting agents）等の医薬的に許容し得る補助物質を、適当な生理条件のために必要に応じて、含んでもよい。更に、送達媒体懸濁液は、貯蔵におけるフリーラジカル及び脂質過酸化損傷に対抗して脂質を保護する脂質保護剤を含んでもよい。αトコフェロール及びフェロキサミン等の水溶性鉄特異性キレート剤（water-soluble iron-specific chelators）等の親油性フリーラジカル失活剤が適している。
送達媒体の医薬製剤中の濃度は、例えば約０．０５重量％から、１０〜３０重量％程度まで幅広く変化させることができるが、通常は約２〜５重量％又は少なくとも約２〜５重量％であり、選択される投与の特定の形態に応じて、主として液量及び粘度等によって選択されるであろう。例えば、治療と付随した液負荷（fluid load）を低減させるために、前記濃度を増加させてもよい。これに代えて、刺激性の脂質で構成された送達媒体を低濃度まで希釈して、投与部位での炎症を小さくしてもよい。診断のため、投与される送達媒体の量は、用いられる特定の標識、診断されている病状及び臨床医の判断に依存するであろう。
本発明の医薬組成物は、好ましくは静脈投与される。送達媒体製剤の投与量は、薬剤と脂質の比（割合）並びに投与する医師の患者の年齢、体重及び体調に基づく見解に依存するであろう。
医薬組成物の他、獣医学的使用にとって適当な製剤を製造し、対象（被検体）に適した方法で投与してもよい。好ましい獣医学的対象には、哺乳類種、例えば、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、及び家禽（domesticated fowl）が含まれる。対象には、実験動物、例えば、特にラット、ウサギ、マウス、及びモルモットも含まれる。
キット
本発明の組成物中の治療薬を、各治療薬が適当な送達媒体と安定的に会合されている個々の組成物に切り離して処方してもよい。投与される治療薬の比が治療の標的で維持されるよう送達媒体の薬物動態が連係して作用される限り、これらの組成物を、対象（患者）に別々に投与することができる。したがって、独立したコンテナに、少なくとも第一の治療薬と安定的に会合した送達媒体を含む第一の組成物と、第二のコンテナに、少なくとも第二の治療薬と安定的に会合した送達媒体を含む第二の組成物とを含むキットを作成することは有用である。前記コンテナを、その後キットに包装することができる。
前記キットには、投与されるべき各組成物の量の比についての記述を少なくとも含む、組成物の対象への投与形態に関する指示書も含まれるであろう。これに代えて、又は更に、一方のコンテナの内容物が他方のコンテナの内容物と組み合わせて適正な比を表すようコンテナ毎に組成物の量を予め測定して、前記キットは作成される。これに代えて、又は更に、前記コンテナには、目に見える目盛りに従って適当量の投与を可能にする計量線（measuring scale）が付されてもよい。前記コンテナはそれ自体、投与に使用できてもよい；例えば、前記キットは、別々のシリンジに封入された適当量の各組成物を含むかもしれない。予め処方した正確な比の治療薬を含む製剤を、同様にこの方法で包装してもよく、その結果、当該製剤はキット内に包装されたシリンジから直接投与される。
下記実施例により本発明を更に説明する。当該実施例は、単に特定の形態に関して本発明を詳細に説明するために与えられる。これらの具体例により、本発明のある特定の視点について詳細に説明されるが、限定がなされるものではなく、或いは開示された発明の範囲に限定されるものではない。
［実施例１］薬剤比依存性であるインビトロでのダウノルビシン:シタラビン相乗作用
２以上の薬剤の組み合わせの多くは、相乗効果を発揮する能力を有する。同様に、その同じ２以上の薬剤の組み合わせはまた、相加的又は拮抗的相互作用を示す場合もある。相乗的であるダウノルビシンとシタラビン（Ａｒａ−Ｃとしても知られている）との比を同定するため、ダウノルビシンとシタラビンとの各種組み合わせについて、インビトロで細胞毒性効果をテストした。より具体的には、薬剤濃度の広い範囲にわたって相乗作用を示す薬剤比を同定した。
