KR20200057104A - 동결건조된 리포좀 - Google Patents

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KR20200057104A
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폴 타르디
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셀라토 파마슈티칼즈, 인코포레이티드
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Abstract

두 개 이상의 포집된 약물들을 가지는 동결건조된 리포좀 제형들이 개시되어 있다. 상술한 제형들은 우수한 약물 보유 프로파일을 나타내고 또한 동결건조 및 재구축 후에도 크기 분포를 유지한다.

Description

동결건조된 리포좀{LYOPHILIZED LIPOSOMES}
본 출원은 2011년 10월 21일에 출원된 미국 특허 출원번호 제61/550,047호를 우선권으로 주장하며, 이것이 전문으로 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
본 발명은 연장된 기간의 시간 동안 저장될 수 있는 최소 2개의 치료제들 또는 진단제들을 포함하는 동결건조된 리포좀들을 포함하는 조성물들 및 이를 제조하는 방법들에 관한 것이다. 하나의 양태에서, 본 발명은 저콜레스테롤(low-cholesterol) 리포좀들에 관한 것으로, 선택적으로 상기 리포좀의 크기 및 통합성(integrity)을 보호할 수 있는 리포좀들의 동결/해동 및 탈수 손상에 대한 저항성을 가지는 동결방지제를 포함하는 외부 배지 내 저-콜레스테롤 리포좀들에 관한 것이다.
리포좀들은 수용성 코어를 둘러싸는 최소 하나의 지질 이중층을 가지는 밀폐된 소포들(closed vesicles)이다. 상기 내부리포좀(intra-liposomal) 공간 및 지질 이중층(들)은 약물들, 화장품들, 진단 시약들(reagents), 유전 물질 및 생활성 화합물들을 포함하는 폭넓은 다양한 물질들을 포집할 수 있다. 비독성 지질들이 리포좀들을 위한 기반으로서 기능하기 때문에, 일반적으로 상기 지질들은 낮은 독성을 나타낸다. 제제들의 혈장 순환 수명을 증가시키는 리포좀들의 능력과 커플링된 상기 낮은 독성은 특히 약제학적으로 활성을 가지는 제제들을 운반하는 데 유용한 소포들로서의 리포좀들을 야기한다. 많은 경우에서, 리포좀 운반된 약물들은 감소된 독성과 함께 우수한 임상적 효능을 초래한다.
약물 운반 소포들로서 리포좀 제조물들(liposomal preparations)의 실제적인 적용은 상기 제조물의 화학적 및 물리적 안정성에 의해 제한된다. 상업화는 화학적 및 물리적 레벨들 모두에서 장기간 안정성을 필요로 한다. 불안정한 약물 및/또는 지질 구성성분들의 분해(breakdown)를 피하기 위해 동결된 또는 동결건조된(freeze-dried)(동결건조된(lyophilized)) 제조물들의 이용은 안정성에서 약간의 개선을 제공한다. 하지만, 동결건조 과정 동안 아이스 결정 형성(ice crystal formation)은 기계적 파괴(rupture), 리포좀 응집 및 융합(증가된 리포좀 크기를 초래함)을 유발할 수 있다. 더욱이, 약물을 포함하는 리포좀들이 동결건조된 후 상온에서 재구축(reconstitution)되는 경우, 촉진된 약물 누출(drug leakage)을 일으키는 상기 리포좀들의 이중층(들)의 구조에서의 변화들이 빈번하게 발생한다.
동결건조된 리포좀 조성물들을 제조하려는 이전 시도들은 전형적으로 체온(body temperature)에서 지질들의 운동이 유동적이고 조절되지 않는 액체상(liquid phase)인 종래의 리포좀들에 의존해 왔다. 그러한 종래의 리포좀들은 2개의 카테고리들로 나뉜다. 첫 번째 리포좀들은 겔 대 액체(gel-to-liquid) 결정화 온도(crystalline temperature, Tc)가 체온 미만(즉, 상기 리포좀들은 체온에서 액체상으로 존재할 것임)인 지질들을 포함하기 때문에 액체 상태(state)로 유지된다. 상술한 리포좀들은 일상적으로 당업계에서 이용되고 있지만; 유동적인 상태의 단점(downside)은 많은 포집된 제제들에 대한 낮은 약물 보유능(drug retention)이다.
두 번째 타입의 종래 리포좀들은 액체에서 젤로의 전이를 결코 겪지 않는데, 이는 이들이 콜레스테롤(예컨대, 30-45몰%(mol%)) 같은 많은 양의 막 견고화 제제들(membrane rigidification agents)을 포함하기 때문이다. 콜레스테롤은 상기 리포좀의 이중층 두께 및 유동성(fluidity)을 증가시키는 반면에 상기 리포좀의 막 투과성, 단백질 상호작용 및 지질단백질의 불안정성을 감소시키는 기능을 한다. 상술한 많은 양의 콜레스테롤은 리포좀 연구들에서 가장 빈번하게 이용되고 있으며, 모든 약물들을 충분하게 보유할 수 없을 지라도 인 비보에서 적합한 혈청 안정성 및 약물 보유능을 위해 필요한 것으로 역사적으로 개시되어 왔다. 실질적으로 어떠한 콜레스테롤도 포함하지 않는 리포좀들에서 어떤 약물들은 인 비트로 및 인 비보 모두에서 보다 더 좋은 약물 보유능을 나타낸다. 예를 들어, Dos Santos, 등, Biochim. Biophs. Acta, (2002) 1561:188-201을 참조하라.
한편, 겔-상의 리포좀들은 보다 안정적이고 개선된 약물 보유능을 나타낸다. 본 발명은 체온에서 겔 상으로 존재하는 리포좀들(즉, 체온이 리포좀들의 Tc 미만임)을 이용한다. 겔상 리포좀들은 많은 지질들로 제조될 수 있다; 하지만, 수소화된 대두 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine, PC), 디팔미토일 포스파티딜콜린(dipalmitoyl phosphatidylcholine, DPPC) 또는 디스테아로일 포스파티딜콜린(distearoyl phosphatidylcholine, DSPC) 같은 보다 더 포화된 아실 사이드 체인(acyl side chain)을 가지는 포스파티딜 지질들로 제조된 겔-상 리포좀들은 체온에서 겔-상을 획득하기 위해 30% 미만의 콜레스테롤을 가지는 것을 필요로 한다. 체온에서 겔-상을 나타내지 않는 종래의 리포좀들 중 하나의 예는 유의한 누출성을 나타내는 EPC(egg phosphatidylcholine)로 구성된 리포좀들이다.
종래의 리포좀들을 이용하여 동결건조된 리포좀 조성물들을 제조하고자 하는 이전의 시도들은 빈 리포좀들이거나 또는 오직 하나의 제제만을 포함하는 리포좀들을 포함하였다. 상술한 리포좀들은 리포좀들의 내부 및 외부 모두에 전형적으로 단당류(saccharide)인 동결방지제(cryoprotectant)를 사용하거나, 또는 리포좀 막을 가로지르는 큰 삼투성 농도구배를 이용할 것이다.
