ES2225178T3

ES2225178T3 - Composicion liposomica resistente a los daños producidos por congelacion/descongelacion.

Info

Publication number: ES2225178T3
Application number: ES00947430T
Authority: ES
Inventors: Robert M. Abra; Andrew R. Dibble
Original assignee: Alza Corp
Current assignee: Alza Corp
Priority date: 1999-07-16
Filing date: 2000-07-14
Publication date: 2005-03-16
Anticipated expiration: 2020-07-14
Also published as: DE60014093T2; IL147559A0; NZ516648A; WO2001005372A2; HK1047046A1; KR20020012009A; DE60014093D1; HUP0202475A3; HK1047046B; DK1196144T3; PT1196144E; JP2003504389A; MXPA02000602A; AU775038B2; ZA200200388B; HUP0202475A2; NO20020236L; CA2379366A1; EP1196144B1; KR100726742B1

Abstract

Composición liposómica que confiere protección frente al daño por congelación/descongelación, que comprende: una suspensión de liposomas en la que cada liposoma contiene un medio acuoso atrapado que presenta una osmolaridad interna, estando suspendidos los liposomas en un medio externo que comprende una sal soluble en agua y un crioprotector, presentando dicho medio externo una osmolaridad externa liposómica mayor que la osmolaridad interna liposómica, estableciendo de ese modo un gradiente osmótico, menor en el interior/mayor en el exterior, a través de cada liposoma.

Description

Composición liposómica resistente a los daños producidos por congelación/descongelación.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a una composición liposómica que presenta una protección mejorada frente a la agregación de las vesículas, a la fusión de las vesículas, y a la pérdida de los contenidos atrapados con la congelación y descongelación subsiguiente.

Referencia cruzada a solicitudes relacionadas

El contenido de la solicitud de patente provisional U.S. "Cryoprotection of a Liposome Composition", nº de serie 60/144.380, presentada en la United States Patent and Trademark Office el 16 de julio de 1999 se incorpora en su integridad a la presente memoria. Las solicitudes son de titularidad compartida.

Antecedentes de la invención

Los liposomas son vesículas lipídicas cerradas usadas para una variedad de fines. En particular, los liposomas se pueden emplear para llevar agentes terapéuticos a una región o célula diana mediante administración sistémica de los liposomas. Los liposomas han demostrado ser particularmente valiosos para tamponar la toxicidad de los fármacos y para alterar los parámetros farmacocinéticos de ciertos compuestos terapéuticos, por ejemplo, doxorrubicina y anfotericina B. Los productos que incorporan estos compuestos están comercialmente disponibles.

La estabilidad y el almacenamiento eficaz de las preparaciones liposómicas farmacéuticas es un aspecto importante de los productos liposómicos. Específicamente, es importante que las preparaciones liposómicas se almacenen durante periodos prolongados de tiempo en condiciones apropiadas sin pérdida excesiva del agente encapsulado o alteración del tamaño de los liposomas. Sin embargo, existe la preocupación de que, cuando los liposomas se deshidratan o se congelan y se descongelan subsiguientemente, pueda ocurrir la fusión de las vesículas y/o la fuga de los contenidos atrapados.

Un método habitual para proteger la integridad de las vesículas durante la deshidratación y congelación es la inclusión de un crioprotector, tal como un azúcar, en la formulación liposómica (Harrigan et al., Chemistry and Physics of Lipids, 52:139-149 (1990)). El crioprotector conserva la integridad de los lípidos y evita la fusión de las vesículas y la pérdida de los contenidos de las vesículas.

La patente U.S. nº 4.927.571, por ejemplo, se refiere a una composición liposómica que contiene doxorrubicina que se reconstituye a partir de una forma liofilizada que incluye entre 1 por ciento (%) y 10% de un crioprotector, tal como trehalosa o lactosa.

La patente U.S. nº 4.880.635 se refiere a una composición liposómica deshidratada que se prepara secando los liposomas en presencia de un azúcar, en la que el azúcar está presente tanto en la superficie interior como exterior de la membrana de la bicapa liposómica. De forma similar, la patente U.S. Nº 5.077.056 se refiere a una composición liposómica deshidratada que incluye un azúcar protector, preferiblemente tanto en la superficie interna como externa de los liposomas.

KOICHIRO MIYAJIMA, et al., "Effect of Saccharides on the Freezing and Thawing of Liposome Dispersion", CHEMICAL AND PHARMACEUTICAL BULLETIN, vol. 34, nº 7, julio de 1986, página 2689-2697, describe una composición liposómica que comprende disoluciones acuosas de glucosa tanto en las fases interna como externa, en la que la composición es estable a la congelación a -70ºC.

Otras formulaciones liposómicas, tales como DOXIL®, una formulación liposómica que contiene doxorrubicina, son suspensiones en las que los liposomas no se deshidratan para la reconstitución posterior, sino que permanecen en una suspensión durante el almacenamiento. Sin embargo, el medio de suspensión incluye típicamente un azúcar para la protección frente al daño por congelación.

Sumario de la invención

En consecuencia, un aspecto de la presente invención es proporcionar una composición liposómica que se protege de la agregación y fusión de las vesículas, y que se protege frente a la pérdida de los contenidos atrapados con la congelación y descongelación subsiguiente.

En otro aspecto, la presente invención proporciona una composición liposómica que tiene protección mejorada frente al daño por congelación/descongelación, como se evidencia por una reducción en la fusión de las vesículas y una reducción en la pérdida de los contenidos atrapados, cuando se compara con la protección proporcionada por la presencia de un crioprotector sólo.

La presente invención proporciona además una composición liposómica, que tiene un fármaco atrapado con una elevada fuerza iónica, que se protege de la fusión de las vesículas y de la pérdida de contenidos debido a la congelación y descongelación subsiguiente.

En aún otro aspecto de la invención, se proporciona una composición liposómica que tiene una protección mejorada frente al daño por congelación/descongelación. En una realización, la composición está compuesta de una suspensión de liposomas, teniendo cada liposoma un medio acuoso atrapado que tiene una osmolaridad interna. Los liposomas se suspenden en un medio externo compuesto de una sal soluble en agua y un crioprotector, en el que el medio externo tiene una osmolaridad externa mayor que la osmolaridad interna de los liposomas, estableciendo de ese modo un gradiente osmótico, menor en el interior/mayor en el exterior, a través de cada liposoma.

En otra realización, el medio externo incluye una sal seleccionada de sales de nitrato, sales de sodio, sales de potasio, sales de amonio, y sales de sulfato. En una realización preferida, la sal es cloruro de sodio (NaCl) o cloruro de potasio (KCl).