相加、相乗又は拮抗作用の測定を、Ｐ３８８及びＬ１２１０マウスリンパ性白血病細胞について、ダウノルビシン：シタラビン（ＤＮ：Ａｒａ−Ｃ）を１０：１、５：１、１：１、１：５及び１：１０のモル比で用いて、行った。標準テトラゾリウムベース比色ＭＴＴ細胞毒性測定プロトコル（standard tetrazolium-based colorimetric MTT cytotoxicity assay protocol）（Mosmann, et al., J. Immunol Methods (1983) 5(1-2): 55-63）を利用して、影響された細胞の画分の読み取り値を測定した。簡単には、生細胞により、テトラゾリウム塩、３−（４，５−ジエチルチアゾイル−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロマイド（3-(4,5-diethylthiazoyl-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide）（ＭＴＴ）が分光測定で読み取ることができる青いホルマザンに還元される。ここで用いられるＰ３８８又はＬ１２１０マウスリンパ性白血病細胞等の細胞は、ＢＤＦ−１マウスで継代（培養）され、必要に応じて、除去され、新鮮な細胞培養培地を含む７５ｃｍ２フラスコに移され、ウェル当たり１００μＬの中にそれぞれ１０，０００若しくは６，０００個のＰ３８８又はＬ１２１０細胞の濃度で、９６ウェル細胞培養プレートに添加される。その細胞を、その後、細胞接着を促進させるため、３７℃、５％ＣＯ２、及び＞７５％湿度で２４時間インキュベートしておく。その翌日、段階薬剤希釈（serial drug dilution）を、１２ウェル細胞培養プレートにおいて作成する。各種溶液について予め作成した薬剤を、新鮮な細胞培養培地で希釈する。薬剤を、単一の薬剤（２０μＬ）及び特定の固定した比の２種薬剤組み合わせ（２０μＬずつ）に対応するウェルに投与する。全ウェル体積を新鮮培地で２００μＬまでにする。薬剤の曝露は、７２時間の期間である。
薬剤の曝露後、ＭＴＴ試薬（１ｍｇ／ｍＬリン酸緩衝塩溶液）を、ウェル当たり５０μＬの体積で各ウェルに添加し、４時間インキュベートする。ウェルの内容物をその後吸引し、１５０μＬのジメチルスルホキシド（dimethylsulfoxide）（ＤＭＳＯ）を各ウェルに添加して、細胞を分裂させ、細胞内部でホルマザン沈殿物を可溶化する。９６ウェルプレートを最低２分間プレート振盪機（plate shaker）で振盪させ、５７０ｎｍの波長に設定したマイクロプレート分光光度計（microplate spectrophotometer）で読み取る。読み取る光学密度（optical density）（ＯＤ）を記録し、培地を単独で含むブランクウェルのＯＤ値を、細胞を含む全てのウェルから引き算する。薬剤への曝露後の細胞生存は、薬剤の曝露のないコントロールウェルの細胞の百分率として基礎づけられる。全ウェルについて三回行い、平均値を計算する。
組み合わせ指数を、その後、薬剤−効果分析のＣｈｏｕ及びＴａｌａｌａｙの理論に基づくＣａｌｃｕｓｙｎを用いて、各ダウノルビシン；シタラビン剤について求める。なお、「Ｍｅｄｉａｎ−Ｅｆｆｅｃｔ方程式（median-effect equation）」を用いて、その技術において広く用いられている多数の生化学的方程式が計算されている。この方程式の導出により、組み合わせ指数（ＣＩ）を計算するために用いられる方程式等、より高い次数の方程式が得られている。以前に述べたように、ＣＩを用いて、１以上の薬剤の組み合わせ及び各組み合わせの各種比が拮抗的（ＣＩ＞１．１）であるか、相加的（０．９≦ＣＩ≧１．１）であるか又は相乗的（ＣＩ＜０．