JP2014532623A - 凍結乾燥リポソーム - Google Patents

Abstract

２つまたはそれよりも多い薬物が封入される凍結乾燥リポソーム製剤が開示される。これらの製剤は、優れた薬物保持プロフィールを示し、凍結乾燥および再構成後にサイズ分布もまた維持する。凍結乾燥後の再構成の際リポソームの完全性を維持するために、特に封入薬剤の保持を確実にするために、凍結保護物質がリポソーム内外両方に必要とされることが一貫して報告されている。本発明者らは、１つだけでなく２つまたはそれ以上の活性薬剤を封入するリポソームの凍結乾燥を成功させるために、内側の凍結保護物質を必要としない安定なリポソームを同定した。

Description

関連出願
本出願は、２０１１年１０月２１日に出願された米国特許出願６１／５５０，０４７号に対して優先権を主張し、その内容は、全体が参照によって本開示に援用される。

技術分野
本発明は、長期間保存され得る少なくとも２つの治療薬または診断薬を含有する凍結乾燥リポソームを製造する方法および組成物に関連する。１つの局面において、本発明は、低コレステロールリポソームであって、必要に応じて外部媒体中に凍結保護物質を含み、リポソームの凍結／解凍および脱水の損傷に対する抵抗性を有し、それゆえリポソームのサイズおよび完全性を維持するリポソームに関する。

本発明の背景
リポソームは、水溶性コアを囲む少なくとも１つの脂質二重層を有している閉鎖小胞である。リポソーム内の空間および脂質層は、薬物、化粧品、診断薬、遺伝物質および生理活性化合物を含む様々な物質を捕捉し得る。無毒性の脂質がリポソームの基盤として機能するので、それらは一般的に低い毒性を示す。低い毒性ならびに薬剤の血漿循環の寿命を増加させるリポソームの能力は、医薬活性剤を送達するのに特に有用なビヒクルとしてのリポソームを生じさせる。多くの場合、リポソーム送達薬剤は、結果として減少した毒性とともに優れた臨床効果をもたらす。

薬物送達ビヒクルとしてのリポソーム製剤の実用化は、当該製剤の化学的および物理的安定性によって制限される。商業化は、化学的および物理的レベル両方での長期安定性を要求する。不安定な薬物および／または脂質成分の分解を避ける凍結または凍結乾燥（ｆｒｅｅｚｅ−ｄｒｉｅｄ）（凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ））製剤の使用は、安定性におけるいくつかの改善を提供する。しかしながら、凍結乾燥プロセスの間、氷結晶形成は、力学的な破裂、リポソームの凝集および融合（結果としてリポソームサイズの上昇が生じる）を引き起こしうる。さらに、薬物を含有するリポソームを凍結乾燥し、その後室温で再構成する場合、リポソームの二重層の構造に時々変化が起き、加速した薬物漏出が生じる。

凍結乾燥リポソーム組成物の調製における従来の試みは、脂質の運動が流動的で制御できない、通常体温で液相である従来のリポソームに頼ってきた。そのような従来のリポソームは、２つのカテゴリーに分類される。１つ目は、ゲル−液晶温度（Ｔ_Ｃ）が体温未満の脂質を含むために（すなわち、それらは体温で液相となり得る）、液体状態で維持されるリポソームである。これらのリポソームは、当該分野において慣用的に使用されている；しかしながら、流動的であることの否定的側面は、多くの封入剤についての不十分な薬物保持性である。

従来のリポソームの２つ目のタイプは、コレステロールのような大量の膜硬化剤を含むために（例えば３０〜４５ｍｏｌ％）、液体−ゲル転移が決して起こらない。コレステロールは、リポソームの膜透過性、タンパク質相互作用およびリポタンパク質の不安定化を減少させる一方で、二重層の厚さおよび流動性を増加させるように機能する。これらの大量のコレステロールは、リポソーム研究において最も頻繁に使用されており、すべての薬剤を十分に保持できるわけではないが、インビボでの十分な血清安定性および薬物保持性ために必要であることが、歴史的に教示されている。ある薬物は、実質的にコレステロールを含有しないリポソームにおいて、インビトロおよびインビボ両方でより優れた薬物保持性を示す。例えば、非特許文献１を参照のこと。

一方で、ゲル相のリポソームは、より安定で、向上した薬物保持性を示す。本発明は、体温でゲル相である（すなわち、体温がリポソームのＴ_Ｃよりも低い）リポソームを利用する。ゲル相リポソームは、多くの脂質を用いて調製され得る；しかしながら、より飽和しているアシル側鎖ホスファチジル脂質（例えば、水素付加大豆ＰＣ、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）またはジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ））で作られたリポソームは、体温でゲル相を達成するために、３０％未満のコレステロールを有することが要求される。体温でゲル相を示さない従来のリポソームの１つの例には、顕著に漏出性である卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）で作られたものがある。

従来のリポソームを使用する凍結乾燥リポソーム組成物の調製における従来の試みは、空のリポソームまたは単一の薬剤のみを含有するリポソームのいずれかに関していた。それらは、リポソームの内外両方に凍結保護物質、一般的には糖類、またはリポソーム膜を横切る大きな浸透圧勾配を使用し得る。

例えば、凍結保護物質は、リポソーム内外両方に十分な量が存在する場合（理想的にはこれらの量が等しい場合）、単一の薬剤を封入している「液体」ＥＰＣリポソームに対して、凍結／解凍の損傷から保護するために使用された。例えば、特許文献１および特許文献２を参照のこと。リポソーム内液における１％〜１０％の凍結保護物質の存在は、ドキソルブシン封入凍結乾燥ＥＰＣリポソーム製剤を保護し、好ましくは、内側のモル浸透圧濃度は、生理的なモル浸透圧濃度に近い。例えば特許文献３を参照のこと。リポソームの内側に凍結保護物質を含めることができないと、再構成の際、特に封入薬剤の保持に関して、結果としてリポソーム完全性の損失が生じることが示されている。非特許文献２に記載の通りである。

１つの場合において、小胞の凝集および融合ならびに捕捉薬剤の損失からの保護は、水素付加大豆ＰＣ：コレステロール：ＤＳＰＥ−ｍＰＥＧ（５１：４４：５モル比）のリポソームについても報告され、当該リポソーム製剤は、外液中に４４ｍｏｌ％コレステロールならびに凍結保護物質および高濃度の塩を含有している。４４％コレステロールの存在は、リポソームが体温または体温未満で液相となり得ることを意味する。さらに、リポソーム外のモル浸透圧濃度が内側のモル浸透圧濃度よりも顕著に高くなるように、膜を横切る大きな浸透圧勾配が存在する場合に限って、保護効果が実現される。例えば特許文献４を参照のこと。

膜結合凍結保護物質はさらに、これらの非ゲル相リポソームの凍結および凍結乾燥の抵抗性をも改善する。特に、１〜３回の繰り返し単位からなるオリゴ（エチレンオキシド）リンカーを介して、ＥＰＣまたはＥＰＣ：コレステロール（１：１モル比）のリポソーム膜表面上に移植した糖が、蛍光プローブを含有するリポソームに対する凍結保護物質であることが報告されている。例えば、非特許文献３；非特許文献４；特許文献５を参照のこと。Ｂａｌｄｅｓｃｈｗｉｅｌｅｒらは、末端糖グループ非存在下で、オリゴエチレンオキシドリンカーを用いて調製されたリポソームそれ自身が、凍結後の融合から保護できなかったことを報告した（特許文献５）。

単一の薬剤を封入するＰＣリポソーム製剤の外液中のトレハロースは、リポソームの凝集および融合に対する抵抗性を提供する（特許文献６）。凝集に対して安定化される小さいリポソームを製造するその他の方法は、糖および単一の薬剤の溶液が加えられ、その後乾燥される空のＰＣ：コレステロール（１：１モル比）のリポソームの形成を必要とする。乾燥プロセスの間、一定の割合の試薬は、リポソーム中に捕捉される。これらのリポソームは、報告によると、保存の際、糖非存在下よりも安定である。例えば、特許文献７を参照のこと。

前述のとおり、凍結乾燥についての技術の大部分は、空のリポソームまたは単一の薬剤を封入するリポソームいずれかの凍結乾燥に着目した。完全性を保持しながらの凍結乾燥は、２つまたはそれ以上の薬剤が封入され、特に当該薬剤が溶解特性において異なる場合、より挑戦的である。ガンのような多くの命を脅かす疾患が、複数の分子メカニズムよって影響され、その複雑性に起因して、単一の薬剤を用いて達成される治療による成功は限られているため、２つまたはそれ以上の薬剤を封入することは、時々有用である。それゆえ、ほとんどすべてのガン治療は、１つよりも多くの治療薬の組み合わせに関する。これは、感染および慢性疾患を含む他の状態の治療にも当てはまる。