El crioprotector es típicamente un azúcar, bien un monosacárido o bien un disacárido, glicerol o polietilenglicol. En una realización preferida, el crioprotector se selecciona de trehalosa, maltosa, sacarosa, glucosa, lactosa, dextrano, glicerol, polietilenglicol, y aminoglicósidos.

En otra realización, la composición incluye además un agente terapéutico atrapado en los liposomas. En una realización preferida, el agente terapéutico es cisplatino, o un análogo de cisplatino, o derivado del mismo.

En aún otra realización, la composición liposómica incluye un lípido formador de vesículas derivatizado con una cadena polimérica hidrófila.

En otro aspecto, la invención proporciona un método para proteger una composición liposómica frente al daño por congelación/descongelación. El método incluye preparar una suspensión de liposomas, teniendo cada liposoma en la suspensión un medio acuoso atrapado que tiene una osmolaridad interna. Los liposomas se suspenden en un medio externo compuesto de una sal soluble en agua y un crioprotector, en el que el medio externo tiene una osmolaridad externa mayor que la osmolaridad interna de los liposomas, estableciendo de ese modo un gradiente osmótico, menor en el interior/mayor en el exterior, a través de cada liposoma.

En aún otro aspecto, la invención proporciona un método para proteger una composición liposómica que contiene un compuesto metálico de coordinación frente al daño por congelación/descongelación. El método incluye preparar una suspensión de liposomas, teniendo cada liposoma en la suspensión un medio acuoso atrapado, que tiene una osmolaridad interna, y un compuesto atrapado. Los liposomas se suspenden en el medio externo compuesto de una sal soluble en agua y un crioprotector, en el que el medio externo tiene una osmolaridad externa mayor que la osmolaridad interna de los liposomas, estableciendo de ese modo un gradiente osmótico, menor en el interior/mayor en el exterior, a través de cada liposoma. En una realización, el agente terapéutico es cisplatino, o un análogo de cisplatino o un derivado del mismo. En otra realización, la sal en el medio externo es cloruro de sodio (NaCl), y el crioprotector es sacarosa.

En aún otro aspecto, la invención proporciona un método para mejorar la crioprotección de una suspensión de liposomas que incluye un crioprotector en el medio de suspensión. La mejora incluye una sal soluble en agua, en el medio de suspensión, eficaz para establecer un gradiente osmótico a través de cada liposoma, en el que el medio de suspensión tiene una osmolaridad mayor que el interior del liposoma. En una realización, el gradiente osmótico es al menos alrededor de 100 mOsm, preferiblemente mayor que alrededor de 200 mOsm, más preferiblemente mayor que alrededor de 400 mOsm, y lo más preferible mayor que alrededor de 500 mOsm.

Descripción detallada de la invención I. Definiciones

Tal como se utilizan en la presente memoria, los siguientes términos tienen los significados siguientes:

"Daño por congelación" se refiere a uno cualquiera de varios efectos indeseables que ocurren al exponer una composición liposómica a una temperatura suficiente para provocar uno de los efectos indeseables. Una temperatura suficiente que da como resultado daño por congelación es típicamente una temperatura menor que alrededor de 0ºC, más típicamente una temperatura menor que alrededor de -5ºC, e incluso más típicamente una temperatura menor que alrededor de -10ºC. Los efectos indeseables incluyen, pero no se limitan a, un aumento en el crecimiento del tamaño de partículas debido a la agregación y/o fusión de vesículas, y pérdida de un agente terapéutico encapsulado. La temperatura real que puede provocar el inicio de tal efecto variará según la formulación liposómica, por ejemplo el tipo de lípidos y otros componentes de la bicapa, así como según el medio atrapado y el agente terapéutico. Algunas veces, el daño por congelación es menor a temperaturas muy frías, particularmente si la velocidad de congelación y descongelación subsiguiente es rápida.

"Daño por congelación/descongelación", como se usa aquí, incluye los efectos secundarios indeseables que están asociados con el daño por congelación (descrito anteriormente), y efectos adicionales observados como resultado de al menos un ciclo de congelación y descongelación, por ejemplo, una distribución no homogénea del tamaño de partículas. Los efectos descritos pueden ser más pronunciados durante un proceso de descongelación lento, es decir, a alrededor de 2-8ºC, frente a un proceso de descongelación más rápido, es decir, a temperatura ambiente, o exposición a baño de agua. (Véase, por ejemplo, la Tabla 8).

"Crioprotector" se refiere a un agente o compuesto adecuado para proteger a una composición liposómica del daño por congelación y/o daño por congelación/descongelación. Los crioprotectores preferidos incluyen, por ejemplo, azúcares (disacáridos y monosacáridos), glicerol, y polietilenglicol.

Los valores del "gradiente osmótico", como se dan aquí, se determinaron mediante el cálculo de la osmolaridad interna y externa de la composición liposómica, tomada como la molaridad por uno (M x 1) para un no electrolito, o como el número de iones por molécula para un electrolito, tanto en los medios interno como externo de los liposomas, y restando la osmolaridad interna de la osmolaridad externa.

II. Composiciones liposómicas ejemplares

Como se ha descrito anteriormente, la presente invención se refiere a composiciones liposómicas que muestran resistencia al daño por congelación y/o al daño por congelación/descongelación. Las composiciones liposómicas tienen un gradiente osmótico a través de la bicapa lipídica de los liposomas, en las que el medio de suspensión externo al liposoma tiene una osmolaridad mayor que la osmolaridad del medio atrapado en el liposoma.

Por ejemplo, el Ejemplo 1 (más abajo) describe la preparación de dos formulaciones liposómicas de tipo placebo, es decir, teniendo una formulación liposómica el crioprotector sacarosa tanto en los medios interno como externo de los liposomas, y teniendo la otra formulación liposómica sacarosa presente solamente en el medio externo. Ambas formulaciones liposómicas tenían 0,9% peso/volumen (p/v) de NaCl presente en los medios interior y exterior del liposoma, y los liposomas estaban compuestos de los lípidos HSPC, colesterol, y mPEG-DSPE, en una relación molar de 51/44/5, respectivamente.

Las dos formulaciones liposómicas se congelaron a -20ºC durante 2,7 días (aproximadamente 65 horas), y se descongelaron subsiguientemente dejando reposar a temperatura ambiente. Se llevó a cabo una dispersión de luz dinámica sobre las dos formulaciones liposómicas de tipo placebo, para determinar el tamaño de partículas antes y después de la congelación. Los resultados se muestran en la Tabla 1.