９）であるかを判定することができる。ＣＩプロットは、典型的にはｘ軸の影響された細胞の割合又は影響された画分（ｆａ）に対してｙ軸を表すＣＩを用いて図示される。影響されたＰ３８８又はＬ１２１０マウスリンパ性白血病細胞の画分に対するＣＩとしてプロットされた図１Ａ及び１Ｂのデータは、それぞれ、ダウノルビシンとシタラビンとの特定の組み合わせが拮抗的である一方、その他のものは相乗的又は相加的であることを図示する。１：１０、１：５及び１：１のダウノルビシン：シタラビン（ＤＮ：Ａｒａ−Ｃ）比では、０．７５以上のｆａ値でＰ３８８細胞について相乗作用が認められる（図１Ａ）。これにより、１：１、１：１０及び１：５の比は、著しい腫瘍細胞死を引き起こすのに十分な濃度で相乗的であることが示される。ダウノルビシン：シタラビンの１：５及び１：１０の比も、ｆａ値の適当な範囲にわたってＬ１２１０細胞について非拮抗的である（図１Ｂ）。逆に、ダウノルビシン：シタラビンの５：１及び１０：１の比は、ｆａ値の広い範囲にわたってＰ３８８及びＬ１２１０細胞について拮抗的である。図１Ｃ及び１Ｄでは、７５％（ＥＤ７５）及び９０％（ＥＤ９５）腫瘍細胞増殖阻害を引き起こすのに十分な薬剤濃度でのＣＩ値が、Ｐ３８８及びＬ１２１０細胞について異なるダウノルビシン：シタラビンモル比で比較されているが、ＣＩのダウノルビシン：シタラビン比への依存は、この図１Ｃ及び１Ｄにおいても示される。これらの結果に基づき、１：５ダウノルビシン：シタラビンのモル比を、固定した薬剤比のリポソーム担体で処方するために、選択した。
［実施例２］リポソーム中に２種負荷されうる（dual-loaded）ダウノルビシン及びシタラビン
ダウノルビシン及びシタラビンの両方を含むリポソームを、ダウノルビシンを能動的に負荷した受動捕捉シタラビン（passively entrapped cytarabine）を含むＤＳＰＣ／ＤＳＰＧ／コレステロール（７：２：１ モル比）リポソームを用いて得ることができた。簡単には、１００ｍｇ脂質／ｍｌ最終濃度の濃度で混合した脂質（ＤＳＰＣ：ＤＳＰＧ：ＣＨＯＬ（７：２；１ モル比））をクロロホルム：メタノール：Ｈ２Ｏ混合物（９５：４：１ ｖｏｌ／ｖｏｌ）中に溶解させることによって、脂質発泡体を、調製した。溶媒を、その後真空蒸発（vacuum evaporation）により除去し、生じた脂質発泡体を、７０℃で、１００ｍＭ Ｃｕ（グルコネート）２、２２０ｍＭトリエタノールアミン（triethanolamine）（ＴＥＡ）、ｐＨ７．４及び５０ｍｇ／ｍＬ（２０３ｍＭ）シタラビン（３Ｈ−シタラビンをトレーサーとして含むもの）からなる溶液で水和させた。生じたＭＬＶを、７０℃で１０分間押し出して、大型単層小胞体を得た。生じたリポソームの平均直径を、ＱＥＬＳ（準弾性光散乱（quasi-elastic light scattering））分析によって測定したところ、約１００ｎｍ＋／−２０ｎｍであった。次いで、リポソームを、タンジェンシャルフロー透析法（tangential flow dialysis）を用いて３００ｍＭ スクロース、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１ｍＭ ＥＤＴＡ（ＳＨＥ）、ｐＨ７．４中へ、バッファ交換し、それによってカプセル化（内封）されなかったシタラビン及びＣｕ（グルコネート）２／ＴＥＡを除去した。シタラビン対脂質モル比を脂質シンチレーションカウンティング（lipid scintillation counting）を用いて測定して、脂質濃度（１４Ｃ−ＤＰＰＣ）及びシタラビン濃度（３Ｈ−シタラビン）を求めた。
ダウノルビシンを、１：５の最終目標ダウノルビシン：シタラビンモル比になるまで、これらのリポソームに添加した。ダウノルビシンのリポソーム中への負荷を、５０℃で３０分間サンプルをインキュベートすることによって促進させた。負荷後、そのサンプルを室温まで冷却した。セファデックス（Sephadex）Ｇ−５０スピンカラムによるリポソーム溶出後、薬剤カプセル化効率（drug encapsulation efficiency）を評価した。