参照によって本開示に援用される特許文献８は、３８℃またはそれ以上の転移温度のゲル相リポソームが、少なくとも１ｍｏｌ％のホスホイノシトール（ＰＩ）またはホスファチジルグリセロール（ＰＧ）が当該組成物中に含まれる場合、飽和ホスファチジル脂質（例えば、ＤＰＰＣおよびＤＳＰＣのような）、および少量（０〜２０％）のコレステロールを使用して調製され得ることを報告する。これらのリポソームは、封入されたイリノテカンおよびフロクスウリジン（ＦＵＤＲ）の組み合わせを含有する場合、−２０℃での凍結に対して安定であることが示された。単なる凍結は、凍結乾燥よりもリポソームの完全性に対して、一般的にあまり過酷ではなく、破壊的でない。

これらの組み合わせについての送達ビヒクルとしてのリポソームの使用は、当該リポソームが、特に非拮抗性である薬剤を含み、その割合を維持する能力がある場合、有利である。この一般的なアプローチは、参照によって本開示に援用される特許文献９に詳細に記載されている。この特許は、広い濃度域にわたってそのような非拮抗作用または相乗作用を維持する抗悪性腫瘍薬を含む、様々な治療薬の非拮抗的または相乗的な割合を決定する方法を教示する。この特許は、当該投与の割合において当該薬物を送達し、送達ビヒクルに薬物動態を制御させることによってその割合を維持することが必要であることも教示する。この特許で例証されるリポソームは、イリノテカンおよびＦＵＤＲを含む２つまたはそれ以上の治療薬の非拮抗的または相乗的な割合を含有し、そして当該割合を維持する。リポソーム中に封入されたそのような組み合わせは、再構成の際、当該リポソームの完全性および当該薬剤の濃度ならびにそれらの割合が維持される場合、凍結乾燥された形態において保存される利点からの利益を得る。リポソーム中に封入されたシタラビンおよびダウノルビシンの特に有用なそのような組み合わせは、参照によって本開示にも援用される特許文献１０に記載されている。

驚くほどよい結果をともなう治療手順におけるこれらの使用が、特許文献１１および特許文献１２に記載されている。望ましい薬物送達オプションのリポソーム封入をともなうさらなる製剤が、特許文献１３および特許文献１４ならびに特許文献１５に記載されている。これらの製剤は、有用な組成物の単なる好例であり、２つまたはそれ以上の治療薬が、患者に送達するためのリポソーム中に含有される。

上述の通り、一般的に再構成の際リポソームの完全性を維持するリポソームの安定な凍結乾燥組成物を調製することは、難しく、予測不可能であった。２つまたはそれ以上の薬剤の組み合わせのために、そのような安定なリポソーム組成物を得ることは、さらに挑戦的である。それゆえ、２つまたはそれ以上の治療薬または診断薬を含有し、再構成の際リポソームの完全性を維持する凍結乾燥リポソームを得ることにおける本発明の方法の成功は、顕著な成果である。

米国特許第５，０７７，０５６号明細書 米国特許第４，８８３，６６５号明細書 米国特許第４，９２７，５７１号明細書 国際公開第０１／０５３７２号 米国特許第４，９１５，９５１号明細書 米国特許第６，３１９，５１７号明細書 国際公開第９９／６５４６５号 国際公開第０３／０４１６８１号 米国特許第７，８５０，９９０号明細書 米国特許第８，０２２，２７９号明細書 国際公開第２００７／０５０７８４号 国際公開第２００８／１０１２１４号 国際公開第２００９／０９７０１１号 国際公開２００９／０７０７６１号 国際公開２０１０／０４３０５０号

Ｄｏｓ Ｓａｎｔｏｓ， ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｓ． Ａｃｔａ， （２００２） １５６１：１８８−２０１ "ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ｏｆ ｌｅａｋａｇｅ ｒｅｑｕｉｒｅｓ ｔｈｅ ｓｕｇａｒ ｂｅ ｐｒｅｓｅｎｔ ｂｏｔｈ ｉｎｓｉｄｅ ａｎｄ ｏｕｔｓｉｄｅ ｔｈｅ ｌｉｐｏｓｏｍｅ" （Ｌｏｗｅｒｙ， Ｍ． （Ｊｕｎｅ ２００２） Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ， Ｖｏｌ． ２， Ｎｏ． ４） Ｂｅｎｄａｓ， ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｓｃｉ． （１９９６） ４：２１１−２２２ Ｇｏｏｄｒｉｃｈ， ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． （１９９１） ３０：５３１３−５３１８

本発明の開示
凍結乾燥後の再構成の際リポソームの完全性を維持するために、特に封入薬剤の保持を確実にするために、凍結保護物質がリポソーム内外両方に必要とされることが一貫して報告されている。本発明者らは、１つだけでなく２つまたはそれ以上の活性薬剤を封入するリポソームの凍結乾燥を成功させるために、内側の凍結保護物質を必要としない安定なリポソームを同定した。

本発明は、１つよりも多くの治療薬および／または診断薬を含有し、内側の凍結保護物質は含有しない成功した凍結乾燥ゲル相リポソーム製剤に関する。それゆえ、１つの局面において、本発明は、凍結乾燥リポソーム組成物に関する発明であり、ここで上記リポソームは、少なくとも２つの治療薬および／または診断薬と安定に会合し、上記組成物が再構成された場合、当該リポソームの平均直径が凍結乾燥前の状態と比較して維持され、リポソーム中に封入されたままである各薬剤の割合は、満足できるレベルで維持される。当該リポソームの完全性は、それゆえリポソームの再構成後に保持された封入薬剤の割合として測定される。満足できる凍結乾燥の判断基準として使用される追加のパラメータは、サイズ分布における最小変化である。特に重要な実施形態は、当該薬剤がリポソーム内に決まった割合で封入され、凍結乾燥形態が再構成されるとき、これらの薬剤の割合が維持されるものである。

この結果を達成するための典型的な条件は、ゲル−液晶転移温度（Ｔ_Ｃ）が、少なくとも室温で、ヒトの体温またはそれより高くなり得るゲル相リポソームの使用を含む。体温は約３７℃であると考える。当該リポソームは、ホスファチジルグリセロールおよび／またはホスホイノシトールで安定化される低コレステロールリポソームであり得る。当該リポソームは、実質的に内側の凍結保護物質を含有しないが、それらの表面で外側の凍結保護物質を含有し得、それゆえ凍結保護物質を含有する液存在下で凍結乾燥され得る。用語「実質的に内側の凍結保護物質がない（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ ｎｏ ｉｎｔｅｒｎａｌ ｃｒｙｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ）」とは、内側の凍結保護物質を含まないリポソーム、ならびに上記リポソームの凍結および／または凍結乾燥プロセスに影響しない凍結保護物質の量（すなわち、１２５ｍＭまたはそれ未満の凍結保護物質、つまり「不活性な」量）を含有するリポソームを含むことを意味する。それゆえ、「実質的に内側の凍結保護物質がない」は、リポソーム内に約０〜１２５ｍＭの凍結保護物質があることを規定する。凍結乾燥プロセス後の薬物漏出を予防することは、リポソームサイズの保持よりも顕著に難しいことに留意することが重要である。上述の通り、凍結乾燥後の薬物保持は、当該リポソーム内外両方での凍結保護物質の使用を介して、歴史的に達成されている。

それゆえ、１つの実施形態において、当該リポソームは、室温あるいは２５℃または３７℃よりも高い膜のゲル−液晶転移温度（Ｔ_Ｃ）を有し、そのため、少なくとも室温（例えば２５℃）で脂質膜は十分にゲル様であり、薬物の保持を補助する。当該組成物は、凍結乾燥および再構成の際、封入薬剤の保持性、減少した凝集および融合を与え、それゆえ拡張された貯蔵期間を有する使用に適した組成物を提供する。凍結乾燥プロセスからの増強された保護は、浸透ポテンシャルに依存しない。これらのリポソームは、薬学的に関連する条件下で長期間にわたって、それらのサイズ分布プロフィールおよび薬物封入プロフィールを維持する。

凍結乾燥リポソーム組成物を調製する方法は、それゆえ、凍結および凍結乾燥前のリポソーム膜が相転移温度Ｔ_Ｃ未満であるリポソームの外側に、選択された濃度で凍結保護物質を含み得る。好ましくは、当該リポソームは、薬物が封入されているリポソームを含む溶液ならびに凍結保護物質を含有するリポソーム外液のガラス転移温度（Ｔ_ｇ）未満の温度で凍結される。