예를 들어, 동결방지제들이 상기 리포좀들의 내부 및 외부 모두에 충분한 양, 이상적으로는 동일한 양들로 제시되는 경우 동결방지제들이 단일 제제를 포집하는 '액체' EPC 리포좀들에 대한 동결/해동 손상을 보호하기 위해 사용되었다. 미국 등록특허 제5,077,056호 및 제4,883,665호를 참조하라. 내부 리포좀 배지에 1%-10% 동결방지제의 존재는 동결건조된 EPC 리포좀-포집된 독소루비신 제형(doxorubicin formulation)을 보호하는데, 바람직하게는 내부 삼투성이 거의 생리학적 삼투성인 조건에서 보호한다. 미국 등록특허 제4,927,571호를 참조하라. 리포좀 내부에 동결방지제를 포함시키는 것의 실패는 재구축 시에 리포좀 통합성의 상실, 특히 포집된 제제를 보유하는 측면에서 통합성의 상실을 초래하는 것으로 보여져 왔다. 기재된 바와 같이, "누출의 예방은 리포좀의 내부 및 외부 모두에 존재하는 당을 필요로 한다"(Lowery, M. (June 2002) Drug Development and Delivery, Vol. 2, No. 4).
하나의 경우에서, 외부 배지 내에 44몰% 콜레스테롤 뿐 아니라 동결방지제 및 고농도의 염을 포함하는 리포좀 제조물의 경우, 수소화된 대두 PC:콜레스테롤:DSPE mPEG(51:44:5 몰 비율) 리포좀들에서 포집된 약물의 손실 뿐 아니라 소포 응집 및 융합에 대한 보호도 보고되었다. 44% 콜레스테롤의 존재는 상기 리포좀들이 체온 또는 그 아래에서 액체 상이라는 것을 의미한다. 나아가, 상기 보호 효과는 큰 삼투성 농도구배가 막을 가로질러 존재하여 상기 외부 리포좀 삼투도(osmolarity)가 내부 삼투도보다 현저하게 더 높은 경우에만 실현된다. WO01/05372를 참조하라.
또한, 막 결합된 동결방지제는 상술한 비 겔상 리포좀들의 동결 및 동결건조에 대한 저항성도 추가적으로 개선시킨다. 특히, EPC 또는 EPC:콜레스테롤(1:1 몰 비율) 리포좀 막 위에 하나 내지 세 개의 반복 단위들(repeating units)로 구성된 올리고(에틸렌 옥사이드) 링커들을 통해 이식된 당들이 형광성 프로브를 포함하는 리포좀들에 대해 동결방지 활성을 가진다는 것이 보고되었다. 예를 들어, 벤다스(Bendas), 등, Eur. J. Pharm. Sci. (1996) 4:211-222; 굿리치(Goodrich), 등, Biochem. (1991) 30:5313-5318; 미국 등록특허 제4,915,951호를 참조하라. 발데슈빌러(Baldeschwieler), 등은 말단 당 기의 부재 하에서 올리고에틸렌 옥사이드 링커만으로 제조된 리포좀들은 동결 이후의 융합을 보호할 수 없다는 것을 보고하였다. 미국 등록특허 제4,915,951호.
단일 제제를 포집하는 PC 리포좀 제형의 외부 배지에 트레할로오스(trehalose)의 존재는 리포좀 응집 및 융합에 대한 저항성을 제공한다. 미국 등록특허 제6,319,517호. 응집에 대해 안정화되어 있는 작은 리포좀들을 생산하는 다른 방법들은 빈 PC:콜레스테롤(1:1 몰 비율) 리포좀들의 형성을 필요로 하는데, 이후 상기 리포좀들에 당 및 단일 시약으로 이루어진 용액이 첨가된 후 건조된다. 상기 건조 과정 동안 상기 시약의 일정 퍼센트가 리포좀 내로 포집된다. 보고에 의하면, 상술한 리포좀들은 보존시에 당 비존재하보다 안정적이다. 예를 들어, WO99/65465호를 참조하라.
이전에 기재된 바와 같이, 동결건조에 대한 대부분의 이전 기술들은 빈 리포좀들 또는 단일 제제를 포집하고 있는 리포좀들 중 어느 하나의 동결건조에 집중하였다. 두 개 이상의 제제들이 포집되는 경우, 특히 상기 제제들이 용해도(solubility) 특성에서 상이한 경우에 통합성의 유지를 가지는 동결건조 과정은 보다 큰 도전을 요구하고 있다. 암 같은 많은 생명-위협성 질환들이 복수의 분자적 기작들에 의해 영향받기 때문에 두 개 이상의 제제들을 포집하는 것이 종종 유용하고, 이러한 복잡성으로 인해 단일 제제로 치료를 달성하는 것이 제한된 성공으로 끝났다. 따라서, 거의 모든 암 치료들은 하나의 치료제보다 그 이상의 조합들을 포함한다. 이것은 감염성 및 만성 질환들을 포함하는 다른 상태들(conditions)의 치료에서도 마찬가지이다.
본 명세서에 참조로서 삽입된 PCT 공개공보 제WO03/041681호는 38℃ 또는 그 이상의 전이온도(transition temperatures)를 가지는 겔상 리포좀들이 최소 1몰%의 포스포이노시톨(phosphoinositol, PI) 또는 포스파티딜글리세롤(phosphatidylglycerol, PG)이 조성물 내에 포함되는 경우 DPPC 및 DSPC 같은 포화된 포스파티딜 지질과 더 적은 양(0-20%)의 콜레스테롤을 이용하여 제조될 수 있다는 것을 보고한다. 상술한 리포좀들이 포집된 이리노테칸(irinotecan) 및 플록수리딘(floxuridine, FUDR)의 조합들을 포함하는 경우 -20℃에서의 동결(freezing)에 대해 안정적이라는 것이 보여졌다. 일반적으로, 단순 동결은 동결건조보다 리포좀 통합성에 대해 덜 혹독하고 덜 파괴적이다.
상술한 조합들에 대한 운반 소포들로서 리포좀들의 이용은 상기 리포좀들이 비-길항적인(non-antagonistic) 제제들을 포함하고 이들의 비율을 유지시킬 수 있는 경우에 특히 유리하다. 이러한 일반적인 접근방법은 미국 등록특허 제7,850,990호에 상세하게 기재되어 있으며, 본 명세서에 참조로서 삽입된다. 이러한 특허는 항종양제들을 포함하는 다양한 치료제들의 비-길항적인 또는 상승적인(synergistic) 비율들을 결정하여 폭넓은 범위의 농도에서 그러한 비길항작용 또는 상승작용을 어떻게 유지하는 지를 교시한다. 또한, 상기 특허는 상기 투여된 비율에서 상기 약물들을 운반하는 것과 운반 소포들이 약물동력학을 조절하는 것을 허용함으로써 그 비율을 유지시키는 것이 중요하다는 것을 교시한다. 이리노테칸 및 FUDR을 포함하는 2개 이상의 치료제들을 포함하고 이들의 비율, 즉 비길항적인 또는 상승적인 비율을 유지하는 리포좀들이 본 특허에서 예시된다. 리포좀들에 포집된 그러한 조합들은 재구축 시에 상기 리포좀들의 통합성, 제제들의 농도 및 이들의 비율이 유지되는 경우 동결건조된 형태로 저장되는 장점들로부터 이점을 제공할 것이다. 특히 유용한, 리포좀들에 포집된 시타라빈과 다우노루비신의 그러한 조합은 미국 등록특허 제8,022,279호에 기재되어 있으며, 이 또한 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
치료 프로토콜들에서 상술한 조합들의 이용은 놀랍도록 우수한 결과들과 함께 PCT 공개공보 제WO2007/050784호 및 PCT 공개공보 제WO2008/101214호에 기재되어 있다. 소망하는 약물 운반 선택들의 리포좀 포집과 함께 추가적인 제형들은 WO2009/097011 및 WO2009/070761 뿐 아니라 WO2010/043050에 기재되어 있다. 상술한 제형들은 2개 이상의 치료제들이 환자에게 운반하기 위한 리포좀들에 포함되어 있는 유용한 조성물들의 간단한 예시이다.