ダウノルビシン負荷効率（daunorubicin loading efficiency）を、標準曲線に対する４８０ｎｍでの吸収を用いて測定した。ダウノルビシン測定のため４８０ｎｍでの吸収を用いて及び脂質濃度を測定するため脂質シンチレーションカウンティングを用いて、各時点での薬剤対脂質比を測定した。表１は、薬剤カプセル化及び遊離型薬剤の除去後の平均ダウノルビシン／脂質比及びシタラビン／脂質比を示す。表１から、０．０４２：１の初期ダウノルビシン対脂質比で添加されたダウノルビシンを、受動捕捉シタラビンを０．２３４の薬剤対脂質比で含むＤＳＰＣ／ＤＳＰＧ／Ｃｈｏｌ（７：２：１ モル比）リポソーム中に有効に負荷することができることは明らかである。
Figure 2007533670
［実施例３］インビボでの薬剤比の維持
ダウノルビシン及びシタラビンがインビボで相乗作用の範囲において１：５の薬剤：薬剤比で維持されうるかどうかを測定するため、カプセル化したダウノルビシン及びシタラビンを含むＤＳＰＣ／ＤＳＰＧ／Ｃｈｏｌ（７：２：１ ｍｏｌ：ｍｏｌ）リポソームを、マウスに静脈投与し、血漿（プラズマ）薬剤／薬剤比を、経時でモニターした。
簡単には、１００ｍｇ脂質／ｍｌ最終濃度の濃度の脂質混合物（ＤＳＰＣ：ＤＳＰＧ：ＣＨＯＬ（７：２：１ モル比））をクロロホルム：メタノール：Ｈ２Ｏ混合物（９５：４：１ ｖｏｌ／ｖｏｌ）中に溶解させることによって、脂質発泡体を、調製した。溶媒を、その後真空蒸発（vacuum evaporation）により除去し、生じた脂質発泡体を、７０℃で、１００ｍＭ Ｃｕ（グルコネート）２、２２０ｍＭ トリエタノールアミン（triethanolamine）（ＴＥＡ）、ｐＨ７．４及び５０ｍｇ／ｍＬ（２０３ｍＭ）シタラビン（微量（trace amounts）の３Ｈ−シタラビンを含むもの）からなる溶液で水和させた。生じたＭＬＶを、７０℃で押し出して、大型単層小胞体を得た。生じたリポソームの平均直径を、ＱＥＬＳ（準弾性光散乱（quasi-elastic light scattering））分析によって測定したところ、約１００ｎｍ＋／−２０ｎｍであった。次いで、リポソームを、タンジェンシャルフロー透析法（tangential flow dialysis）を用いて３００ｍＭ スクロース、２０ｍＭ リン酸ナトリウム、１０ｍＭ ＥＤＴＡ（ＳＨＥ）、ｐＨ７．４中へ、バッファ交換し、それによってカプセル化（内封）されなかったシタラビン及びＣｕ（グルコネート）２／ＴＥＡを除去した。
ダウノルビシンを、ダウノルビシン対シタラビン最終モル比が約１：５になるよう、これらのリポソームに添加した。リポソーム中へのダウノルビシン負荷を、５０℃で３０分間サンプルをインキュベートすることによって促進させた。負荷後、そのサンプルを室温まで冷却した。セファデックス（Sephadex）Ｇ−５０スピンカラムによるリポソーム溶出後、薬剤カプセル化効率（drug encapsulation efficiency）を評価した。シタラビン対脂質モル比を脂質シンチレーションカウンティング（lipid scintillation counting）を用いて測定して、脂質濃度（１４Ｃ−ＤＰＰＣ）及びシタラビン濃度（３Ｈ−シタラビン）を求めた。ダウノルビシン負荷効率（daunorubicin loading efficiency）を、標準曲線に対する４８０ｎｍでの吸収を用いて測定した。ダウノルビシン測定のため４８０ｎｍでの吸収を用いて並びに脂質及びシタラビン濃度を測定するため脂質シンチレーションカウンティングを用いて、薬剤対脂質比を測定した。