本発明は、他の局面において、上記記載の実施形態に従って２つまたはそれ以上の治療薬および／または診断薬を含有する凍結乾燥リポソームを調製する方法、上記凍結乾燥組成物を再構成する方法、および動物に再構成されたリポソームを投与する方法、ならびに疾患（例えばガン）に罹患した動物、罹患しやすい動物、または罹患した疑いがある動物を治療する方法に関する発明でもある。

図１は、凍結前のＣＰＸ−１リポソームの粒子サイズプロフィールを示している。

図２は、凍結、凍結乾燥および再構成直後の再構成されたＣＰＸ−１リポソームの粒子サイズプロフィールを示している。

図３は、保存１ヶ月後の再構成されたＣＰＸ−１リポソームの粒子サイズプロフィールを示している。

図４Ａ〜４Ｃは、保存６ヶ月後の再構成されたＣＰＸ−１リポソームの粒子サイズプロフィールを示している。 図４Ａ〜４Ｃは、保存６ヶ月後の再構成されたＣＰＸ−１リポソームの粒子サイズプロフィールを示している。 図４Ａ〜４Ｃは、保存６ヶ月後の再構成されたＣＰＸ−１リポソームの粒子サイズプロフィールを示している。

本発明は、初めて、再構成された凍結乾燥組成物の特徴および性質が、凍結乾燥前の組成物の特徴および性質と本質的に一致するような、２つまたはそれ以上の治療薬および／または診断薬を含有する凍結乾燥ゲル相リポソーム組成物を提供する。これらの特徴としては、リポソームの平均直径、サイズ分布および内容が挙げられ得る。リポソームの内容とは、薬剤の保持をいい；いくつかの実施形態において、同様に保持される薬剤の割合をいう。

当該リポソームは、治療薬および／または診断薬を含有するが、本出願において「薬物」は、時々これらを指定する略記として使用される。

当該ゲル相リポソームは、内側のコンパートメントを取り囲む１つまたはそれ以上の脂質二重層を含んでいる。これらのリポソームは、二層または単層の小胞となり得る。単層リポソーム（単層小胞または「ＵＬＶ」としても公知である）は、単一の内側の水溶性コンパートメントを取り囲んでおり、小単層小胞（ＳＵＶ）または大単層小胞（ＬＵＶ）のいずれかに分類される。ＬＵＶおよびＳＵＶは、サイズにおいてそれぞれ約５０〜５００ｎｍおよび約２０〜５０ｎｍにわたる。二層のリポソームは、内側の膜が単一の内側の水溶性コンパートメントを囲み、２つ目の大きな外側の膜は、内側の膜を囲み、それゆえ２つ目の内側の水溶性コンパートメントを作り出す２つの脂質膜を有する。

当該ゲル相リポソームのサイズ分布の維持は、本出願の図１〜４に記載されたような、粒子サイズプロフィールを得ることによって、実験的に評価され得る。準弾性光散乱によって決定されたサイズ分布は、リポソームの平均直径を示しているヒストグラムとして典型的に表される。当該分野で最も一般的に使用される重要なサイズ分布の測定値は、Ｄ１０、Ｄ９０、Ｄ９９または標準偏差あるいは多分散指数である。「Ｄ９９」値は、９９％のリポソームが参照サイズ（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｄ ｓｉｚｅ）未満であり、または参照サイズよりも大きいことを意味する。これは、例えば、より大きいまたは小さいサイズいずれかを除外することが重要である場合、特に有用である。例えば、特定の実施形態において、平均直径が２００ｎｍを超えるリポソームが存在しないことを保証することが望ましい。

１７８ｎｍのＤ９９値を有する具体的な実施例は、例証するのに使用される。１７８ｎｍと測定するＤ９９値（実施例２の表１で見られるように）は、少なくとも９９％のリポソームの集合が１７８ｎｍ未満であることを保証する。平均直径についてＤ１０およびＤ９０値も、一般的に使用され、集合の１０％以下が最小の参照サイズよりも小さくなっているものであり（すなわちＤ１０）、Ｄ９０については、集合の９０％が参照サイズの上限またはそれ未満である。例えば、バッチ１および２で見られるように、Ｄ１０値は、６８ｎｍであり、リポソームの集合の１０％以下は６８ｎｍ未満である。Ｄ９０値は、バッチ１および２について、集合の９０％が、それぞれ１３５ｎｍまたは１３７ｎｍまたはそれら未満であることを示している。凍結乾燥および再構成後のリポソームのサイズ分布を維持するということは、選択されるＤ値の参照対象値（ｒｅｆｅｒｅｎｔ ｖａｌｕｅ）が、凍結および／または凍結乾燥前のＤ値と比較して、再構成の際、５０％、２５％、２０％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、または５％以下だけ変化することを示すことによって実証されるとして本明細書中において定義される。選択されたＤ値は、９９、９８、９４、および９０までの間に存在する整数、またはＤ１０であり得る。

凍結乾燥リポソームの特徴の１つは、当該組成物におけるリポソームの平均直径に関連する。凍結前の直径に基づいて、凍結乾燥後および再構成の際、リポソームの平均直径が、５０％、２５％、体積加重基準で２０％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％または５％より大きく増加しない場合、リポソーム組成物の平均直径は、再構成において維持されている。リポソームの平均直径における１０％の増加およびＤ９０（または上に列挙されているような他のＤ値）についての参照対象における１０％の増加のような併用値（ｃｏｎｃｏｍｉｔａｎｔ ｖａｌｕｅ）は、粒子（例えばリポソーム）のサイズ分布が変わらなかったこと保証するための１つの尺度である。分散の全性質もまた、好ましくは、図１〜４に示されるように体積加重基準で評価され得る。

より詳細には、リポソームの組成物は、ガウス曲線に典型的に従ったサイズの範囲を含有する。リポソームの平均直径は、凍結後の再構成の際、または凍結乾燥および再構成の際、最初のサイズから約３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％または５％以下だけ増加し得る。例えば、平均直径が９０ｎｍであるリポソームの試料は、再構成の際平均直径が３０％以下だけ大きい場合（すなわち、約１１７ｎｍ以下）、凍結および／または凍結乾燥の影響に抵抗すると考えられる。当該リポソームの凝集および融合が起こったことを示唆する場合よりもサイズが増加する。十分に感受性がある測定技術は、サイズ分布または平均直径の変化を測定するために使用され、その結果、１０％未満の変化が測定され得る。

完全性の保存についての別の判断基準は、封入薬剤の保持性である。凍結乾燥前の値と比較して評価される平均直径、サイズ分布および薬物の割合と異なり、薬物保持性は、再構成後に、薬物自体の総量との相対値として（すなわち、凍結乾燥組成物中の総薬物に基づいて）、評価される。リポソーム内に封入される薬物の割合、または、リポソーム外液中の薬物の割合（「非封入」％）は、当該組成物中の薬物の総量との相対値である。１つの実施形態において、少なくとも約７５％の封入薬剤が、凍結乾燥後および再構成の際、封入されたまま保持される。各々の少なくとも約８５％または少なくとも９０％あるいは９５％が、封入されたまま保持され得る。これは、同様に周囲の液中の非封入薬剤の量により測定され得、凍結乾燥リポソームの再構成の際、封入された最初の量の２５％、２０％、１５％、１０％または５％よりも高くなってはならない。

封入された治療薬および／または診断薬の割合は、当該割合が、凍結乾燥前の組成物自体における割合から２０％、１０％、９％、８％、７％、６％または５％より大きく変動しない場合、再構成において維持される。割合はモル比で表される。

１つの実施形態において、上記リポソームの凍結乾燥後および再構成の際のリポソームの平均直径は、凍結乾燥前の上記測定値と比較して、２５％以下だけ増加し得る。別の実施形態において、上記リポソームの凍結乾燥後および再構成の際のリポソームの平均直径は、凍結乾燥前の上記測定値と比較して、１５％以下だけ変化する。さらに他の実施形態において、上記リポソームの凍結乾燥後および再構成の際のリポソームの平均直径は、凍結乾燥前の上記測定値と比較して、１０％、９％、８％、７％、６％または５％以下だけ変化する。

いくつかの実施形態において、非封入薬物のパーセントは、上記リポソームの再構成の際、本来封入される薬物の２５％以下である。他の実施形態において、非封入薬物のパーセントは、上記リポソームの再構成の際、本来封入される薬物の１５％以下である。他の実施形態において、非封入薬物のパーセントは、上記リポソームの再構成の際、本来封入される薬物の１０％以下、または９％、８％、７％、６％あるいは５％以下である。