TABLA 1

1

La formulación liposómica que tuvo sacarosa en los medios interno y externo (formulación nº 2) fue más susceptible al daño por congelación, como se evidencia por el aumento en el tamaño de partículas, es decir, de aproximadamente 116 nm (el control nunca congelado) hasta 204 nm para la muestra congelada/descongelada. La formulación liposómica que contiene sacarosa en el medio externo solo (formulación nº 1) produjo un aumento más pequeño del tamaño de partículas después de la congelación, hasta aproximadamente 166 nm. Como se demostrará de forma más completa en los Ejemplos a continuación, estos resultados sugieren que una formulación liposómica que tiene un gradiente hiperosmótico, es decir, una osmolaridad externa mayor que la osmolaridad interna (por ejemplo, la formulación nº 1 que tiene un gradiente osmótico de 146 mOsm), fue menos susceptible al daño por congelación/descongelación.

El Ejemplo 2 describe la preparación de una formulación liposómica de tipo placebo con la composición lipídica descrita anteriormente, que contiene 5% (p/v) de sacarosa externamente y que internamente no contiene sacarosa. La formulación liposómica se diluyó subsiguientemente con 5% (p/v) de sacarosa y cantidades variables de NaCl, para producir formulaciones liposómicas que tienen 0,9%, 0,6%, y 0,3% (p/v) de NaCl en el medio acuoso externo. La concentración de NaCl en el medio acuoso interno fue 0,9% (p/v). Las muestras de cada formulación liposómica se congelaron a -20ºC durante aproximadamente 5 días (aproximadamente 118 horas), y se descongelaron subsiguientemente. Se determinó el tamaño de partículas, y los resultados se muestran a continuación en la Tabla 2.

TABLA 2

2

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Los datos mostrados en la Tabla 2 revelan que el grado de daño por congelación/descongelación, según se determina mediante el incremento en el tamaño de partículas después de congelar, está influido por el gradiente osmótico a través de la bicapa lipídica de los liposomas. La formulación liposómica que tiene un medio externo de 5% de sacarosa y 0,9% de NaCl (gradiente osmótico = 146 mOsm) fue la menos susceptible al daño por congelación/descongelación, según se evidencia por el aumento más pequeño en el tamaño de partículas de las tres formulaciones liposómica. La formulación liposómica con un gradiente osmótico inverso, esto es, la formulación con 5% de sacarosa y 0,3% en NaCl en el medio externo (gradiente osmótico = -59 mOsm), tuvo el mayor aumento en el tamaño de partículas al congelar y descongelar.

El Ejemplo 3 describe un ensayo cualitativo sobre 24 formulaciones liposómicas para analizar adicionalmente la importancia de un gradiente osmótico sobre la susceptibilidad de una formulación liposómica al daño por congelación/descongelación. En este ejemplo, se prepararon formulaciones liposómicas de placebo que tienen la composición lipídica anterior (HSPC, colesterol y mPEG-DSPE). El medio interno de los liposomas fue 0,9% o 1,8% (p/v) de NaCl. El medio acuoso externo contenía: (i) 10 milimolar (mM) de histidina, (ii) 0%, 5% o 10% (p/v) de sacarosa, y (iii) una concentración de NaCl igual a la concentración de NaCl interna multiplicada por 0,5, 1, 1,5 ó 2,0. Los medios interno y externo de cada formulación se expresan en la Tabla 3.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 3

3

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Las muestras mostradas en la Tabla 3 se congelaron a -20ºC durante 3 horas, y se descongelaron subsiguientemente hasta temperatura ambiente. Cada muestra se inspeccionó visualmente para buscar signos macroscópicos de daño por congelación, tal como la presencia de partículas macroscópicas, y para determinar la claridad de la suspensión. Las muestras que tienen un gradiente hipoosmótico (muestras con los números 1, y 13-14 en la Tabla 3, en las que la osmolaridad externa es menor que la osmolaridad interna) fueron visualmente heterogéneas, con partículas macroscópicas visibles después de la congelación y descongelación. Por el contrario, las formulaciones liposómicas que tienen un gradiente hiperosmótico (muestras con los números 3, 5-12, y 17-24 en la Tabla 3) fueron visualmente similares a las muestras de control descongeladas. Las muestras casi isoosmóticas (muestras con los números 2, 4, y 15-16 en la Tabla 3) tuvieron un aspecto intermedio, sin tantas partículas presentes comparado con las muestras hipoosmóticas, pero no tan visualmente claras como el control. Merece la pena señalar que la muestra casi isoosmótica (muestra nº 16), que tiene 1,8% de NaCl interno y externo, tenía un aspecto intermedio, indicando que la protección frente al daño por congelación no es simplemente un resultado de un aumento en la concentración de NaCl externo, sino también es el resultado de un gradiente hiperosmótico a través de la bicapa lipídica de los liposomas.

En otro experimento realizado para apoyar la invención, y descrito en el Ejemplo 4, se prepararon formulaciones liposómicas que contienen cisplatino. Los liposomas estaban compuestos de HSPC, colesterol, y mPEG-DSPE en una relación molar 51/44/5, respectivamente. En los liposomas había atrapado cisplatino en una disolución 0,9% (p/v) de NaCl. El medio de suspensión másico externo estaba compuesto de 10 mM de histidina, NaCl a una concentración de 0,9%, 1,8%, 2,7% o 3,6% (p/v), y sacarosa a una concentración de 5%, 10%, 15% o 20% (p/v). Las formulaciones ejemplares se exponen en la Tabla 4. Las muestras liposómicas se congelaron a -20ºC durante 6,8 días (aproximadamente 118 horas), y después se descongelaron dejándolas reposar a temperatura ambiente. El tamaño medio de partículas de los liposomas en cada muestra se determinó como una medida del grado de daño por congelación. Los resultados se muestran en la Tabla 4.

TABLA 4

4

Como se muestra en la Tabla 4, el aumento en el tamaño medio de partículas con un único ciclo de congelación/descongelación es menor cuando la concentración externa de NaCl se aumenta por encima del NaCl isotónico, es decir, 0,9% (p/v). A cada concentración de sacarosa, por ejemplo 5%, 10%, 15% y 20% (p/v), cuanto mayor es la concentración de NaCl, mejor se protegen las vesículas liposómicas frente al daño por congelación/descongelación. La composición externa que proporcionó la mejor protección frente al daño por congelación fue 5% (p/v) de sacarosa y 3,6% (p/v) de NaCl, en la que la partícula no tuvo ningún aumento estadístico en el tamaño de partículas.