前記製剤をその後、ＢＤＦ−１マウスに尾静脈を介して静脈注射した。リポソーム製剤の投与量を、ダウノルビシンにつき５ｍｇ／ｋｇ、シタラビンにつき１２．５ｍｇ／ｋｇとした。静脈投与後の望ましい時点で、血液を、心臓穿刺（時点につき３マウス）によって採取し、ＥＤＴＡ被覆マイクロコンテナ（EDTA coated micro containers）に入れた。それらのサンプルを、遠心分離して血漿を分離し、血漿を別のチューブに移した。ダウノルビシン及びシタラビン血漿（プラズマ）レベルを、高速液体クロマトグラフィー（High Performance Liquid Chromatography）（ＨＰＬＣ）を用いて定量化した。
図２Ａは、ダウノルビシン及びシタラビンが前記記載したリポソームによって送達されたときにＢＤＦ−１マウスへの静脈投与後の各種時点におけるダウノルビシン及びシタラビンの血漿消失曲線を示す。静脈注射１時間後、ダウノルビシン血漿濃度は１６７ｎｍｏｌ／ｍｌとなり、８７２ｎｍｏｌシタラビン／ｍｌの血漿濃度が観察された。注射４時間後、ダウノルビシン血漿濃度は１４３ｎｍｏｌ／ｍｌとなり、シタラビン濃度は７８１ｎｍｏｌ／ｍｌとなった。
図２Ｂは、ダウノルビシン及びシタラビンが前記記載したリポソームに同時送達されたときにＢＤＦ−１マウスへの静脈投与後の長期間にわたって相乗的な範囲でダウノルビシン及びシタラビンの血漿レベルが有効に維持されることを示す。データポイントは、特定の時点で血漿について測定したダウノルビシン：シタラビンのモル比（＋／− 標準偏差）を表す。それゆえ、リポソーム等の適当にデザインした送達媒体により、望ましい比のダウノルビシン及びシタラビンが、インビボで送達されるうる。
［実施例４］相乗的な比でリポソーム中に同時に処方されたダウノルビシン及びシタラビンが示す優れた抗腫瘍効率（有効性）
薬剤組み合わせの治療活性を最大にするため及びインビトロで認められる相乗的な利益を得るため、薬剤組み合わせは、最適な薬剤対薬剤比で腫瘍部位に送達される必要がある。組織培養において相乗的であるとわかった固定した比で、二つの薬剤を含む単一のリポソーム製剤を、実施例３において示したのと同様にインビボでの薬剤放出を連係して行うことができるように、開発した。この製剤の抗腫瘍活性を、その後Ｐ３８８及びＬ１２１０マウスリンパ性白血病モデルで評価した。
約１：５の相乗的なモル比でダウノルビシン及びシタラビンと共カプセル化されたＤＳＰＣ／ＤＳＰＧ／Ｃｈｏｌ（７：２：１ モル比）リポソームを、実施例３において記載したのと同様に調製した。
マウスの腫瘍研究を行うため、動物には、１×１０６のＰ３８８又はＬ１２１０腫瘍細胞を腹腔内（ｉｐ）接種し、その後この腫瘍細胞を、治療開始前に２４時間増殖させておいた。マウスは、生理食塩水、リポソームダウノルビシン、リポソームシタラビン、遊離型薬剤カクテル及び結果として約１：５の最終ダウノルビシン：シタラビンモル比となるようＤＳＰＣ：ＤＳＰＧ：Ｃｈｏｌ（７：２：１、ｍｏｌ；ｍｏｌ）リポソームに共負荷したダウノルビシン：シタラビンを含むコントロール並びに治療群からなる適当な治療群に分けた。マウスについては、腫瘍細胞接種後１、４及び７日に個々のマウスの体重に基づき前記処方した一回分がこの動物に投与されるように、必要とする体積のサンプルを静脈注入した。動物の体重を測定し、更に動物の生存についてモニターした。体重測定の時に実生活内での観察（in-life observations）を行う。図３は、これらの実験の結果を図示する。