상술한 바와 같이, 일반적으로 재구축 시에 통합성을 유지하는 리포좀들의 안정적인 동결건조된 조성물들을 제조하는 것은 어렵고 예측할 수 없었다. 두 개 이상의 제제들의 조합을 위한 그런 안정적인 리포좀 조성물들을 얻는 것은 보다 큰 도전을 요구하고 있다. 따라서, 2개 이상의 치료제들 또는 진단제들을 포함하고 재구축 시에 리포좀의 통합성을 유지하는 동결건조된 리포좀들을 얻는 것에 대한 본 발명의 방법의 성공은 탁월한 업적이다.
동결건조 후 재구축 시에 리포좀 통합성을 유지하기 위해, 특히 포집된 제제의 보유를 보장하기 위해 동결방지제가 리포좀의 내부 및 외부 모두에 필요하다는 것이 지속적으로 보고되어 왔다. 본 발명자들은 하나 뿐 아니라 두 개 이상의 활성 제제들(active agents)을 포집하는 리포좀들의 성공적인 동결건조를 위해 어떠한 내부 동결방지제도 필요로 하지 않는 안정적인 리포좀들을 동정하였다.
본 발명은 하나 이상의 치료제 및/또는 진단제를 포함하고 어떠한 내부 동결방지제를 포함하지 않는 성공적으로 동결건조된 겔상 리포좀 제조물들(preparations)에 관한 것이다. 따라서, 하나의 양태에서 본 발명은 동결건조된 리포좀 조성물에 관한 것으로, 상기 리포좀들은 최소 2개의 치료제들 및/또는 진단제들과 안정적으로 결합되어 있고, 상기 조성물이 재구축되는 경우 전동결건조 상태(pre-lyophilization state)와 비교시 상기 리포좀들의 평균 직경이 유지되며 상기 리포좀들에 포집되어 남아 있는 각 제제들의 퍼센트(percentage)가 만족할만한 레벨로 유지된다. 따라서, 상기 리포좀들의 통합성은 상기 리포좀들의 재구축 후 함유되어 있는 포집된 제제들의 퍼센트로서 측정된다. 만족스러운 동결건조를 위한 기준(criterion)으로서 이용된 추가적인 매개변수는 크기 분포에서 최소의 변화이다. 특히 중요한 구현예는 제제들이 리포좀들의 내부에 특정된 비율로 포집되어 있고 상술한 제제들의 비율이 상기 동결건조된 형태들이 재구축되는 경우에 유지된다는 것이다.
이러한 결과를 달성하기 위한 전형적인 조건들(conditions)은 최소 상온이고 인간 체온 또는 그 이상일 수도 있는 겔 대 액체 결정화 전이온도(Tc)를 가지는 겔-상 리포좀들의 이용을 포함한다. 체온은 약 37℃인 것으로 간주된다. 상기 리포좀들은 포스파티딜글리세롤 및/또는 포스포이노시톨로 안정되어 있는 저콜레스테롤 리포좀들일 수 있다. 상기 리포좀들은 실질적으로 어떠한 내부 동결방지제를 포함하지 않지만, 이들의 표면에 외부 동결방지제를 포함할 수 있어 동결방지제를 포함하는 배지의 존재 하에서 동결건조될 수 있다. 용어 "실질적으로 어떠한 내부 동결방지제를 포함하지 않는(substantially no internal cryoprotectant)"은 어떠한 내부 동결방지제를 포함하지 않는 리포좀들 뿐 아니라 상기 리포좀들의 동결 및/또는 동결건조에 영향을 미치지 않는 양의 동결방지제(즉, "불활성(inactive)" 양인 125 mM 또는 그 미만의 동결방지제)를 포함하는 리포좀들을 포함하는 것을 의미한다. 따라서, "실질적으로 어떠한 내부 동결방지제를 포함하지 않는"은 리포좀들 내부에 약 0-125 mM의 동결방지제가 존재하는 것으로 정의된다. 동결건조 과정에 따른 약물 누출을 예방하는 것이 리포좀 크기의 유지보다 현저하게 더 어렵다는 것을 유의하는 것이 중요하다. 상술한 바와 같이, 동결건조 후 약물 보유는 역사적으로 리포좀들의 내부 및 외부 모두에 동결방지제의 이용을 통해 성취되었다.
이에, 하나의 구현예에서, 최소 상온, 예를 들어, 25℃에서 지질막이 약물들을 보유하는 데 도움을 주는 겔 유사(gel-like) 형태로 유의하게 존재하기 위해, 상기 리포좀들은 상온 또는 25℃ 또는 37℃보다 더 높은 막의 겔 대 액체 결정화 전이온도(Tc's)를 가진다. 상기 조성물들은 포집된 제제들의 보유, 그리고 동결건조 및 재구축 시에 감소된 응집 및 융합을 할 여유가 있어 연장된 저장수명(shelf life)을 가진 유용할 수 있는 조성물들을 제공한다. 상기 동결건조 과정에 대한 증가된 보호는 삼투 포텐셜(osmotic potential)에 독립적이다. 상술한 리포좀들은 약제학적으로 관련된 상태들 하에서 연장된 시간의 기간 동안 크기 분포 및 약물-포집 프로파일들을 유지한다.
따라서, 동결건조된 리포좀 조성물들을 제조하기 위한 방법들은 선택된 농도에서 리포좀의 외부에 동결방지제를 포함할 수 있고, 동결 및 동결건조 전의 상기 리포좀 막은 리포좀의 상 전이온도(phase transition temperature, Tc) 미만이다. 바람직하게는, 상기 리포좀들은 포집된 약물을 가지는 리포좀들 뿐 아니라 상기 동결방지제를 포함하는 외부리포좀(extraliposomal) 배지를 포함하는 용액의 유리전이온도(glass transition temperature, Tg) 미만인 온도에서 동결된다.
또한, 다른 양태들에서 본 발명은 상기 설명된 구현예들에 따른 2개 이상의 치료제들 및/또는 진단제들을 포함하는 동결건조된 리포좀들을 제조하는 방법들, 상기 동결건조된 조성물들을 재구축하는 방법들, 그리고 상기 재구축된 리포좀들을 동물에게 투여하는 방법들, 그리고 질환(예컨대, 암)에 감염되거나, 질환에 민감하거나 또는 질환에 감염된 것으로 의심되는 동물들을 치료하는 방법들에 관한 것이다.