Como se evidencia por los datos mostrados en la cuarta columna de la Tabla 4, incluso en ausencia de congelación, el tamaño medio de partículas disminuyó de forma medible al aumentar la osmolaridad externa. Estos experimentos indican que la disminución en el tamaño no es el resultado de un cambio en la forma del liposoma. Aunque es de esperar una contracción de los liposomas en presencia de un gradiente hiperosmótico, debido a la expulsión de agua, no debe persistir ningún cambio en la forma de los liposomas después de la dilución unas 300 veces con 0,9% (p/v) de NaCl, lo que ocurre antes de la medida del tamaño de partículas mediante difracción dinámica de luz. Los experimentos mostraron que la dilución de formulaciones hipertónicas con 3,6% (p/v) de NaCl o con agua destilada dio como resultado el mismo tamaño medio de partículas medido que las muestras diluidas con 0,9% (p/v) de NaCl. Esto sugiere que la disminución en el tamaño medido de partículas con el aumento de la osmolaridad es principalmente debida a un cambio en el estado de agregación de las vesículas.

Un resultado sorprendente mostrado en la Tabla 4 es que el aumento de la concentración externa de sacarosa no disminuye significativamente el grado de crecimiento del tamaño de partículas con la congelación/descongelación, particularmente cuando la concentración externa de NaCl fue mayor o igual a 1,8% (p/v). Cuando la concentración externa de NaCl fue 2,7% o 3,6%, los datos sugieren que una menor concentración externa de sacarosa puede ofrecer la mejor protección frente al daño por congelación para esta composición liposómica particular. Este punto se investigó adicionalmente preparando formulaciones liposómicas que tienen la misma composición como se expone en el Ejemplo 4, excepto que la concentración externa de sacarosa fue 1%, 2%, 3%, 4% ó 5% (p/v). Las muestras se congelaron a -20ºC durante 3,9 días (aproximadamente 94 horas), y se descongelaron hasta temperatura ambiente, y se determinó el grado de daño por congelación midiendo el tamaño medio de partículas antes y después de la congelación. Los resultados se muestran en la Tabla 5.

TABLA 5

5

Los resultados mostrados en la Tabla 5 son consistentes con los resultados mostrados en la Tabla 4, que muestran que, a concentraciones externas elevadas de NaCl, la concentración externa óptima de sacarosa para la crioprotección es relativamente baja para esta formulación liposómica particular.

Los experimentos descritos anteriormente se centran principalmente en el crecimiento del tamaño de partículas con la congelación y descongelación subsiguiente, según se evidencia por el grado de daño por congelación/descon-
gelación. Los experimentos adicionales, descritos aquí, se refieren a la pérdida de un agente terapéutico atrapado para analizar el grado de daño por congelación/descongelación. En este experimento, algunas de las muestras ensayadas para los datos de la Tabla 5 se analizaron adicionalmente para determinar el porcentaje de encapsulamiento del fármaco antes y después de la congelación. El porcentaje de cisplatino atrapado se midió mediante espectroscopia de absorción atómica de llama, según se describe en la sección de métodos más abajo. Los resultados se exponen en la Tabla 6.

TABLA 6

6

Es evidente la correlación entre el porcentaje de encapsulamiento de cisplatino y el crecimiento del tamaño medio de partículas. Por ejemplo, se encontró que la liberación de cisplatino con la congelación y descongelación subsiguiente ocurría cuando había un crecimiento del tamaño de partículas, es decir, una aumento según se mide mediante dispersión de luz dinámica (DLS).

Para asegurarse de que no se formaba un pequeño número de partículas relativamente grandes durante la congelación, se realizaron medidas de turbidez a 650 nm (según se detalla en la sección de métodos más abajo). Las medidas de turbidez generalmente son más sensibles que la dispersión de luz dinámica a pequeñas porciones de grandes partículas en una muestra. Los liposomas se prepararon como se describe en el Ejemplo 4, pero manteniendo constante la concentración externa de sacarosa a 3% (p/v). El intervalo de concentraciones externas de NaCl se expone en la Tabla 7. Las muestras se congelaron a -20ºC durante 3,9 días (aproximadamente 93 horas), y se descongelaron dejándolas reposar a temperatura ambiente. Las muestras se analizaron entonces mediante DLS y mediante determinación de la turbidez, y se compararon con un control, es decir, una muestra que nunca se congeló. Los resultados se muestran en la Tabla 7 a continuación.

TABLA 7

7

El cambio relativo en la turbidez provocado por un ciclo de congelación/descongelación se determina por la relación de turbidez_{(congelado \ y \ descongelado)} a turbidez_{(nunca \ congelado)}. Comparando las dos últimas columnas de la Tabla 7, es evidente la correlación entre el crecimiento del tamaño medio de partículas y el cambio relativo en la turbidez debido a la protección frente a la congelación y descongelación. Los datos sugieren que la resistencia al daño por congelación/descongelación proporcionada por la presencia de un gradiente osmótico a través de la bicapa liposómica es buena, particularmente cuando la concentración externa de sacarosa está entre alrededor de 1% y alrededor de 10%, más preferiblemente entre alrededor de 1% y alrededor de 5%, y lo más preferible entre alrededor de 2% y alrededor de 4%, en presencia de una cantidad mayor que alrededor de 3% (p/v) de NaCl.

En particular, la composición liposómica que contiene cisplatino, usada en los experimentos descritos anteriormente, se protege frente al daño por congelación/descongelación, en presencia de un medio externo que tiene entre alrededor de 2,7% y alrededor de 3,6% (p/v) de NaCl, y entre alrededor de 2% y alrededor de 5% de sacarosa.

En un experimento adicional, se expusieron formulaciones liposómica, que contienen diversas cantidades de un crioprotector y una sal, a diferentes condiciones de congelación/descongelación. Los liposomas se prepararon a partir de HPSC, mPEG-DSPE, y colesterol, como se ha descrito previamente. Se atrapó cisplatino en una disolución al 0,9% (p/v) de NaCl en los liposomas, y el medio externo se ajustó para que contuviera 3,3% (p/v) de NaCl y 3% (p/v) de sacarosa. Las muestras se prepararon por triplicado, y se congelaron por varios métodos, incluyendo: (i) baño de hielo seco/isopropanol durante alrededor de 10 minutos, seguido de incubación en un congelador a -70ºC; (ii) hielo seco/isopropanol seguido de incubación en un congelador a -20ºC; (iii) se almacenaron directamente en un congelador a -70ºC; (iv) se almacenaron directamente en un congelador a -35ºC; y (v) se almacenaron directamente en un congelador a -20ºC. Después de 3,9 días (aproximadamente 94 horas) todas las muestras se descongelaron subsiguientemente. De cada conjunto de triplicados, se descongeló una muestra en agua a temperatura ambiente, otra muestra se descongeló en aire a temperatura ambiente, y otra muestra se descongeló en un refrigerador a 2-8ºC. Todas las muestras se analizaron para determinar el daño por congelación/descongelación midiendo el tamaño de partículas por DLS. Las únicas muestras que exhibieron un crecimiento medible del tamaño fueron aquellas muestras congeladas a -70ºC, bien directamente o bien después de introducirlas en un baño de hielo seco/isopropanol seguido de incubación en un congelador a -70ºC. El crecimiento del tamaño dependió tanto de las condiciones de congelación como de descongelación, provocando las velocidades más lentas de congelación y descongelación el mayor daño debido a la congelación/descongelación, según se muestra a continuación en la Tabla 8.