つまり、いくつかの実施形態において、保持される封入薬物のパーセントは、上記リポソームの再構成の際、７５％以上である。他の実施形態において、各封入薬物のパーセントは、上記リポソームの再構成の際、８５％または９０％または９５％以上である。

これらのパラメータの組み合わせもまた含められる。例えば、平均直径は、２５％以下だけ増加し得、封入薬物のパーセントが少なくとも９０％であり得、または平均直径は、１０％以下だけ増加し得、封入薬物のパーセントが少なくとも９０％であり得る。

いくつかの実施形態において、当該リポソームのサイズ分布は、凍結乾燥前と比較して、上記リポソームの凍結乾燥後および再構成の際、２５％以下だけ変化する。他の実施形態において、当該リポソームのサイズ分布は、凍結乾燥前と比較して、上記リポソームの凍結乾燥後および再構成の際、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％または５％以下だけ変化する。

上述の通り、これらのパラメータの様々な組み合わせ、またはリポソームをうまく凍結乾燥および再構成しているかの判断基準が考慮される−例えば、封入された薬物が少なくとも８５％であることが、平均直径の増加１５％以下と組み合わせられ、必要に応じてサイズ分布の変化５％以下のパラメータが組み合わせられる。これらのパラメータのそれぞれの考えられる組み合わせは、本発明の範囲内である。

ゲル相リポソームは、従来の技術で作られ得る。例えば、注入法（Ｄｅａｍｅｒ， ｅｔ ａｌ．， Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． （１９７８） ３０８：２５０）、界面活性剤の方法（ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ ｍｅｔｈｏｄ）（Ｂｒｕｎｎｅｒ， ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ （１９７６） ４５５：３２２）、凍結融解法（Ｐｉｃｋ， ｅｔ ａｌ．， Ａｒｃｈ． Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． （１９８１） ２１２：１８６）、逆相蒸発法（Ｓｚｏｋａ， ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ． （１９８０） ６０１：５５９−５７１）、超音波処理法（Ｈｕａｎｇ， ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ （１９６９） ８：３４４）、エタノール注入法（Ｋｒｅｍｅｒ ， ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ （１９７７） １６：３９３２）、押出法（ｅｘｔｒｕｓｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ）（Ｈｏｐｅ， ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ （１９８５） ８１２：５５−６５）、およびフレンチプレス法（Ｂａｒｅｎｈｏｌｚ， ｅｔ ａｌ．， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． （１９７９） ９９：２１０）のいずれかが挙げられる。

これらのプロセスは、組み合わせで使用され得る。小単層小胞（ＳＵＶ）は特に、超音波処理法、エタノール注入法およびフレンチプレス法によって調製され得る。大単層小胞（ＬＵＶ）は、注入法、界面活性剤の方法、凍結融解法、逆相蒸発法、フレンチプレス法または押出法のいずれかによって調製され得る。好ましくは、ＬＵＶは押出法に従って調製される。

凍結乾燥および再構成は、リポソームがゲル相である条件下で行われる。リポソームのゲル−液相転移温度は、それゆえ、室温（すなわち約２０〜３０℃）より高く、さらに好ましくは体温またはそれより上よりも高くなければならない。室温は、相当変化し得るが、凍結乾燥プロセスが、リポソームがゲル状である条件下で始まることが重要である。いくつかの実施形態において、Ｔ_Ｃは、少なくとも体温（すなわち約３７℃）と同じ高さである。いくつかの実施形態において、当該リポソームは、ゲル様を維持するために、当該相転移温度未満の温度で調製される。任意の適した内液が使用され得る。典型的には、内液は水性媒体である。当該内液は、実質的に、凍結保護物質を含有しない（すなわち１２５ｍＭ未満の凍結保護物質）。当該内液は、１００ｍＭ未満または５０ｍＭ未満の凍結保護物質を含有しても、凍結保護物質を含有しなくてもよい。

適したＴ_Ｃ値を有するリポソーム製剤は、「低コレステロール」リポソームであり得、すなわち、リポソームの相転移の特徴を顕著に変化させるには不十分であるコレステロールの量（すなわち、典型的に２０ｍｏｌ％またはそれ未満のコレステロール）存在下で調製され、含有する。２０ｍｏｌ％より高いコレステロールは、相転移が起こる温度域を広げ、より高いコレステロールレベルでは相転移が現れない。低コレステロールを有するリポソームは、２０ｍｏｌ％未満または１５ｍｏｌ％未満のコレステロール、あるいは１０ｍｏｌ％または５ｍｏｌ％またはそれ未満のコレステロールを有し得、あるいはコレステロールを有し得ない。そのようなリポソームは、必要に応じて、少なくとも１ｍｏｌ％のＰＧまたはＰＩのような安定化剤を必要とする。

凍結保護物質が使用される方法において、凍結保護物質は、好ましくは、製剤の外液中にのみ存在する。典型的には、凍結保護物質は、スクロース、マルトース、トレハロースおよびラクトースのような二糖類である。当該凍結保護物質は、約１００ｍＭ〜５００ｍＭまたは約２５０〜４００ｍＭあるいは３００ｍＭより高い濃度を有するスクロースのような二糖類であり得る。外液は約１００ｍＭ〜５００ｍＭ、内液は１２５ｍＭ未満の凍結保護物質を含有し得、または外液は約２５０ｍＭ〜４００ｍＭ、内液は１００ｍＭ未満の凍結保護物質を含有し得、または外液は約２５０ｍＭ〜４００ｍＭ、内液は５０ｍＭ未満の凍結保護物質を含有し得、あるいは外液は約２５０ｍＭ〜４００ｍＭの凍結保護物質を含有し、内液は凍結保護物質を含有しなくてもよい。当該凍結保護物質は、スクロースのような糖類であり得る。

ゲル相リポソーム製剤は、任意の適切なプロトコルを使用して凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ）（または凍結乾燥（ｆｒｅｅｚｅ−ｄｒｉｅｄ））され得る。凍結乾燥室の初期の温度は、好ましくは、外液を含む溶液、ならびに薬物が封入されているリポソームを含有する溶液のガラス転移温度（Ｔ_ｇ）未満である。例えば、リポソームは、約−５℃、約−１０℃、約−２０℃、約−３０℃または約−４０℃未満の温度で凍結され得る。いくつかの実施形態において、凍結保護物質の溶液としてスクロースが使用された場合、凍結乾燥室の開始温度は、スクロース溶液のＴ_ｇである−３２℃未満である。「Ｔ_ｇ」は、非凍結溶液がやわらかく粘性のゲルから、固く相対的に脆い形態への転移が起こる、およその中点温度である「ガラス転移温度」および「ガラス相転移温度」を含む。

凍結乾燥リポソームは、室温またはそれ未満で保存され得る。いくつかの例証された実施形態は、５℃またはそれ未満で保存されるリポソームを有する。いくつかの他の例証された実施形態は、２５℃で保存されるリポソームを有する。凍結乾燥製品は、少なくとも約６ヶ月間、少なくとも９ヶ月間、少なくとも１年間または少なくとも２４ヶ月〜３６ヶ月間、安定したままである（例えば、相対的な粒子サイズを保持し、封入薬物を維持する）。

捕捉された薬剤は、治療薬または診断薬、時々抗ガン剤である。驚くべきことに、ゲル相リポソーム組成物の内容および完全性は、たとえ当該薬剤が、水性溶媒および非水性溶媒に関する溶解特性が異なっても、維持される。本発明のアプローチを使用して、ｌｏｇ分配係数（ＬｏｇＰ）が１．０だけ異なる薬剤は、うまく保持され得る。１．５、２．０または３．０のｌｏｇ分配係数における差は、同様に許容され得る。薬剤の１つは、両親媒性であり、その一方で、もう１つは水溶性であり得るか、または、疎水性であり得、その一方で、もう１つは水溶性である得る。ＬｏｇＰ値は、オクタノールと水との間の分散係数に基づいており、すなわち、化合物が相分離を受ける場合の、水の量に対するオクタノールの量の比の底が１０の対数である。

抗ガン剤としては、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシンまたはイダルビシン）が挙げられ得る。これらの薬剤は、両親媒性である。当該抗ガン剤としては、ヌクレオシドアナログ（例えば、親水性であるシトシンアラビノシド、５−ＦＵまたはＦＵＤＲ）が挙げられ得る。その他の抗ガン剤としては、両親媒性であるイリノテカンのようなカンプトテシンまたはカンプトテシン誘導体が挙げられる。アントラサイクリンおよびヌクレオシドアナログの両方は、いくつかの場合において封入され、またはカンプトテシンまたはカンプトテシン誘導体およびヌクレオシドアナログの両方が封入される。リポソームへの薬剤の封入および／またはロードは、受動的および能動的なロードを含む任意の適切なロード技術を使用して、行われ得る。重要な実施形態としては、上で引用された米国特許第７，８５０，９９０号および米国特許第８，０２２，２７９号に記載されたもの（すなわち、モル比１：１のイリノテカン：フロクスウリジン（ＦＵＤＲ）、およびモル比１：５のダウノルビシン：シタラビン（ＡｒａＣ）の組み合わせ）が挙げられる。これらの薬物の特定の製剤は、それぞれＣＰＸ−１およびＣＰＸ−３５１を指定する。