우선, 본 발명은 2개 이상의 치료제들 및/또는 진단제들을 포함하는 동결건조된 겔상 리포좀 조성물들을 제공하며, 재구축된 동결건조된 조성물의 특징 및 특성들은 본질적으로 동결건조 전의 조성물의 특징 및 특성들과 유사하다. 상술한 특징들은 상기 리포좀들의 평균 직경, 크기 분포 및 함유물(contents)을 포함할 수 있다. 상기 리포좀들의 함유물은 상기 제제들의 보유를 의미하며; 어떤 구현예들에서, 상기 제제들의 비율도 또한 유지된다.
상기 리포좀들이 치료제들 및/또는 진단제들을 포함하고 있을 지라도, 본 출원에서 "약물들(drugs)"은 때때로 이들을 지칭하는 약칭으로서 이용된다.
상기 겔상 리포좀들은 내부 구획(internal compartment)을 둘러싸는 하나 이상의 지질 이중층들을 포함한다. 상술한 리포좀들은 이중라멜라(bi-lamellar) 또는 단일라멜라(unilamellar) 소포들일 수 있다. 단일라멜라 리포좀들(단일라멜라 소포들 또는 "ULV"로도 알려짐)은 하나의 내부 수성 구획(internal aqueous compartment)을 둘러싸고 작은 단일라멜라 소포들(small unilamellar vesicles, SUV) 또는 큰 단일라멜라 소포들(large unilamellar vesicles, LUV) 중 어느 하나로 분류된다. LUV 및 SUV는 각각 약 50 nm부터 500 nm까지의 크기 및 약 20 nm부터 50 nm까지의 크기 범위에 이른다. 이중라멜라 리포좀들은 2개의 지질막들을 가지고, 상기 내부 막은 하나의 내부 수성 구획을 둘러싸고 상기 두 번째 더 큰 외부 막은 상기 내부 막을 둘러쌈으로써 두 번째 내부 수성 구획을 창출한다.
상기 겔상 리포좀들의 크기 분포를 유지하는 것은 본 명세서에서 도 1 내지 도 4에서 설명된 바와 같이 입자 크기 프로파일들을 얻음으로써 실험적으로 평가될 수 있다. 준탄성 광산란(quasielastic light scattering)에 의해 결정된 크기 분포는 전형적으로 상기 리포좀들의 평균 직경을 나타내는 막대그래프로서 제시된다. 당업계에서 가장 일반적으로 이용되는 유의한 크기 분포 측정치들(measurments)은 D10, D90, D99 또는 표준편차 또는 다분산지수(polydispersity index)이다. "D99" 값들은 99%의 리포좀들이 참조된 크기 미만이거나 또는 참조된 크기 초과라는 것을 의미한다. 이것은, 예를 들어 상위의 크기 또는 하위의 크기 중 어느 하나를 배제하는 것이 중요한 경우에, 특히 유용하다. 예를 들어, 어떤 구현예들에서는 평균 직경에서 200 nm를 초과하는 리포좀들이 존재하지 않는 것을 확실하게 하는 것이 바람직하다.
예시하기 위해 178 nm의 D99 값을 가지는 특정 예가 이용된다. 178 nm로 측정된 D99 값(실시예 2의 표 1에서 보여짐)은 최소 99%의 리포좀 개체군이 178 nm 미만이라는 것을 보장한다. 또한, 일반적으로 이용되는 평균 직경들에 대한 D10 및 D90 값들은 불과 10% 이하의 개체군이 참조된 크기의 최소값(minimum referenced size; 즉, D10)보다 더 작고, D90의 경우 90%의 개체군이 참조된 크기의 상위 제한(upper referenced size limit)이거나 또는 그 미만인 값들이다. 예를 들어, 배치 1 및 2에서 보여지듯이, D10 값은 68 nm이고 이는 상기 리포좀 개체군의 10%만이 68 nm 미만이라는 것을 의미한다. D90 값은 개체군의 90%가 배치 1 및 2에서 각각 135 nm 또는 137 nm이거나 또는 그 미만이라는 것을 보여준다. 본 명세서에서 동결건조 및 재구축 후 상기 리포좀들의 크기 분포를 유지하는 것은 선택된 D 값의 레퍼런트 값(referent value)이 동결 및/또는 동결건조 전의 값과 비교시 재구축 시에 50%, 25%, 20%, 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6% 또는 5%까지만 변화하는 것을 보임으로써 입증되는 것으로 정의된다. 선택된 상기 D 값들은 99, 98, 94 및 90까지의 사이 정수들 또는 D10일 수 있다.
상기 동결건조된 리포좀들의 하나의 특징은 조성물 내 리포좀들의 평균 직경에 관한 것이다. 리포좀 조성물의 평균 직경이 50%, 25%보다 더 크게 증가하지 않는 경우, 상기 리포좀들의 평균 직경은 동결 전 직경에 기반되어 동결건조 후 및 재구축 시에 체적(volume weighted) 기반 20%, 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6% 또는 5%로 재구축 상에 유지된다. 예를 들어 D90(또는 상기 나열된 값들 같은 다른 D 값)에 대한 레퍼런트에서 10% 증가와 커플링된 평균 리포좀 직경의 10% 증가 같은 수반 값(concomitant value)은 입자(예를 들어, 리포좀) 크기 분포가 변화하지 않았다는 것을 확인하기 위한 하나의 측정기준(measure)이다. 또한, 상기 분포의 전체적인 성질은 도 1 내지 도 4에서 보여지는 바와 같이 바람직하게는 체적 기반으로 평가될 수 있다.
보다 상세하게는, 리포좀 조성물은 전형적으로 가우스 곡선(Gaussian curve)을 나타내는 크기들의 범위를 포함한다. 상기 리포좀들의 평균 직경은 동결 또는 동결건조 및 재구축 후 원래 크기로부터 약 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6% 또는 5%까지만 재구축 시에 증가할 것이다. 예를 들어, 90 nm의 평균 직경을 가지는 리포좀들의 시료는 재구축 시에 상기 평균 직경이 30% 이상보다 더 크지 않은 경우, 즉 약 117 nm인 경우에 동결 및/또는 동결건조의 효과들에 저항하는 것으로 간주될 것이다. 이들보다 더 큰 크기 증가들은 상기 리포좀들의 응집 및 융합이 일어났다는 것을 의미한다. 10% 미만의 변화들을 측정하기 위해, 크기 분포 또는 평균 직경에서의 변화를 측정하는 현저하게 민감한 측정 기술이 이용될 수 있다.