TABLA 8

8

Este experimento sugiere que las composiciones liposómicas que tienen un gradiente osmótico se protegen frente al daño por congelación/descongelación hasta temperaturas de al menos -35ºC.

Los experimentos anteriores han demostrado que un gradiente osmótico a través de la bicapa liposómica proporciona protección frente al daño por congelación/descongelación a las composiciones liposómicas. Sin embargo, también es necesario que el gradiente osmótico no afecte a la estabilidad de la composición liposómica en condiciones no congelantes. Para analizar la estabilidad de las composiciones liposómicas que tienen un gradiente osmótico, se colocaron muestras en un ensayo de estabilidad acelerada. Específicamente, se prepararon dos lotes de composiciones liposómicas como se describe en el Ejemplo 4. Las composiciones liposómicas contenían HSPE, mPEG-DSPE, y colesterol, con cisplatino atrapado. El medio externo de suspensión acuosa estaba compuesto de 3,3% (p/v) de NaCl, y 3% (p/v) de sacarosa. La Tabla 9 muestra los componentes y concentraciones para los Lotes 1 y 2 del ensayo, y para la formulación del control.

TABLA 9

9

Los dos lotes de ensayo y la formulación del control se almacenaron a diversas temperaturas (como se muestra en la Tabla 10) durante un tiempo hasta 3,5 meses. Las muestras se retiraron, a intervalos durante este periodo de 3,5 meses, para análisis mediante DLS para determinar el porcentaje de cisplatino encapsulado y el tamaño medio de partículas. Los resultados se resumen en la Tabla 10.

TABLA 10

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La Tabla 10 ilustra, entre otros, que la congelación del lote nº 1 a -20ºC durante una semana dio como resultado una caída del 6% en la cantidad del fármaco encapsulado. En esta muestra, después de 2 semanas de congelación, el porcentaje de pérdida de fármaco encapsulado fue de 9%. Como se ha demostrado, el tamaño medio de partículas en estos puntos de tiempo sólo tuvieron un ligero aumento. La infusión de un producto que muestra una pérdida del 9% del fármaco atrapado seleccionado y que demuestra poco cambio en el tamaño de partículas no debe comprometer la eficacia o seguridad para el paciente, puesto que la mayoría del fármaco está atrapado en los liposomas. Como se muestra, el lote nº 2 mostró una fuga incluso menor que la del lote nº 1.

Los ensayos de estabilidad indican que una composición liposómica que tiene un gradiente osmótico a través de la bicapa lipídica, en la que la osmolaridad externa de los liposomas es mayor que la osmolaridad interna, proporciona protección adicional frente al daño por congelación accidental durante el transporte del producto, con un efecto despreciable sobre la estabilidad del producto.

III. Componentes liposómicos A. Lípidos

En los estudios expuestos anteriormente que emplean un gradiente osmótico, es decir, en los que la osmolaridad externa de los liposomas es mayor que la osmolaridad interna, para disminuir la susceptibilidad de los liposomas al daño por congelación, se demostró usando liposomas compuestos de fosfatidilcolina de soja hidrogenada (HSPC), colesterol y mPEG-DSPE. Se apreciará por el experto en la materia, sin embargo, que se contemplan composiciones liposómicas compuestas de una variedad de composiciones lipídicas. Los liposomas están compuestos principalmente de lípidos formadores de vesículas, es decir, lípidos que pueden formar espontáneamente vesículas bicapas en agua, según se ejemplifica mediante los fosfolípidos. Los lípidos formadores de vesículas de este tipo tienen preferiblemente dos cadenas hidrocarbonadas, típicamente cadenas acílicas, y un grupo de cabeza, ya sea polar o no polar. Hay una variedad de lípidos sintéticos formadores de vesículas y de lípidos de origen natural formadores de vesículas, incluyendo los fosfolípidos, tales como fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilglicerol, fosfatidilserina, ácido fosfatídico, fosfatidilinositol, y espingomielina, en los que las dos cadenas hidrocarbonadas tienen típicamente entre alrededor de 12 y 22 átomos de carbono de longitud, y tienen grados variables de insaturación. Los lípidos y fosfolípidos descritos anteriormente, cuyas cadenas acílicas tienen grados variables de insaturación, se pueden obtener comercialmente, o se pueden preparar según métodos publicados. Las referencias para las síntesis de lípidos incluyen: (i) Mason et al., "A method for the synthesis is isomerically pure saturated mixed-chain phosphatidylcholines", Anal. Biochem., 113(1):96-101 (1981); (ii) Zalipsky, S. "Synthesis of an endgroup functionalized polyethylene glycol-lipid conjugate for preparation of polymer-grafter liposomes," Bioconjug. Chem., 4(4):296-299 (1993).

Los liposomas también pueden incluir un lípido que se incorpora establemente en la bicapa lipídica de los liposomas, tales como diacilgliceroles, lisofosfolípidos, ácidos grasos, glicolípidos, cerebrósidos y esteroles, tal como colesterol.

Si se desea, el liposoma también puede incluir un lípido formador de vesículas derivatizado con un polímero hidrófilo, como se describe, por ejemplo, en la patente U.S. nº 5.013.556. La inclusión de un lípido derivatizado en la composición liposómica forma un revestimiento de superficie de cadenas de polímero hidrófilo alrededor del liposoma. El revestimiento superficial de cadenas de polímero hidrófilo es eficaz para aumentar el tiempo de vida de circulación in vivo en la sangre de los liposomas, cuando se compara con los liposomas que carecen de tal reves-
timiento.

Los lípidos formadores de vesículas adecuados para derivatización con un polímero hidrófilo incluyen cualquiera de los polímeros enumerados anteriormente, y, en particular, fosfolípidos, tales como diestearoilfosfatidiletanolamina (DSPE).

Los polímeros hidrófilos adecuados para derivatización con un lípido formador de vesículas incluyen polivinilpirrolidona, polivinilmetiléter, polimetiloxazolina, polietiloxazolina, polihidroxipropiloxazolina, polihidroxipropilmetacrilamida, polimetacrilamida, polidimetilacrilamida, poli(metacrilato de hidroxipropilo), poli(acrilato de hidroxietilo), hidroximetilcelulosa, hidroxietilcelulosa, polietilenglicol, poliaspartamida y secuencias de péptidos hidrófilos. Los polímeros se pueden emplear como homopolímeros, copolímeros, y como copolímeros de bloques o alea-
torios.