図３Ａが示すように、約１：５モル比で共負荷したダウノルビシン：シタラビンを含むリポソーム製剤の抗腫瘍活性が、リポソーム中に個々に処方された各単一の薬剤並びに最大耐容量（maximum tolerated dose）（ＭＴＤ）で投与した遊離型薬剤カクテルと比較して著しく増大することが観察された。バッファコントロール群では、５０％生存期間（median survival time）は８日であった。５ｍｇ／ｋｇの投与量のリポソームダウノルビシンを用いて治療した動物では、１００％の生存期間の増大に相当する、１６日の５０％生存期間が示された。１２．５ｍｇ／ｋｇの投与量のリポソームシタラビンを用いて治療したマウスでは、１７５％の生存期間の増大に相当する、２２日の５０％生存期間が示され、そしてＤＳＰＣ：ＤＳＰＧ：Ｃｈｏｌ（７：２：１ ｍｏｌ：ｍｏｌ）リポソーム内部に約１：５モルの薬剤比で共負荷したダウノルビシン及びシタラビンを用いて治療した動物では、＞６０日の５０％生存期間及び９／１０の長期間生存に加え＞６５０％の寿命の増大が示された。比較して、ＭＴＤ（両方の遊離型薬剤の最大投与量（maximizing dose）に基づく）のダウノルビシン：シタラビンを遊離型薬剤カクテルとして用いて治療したマウスでは、２７日の５０％生存期間及び２３７％に相当する寿命の増大によって反映されるように、抗腫瘍治療にも応答しなかった。
同様に、図３Ｂに示されるように、対応する遊離型薬剤カクテル又はリポソーム中に個々に負荷した各薬剤と比較すると、約１：５のモル比で共負荷したダウノルビシン及びシタラビンを含むリポソーム製剤については、優れた抗腫瘍活性が得られた。バッファコントロール群では、５０％生存期間は７日であった。リポソームカプセル化ダウノルビシン又はリポソームカプセル化シタラビンを用いて治療したマウスでは、５０％生存期間は、それぞれ、２０日及び４３．５日であった。比較して、ＤＳＰＣ：ＤＳＰＧ：Ｃｈｏｌ（７：２：１ ｍｏｌ比）リポソーム中に約１：５のモル比で共負荷したダウノルビシン及びシタラビンを用いて治療した動物では、６０日を超える５０％生存期間が示された。
これらの結果から、固定した相乗作用を示すダウノルビシン：シタラビン比は、適当に設計されたリポソームの内部にダウノルビシン：シタラビンを封入することによって抗腫瘍活性を著しく改善することができるということが示される。
上記実施例は、詳細な説明のためにのみ含まれるものであり、本発明の範囲を限定することを意図したものではない。前記実施例に対する多くの変形が可能である。前記実施例の改良及び変形は当業者に自明であろうから、本発明が添付した請求の範囲によってのみ制限されることを意図している。
上記公報又は文献の引用は、上述のもの全てが関連する先行技術であると認めるものではなく、これらの公報又は文献の内容及び日付に関して何ら承認を構成するものでもない。
図１Ａは、各種モル比：１０：１（四角形）、５：１（三角形）、１：１（中抜きの丸）、１：５（逆三角形）及び１：１０（塗りつぶした丸）のダウノルビシン：シタラビン（又はＡｒａ−Ｃ）の組み合わせによって影響されたＰ３８８マウスリンパ性白血病細胞の画分（ｆａ）の関数としてプロットされた組み合わせ指数（ＣＩ）を示すグラフである。 図１Ｂは、各種モル比：１０：１（四角形）、５：１（三角形）、１：１（中抜きの丸）、１：５（逆三角形）及び１：１０（塗りつぶした丸）のダウノルビシン：シタラビン（又はＡｒａ−Ｃ）の組み合わせによって影響されたＬ１２１０マウスリンパ性白血病細胞の画分（ｆａ）の関数としてプロットされた組み合わせ指数（ＣＩ）を示すグラフである。 図１Ｃは、Ｐ３８８マウスリンパ性白血病細胞におけるＣＩ対ダウノルビシン：シタラビン（１０：１、５：１、１：１、１：５、１：１０）各種モル比を示すグラフである。７５％（ＥＤ７５）及び９０％（ＥＤ９０）腫瘍細胞増殖阻害を引き起こすために十分な薬剤濃度でのＣＩ値が、異なるダウノルビシン：シタラビンモル比で比較されている。 図１Ｄは、Ｌ１２１０マウスリンパ性白血病細胞におけるＣＩ対ダウノルビシン：シタラビン（１０：１、５：１、１：１、１：５、１：１０）各種モル比を示すグラフである。７５％（ＥＤ７５）及び９０％（ＥＤ９０）腫瘍細胞増殖阻害を引き起こすために十分な薬剤濃度でのＣＩ値が、異なるダウノルビシン：シタラビンモル比で比較されている。 図２Ａは、ＤＳＰＣ：ＤＳＰＧ：ＣＨＯＬ（７：２：１ モル比）リポソームでＢＤＦ−１マウスに静脈投与した後の各種時点でのダウノルビシン：シタラビンの血漿（プラスマ）消失曲線（plasma elimination curve）を示すグラフである。 