통합성의 보존에 대한 다른 기준은 포집된 제제들의 보유이다. 전동결건조 값들에 대해 상대적으로 평가되는 평균 직경, 크기 분포 및 약물 비율과 달리, 약물 보유는 재구축 후 총 약물 그 자체, 즉 상기 동결건조된 조성물 내 총 약물에 기반되어 상대적으로 평가된다. 리포좀 내부에 포집된 약물의 퍼센트 또는 리포좀 밖의 외부 배지 내 약물의 퍼센트("포집되지 않은(unencapsulated)" 약물의 %)는 조성물 내 약물의 총량에 상대적이다. 하나의 구현예에서, 포집된 제제들의 최소 약 75%가 동결건조 후 및 재구축 시에 포집된 바와 같이 유지된다. 각 제제의 최소 약 85%가 포집된 바와 같이 유지될 수 있고, 또는 최소 약 90% 또는 95%가 포집된 바와 같이 유지될 수 있다. 이것은 동결건조된 리포좀들의 재구축 시에 포집된 원래의 양들의 25%, 20%, 15%, 10% 또는 5% 이하인 주변 배지 내 포집되지 않은 약물의 양에 의해 유사하게 측정될 수 있다.
포집된 치료제들 및/또는 진단제들의 비율이 전동결건조된 조성물 자체 내 비율로부터 20%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 또는 5% 이상까지 다양하지 않다면 상기 비율이 재구축 시에 유지된다. 비율들은 몰 비율들로 표시된다.
하나의 구현예에서, 리포좀들의 동결건조 후 및 재구축 시에 상기 리포좀들의 평균 직경은 동결건조 전에 측정된 값과 비교시 25%까지만 증가할 것이다. 다른 구현예에서, 리포좀들의 동결건조 후 및 재구축 시에 상기 리포좀들의 평균 직경은 동결건조 전에 측정된 값과 비교시 15%까지만 변한다. 또 다른 구현예들에서, 리포좀들의 동결건조 후 및 재구축 시에 상기 리포좀들의 평균 직경은 동결건조 전에 측정된 값과 비교시 10%, 9%, 8%, 7%, 6% 또는 5%까지만 변한다.
일부 구현예들에서, 포집되지 않은 약물의 퍼센트는 리포좀들의 재구축 시에 원래 포집된 약물의 25%일 뿐이다. 다른 구현예들에서, 포집되지 않은 약물의 퍼센트는 리포좀들의 재구축 시에 원래 포집된 약물의 15%일 뿐이다. 다른 구현예들에서, 포집되지 않은 약물의 퍼센트는 리포좀들의 재구축 시에 원래 포집된 약물의 10%일 뿐이거나, 또는 9%, 8%, 7%, 6% 또는 5%일 뿐이다.
다른 방식으로 기재하면, 일부 구현예들에서, 보유된 포집된 약물들의 퍼센트는 상기 리포좀들의 재구축 시에 꼭 75%만큼이다. 다른 구현예들에서, 각 포집된 약물의 퍼센트는 상기 리포좀들의 재구축 시에 꼭 85% 또는 90% 또는 95%만큼이다.
상술한 매개변수들의 조합들도 포함된다. 예를 들어, 상기 평균 직경은 단지 25%까지 증가할 수 있고, 포집된 약물의 퍼센트는 최소 90%일 수 있거나, 또는 상기 평균 직경은 단지 10%까지 증가할 수 있고, 포집된 약물의 퍼센트는 최소 90%일 수 있다.
일부 구현예들에서, 리포좀들의 크기 분포는 동결건조 전과 비교시 상기 리포좀들의 동결건조 후 및 재구축 시에 단지 25%까지만 변한다. 다른 구현예들에서, 리포좀들의 크기 분포는 동결건조 전과 비교시 상기 리포좀들의 동결건조 후 및 재구축 시에 단지 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 또는 5%까지만 변한다.
상기 기재된 바와 같이, 성공적으로 리포좀들을 동결건조시키고 재구축하기 위한 상술한 매개변수들 또는 기준들의 다양한 조합들이 고려된다 - 예를 들어, 크기 분포에서 단지 5%의 변화와 선택적으로 결합된 평균 직경에서 단지 15% 증가와 결합된 최소 85%의 포집된 약물들. 상술한 매개변수들의 가능한 조합들 각각은 본 발명의 범위 안에 있다.
겔상 리포좀들은 종래의 기술들, 예를 들어 에테르 주입 방법(Deamer, et al., Acad. Sci. (1978) 308:250), 계면활성제 방법(Brunner, et al., Biochim. Biophys. Acta (1976) 455:322), 동결 해동 방법(Pick, et al., Arch. Biochim. Biophys. (1981) 212:186), 역상 증발 방법(Szoka, et al., Biochim. Biophys. Acta. (1980) 601:559-571), 초음파 처리 방법(Huang, et al., Biochemistry (1969) 8:344), 에탄올 주입 방법(Kremer, et al., Biochemistry (1977) 16:3932), 분출 방법(Hope, et al., Biochim. Biophys. Acta (1985) 812:55-65) 및 프렌치 프레스 방법(Barenholz, et al., FEBS Lett. (1979) 99:210)에 의해 생산될 수 있다.
상술한 과정들은 조합으로 이용될 수 있다. 특히, 작은 단일라멜라 소포들(SUVs)은 초음파 처리 방법, 에탄올 주입 방법 및 프렌치 프레스 방법에 의해 제조될 수 있다. 큰 단일라멜라 소포들(LUVs)은 에테르 주입 방법, 계면활성제 방법, 동결 해동 방법, 역상 증발 방법, 프렌치 프레스 방법 또는 분출 방법에 의해 제조될 수 있다. 바람직하게는, LUV들은 분출 방법에 따라 제조된다.
동결건조 및 재구축은 리포좀들이 겔 상인 조건들 하에서 실시된다. 따라서, 상기 리포좀들의 겔 대 액체 전이온도는 상온, 즉 약 20-30℃보다 더 높을 수 있고, 보다 바람직하게는 체온 또는 체온 초과일 수 있다. 상온은 상당히 다양할 수 있지만, 상기 리포좀들이 겔 상태인 조건들 하에서 상기 동결건조 과정이 시작된다는 것이 중요하다. 일부 구현예들에서, Tc는 적어도 체온(즉, 약 37℃)만큼 높다. 일부 구현예들에서, 상기 리포좀들은 겔 유사 상태를 유지하기 위해 상 전이온도 미만의 온도에서 제조된다. 어떠한 적합한 내부 배지가 이용될 수 있다. 전형적으로, 상기 내부 배지는 수용성 배지이다. 상기 내부 배지는 실질적으로 어떠한 동결방지제를 포함하지 않는다(즉, 125 mM 미만의 동결방지제). 상기 내부 배지는 100 mM 미만의 동결방지제를 포함할 수 있거나, 또는 50 mM 미만의 동결방지제를 포함할 수 있거나, 또는 어떠한 동결방지제도 포함하지 않을 수 있다.
적합한 Tc 값들을 가지는 리포좀 제형들은 "저콜레스테롤(low cholesterol)" 리포좀들, 즉 리포좀의 상 전이 특성을 유의하게 변화시키기에 충분하지 않은 양, 즉 전형적으로 20몰% 이하의 콜레스테롤의 존재 하에서 제조된 리포좀들 및 상기 충분하지 않은 양의 콜레스테롤을 포함하는 리포좀들일 수 있다. 20몰%보다 더 많은 양의 콜레스테롤은 더 높은 콜레스테롤 레벨들에서 사라지는 상 전이와 함께, 상 전이가 일어나는 온도의 범위를 확장시킨다. 저농도 콜레스테롤을 가지는 리포좀은 20몰% 미만, 또는 15몰% 미만, 또는 10몰% 미만 또는 5몰% 이하의 콜레스테롤을 가지거나 또는 콜레스테롤이 결핍될 것이다. 선택적으로, 그러한 리포좀들은 최소 1몰%의 PG 또는 PI 같은 안정화제(stabilizing agent)를 필요로 한다.