Una cadena preferida de polímero hidrófilo es polietilenglicol (PEG), preferiblemente una cadena de PEG que tiene un peso molecular entre alrededor de 500 daltons hasta alrededor de 10.000 daltons, más preferiblemente entre alrededor de 1.000 daltons hasta alrededor de 5.000 daltons. También se prefieren como polímeros hidrófilos los análogos de PEG terminados en los extremos con grupos metoxi o etoxi, comercialmente disponibles en una variedad de tamaños de polímero, por ejemplo, alrededor de 120 daltons hasta alrededor de 20.000 daltons.

La preparación de lípidos formadores de vesículas derivatizados con polímeros hidrófilos se ha descrito, por ejemplo, en la patente U.S. nº 5.395.619. También se ha descrito la preparación de liposomas que incluyen tales lípidos derivatizados, que contienen típicamente entre alrededor de 1-20 por ciento en moles de tal lípido derivatizado incluido en la composición liposómica.

B. Agente atrapado

Los liposomas también incluyen típicamente un agente y/o fármaco atrapado, en el que "atrapado" incluye el encapsulamiento del agente y/o del fármaco en el núcleo acuoso y espacios acuosos de los liposomas, además del atrapamiento del agente y/o del fármaco en la bicapa o bicapas lipídicas de los liposomas.

Los agentes y/o fármacos contemplados para uso en la composición liposómica de la invención varían ampliamente, e incluyen, por ejemplo, tanto aplicaciones terapéuticas como de diagnóstico.

Los agentes y/o fármacos terapéuticos incluyen compuestos naturales y sintéticos que tienen las siguientes actividades terapéuticas: antiartrítica, antiarrítmica, antibacteriana, anticolinérgica, anticoagulante, antidiurética, como antídoto, antiepiléptica, antifúngica, anti-inflamatoria, antimetabólica, antimigraña, antineoplásica, antiparasitaria, antipirética, antiapopléjica, antisérica, antiespasmódica, analgésica, anestésica, beta-bloqueante, modificadora de la respuesta biológica, reguladora del metabolismo óseo, cardiovascular, diurética, enzimática, potenciadora de la fertilidad, promotora del crecimiento, hemostática, hormonal, supresora de hormonas, reductora de la hipercalcemia, reductora de la hipocalcemia, reductora de la hipoglicemia, reductora de hiperglicemia, inmunosupresora, inmunopotenciadora, relajante muscular, neurotransmisora, parasimpaticomimética, simpaticomimética, extensora del plasma, expansora del plasma, psicotrópica, trombolítica y vasodilatadora.

En una realización preferida, el agente atrapado es un "fármaco citotóxico", esto es, un fármaco que tiene un efecto perjudicial o tóxico sobre las células diana. Los agentes citotóxicos ejemplares incluyen los antibióticos antraciclínicos tales como doxorrubicina, daunorrubicina, epirrubicina e idarrubicina, y análogos de estos, tales como epirrubidina y mitoxantrona; compuestos de platino, tales como cisplatino, carboplatino, ormaplatino, oxaliplatino, ceniplatino, enloplatino, lobaplatino, espiroplatino, monohidrato de ((-)-(R)-2-aminometilpirrolidina(1,1-ciclobutanodicarboxilato)platino) (DWA2114R), [SP-4-3(R)]-1,1-ciclobutandicarboxilato(2-)-(2-metil-1,4-butanodiamin-N,N')platino) (CI-973), nedaplatino (254-S) y (bis-acetato-amin-dicloro-ciclohexilamin-platino(IV))(JM-216) (Weiss et al., Drugs,
46(3):360-377 (1993)); y alcaloides de la vinca, tales como vincristina, vinblastina, vinleurosina, vinrodisina, vinorelbina (navelbina) y vindesina.

Otro grupo de agentes citotóxicos son los inhibidores de topoisomerasa I, tales como camptotecina y sus análogos, incluyendo SN-38 ((+)-(4S)-4,11-dietil-4,9-dihidroxi-1H-pirano[3',4':6,7]-indolizino[1,2-b]quinolin-3,14(4H,12H)-diona); 9-aminocamptotecina; 9-nitrocamptotecina, topotecan (hicamtina; 9-dimetil-aminometil-10-hidroxicamptotecina); irinotecan (CPT-11; 7-etil-10-[4-(1-piperidino)-1-piperidino]-carboniloxi-camptotecina), que se idroliza in vivo a SN-38); 7-etilcamptotecina y sus derivados (Sawada et al., Chem. Pharm. Bull., 41(2):310-313 (1993)); 7-clorometil-10,11-metilen-dioxi-camptotecina; y otros (SN-22, Kunimoto et al., J. Pharmacobiodyn., 10(3):148-151 (1987); DX-8951f y GG-211 ((7-(4-metilpiperazino-metilen)-10,11-etilendioxi-20(S)-camptotecina)) (Rothenberg, Ann. Oncol., 8(9):837-855 (1997)), y 7-(2-N-isopropilamino)etil)-(20S)-camptotecina (Chong Kun Dang Corp., Seul, Korea, CKD602).

En una realización preferida de la invención, la composición se usa para la protección de liposomas que atrapan un agente y/o fármaco terapéutico, que tienen una fuerza iónica elevada, tal como cisplatino y sus análogos relacionados, citados anteriormente.

C. Sal y crioprotector

El medio externo de suspensión de la composición liposómica tiene típicamente una osmolaridad mayor que la osmolaridad del medio interno de los liposomas. El aumento de la osmolaridad se proporciona principalmente por adición de una sal al medio externo. Para este fin, es adecuada cualquier sal soluble en agua. Por ejemplo, se contemplan sales seleccionadas de sales de nitrato, sales sódicas, sales potásicas, sales de amonio, y sales de sulfato. En una realización preferida, la sal es NaCl o KCl.

El medio externo también incluye un crioprotector, que comprende generalmente como antes azúcares, glicerol y polietilenglicol. El azúcar puede ser un disacárido o un monosacárido, y los azúcares ejemplares incluyen trehalosa, maltosa, sacarosa, glucosa, lactosa, dextrano y aminoglicósidos.

Todas las publicaciones, patentes y documentos de patentes se incorporan aquí como referencia, como si se incorporaran individualmente como referencia. La invención se ha descrito con referencia a diversas realizaciones y técnicas específicas y preferidas. Sin embargo, se debe entender que se pueden realizar muchas variaciones y modificaciones permaneciendo dentro del espíritu y alcance de la invención.