当該薬物は、受動的または能動的なロード手順、あるいはそれらのいくつかの組み合わせのいずれかによって、リポソーム内の水溶性コンパートメント（単数または複数）に取り込まれる。受動的なロードにおいて、生物活性薬剤は、リポソームが形成される調製物中に単に含まれ得、あるいは当該活性薬剤が形成前リポソームの外側に加えられ得、そして濃度の下り勾配に従ってリポソーム中に受動的にロードされる。必要に応じて、非封入物質は、任意の適した手順によって調製物から取り除かれ得る。あるいは、イオン勾配、イオン透過孔、ｐＨ勾配および金属錯体に基づく金属ベースのロード方法のような能動的なロード手順が使用され得る。適した薬物について一般的に使用される１つの実施形態は、金属ベースの方法によってロードすることである。

リポソームは、約８０〜５００ｎｍのサイズである。１つの実施形態において、リポソームは、３００ｎｍ未満、時々２００ｎｍ未満の直径を有する。１つの実施例において、これらのリポソームの通常のサイズは、約１００ｎｍである。いくつかの実施形態において、リポソーム膜は、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルグリセロール（ＤＳＰＧ）およびコレステロール（ＣＨＯＬ）からなる。いくつかの実施形態において、リポソーム膜は、５０〜８０％のＤＳＰＣ、１〜２０％のＤＳＰＧおよび１〜２０％のＣＨＯＬからなる。他の実施形態において、リポソーム膜は、５０〜８０％のＤＳＰＣまたはＤＰＰＣ、１〜２０％ＤＳＰＧまたはジステアロイルホスファチジルイノシトール（ＤＳＰＩ）、１〜２０％ＣＨＯＬから構成され、そして当該リポソームは、リポソーム内液中に１２５ｍＭ未満の凍結保護物質を含有する。いくつかの例証された実施形態において、リポソーム膜は、５０〜８０％のＤＳＰＣまたはＤＰＰＣ、１〜２０％のＤＳＰＧまたはＤＳＰＩ、１〜２０％のＣＨＯＬから構成され、そして当該リポソームは、リポソーム内液中に５０ｍＭ未満の凍結保護物質を含有する。その他に例証された実施形態において、リポソーム膜は、モル比約７：２：１でＤＳＰＣ、ＤＳＰＧおよびＣＨＯＬから構成され、リポソーム内液中に凍結保護物質を含有しない。１つの例において、リポソームは、リポソーム法由来の油中水によって調製され、押出されたリポソームは、ｐＨ７．０のリン酸緩衝スクロース（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓｕｃｒｏｓｅ）中に懸濁される。別の例において、押出されたリポソームは、スクロース中に懸濁される。１つの実施形態において、押出されたリポソームは、２５０〜４００ｍＭスクロース中に懸濁される。

リポソーム中に薬物の組み合わせを封入する任意の適した方法が使用され得る。具体的な実施形態において、イリノテカンおよびフロクスウリジンは、ＤＳＰＣ／ＤＳＰＧ／ＣＨＯＬ（７／２／１）形成前リポソームに同時にロードされ、それによって、内液中の硫酸銅または銅グルコネートを使用して、５０℃で、フロクスウリジンはリポソームへ受動的にロードされ、イリノテカンは能動的にロードされる。参照によって援用される共願にかかる米国特許第７，８５０，９９０号および７，２３８，３６７号の両方を参照のこと。別の具体的な実施形態において、シタラビンおよびダウノルビシンは、リポソーム中に封入され、それによって、銅グルコネート／トリエタノールアミンベースのロード手順を使用して、高いトラップ効率で、シタラビンは受動的に形成前リポソームに封入され、ダウノルビシンはリポソーム内に能動的に蓄積される。例えば、全体が参照によって援用される同時係属および共願にかかるＰＣＴ出願の国際公開第０５／１０２３５９号および国際公開第０７／０７６１１７ Ａ２号両方も参照のこと。

本発明の凍結乾燥組成物は、保存、貯蔵および輸送の容易さにおける利便性を提供する。これらの凍結乾燥組成物は、長期間にわたってそれらの特徴を維持する。

使用のために、本発明の組成物は、適した薬学的な担体または媒体中に再構成される。

使用のためのこれらの製剤は、薬学的に許容され得る担体を使用する標準再構成技術に従って、調製される。一般的に、通常の生理食塩水は、薬学的に許容され得る担体として使用される。その他の適した担体としては、例えば、水、緩衝用水（ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｗａｔｅｒ）、デキストロース、０．４％塩化ナトリウム、０．３％グリシンなどが挙げられ、増強された安定性のために、アルブミン、リポタンパク質、グロブリンなどのような糖タンパク質を含んでいる。これらの組成物は、通常の周知の滅菌技術によって滅菌され得る。得られた水性溶液は、使用のために包装され、または無菌条件下でフィルターされ、そして凍結乾燥され、凍結乾燥された調製物は、投与前に滅菌水性溶液と組み合わせられ得る。当該組成物は、およその生理条件に対して必要とされるような薬学的に許容され得る補助物質（ｐＨ調整剤および緩衝剤、浸透圧調整剤などのような、例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウムなど）を含有し得る。そのうえ、リポソーム懸濁液は、保存におけるフリーラジカルおよび脂質の過酸化の損傷から脂質を保護する脂質保護剤を含み得る。αトコフェロールおよび水溶性鉄特異的キレート剤（例えばフェリオキサミン）のような親油性のフリーラジカルクエンチャーが適している。

再構成された製剤は、ヒトまたは他の哺乳類（例えば、ヒトではない霊長類、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジなど）を含む動物に投与され、様々な疾患の治療に使用され得る。本発明の組成物の医学的使用の例としては、ガンの治療、高血圧、不整脈および再狭窄のような循環器疾患の治療、細菌性、真菌性または寄生性の感染の治療、ワクチンとしての本発明の組成物の使用を介する疾患の治療および／または予防、炎症の治療あるいは自己免疫疾患の治療が挙げられるが限定されない。ヒトの病気の治療のために、資格ある医師は、確立したプロトコルを使用して、どのように本発明の組成物が、用量、スケジュールおよび投与経路に関して利用されるべきか、決定する。そのような適用においては、本発明のリポソームおよび脂質担体中に封入された生理活性薬剤が、被験者の健常な組織に対して減少した毒性を示すかどうか、用量漸増も利用し得る。

当該薬学的組成物は、典型的に非経口的（例えば、静脈内に）に投与されるが、その他の経路が使用され得る。リポソーム製剤の投与量は、患者の年齢、体重および状態に基づく、脂質に対する薬物の割合および投与する医師の意見に依存する。

全体的にみると、本発明において有用である１つのプロセスは、リポソーム組成物を凍結乾燥することを含み、ここで上記リポソームが２０ｍｏｌ％またはそれ未満のコレステロールおよび２つまたはそれより多くの活性薬剤を含み、そして、室温で、かつ凍結保護物質を含有する外液における場合、当該リポソーム膜が相転移温度未満であり；凍結乾燥リポソームを保存すること；所定の水溶性の容量中に凍結乾燥リポソームを再構成することを含む。当該リポソームは、約−５℃未満、または約−１０℃未満および−２０℃未満、あるいはさらに約−３０℃または−４０℃未満の温度で凍結乾燥され、室温（約２３〜２５℃）またはそれ未満で保存され得る。

１つの実施形態において、当該リポソーム組成物は、２〜２０％コレステロールまたは１０％コレステロールのような任意の中間値のコレステロールで構成される。

１つの実施形態において、当該凍結乾燥組成物は、約１０％のコレステロール、外液中に選択された濃度の二糖で構成されるリポソームを含み、室温で行われる再構成は、Ｔ_Ｃ未満であり、凍結保護物質は、リポソームの外側のみにおいて結合せずに存在する。