동결방지제가 이용되는 방법들에 있어서, 상기 동결방지제는 바람직하게는 제형의 외부 배지에만 존재한다. 전형적으로, 상기 동결방지제들은 수크로오스, 말토오스, 트레할로오스 및 락토오스 같은 이당류들이다. 상기 동결방지제는 약 100 mM 내지 500 mM, 또는 약 250-400 mM, 또는 300 mM 이상의 농도를 가지는 수크로오스 같은 이당일 수 있다. 상기 외부 배지는 약 100 mM 내지 500 mM의 동결방지제를 포함할 수 있고, 상기 내부 배지는 125 mM 미만의 동결방지제를 포함하거나, 또는 상기 외부 배지는 약 250 mM 내지 400 mM의 동결방지제를 포함하며, 상기 내부 배지는 100 mM 미만의 동결방지제를 포함하거나, 또는 상기 외부 배지는 약 250 mM 내지 400 mM의 동결방지제를 포함하고, 상기 내부 배지는 50 mM 미만의 동결방지제를 포함하거나, 또는 상기 외부 배지는 약 250 mM 내지 400 mM의 동결방지제를 포함하며, 상기 내부 배지는 어떠한 동결방지제도 포함하지 않는다. 상기 동결방지제는 수크로오스 같은 당류일 수 있다.
겔-상 리포좀 제형들은 어떠한 적절한 프로토콜을 이용하여 동결건조되거나(lyophilized) 또는 동결건조될(freeze-dried) 수 있다. 바람직하게는, 동결건조 챔버의 개시 온도는 외부 배지 뿐 아니라 포집된 약물들을 가지는 리포좀들을 포함하는 용액의 유리전이온도(Tg) 미만이다. 예를 들어, 리포좀들은 약 -5℃ 미만의 온도, 또는 약 -10℃ 미만의 온도, 또는 약 -20℃ 미만의 온도, 또는 약 -30℃ 미만의 온도, 또는 약 -40℃ 미만의 온도에서 동결될 수 있다. 일부 구현예들에서, 수크로오스가 동결방지제로서 이용되는 경우 동결건조 챔버의 개시 온도는 수크로오스 용액의 Tg인 -32℃ 미만이다. "Tg"는 "유리전이온도(glass transition temperature)" 및 동결되지 않은 용액이 부드럽고 점성의 겔로부터 경화되고 상대적으로 잘 부서지는 형태로 전이를 거치는 거의 중간 온도(midpoint temperature)인 "유리 상 전이온도(glass phase transition temperature)"를 포함한다.
상기 동결건조된 리포좀들은 상온 또는 상온 미만의 온도에서 저장될 수 있다. 일부 예시된 구현예들은 5℃ 또는 그 미만의 온도에서 저장된 리포좀들을 가진다. 일부 다른 예시된 구현예들은 25℃에서 저장된 리포좀들을 가진다. 상기 동결건조된 산물은 최소 약 6개월 동안 또는 최소 약 9개월 동안, 또는 최소 약 1년 동안, 또는 최소 약 24개월 내지 36개월 동안 안정적으로 유지된다(예를 들어, 상기 산물의 상대적인 입자 크기를 유지하고 포집된 약물을 보유함).
상기 함유된 제제들은 치료제들 또는 진단제들로, 종종 항암제들(anticancer agents)이다. 놀랍게도, 상기 제제들이 수용성 용매 및 비수용성 용매들에 대한 용해도 특성이 다를 지라도 상기 겔상 리포좀 조성물들의 함유물 및 통합성이 유지된다. 본 발명의 접근방법을 이용하는 경우, 1.0만큼 로그 분배계수(log partition coefficient, LopP)에서 차이를 나타내는 제제들이 성공적으로 보유될 수 있다. 1.5 또는 2.0 또는 3.0의 로그 분배계수에서의 차이도 또한 견뎌질 수 있다. 상기 제제들 중 하나는 양친매성인 반면에 다른 것은 수용성(water-soluble)일 수 있거나, 하나는 소수성이고 다른 것은 수용성일 수 있다. 상기 LogP 값들은 옥탄올과 물 간의 분배계수들에 기반된다 - 즉, 상기 화합물이 상 분리(phase separation)에 종속되는 경우 옥탄올의 양 대 물의 양의 로그 밑(logarithm base) 10의 비율이라는 것이다.
상기 항암제들은 안트라사이클린(예를 들어, 다우노루비신, 독소루비신, 에피루비신 또는 이다루비신)을 포함할 수 있다. 상술한 제제들은 양친매성이다. 상기 항암제들은 뉴클레오시드 유사체(nucleoside analog), 예를 들어 친수성인 사이토신 아라비노시드, 5-FU 또는 FUDR을 포함할 수 있다. 다른 항암제들은 양친매성인 이리노테칸 같은 캄토테신(camptothecin) 또는 캄토테신 파생물을 포함한다. 일부 경우들에서 안트라사이클린 및 뉴클레오시드 유사체 모두가 포집되거나, 또는 캄토테신 또는 캄토테신 파생물과 뉴클레오시드 유사체 모두가 포집된다. 리포좀들 내로 제제들의 포집(encapsulation) 및/또는 로딩(loading)은 수동(passive) 및 능동(active) 로딩을 포함하는 어떠한 적합한 로딩 기술들을 이용하여 실시될 수 있다. 중요한 구현예들은 상기 인용된 미국 등록특허 제7,850,990호 및 제8,022,279호에 기재된 구현예들을 포함한다 - 즉, 1:1 몰 비율의 이리노테칸:플록수리딘(FUDR)의 조합물들 및 1:5 몰 비율의 다우노루비신:시타라빈(AraC)의 조합물들을 포함한다. 상술한 약물들의 특정 제형들은 각각 CPX-1 및 CPX-351로 지시되었다.
상기 약물들은 수동 로딩 또는 능동 로딩 과정들 또는 이의 일부 조합 중 어느 하나에 의해 상기 리포좀들의 수용성 내부 구획(들) 내로 삽입된다. 수동 로딩에서, 생물학적으로 활성을 가지는 제제(active agent)는 리포좀들이 형성되는 제조물(preparation)에 단순 포함될 수 있거나, 또는 택일적으로 상기 활성 제제는 전형성된 리포좀들의 외부에 첨가되어 이의 농도구배에 따라 상기 리포좀들 내로 수동적으로 로딩될 수 있다. 택일적으로, 포집되지 않은 물질은 어떠한 적합한 과정들에 의해 상기 제조물로부터 제거될 수 있다. 택일적으로, 이온 농도구배, 이오노포어(ionophores), pH 농도구배 및 금속 착물 형성(metal complexation)에 기반된 금속 기반 로딩 과정들 같은 능동 로딩 과정들이 실시될 수 있다. 적합한 약물들을 위해 공통적으로 실시되는 하나의 구현예는 금속 기반 과정들을 통한 로딩이다.