Los siguientes Ejemplos pretenden ilustrar pero no limitar la invención.

Materiales: la DSPE se compró de Avanti Polar Lipids (Birmingham, AL), y la metoxi-polietilenglicol-diestearoilfosfatidiletanolamina (mPEG-DSPE, peso molecular de mPEG = 200 Daltons) se obtuvo de Sygena, Inc. (Cambridge, MA). El colesterol se obtuvo de Solvay Pharmaceuticals (Veenedaal, Países Bajos). La HSPC se obtuvo de Lipoid K.G. (Ludwigshafen, Alemania). El cisplatino se obtuvo de W.C. Heraeus GmbH (Hanau, Alemania)

Métodos 1. Tamaño de partículas de los liposomas

El tamaño de partículas de los liposomas se determinó mediante dispersión de luz dinámica usando un Coulter modelo N4MD (Coulter Corp, Miami, FL). Excepto que se señale de otro modo, cada composición liposómica se diluyó alrededor de 300 veces con 0,9% (p/v) de NaCl antes de realizar una medida DSL con un haz de luz a ángulos variables (90º y 30º). Las medidas se realizaron por triplicado a 20ºC.

2. Porcentaje de encapsulamiento de cisplatino

Los liposomas se separaron del fármaco libre mediante cromatografía de exclusión por gel, analizándose las fracciones para determinar el contenido total de Pt mediante espectroscopia de absorción atómica de llama usando un Perkin-Elmer modelo 3110.

3. Turbidez

Los liposomas se diluyeron 5 veces con 0,9% (p/v) de NaCl antes de medir la densidad óptica a 650 nm (OD_{650 nm}) a temperatura ambiente, usando 0,9% de NaCl (p/v) como blanco. El cambio relativo en la turbidez provocado por la congelación y descongelación se define como la relación de OD_{650 nm} (congelado y descongelado) a OD_{650 nm} (nunca congelado).

Ejemplo 1 Crioprotección en presencia de un gradiente osmótico A. Preparación de liposomas de placebo: sacarosa interna

Se añadieron los lípidos HSPC, colesterol y mPEG-DSPE, en una relación molar de 51/44/5, a etanol deshidratado a 60-65ºC, para dar 0,002 moles de lípido por ml de etanol, y se mezcló hasta que se disolvió, aproximadamente 1 hora. Los lípidos disueltos se añadieron a una disolución de 0,9% (p/v) de NaCl y 5% (p/v) de sacarosa en agua estéril, para producir una concentración total de lípidos de aproximadamente 126 mg/ml. Las muestras se diluyeron después de la diálisis hasta una concentración total de lípido de alrededor de 100 nM.

B. Preparación de liposomas de placebo: sin sacarosa interna

Se añadieron los lípidos HSPC, colesterol y mPEG-DSPE, en una relación molar de 51/44/5, a etanol deshidratado a 60-65ºC, para dar 0,002 moles de lípido por ml de etanol, y se mezcló hasta que se disolvió, aproximadamente 1 hora. Los lípidos disueltos se añadieron a una disolución de 0,9% (p/v) de NaCl en agua estéril para producir una concentración total de lípido de aproximadamente 126 mg/ml.

Para ambas preparaciones descritas anteriormente en A y B, los liposomas se hidrataron a 60-65ºC con agitación mecánica durante aproximadamente 1 hora antes de la formación de vesículas de una sola laminilla, de aproximadamente 120 nm de diámetro, mediante extrusión a 60-65ºC usando membranas de policarbonato que tienen un tamaño de poros de 0,1 micrómetro. Se eliminó el etanol, y el medio acuoso externo se ajustó a 0,9% (p/v) de NaCl y 5% (p/v) de sacarosa, mediante diálisis.

C. Condiciones de congelación y descongelación

Se colocó una alícuota de 3 ml a temperatura ambiente, de las suspensiones liposómicas formadas anteriormente en A y B, en un vial de vidrio transparente de 10 ml para suero. Los viales se colocaron en un congelador convencional a -20ºC durante 2,7 días. Las muestras se retiraron entonces del congelador y se colocaron a temperatura ambiente para descongelarlas.

D. Análisis de las muestras

El tamaño de partículas de los liposomas en cada una de las formulaciones después de la descongelación, así como las muestras de control de cada formulación (queriendo decir con el término control que la muestra no se congeló), se determinó mediante dispersión de luz dinámica. Los resultados se muestran en la Tabla 1.

Ejemplo 2 Formulaciones liposómicas con diversas concentraciones externas de NaCl

Los liposomas se prepararon disolviendo los lípidos HSPC, colesterol y mPEG-DSPE, en una relación molar de 51/44/5, en etanol deshidratado a 60-65ºC, para dar 0,002 moles de lípido por ml de etanol. Los lípidos disueltos se añadieron a 0,9% (p/v) de NaCl, para producir una concentración total de lípido de aproximadamente 126 mg/ml. La disolución lipídica acuosa se mezcló para formar los liposomas. Los liposomas se redujeron subsiguientemente en tamaño mediante extrusión. Después de la diálisis, la concentración total de lípidos se disminuyó hasta alrededor de 100 mM (antes de las diluciones de 3 veces con 5% de sacarosa y 0,9%, 0,45% ó 0% de NaCl, descrito más
abajo).

El medio másico externo se intercambió con un medio que contiene 0,9% (p/v) de NaCl y 5% (p/v) de sacarosa, mediante diálisis. La formulación se diluyó 3 veces con disoluciones acuosas de 5% (p/v) de sacarosa y 0,9%, 0,45% ó 0% (p/v) de NaCl, para producir un medio externo de 5% (p/v) de sacarosa y 0,9%, 0,6% ó 0,3% (p/v) de NaCl.

Las muestras de cada formulación se congelaron durante 4,9 días a -20ºC. Las muestras se descongelaron dejándolas reposar a temperatura ambiente, y después se determinó el tamaño de partículas mediante dispersión de luz dinámica. Los resultados se muestran en la Tabla 2.

Ejemplo 3 Preparaciones liposómicas de la Tabla 3

Las preparaciones liposómicas expuestas en la Tabla 3 se prepararon como se describe en los Ejemplos 1 y 2, con las siguientes modificaciones:

(i): para la mitad de las muestras, la fase acuosa usada para hidratación fue 0,9% de NaCl, y para la otra mitad fue 1,8% de NaCl; y

(ii): la dilución después de la diálisis se realizó con histidina junto con cantidades variables de NaCl y sacarosa para llevar la [NaCl] y [sacarosa] externas hasta valores mostrados en la Tabla 3, y que contenía 0,5 mM de piranina. La piranina es una sonda fluorescente que no afecta a los resultados del experimento de congelación/descongelación. Todos los medios de hidratación contenían 0,5 mM de piranina, además de NaCl.