図２Ｂは、ダウノルビシン：シタラビン（約１：５モル比）２種負荷したＤＳＰＣ：ＤＳＰＧ：Ｃｈｏｌ（７：２：１ モル比）リポソームの静脈投与後の時間の関数として血漿中のダウノルビシン：シタラビンの比（ｍｏｌ：ｍｏｌ）のグラフである。データポイントは、特定の時点で血漿において測定したダウノルビシン：シタラビンのモル比（＋／− 標準偏差）を表す。 図３Ａは、マウスのＰ３８８リンパ性白血病モデルに対して静脈（i.v.）（Ｑ３ＤＸ３）を介して投与された個々のリポソームカプセル化剤及び遊離型薬剤カクテルと比較した、共負荷したリポソーム捕捉ダウノルビシン：シタラビン（約１：５ モル比）の有効性を示すグラフである。マウスは、生理食塩水（丸）、リポソームダウノルビシン（三角形）、リポソームシタラビン（四角形）、ダウノルビシン：シタラビンの遊離型カクテル（９：６００ｍｇ／ｋｇ）（逆三角形）及び約１：５の最終ダウノルビシン：シタラビンモル比を結果として与えるＤＳＰＣ：ＤＳＰＧ：Ｃｈｏｌ（７：２：１、ｍｏｌ：ｍｏｌ）リポソームで共負荷したダウノルビシン：シタラビン（菱形）を含むコントロール並びに治療群からなる適当な治療群に分けて構成した。 図３Ｂは、マウスのＬ１２１０リンパ性白血病モデルに対して静脈（i.v.）（Ｑ３ＤＸ３）を介して投与された個々のリポソームカプセル化剤及び遊離型カクテルと比較した共負荷したリポソーム捕捉ダウノルビシン：シタラビン（約１：５ モル比）の有効性を示すグラフである。マウスは、生理食塩水（丸）、リポソームダウノルビシン（三角形）、リポソームシタラビン（四角形）、ダウノルビシン：シタラビンの遊離型カクテル（１２：３０ｍｇ／ｋｇ）（中抜きの菱形）及び約１：５の最終ダウノルビシン：シタラビンモル比を結果として与えるＤＳＰＣ：ＤＳＰＧ：Ｃｈｏｌ（７：２：１、ｍｏｌ：ｍｏｌ）リポソームで共負荷したダウノルビシン：シタラビン（塗りつぶした菱形）を含むコントロール並びに治療群からなる適当な治療群に分けて構成した。

Claims (37)

  1. 送達媒体を含む組成物であって、
    前記送達媒体は、投与経路に依存した寸法の粒子であり、それと安定的に会合して少なくとも１つのアントラサイクリン系薬剤及び１つのシチジンアナログを、関連細胞に対して望ましい細胞毒性効果、細胞増殖抑制効果又は生物学的効果を及ぼすアントラサイクリン系薬剤対シチジンアナログモル比で有することを特徴とする組成物。
  2. 前記関連細胞への望ましい細胞毒性効果、細胞増殖抑制効果又は生物学的効果は、非拮抗的である請求項１に記載の組成物。
  3. 前記アントラサイクリン系薬剤は、ダウノルビシン、ドキソルビシン及びイダルビシンからなる群より選択される請求項１に記載の組成物。
  4. 前記シチジンアナログは、シタラビン、ゲムシタビン及び５−アザシチジンからなる群より選択される請求項１に記載の組成物。
  5. 前記アントラサイクリン系薬剤は、ダウノルビシンである請求項１に記載の組成物。
  6. 前記アントラサイクリン系薬剤は、ドキソルビシンである請求項１に記載の組成物。
  7. 前記シチジンアナログは、５−アザシチジンである請求項１に記載の組成物。
  8. 前記シチジンアナログは、ゲムシタビンである請求項１に記載の組成物。
  9. 前記アントラサイクリン系薬剤及びシチジンアナログは、共カプセル化されている請求項１に記載の組成物。
  10. 患者に投与したとき、前記アントラサイクリン系薬剤及び前記シチジンアナログは同一の比で投与されるが前記送達媒体と安定的に会合していない場合に得られる治療活性よりも高い治療活性を示す請求項１に記載の組成物。
  11. 第三の薬剤を含む請求項１に記載の組成物。
  12. 前記送達媒体は、平均直径４．５〜５００ｎｍである請求項１に記載の組成物。