別の実施形態において、水性媒体の所定の体積を用いる再構成の際、２つまたはそれより多くの封入薬物を含む凍結乾燥リポソーム組成物は；（ａ）２０ｍｏｌ％またはそれ未満のコレステロールを含有するリポソーム、（ｂ）大部分が約８０〜５００ｎｍの間のリポソームサイズ、（ｃ）薬剤の封入パーセントが約９５％、９０％、８５％、８０％または７５％以上であるリポソームに捕捉された薬剤（単数または複数）、および（ｄ）リポソーム外液中の約１００ｍＭ〜５００ｍＭの間の凍結保護物質を、含んでいるリポソーム組成物をもたらす。いくつかの実施形態において、２５０〜４００ｍＭの間の凍結保護物質が、リポソーム外液中に存在する。いくつかの実施形態において、約９．５〜１０％の凍結保護物質が、リポソーム外液中に存在する。

１つの実施形態において、２０ｍｏｌ％またはそれ未満のコレステロール、少なくとも２つの薬物、およびリポソーム外に少なくとも約３００ｍＭのスクロースを含む単層または二層のゲル相リポソームが凍結乾燥され、再構成の際、少なくとも約９０％の各封入薬物が封入され、そして平均リポソーム直径が約２５％未満変化する。

本明細書中で使用される場合、「１つ（ａ）」または「１つ（ａｎ）」は、単一の指示対象のみが意図されることが文脈から明らかでない限り、「少なくとも１つ」または「１つまたはそれよりも多い」ことを意味する。

以下の実施例は、単に例示するために提供されるが、本発明を限定するものではない。

実施例１
ＣＰＸ−１の凍結乾燥
１：１のイリノテカンおよびフロクスウリジンを、ＤＳＰＣ／ＤＳＰＧ／コレステロール（７：２：１モル比率）リポソームおよび指定されたＣＰＸ−１中に、ともに封入する。凍結乾燥したＣＰＸ−１は、結果として安定した薬物負荷リポソームとなり、その結果、再構成された剤形から活性医薬成分の最小の漏出があった。ＣＰＸ−１において使用されるイリノテカン塩酸塩は、３．９４の予測されるＬｏｇ分配係数（ＬｏｇＰ）を有する。フロクスウリジンは、−１．１４の予測されるＬｏｇＰを有する。

ＣＰＸ−１リポソーム薬の製品について、様々なロットを使用して、熱分析を行い、ガラス転移温度（Ｔ_ｇ）、熱容量の変化およびその他の発熱性の事象に関する情報を提供した。ＣＰＸ−１リポソーム薬の製品の崩壊温度を、凍結乾燥顕微鏡によって、２つのロットについて決定した。最終凍結乾燥サイクルの決定において、これらの結果を使用した。

試料は、１：１の比率でイリノテカン塩酸塩およびフロクスウリジンの２つの活性医薬成分を含むリポソームで製剤された青緑色バルク水性懸濁液からなった。試料は、周辺相対湿度で、−２０℃（または場合によっては−８０℃）で保存し、冷蔵庫内で一晩解凍し、充填および凍結乾燥の前によく混合した。

サイクル１：２０ｍＬクラスＡピペットを使用して、２０ｃｃのＣＰＸ−１を６０ｃｃのガラス成形バイアルに充填した。２４個のバイアルを、ＬｙｏＳｔａｒＩＩ Ｔｒａｙ Ｄｒｙｅｒ中にロードし、２個の製品バイアルに熱電対プローブを取り付け、製品の温度を記録し、４日半にわたって凍結乾燥した。約７２０，０００ｍＴｏｒｒのチャンバー圧力まで、窒素ガスで当該バイアルを埋め戻した後、当該バイアルに栓をし、Ｔｒａｙ Ｄｒｙｅｒから取り外し、Ｌｏｔ ＴＰ−ＣＰＸ１−００１−０３２４０５とラベルした。いくつかの凍結乾燥したバイアルを、その後、２５℃および４０℃の加速安定性に置き、残りのバイアルは−２０℃で保存した。

サイクル２：約２１ｍＬのＣＰＸ−１を、６０ｃｃのガラス形成バイアルおよび５０ｃｃガラス管バイアルにそれぞれ充填した。当該バイアルは、ＬｙｏＳｔａｒＩＩ^ＴＭ Ｔｒａｙ Ｄｒｙｅｒ中にロードし、上段の１個の製品バイアルおよび下段の１個の製品バイアルに１個に熱電対プローブを取り付けた。凍結乾燥サイクル完了時、当該バイアルを、約７２０，０００ｍＴｏｒｒのチャンバー圧力まで、窒素ガスで埋め戻し、栓をし、Ｔｒａｙ Ｄｒｙｅｒから取り外し、そしてＬｏｔ ＴＰ−ＣＰＸ１−００２−０４１３０５Ｔとラベルした。いくつかの凍結乾燥したバイアルを、その後、２５℃および４０℃の加速安定性に置き、残りのバイアルは−２０℃で保存した。

サイクル３：凍結乾燥の試料は、５０ｃｃのガラス管バイアルに充填されることのみを除いて、サイクル２と同様の態様で調製された。密封されたバイアルを、ＣＰＸ−１製剤、Ｌｏｔ ＴＰ−ＣＰＸｌ−００３−０５１１０５Ｔとラベルした。いくつかの凍結乾燥したバイアルを、その後、２５℃および４０℃の加速安定性に置き、残りのバイアルは−２０℃で保存した。

サイクル４：凍結乾燥の試料は、ＣＰＸ−１が５０ｃｃのガラス管バイアルに充填されることを除いて、サイクル２と同様の態様で調製された。密封し、凍結乾燥したバイアルを、ＣＰＸ−１製剤、Ｌｏｔ ＴＰ−ＣＰＸｌ−００４−０５１８０５Ｔとラベルし、安定性試験のために、−２０℃、５℃、２５℃および４０℃で保存した。

サイクル５：凍結乾燥の試料は、５０ｃｃのガラス管バイアルに充填されるサイクル２と同様の態様で調製された。密封し凍結乾燥したバイアルを、ＣＰＸ−１製剤ＴＰ−ＣＰＸｌ−００５−０６２７０５Ｔ−３００とラベルした。当該ＣＰＸ−１リポソーム製剤バイアルを、安定性チャンバーに−２０℃、５℃および２５℃で保存した。

最初の凍結乾燥サイクルの実行。最初の凍結乾燥サイクルの実行（サイクル１）についての第一目標は、製剤化バルクＣＰＸ−１リポソーム製剤（ＣＰＸ−１）を、おだやかに、２段階１次乾燥フェーズで、首尾よく凍結乾燥できるか、決定することであった。この凍結乾燥の実行の成功を、当該製剤の温度および圧力プロフィールを分析することによって、ならびに凍結乾燥ケーキの外観を視覚的に検査することによって、評価した。

サイクル１についての凍結乾燥製品プロフィールは、−１０℃の１次乾燥段階の間、バルク氷が取り除かれたことを示した。当該製品の温度が、わずかに棚の温度を超えていたことにおいて、これは明らかであった。また、真の圧力および水蒸気の分圧を測定する熱電対圧力は、静電容量型圧力計の圧力または真の圧力のそれに向かって減少した。さらに、当該凍結乾燥製剤バイアルは、ケーキ崩壊のほとんど、またはまったくの証拠がなく、乾燥して見えた。しかしながら、いくつかの分析物の濃縮または層形成が観察された。当該サイクルを最適化するために、熱処理のフェーズおよび１次乾燥段階を、２回目の実行のために変更した。

２回目の凍結乾燥サイクルの実行。サイクル１と同様のおだやかな１次および２次乾燥フェーズを使用して、２回目の凍結乾燥の実行（サイクル２）を行った。凍結乾燥機における氷のロードを最大化するために、脱イオン水で充填されたバイアルを、空いている棚の空間にロードした。当該凍結乾燥の実行の成功もまた、温度および圧力プロフィールによって、ならびに凍結乾燥ケーキを視覚的に検査することによって、評価した。

たとえ５０ｃｃガラス管バイアルおよび６０ｃｃガラス成形バイアルについて、４日半のサイクルにわたる製品温度および圧力プロフィールが、似ていたとしても、５０ｃｃ管バイアル中の製剤は、より均一な態様で凍結乾燥しているようであった。２次乾燥の棚温度に達した後、約８時間半、当該製品温度は、氷の障壁を超えることで（すなわち、当該製品温度が０℃を超える）、バルク氷の昇華の完了を示した。しかしながら、これらのバイアルは、十分に乾燥されなかった。当該製品温度は、１次乾燥フェーズの最後で、棚温度を下回り、熱電対の圧力と静電容量型圧力計の圧力との間の差は、２次乾燥フェーズの最後を通して、実行の初めから変わらず、これらのことは、バイアル中の実質的なバルク氷の存在を示している。