Ejemplo 4 Liposomas con cisplatino atrapado

Se calentó agua estéril hasta 63-67ºC en una vasija a presión forrada con TEFLÓN, y se añadió cloruro de sodio (0,9%). Se añadió cisplatino a una concentración de 8,5 mg/ml, y se mezcló hasta que se disolvió, aproximadamente 15-25 minutos. Se añadieron 257,0 g de PEG-DSPE, 719,4 g de HSPC y 308,4 g de colesterol (relación molar de 50,6/44,3/5,1) a 900 ml de etanol deshidratado a 60-65ºC, y se mezcló hasta que se disolvió, aproximadamente 2 horas. Los lípidos disueltos se añadieron a 7670 g de disolución de fármaco para dar una concentración total de lípidos de aproximadamente 150 mg/ml.

La disolución caliente de lípidos se añadió rápidamente a la disolución caliente de fármacos (63-67ºC), con mezclamiento, para formar una suspensión de liposomas que tienen tamaños heterogéneos. La suspensión se mezcló durante una hora a 63-67ºC. La concentración de cisplatino en la mezcla de hidratación fue 7,7 mg/ml y, en esta etapa, aproximadamente el 30% de fármaco estaba encapsulado en los liposomas. El 10% del volumen total de la disolución fue etanol, y la concentración total de lípidos fue 150 mg de lípidos/ml.

Los liposomas se dimensionaron hasta el diámetro medio de partículas deseado, mediante extrusión controlada a través de cartuchos de filtro de policarbonato alojados en vasijas de acero inoxidable forradas con Teflón. La suspensión liposómica se mantuvo a 63-65ºC durante el proceso de extrusión, durante un periodo de 6-8 horas.

Después de tamizarla, la suspensión liposómica se enfrió hasta 2-8ºC toda la noche, y después se calentó hasta temperatura ambiente (20-25ºC) antes de filtrar a través de un filtro Gelman Versapor de 1,2 \mum 142 mm (copolímero acrílico en un soporte de Nylon 66), para eliminar el fármaco precipitado.

Se preparó una disolución acuosa al 0,9% (p/v) de NaCl disolviendo el NaCl en agua estéril. El pH de la disolución se ajustó hasta aproximadamente 5,5 con HCl o NaOH 2 N. La disolución se filtró a través de un filtro Durapore de 0,22 \mum.

La suspensión liposómica se diluyó en aproximadamente una relación 1:1 (v/v) con la disolución de NaCl, y se filtró por diálisis a través de un ultrafiltro de fibra hueca de polisulfona. Se realizaron ocho intercambios de volumen frente a la disolución de NaCl, para eliminar el etanol y el fármaco no encapsulado. La temperatura del fluido del proceso se mantuvo a alrededor de 20-30ºC. El tiempo total de la diafiltración fue aproximadamente 4,5 horas.

La suspensión liposómica se concentró entonces hasta aproximadamente 1,2 mg de cisplatino/ml mediante ultrafiltración. El fluido tras el proceso de diafiltración se analizó para determinar el contenido de cisplatino mediante HPLC. Los liposomas tuvieron una fase interna de 7,7 mg/ml de cisplatino en 0,9% de NaCl, y una fase externa de NaCl acuoso al 0,9%.

Las muestras de la formulación liposómica se colocaron en viales de vidrio, y se añadieron NaCl y sacarosa sólidos para producir concentraciones externas de NaCl entre 0,9-3,6% (p/v), y concentraciones externas de sacarosa entre alrededor de 1% y alrededor de 20% (p/v), suponiendo que el volumen del medio externo fue 85% del volumen total antes de la adición de los sólidos. Cada muestra se congeló a -20ºC durante 6,8 días, y después se descongeló dejándola reposar a temperatura ambiente. El tamaño medio de partículas de los liposomas en cada muestra se determinó como una medida del grado de daño por congelación. Los resultados se muestran en la Tabla 4.

Aunque la invención se ha descrito con respecto a realizaciones particulares, resultará de manifiesto para los expertos en la materia que se pueden realizar diversos cambios y modificaciones sin apartarse por ello de la invención.

Claims

1. Composición liposómica que confiere protección frente al daño por congelación/descongelación, que comprende:

una suspensión de liposomas en la que cada liposoma contiene un medio acuoso atrapado que presenta una osmolaridad interna, estando suspendidos los liposomas en un medio externo que comprende una sal soluble en agua y un crioprotector, presentando dicho medio externo una osmolaridad externa liposómica mayor que la osmolaridad interna liposómica, estableciendo de ese modo un gradiente osmótico, menor en el interior/mayor en el exterior, a través de cada liposoma.

2. Composición según la reivindicación 1, en la que el medio externo incluye una sal seleccionada de entre el grupo que consta de sales de nitrato, sales de sodio, sales de potasio, sales de amonio y sales de sulfato.

3. Composición según la reivindicación 1 ó 2, en la que el crioprotector es un azúcar disacárido, un azúcar monosacárido, o se selecciona de entre el grupo que consta de trehalosa, maltosa, sacarosa, glucosa, lactosa, dextrano, glicerol, polietilenglicol, y aminoglicósidos.

4. Composición según la reivindicación 2 ó 3, en la que la sal se selecciona de entre cloruro de sodio (NaCl) y cloruro de potasio (KCl), o una combinación de las mismas.

5. Composición según la reivindicación 3 ó 4, en la que la sal en el medio externo es NaCl, y el crioprotector es sacarosa.

6. Composición según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que los liposomas incluyen un lípido formador de vesículas derivatizado con una cadena de polímero hidrófilo.

7. Composición según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, quecomprende además un agente terapéutico atrapado en el liposoma.

8. Composición según la reivindicación 7, en la que el agente terapéutico comprende un compuesto de coordinación metálico.

9. Composición según la reivindicación 8, en la que el compuesto de coordinación metálico es cisplatino o un análogo de cisplatino o derivado del mismo.

10. Método para proteger una composición liposómica frente al daño por congelación/descongelación, que comprende preparar una suspensión de liposomas según cualquiera de las reivindicaciones anteriores.

11. Método para mejorar la congelación de una suspensión de liposomas, que comprende combinar en la suspensión de liposomas un crioprotector y una sal soluble en agua, eficaz para establecer un gradiente osmótico a través de cada liposoma, presentando el medio de suspensión una osmolaridad mayor que el interior del liposoma.

12. Composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 o un método según la reivindicación 10 u 11, en los que el gradiente osmótico es al menos 100 mOsm.