  13. 前記送達媒体は、平均直径２５０ｎｍ未満である請求項１２に記載の組成物。
  14. 前記アントラサイクリン系薬剤及び前記シチジンアナログは、共カプセル化されている請求項２に記載の組成物。
  15. 前記送達媒体は、リポソーム、脂質ミセル、ブロック共重合体ミセル、マイクロパーティクル、ナノパーティクル、ポリマー脂質ハイブリッド系、及び／又は誘導体化した単鎖ポリマーを含む請求項１に記載の組成物。
  16. 前記送達媒体は、リポソームを含む請求項１に記載の組成物。
  17. 前記リポソームは、ホスファチジルコリン含有脂質を含む請求項１６に記載の組成物。
  18. 前記ホスファチジルコリン含有脂質は、ＤＰＰＣ、ＤＳＰＣ又はＤＡＰＣである請求項１７に記載の組成物。
  19. 前記リポソームは、荷電脂質を含む請求項１６に記載の組成物。
  20. 前記荷電脂質は、ホスファチジルグリセロールである請求項１９に記載の組成物。
  21. 前記ホスファチジルグリセロールは、ＤＳＰＧ、ＤＰＰＧ又はＤＭＰＧである請求項２０に記載の組成物。
  22. 前記荷電脂質は、ホスファチジルイノシトールである請求項１９に記載の組成物。
  23. 前記リポソームは、スフィンゴミエリンを含む請求項１６に記載の組成物。
  24. 前記リポソームは、ステロールを含む請求項１６に記載の組成物。
  25. 前記ステロールは、コレステロールである請求項２４に記載の組成物。
  26. 前記アントラサイクリン系薬剤は、ダウノルビシンであり、前記シチジンアナログは、シタラビンである請求項２に記載の組成物。
  27. 前記送達媒体は、ＤＳＰＣを含むリポソームを含む請求項２６に記載の組成物。
  28. 前記リポソームは、ＤＳＰＧを含む請求項２７に記載の組成物。
  29. 前記リポソームは、スフィンゴミエリンを含む請求項２７に記載の組成物。
  30. 前記アントラサイクリン系薬剤及び／又は前記シチジンアナログは、受動負荷技術を用いてリポソームと会合している請求項１６に記載の組成物。
  31. 前記アントラサイクリン系薬剤及び／又は前記シチジンアナログは、能動負荷技術を用いてリポソームと会合している請求項１６に記載の組成物。
  32. 前記能動負荷技術は、遷移金属負荷技術を含む請求項３１に記載の組成物。
  33. 患者の病状を治療する方法であって、
    そのような治療を必要とする患者に治療上効果的な量の請求項１に記載の組成物を投与することを含むことを特徴とする方法。
  34. 前記患者は、ヒトである請求項３３に記載の方法。
  35. 前記患者は、非ヒト哺乳類又は鳥類である請求項３３に記載の方法。
  36. 送達媒体を含む組成物を製造する方法であって、
    前記送達媒体は、非拮抗的なモル比でこの送達媒体と安定的に会合した少なくとも１つのアントラサイクリン系薬剤及び１つのシチジンアナログを含み、
    前記方法は、
    ａ）生物活性に対する関連細胞培養法、無細胞法又は腫瘍ホモジネート法で、薬剤の前記比が細胞のうち１％を超える細胞に影響を与える（ｆａ＞０．０１）濃度範囲の少なくとも５％にわたって非拮抗的である前記アントラサイクリン系薬剤及びシチジンアナログのモル比を決定すること、並びに
    ｂ）前記工程ａ）で非拮抗的であると決定したモル比のアントラサイクリン系薬剤対シチジンアナログを前記送達媒体を用いてカプセル化すること
    を含むことを特徴とする方法。
  37. 第一の送達媒体と安定的に会合したシチジンアナログと第二の送達媒体と安定的に会合したアントラサイクリン系薬剤とを投与することによって、治療上効果的な量のアントラサイクリン系薬剤：シチジンアナログ組み合わせを送達し、前記アントラサイクリン系薬剤及び前記シチジンアナログの比は非拮抗的であることを特徴とする方法。
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