１次乾燥フェーズにおいて使用された棚温度は、製品の昇華速度を駆動し完了させるのに十分なエネルギーを与えることができなかったため、３回目の凍結乾燥サイクルを行い、氷の昇華を増加させる棚温度およびチャンバー圧力を使用することによって（一方で崩壊温度を超えないように）、１次乾燥フェーズを駆動し完了させた。

３回目の凍結乾燥サイクルの実行。サイクル２および熱分析の結果に基づいて、１次乾燥を促進するように、サイクル３についての棚温度およびチャンバー圧力を調節し、一方で、−２０℃の推定崩壊温度より低く製品温度を維持した。氷のロードを最大化するために、完全にロードされる実行条件下で、当該サイクルを行った。

サイクル３で得られたプロフィールプロットは、１００ｍＴｏｒｒの圧力で−２０℃の開始１次乾燥棚温度では、完全にロードされる実行条件下４０時間において、バルク氷の昇華を十分に駆動しなかったことを示した。また、熱電対の圧力トレースは、−１０℃の１次乾燥フェーズの最後まで、このフェーズの制限される持続時間のため、静電容量型圧力計の圧力に向かって顕著に減少しなかった。しかしながら、当該プロフィールは、−１０℃の２回目の１次乾燥棚温度および持続時間が、すべてのバルク氷が昇華するまで、−２０℃の崩壊温度より低く製品温度を維持し得、このことが、当該フェーズの最後で当該棚温度を最終的に超える製品温度の急激な上昇において明らかであることを例示した。

４回目の凍結乾燥サイクルの実行。１次乾燥フェーズについての棚温度を最終的に決定するために、４回目の凍結乾燥サイクル（サイクル４）では、完全にロードされる実行条件下、−２０℃で６時間の開始１次乾燥段階とともに、より長い持続時間で−１０℃の棚温度を使用した。

凍結乾燥サイクルのプロフィールおよび視覚的観察に基づいて、開始１次乾燥フェーズについて−２０℃の棚温度が、バイアルを乾燥させることにおいて、ほとんど利点を有していないようだった。製品温度のプローブは、約６０時間の保持時間の後、−１０℃の棚温度を超えた。当該製品温度のプロフィールが、棚温度の熱電対の圧力と緊密に一致していたため、２次乾燥フェーズの間の熱電対の圧力は、バイアルが比較的低い残留水分を有していたことを示した。

医薬物質の封入、リポソームの粒子サイズおよび平均残留水分を、凍結乾燥製品のバイアルについて評価した。使用されたカールフィッシャー法では、３．１％の平均残留水分量を回収し、それは過度に乾燥したリポソーム製品ではなかった。また、粒子サイズおよびイリノテカンの封入％の分析の結果、当該凍結乾燥製品が、凍結乾燥前物質と比較して変わらなかったことを見出した。しかしながら、非封入フロクスウリジンの割合は、−２０℃で１３週間保存した場合、凍結乾燥前バルクにおける７．０％から凍結乾燥製品における８．６％まで増加した。また、２５℃で４週間、当該製品にストレスを与えた後、非封入フロクスウリジンの割合は、１１．８％まで増加し、この製剤について、非封入フロクスウリジンを１０％以下とする暫定的な規格を超えた。

５回目の凍結乾燥サイクルの実行。５回目の凍結乾燥サイクルの実行（サイクル５）の目標は、完全にロードされる実行条件下で適切な残留水分を達成しつつ、フロクスウリジンの漏出を最小化するために、＋２０℃から＋１０℃までの２次乾燥フェーズについての棚温度を決定することであった。この物質の水分量は、２次乾燥フェーズの間、定期的に圧力上昇測定を行うことで評価した。

サイクル５についての製剤プロフィールは、７２〜８４時間の−１０℃での１次乾燥の後、バルク氷が大部分昇華したことを示した。さらに、圧力検出器の違いおよび圧力上昇試験に基づくと、５０ｍＴｏｒｒで１２時間、＋１０℃の棚温度を使用することで、当該物質は十分に乾燥するようである。

この凍結乾燥物質の適合性を評価するために、サイクル４および５両方からの凍結乾燥製剤バイアルについての再構成時間を、１８ゲージ針および３０ｃｃのシリンジを用いて、栓を通して注射された１９ｍＬの水を使用して評価した。平均再構成時間は、サイクル４および５それぞれについて、４０および９３秒であると決定した。さらに、サイクル５についてのカールフィッシャーの結果は、３．２％の平均残留水分を回収し、サイクル４からのバイアルの平均残留水分と一致した。

医薬物質の封入およびリポソームの粒子サイズもまた評価した。サイクル５の凍結乾燥製剤について、非封入イリノテカンの割合は、−２０℃での保存７週間後に０．４％、および２５℃での保存４週間後に０．９％であった。凍結乾燥製剤の粒子サイズは、−２０℃で保存した場合の製剤と比較して、５℃での保存８週間後、ほんのわずかに増加したが、２５℃での保存わずか４週間後、ほとんど１０ｎｍ増加した。当然、非封入フロクスウリジンの割合は、粒子サイズの変化と同様の傾向を示した。非封入フロクスウリジンの割合は、−２０℃で７週間後５．５％、５℃で８週間後７．７％および２５℃で４週間後１８．７％だった。

２次乾燥フェーズの間の減少した棚温度を使用した５回目の凍結乾燥サイクルの実行によって、増加した封入物の保持力を有する許容可能な凍結乾燥ＣＰＸ−１リポソーム製剤を製造することに成功した。

実施例２
凍結乾燥リポソームにおいて、時間とともに変わらない粒径サイズプロフィール
二重にロードされるＣＰＸ−１およびＣＰＸ−３５１リポソームのサイズ分布に対する、凍結、凍結乾燥および保存の影響を調べるために、実験を行った。ＣＰＸ−３５１は、ジステアロイルフォスフォコリン（ＤＳＰＣ）：ジステアロイルフォスファチジルグリセロール（ＤＳＰＧ）：およびコレステロール（ＣＨＯＬ）がモル比で７：２：１であるリポソーム中に、モル比が１：５のダウノルビシンおよびシタラビンを有する製剤である。ダウノルビシンは、１．６８の予測されるＬｏｇＰを有する。シタラビンは、−２．１７の予測されるＬｏｇＰを有する。

同時にロードされたリポソームの粒子サイズの分布を、リポソームの凍結および凍結乾燥の前後だけでなく凍結乾燥製剤の保存の１ヶ月よび６ヶ月後にも測定した。

ＣＰＸ−１リポソームを、３００ｍＭのスクロース、２０ｍＭのリン酸、ｐＨ７．０の外部バッファーで調製した。９００μｌの一定分量を２ｍＬのバイアルに加え、金属皿（−２０℃まで予備冷却）中に置き、−２０℃で一晩保存した。凍結後、当該試料を凍結乾燥機（−２０℃まで予備冷却）へ移した。減圧を行い、棚温度を７時間−２０℃で維持し、その後、約１６時間で−１０℃まで上げた。第３温度ステップについては、その後、当該棚温度を、次の３時間でさらに４℃まで上昇させ、その後、室温で３時間の乾燥で終了した。乾燥試料を１ｍＬのＨ_２Ｏで水和し、直ちに凍結乾燥ケーキを溶解した。その後、試料を、動的光散乱（ＤＬＳ）を使用して分析した。

あらかじめ凍結したＣＰＸ−１リポソームは、１１０ｎｍの平均サイズの直径を示した（図１）。凍結乾燥および再水和直後のリポソームサイズは、１１６ｎｍであることが観察された（図２）。凍結乾燥リポソームＣＰＸ−１の２つの試料を、１ヶ月または６ヶ月間５℃で保存し、再水和組成物のリポソームサイズを観察した。各平均リポソームサイズは、それぞれ１１７ｎｍおよび１２３ｎｍだった（それぞれ図３および図４）。図１〜３は、体積加重（ｖｏｌｕｍｅ ｗｅｉｇｈｔｅｄ）分布を示している。図４Ｂは、比較体積加重分布を示している。他のさほど好ましくないアルゴリズムの結果を、図４Ａおよび４Ｃに示している。そうではないと規定しない限り、平均直径は、体積加重分布をいう。