상기 리포좀들은 약 80-500 nm의 크기이다. 하나의 구현예에서, 상기 리포좀들은 300 nm 미만의 직경, 때때로 200 nm 미만의 직경을 가진다. 하나의 예에서, 상술한 리포좀들의 명목상 크기는 약 100 nm이다. 일부 구현예들에서, 상기 리포좀 막은 디스테아로일포스파티딜콜린(distearoylphosphatidylcholine, DSPC), 디스테아로일포스파티딜글리세롤(distearoylphosphatidylglycerol, DSPG) 및 콜레스테롤(CHOL)로 구성된다. 일부 구현예들에서, 상기 리포좀 막은 50-80% DSPC, 1-20% DSPG 및 1-20% CHOL로 구성된다. 다른 구현예들에서, 상기 리포좀 막은 50-80% DSPC 또는 DPPC, 1-20% DSPG 또는 디스테아로일포스파티딜이노시톨(distearoylphospatidylinositol, DSPI), 1-20% CHOL로 구성되고, 상기 리포좀들은 내부리포좀(intraliposomal) 배지에 125 mM 미만의 동결방지제를 포함한다. 일부 예시된 구현예들에서, 상기 리포좀 막은 50-80% DSPC 또는 DPPC, 1-20% DSPG 또는 DSPI, 1-20% CHOL로 구성되며, 상기 리포좀들은 내부리포좀 배지에 50 mM 미만의 동결방지제를 포함한다. 다른 예시된 구현예들에서, 상기 리포좀 막은 약 7:2:1의 몰 비율의 DSPC, DSPG 및 CHOL로 구성되며, 상기 리포좀들은 내부 리포좀 배지(internal liposomal medium)에 어떠한 동결방지제도 포함하지 않는다. 하나의 예에서, 상기 리포좀들은 유중수(water-in-oil) 유래된 리포좀 방법에 의해 제조되고 분출된 리포좀들은 pH 7.0에서 포스페이트 완충화된 수크로오스에 현탁된다. 다른 예에서, 상기 분출된 리포좀들은 수크로오스에 현탁된다. 하나의 구현예에서, 상기 분출된 리포좀들은 250-400 mM의 수크로오스에 현탁된다.
리포좀들 내에 약물 조합을 포집하는 어떠한 적합한 방법들이 실시될 수 있다. 하나의 특이적 구현예에서, 이리노테칸 및 플록수리딘이 DSPC/DSPG/CHOL (7/2/1) 전형성된 리포좀들 내로 공동 로딩(co-load)되는데, 이때 플록수리딘은 리포좀들 내로 수동적으로 로딩되며 이리노테칸은 내부 배지에 포함된 황산 구리 또는 글루콘산 구리를 이용하여 50℃에서 능동적으로 로딩된다. 공동 소유된(co-owned) 미국 등록특허 제7,850,990호 및 제7,238,367호를 참고하고, 이들 문헌 모두가 참조로서 삽입된다. 다른 특이적 구현예에서, 시타라빈과 다우노루비신이 리포좀 내로 포집되는데, 이때 시타라빈은 전형성된 리포좀들 내로 수동적으로 포집되며 다우노루비신은 글루콘산 구리/트리에탄올아민 기반된 로딩 과정을 이용하여 높은 트랩핑 효율(trapping efficiencies)로 리포좀 내로 능동적으로 축적된다. 동시계속중이고 공동 소유된 PCT 출원번호 제WO05/102359호 및 제WO07/076117A2호를 참고하고, 이들 문헌 모두도 참조로서 전문이 삽입된다.
본 발명의 동결건조된 조성물들은 저장, 보존 및 적재의 용이성에서 편리함을 제공한다. 상술한 동결건조된 조성물들은 오랜 기간의 시간 동안 그들의 특성을 유지한다.
이용을 위해, 본 발명의 조성물들은 적합한 약제학적 담체 또는 배지에서 재구축된다.
이용을 위한 상술한 제형들은 약제학적으로 허용가능한 담체를 이용한 표준 재구축 기술들에 따라 제조된다. 일반적으로, 생리식염수가 상기 약제학적으로 허용가능한 담체로서 이용될 것이다. 다른 적합한 담체들은, 예를 들어 알부민, 지질단백질, 글로불린 등 같은 증가된 안정성을 위한 당단백질들을 포함하는 물, 완충화된 물, 덱스트로오스, 0.4% 염화나트륨, 0.3% 글라이신 및 이와 유사한 것들을 포함한다. 상술한 조성물들은 종래의 잘 알려진 살균 기술들에 의해 멸균될 수 있다. 결과적인 수용성 용액들은 이용을 위해 패킹될 수 있거나, 또는 무균 상태 하에서 여과되고 동결건조될 수 있으며, 상기 동결건조된 제조물은 투여 전에 멸균 수용성 용액과 조합된다. 상기 조성물들은 거의 생리학적 조건들에 요구되는 약제학적으로 허용가능한 보조제(auxiliary substances)를 포함할 수 있고, 예를 들어 pH 조절성 및 완충성 제제들, 긴장성 조절성 제제들 및 이와 유사한 것들로, 예컨대 아세트산나트륨, 젖산나트륨, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘 등을 포함한다. 추가적으로, 상기 리포좀 현탁액은 저장 시 유리기(free radical) 및 지질 과산화 손상들로부터 지질을 보호하는 지질 보호 제제들을 포함할 수 있다. 알파토코페롤(alphatocopherol) 같은 친유성 유리기 퀀처들(quenchers) 및 페리옥사민(ferrioxamine) 같은 수용성 철 특이적 킬레이터들(chelators)이 적합하다.
상기 재구축된 제형들은 인간 또는 비인간 영장류, 개, 고양이, 소, 말, 양 및 이와 유사한 것들 같은 다른 포유동물 종들을 포함하는 동물들에 투여될 수 있으며, 많은 질환들을 치료하는 데 이용될 수 있다. 본 발명의 조성물들의 의학적 용도의 예들은 암을 치료하는 것, 고혈압, 심부정맥 및 협착증 같은 심혈관질환을 치료하는 것, 박테리아, 곰팡이 또는 기생성 감염들을 치료하는 것, 백신 같은 본 발명의 조성물의 이용을 통해 질환들을 치료 및/또는 예방하는 것, 염증을 치료하는 것 또는 자가면역 질환들을 치료하는 것을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 인간 질병들의 치료를 위해, 자격을 갖춘 의사가 투여량, 스케쥴 및 투여 경로의 측면에서 본 발명의 조성물들이 확립된 프로토콜들을 이용하여 어떻게 사용될 것인지를 결정할 것이다. 또한, 본 발명의 리포좀들에 포집된 생활성 제제들 및 지질 담체들이 대상자의 건강한 조직들에 감소된 독성을 나타낸다면, 그러한 적용들은 투여량의 단계적 확대를 이용할 수 있다.