図１〜４に代表されるものと同様の実験を、ＣＰＸ−３５１リポソームについても行った。

上述の通り、ＣＰＸ−３５１は、抗悪性腫瘍薬シタラビンおよびダウノルビシン塩酸塩の固定された組み合わせのリポソーム製剤である。リポソームは、モル比７：２：１でＤＳＰＣ、ＤＳＰＧおよびＣＨＯＬを使用し、銅グルコネート−トリエタノールアミンバッファー、ｐＨ７．４で作られる。粗製リポソームを押出して（ｅｘｔｒｕｄｅｄ）、平均リポソーム直径が８０ｎｍと１１０ｎｍの間であり、Ｄ９９が２００ｎｍ未満（動的光散乱による分析）のリポソーム粒子のサイズ分布をもたらす。シタラビンを受動的なロードメカニズムによって封入する。ダウノルビシンを、能動的な銅媒介メカニズムによって封入し、シタラビン：ダウノルビシンの５：１のモル比を達成する。任意の非封入薬物を取り除き、バルクバッファーをダイアフィルトレーションによって変更する。３００ｍＭスクロースの複数のボリュームを交換し、ＣＰＸ−３５１リポソームの最終物とし、その後、凍結乾燥の最適化に供される。乾燥したＣＰＸ−３５１試料を１９ｍＬのＨ_２Ｏで再構成し、リポソームの分散を直ちに再編成する。その後、試料を、動的光散乱（ＤＳＬ）を使用して分析する。

あらかじめ凍結乾燥したＣＰＸ−３５１リポソームは、約１００ｎｍの平均サイズの直径を示した。凍結およびその後の凍結乾燥／再水和直後のリポソームサイズは、バッチ１（下表１の「１Ｃ００１」）について、それぞれ９９ｎｍおよび１００ｎｍであることが観察された。２回目のバッチ、１Ｄ００２については、凍結およびその後の凍結乾燥／再水和直後のＣＰＸ−３５１リポソームサイズは、それぞれ１０４ｎｍおよび１０５ｎｍであることが観察された。

これらの結果は、イリノテカン＋フロクスウリジンまたはシタラビン＋ダウノルビシンのいずれかを同時にロードされたＤＳＰＣ／ＤＳＰＧ低コレステロールリポソームが、凍結ならびに凍結乾燥および長期間の保存の際、当該リポソームのサイズ分布プロフィールを効果的に維持することを示している。この結果は、低コレステロールで調製されたこれらのゲル相リポソームが、高レベルのコレステロール非存在下において特に凍結および凍結乾燥に共通して生じる凝集および融合に抵抗性があることも示している。

実施例３
凍結乾燥リポソームにおいて、時間とともに変わらない薬物封入パーセント
二重にロードされたＣＰＸ−１またはＣＰＸ−３５１リポソームからの薬物漏出の程度に対する、凍結および／または凍結乾燥ならびに保存の影響を調べるために、実験を行った。

同時にロードされたＣＰＸ−１リポソーム中に封入されたイリノテカンおよびフロクスウリジンンの量を、凍結乾燥（「開始」）直後だけでなく５℃での保存６ヶ月および９ヶ月後にも測定した。安定性試験の結果、イリノテカンの封入パーセント（％）が、凍結乾燥直後に９９％、保存６ヶ月後に９７％、および保存９ヶ月後に９７％であることを実証した（下表２）。同様に、フロクスウリジンの封入パーセントは、凍結乾燥直後に９８％、５℃での保存６ヶ月および９ヶ月後の両方で９５％だった（下表３）。

ＣＰＸ−３５１リポソームについて、薬物封入パーセントに対する凍結および凍結乾燥の影響もまた調査した。下表４を見ると、同時にロードされたＣＰＸ−３５１リポソーム中に封入されたシタラビンの量は、２つの別個のバッチ（１Ｃ００１および１Ｄ００２）において、凍結（「完全な凍結」）直後１００％および凍結乾燥（「完全な凍結乾燥」）直後９８％であると測定された。ダウノルビシンの封入パーセントは、両方のバッチにおいて、凍結および凍結乾燥直後の両方で９９％だった。薬物封入は、ＣＰＸ−３５１が５℃または２５℃で保存される場合でも安定である（下表５および６）。

これらの結果は、外部溶液において少量のコレステロールおよび凍結保護物質を取り込んでいるＣＰＸ−１およびＣＰＸ−３５１両方のゲル相リポソームが、両方の封入薬物最小の漏出で、効率的に凍結し、脱水し、そして再構成され得ることを、明らかに実証している。

Claims (28)

1. 凍結乾燥ゲル相リポソーム組成物であって、ここで、該ゲル相リポソームが、少なくとも２５℃の溶融相温度（Ｔ_Ｃ）を示し、少なくとも２つの治療薬および／または診断薬と安定に会合し、実質的に内側の凍結保護物質を含有せず、そして、
   ここで、該ゲル相リポソーム組成物が再構成される場合、該リポソームの平均直径が、凍結乾燥前の該組成物と比較して維持され、該薬剤が該リポソーム中に保持される、組成物。
2. 封入された前記薬剤が固定された割合であり、前記組成物が再構成される場合、前記薬剤の割合が、凍結乾燥前の該組成物と比較して２５％以下変化する、請求項１に記載の組成物。
3. 前記リポソームが、少なくとも３７℃である相転移温度（Ｔ_Ｃ）を有する、請求項１に記載の組成物。
4. 前記リポソームの平均直径が、凍結乾燥前に測定された該値と比較して、前記リポソームの凍結乾燥後および再構成の際、２５％以下増加する、請求項１に記載の組成物。
5. 前記リポソームの平均直径が、凍結乾燥前に測定された該値と比較して、前記リポソームの凍結乾燥後および再構成の際、１５％以下増加する、請求項４に記載の組成物。
6. 前記リポソームの平均直径が、凍結乾燥前に測定された該値と比較して、前記リポソームの凍結乾燥後および再構成の際、１０％以下増加する、請求項５に記載の組成物。
7. 各薬剤の少なくとも７５％が、前記リポソームの再構成の際保持される、請求項１に記載の組成物。
8. 各薬剤の少なくとも８５％が、前記リポソームの再構成の際保持される、請求項７に記載の組成物。
9. 各薬剤の少なくとも９０％が、前記リポソームの再構成の際保持される、請求項８に記載の組成物。
10. 前記リポソームのサイズ分布が、前記リポソームの凍結乾燥後および再構成の際、２５％以下変化する、請求項１に記載の組成物。
11. 前記リポソームのサイズ分布が、前記リポソームの凍結乾燥後および再構成の際、１５％以下変化する、請求項１０に記載の組成物。
12. 前記リポソームのサイズ分布が、前記リポソームの凍結乾燥後および再構成の際、１０％以下変化する、請求項１１に記載の組成物。
13. 前記リポソームが、２０ｍｏｌ％以下のコレステロールを含み、少なくとも１ｍｏｌ％のホスファチジルグリセロール（ＰＧ）および／またはホスホイノシトール（ＰＩ）を含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組成物。
14. 凍結保護物質が、前記リポソームの外側に存在する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組成物。
15. 前記凍結保護物質が、スクロースである、請求項１４に記載の組成物。
16. 前記薬剤が、少なくとも１．０だけ異なるｌｏｇ分配係数を有する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組成物。
17. 前記薬剤が、抗悪性腫瘍薬である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組成物。
18. 前記抗悪性腫瘍薬の少なくとも１つが、ヌクレオシドアナログであり、または
    前記抗悪性腫瘍薬の少なくとも１つが、アントラサイクリンである、請求項１７に記載の組成物。
19. 前記抗悪性腫瘍薬が、ダウノルビシンおよびシタラビンである、請求項１８に記載の組成物。
20. ダウノルビシン：シタラビンの比が、モルベースで１：５である、請求項１９に記載の組成物。
21. 前記抗悪性腫瘍薬が、イリノテカンおよびフロクスウリジンである、請求項１８に記載の組成物。
22. イリノテカンおよびフロクスウリジンのモル比が、モルベースで１：１である、請求項２１に記載の組成物。
23. 請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組成物を調製する方法であって、少なくとも２５℃の溶融相温度（Ｔ_Ｃ）を示し、少なくとも２つの治療薬および／または診断薬と安定に会合し、実質的に内側の凍結保護物質を含有しないゲル相リポソームを含む水性媒体を凍結乾燥に付すことを含む、方法。
24. ゲル相リポソームを含む前記媒体が、前記媒体のガラス転移温度（Ｔ_ｇ）未満である温度で凍結される、請求項２３に記載の方法。
25. 被験者に治療薬および／または診断薬を投与するための薬学的組成物を調製する方法であって、薬学的担体中に請求項１〜１２のいずれか一項に記載されたリポソーム組成物を再構成し、再構成された組成物を得ることを含む、方法。
26. 動物の被験体に治療薬および／または診断薬を投与する方法であって、請求項２５に記載された再構成組成物を、該被験体に投与することを含む、方法。
27. 前記投与が、非経口的である、請求項２６に記載の方法。
28. 前記被験体が、ヒトである、請求項２６または２７に記載の方法。

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