약제학적 조성물들은 전형적으로 비경구적으로, 예를 들어 정맥 내로 투여되지만, 다른 경로들도 실행될 수 있다. 상기 리포좀 제형들의 투여량은 약물 대 지질의 비율, 그리고 나이, 몸무게 및 환자의 상태에 기반된 투여하는 의사의 의견에 의존할 것이다.
전체적으로, 본 발명에 유용한 하나의 과정은 리포좀 조성물을 동결건조하는 단계로, 상기 리포좀들은 20몰% 이하의 콜레스테롤 및 2개 이상의 활성 제제들을 포함하고, 상기 리포좀 막은 상온 및 동결방지제를 포함하는 외부 배지에서 상기 막의 상 전이온도 미만인 단계; 상기 동결건조된 리포좀들을 저장하는 단계; 및 전결정된 수용성 용량에서 상기 동결건조된 리포좀들을 재구축하는 단계를 포함한다. 상기 리포좀들은 약 -5℃ 미만의 온도, 또는 약 -10℃ 미만의 온도, 그리고 약 -20℃ 미만의 온도, 또는 심지어는 약 -30℃ 또는 -40℃ 미만의 온도에서 동결건조되고, 상온(23-25℃) 또는 상온 미만의 온도에서 저장될 수 있다.
하나의 구현예에서, 상기 리포좀 조성물은 2-20% 콜레스테롤로 구성되거나, 또는 10% 콜레스테롤 같이 중간 값 중 어느 하나의 콜레스테롤로 구성된다.
하나의 구현예에서, 상기 동결건조된 조성물은 상온에서 실시된 재구축이 Tc 미만이며 동결방지제가 결합되어 있지 않고 리포좀들의 외부에만 존재하는 외부 배지에 약 10% 콜레스테롤, 선택된 농도의 이당류로 구성된 리포좀들을 포함한다.
다른 구현예에서, 전결정된 용량의 수용성 배지에서 재구축 상에 2개 이상의 포집된 약물들을 포함하는 상기 동결건조된 리포좀 조성물은 (a) 20몰% 이하의 콜레스테롤을 포함하는 리포좀들을 포함하되, (b) 리포좀 크기는 대부분 약 80-500 나노미터 사이이고, (c) 상기 제제(들)의 포집 퍼센트는 약 95%, 90%, 85%, 80% 또는 75% 이상이며; (d) 외부 리포좀 배지에 약 100 mM-500 mM 사이의 동결방지제를 포함하는 리포좀 조성물을 생산한다. 일부 구현예들에서, 외부 리포좀 배지에 250 mM 내지 400 mM의 동결방지제가 존재한다. 일부 구현예들에서, 외부 리포좀 배지에 약 9.5-10%의 동결방지제가 존재한다.
하나의 구현예에서, 20몰% 이하의 콜레스테롤, 최소 2개의 약물들 및 리포좀들의 외부에 최소 약 300 mM의 수크로오스를 포함하는 단일라멜라 또는 이중-라멜라 겔-상 리포좀들은 동결건조되고 포집된 약물들 각각의 최소 약 90%가 재구축 시에 포집되며 리포좀의 평균 직경이 약 25% 미만까지 변화한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 오직 하나의 레퍼런트만이 의도된 것이 문맥으로부터 명백하지 않는 한 "하나(a)" 또는 "하나(an)"는 "최소 하나(at least one)" 또는 "하나 이상(one or more)"을 의미한다.
도 1은 동결 전 CPX-1 리포좀들의 입자 크기 프로파일을 보여주는 결과이다.
도 2는 동결, 동결건조 및 재구축 후 즉시 측정된 재구축된 CPX-1 리포좀들의 입자 크기 프로파일을 보여주는 결과이다.
도 3은 저장 한 달 후 재구축된 CPX-1 리포좀들의 입자 크기 프로파일을 보여주는 결과이다.
도 4a-4c는 저장 6개월 후 재구축된 CPX-1 리포좀들의 입자 크기 프로파일을 보여주는 결과이다.
하기 실시예들은 본 발명을 예시하기 위해서만 제공되는 것일 뿐, 이를 제한하기 위해 제공되는 것은 아니다.
실시예 1
CPX-1의 동결건조
이리노테칸 및 플록수리딘 1:1이 DSPC/DSPG/콜레스테롤(7:2:1 몰 비율) 리포좀들에 공동 포집되어 CPX-1로 지정된다. 동결건조된 CPX-1은 안정적인 약물 로딩된 리포좀들을 생산하여, 재구축된 투여량 형태로부터 활성 약제학적 유효성분들의 최소한의 누출이 있었다. CPX-1에 이용된 염산이리노테칸은 3.94의 예측된 로그 분배계수(LogP)를 가진다. 플록수리딘은 -1.14의 예측된 LogP를 가진다.
유리전이온도(Tg), 열 용량에서의 변화 및 다른 이벤트들에 대한 정보를 제공하기 위해 다양한 그룹(lots)을 이용하여 CPX-1 리포좀 약물 산물에 대한 열적 분석들이 실시되었다. CPX-1 리포좀 약물 산물의 붕괴 온도(collapse temperature)는 2개의 그룹에 대한 동결건조 현미경으로 결정되었다. 상술한 결과들은 최종 동결건조 사이클을 결정하는 데 이용되었다.
상기 시료들은 2개의 활성 약제학적 유효성분들인 염산이리노테칸 및 플록수리딘의 1:1 비율을 포함하는 리포좀들로 제형화된 청록색의 벌크(bulk) 수용성 현탁액으로 구성되었다. 시료들은 주변의 상대습도로 -20℃(또는 일부 경우들에서 -80℃)에서 저장되었으며, 냉장고에서 하룻밤 동안 해동되어 필링(filling) 및 동결건조 전에 조심스럽게 혼합되었다.
사이클 1: 20 mL 글래스 A 파이펫을 이용하여 20 cc의 CPX-1이 60 cc 글래스 주형된 바이얼들 내로 채워졌다. 24개의 바이얼들이 산물 온도를 측정하기 위해 열전대 프로브들(thermocouple probes)로 준비된 2개의 산물 바이얼들과 함께 리오스타II 트레이 드라이어(LyoStarII Tray Dryer) 내로 로딩되었고, 4.5일 동안 동결 건조되었다. 약 720,000 mTorr의 챔버 압력 하에 질소 가스로 상기 바이얼들을 다시채운 후, 상기 바이얼들이 마개로 씌워지고 상기 트레이 드라이어로부터 제거되어 Lot TP-CPX1-001-032405로 표지되었다. 이후, 여러 개의 상기 동결건조된 바이얼들이 촉진된 안정성을 위하여 25℃ 및 40℃에 놓여졌으며, 나머지 바이얼들은 -20℃에서 저장되었다.
사이클 2: 대략 21 mL의 CPX-1이 각각 60 cc 글래스 주형된 바이얼들 및 50 cc의 글래스 튜빙 바이얼들 내로 채워졌다. 상기 바이얼들이 위쪽 선반 위의 산물 바이얼 내 하나의 열전대 프로브 및 바닥쪽 선반 위의 산물 바이얼 내 다른 열전대 프로브와 함께 리오스타IITM 트레이 드라이 내로 로딩되었다. 상기 동결건조 사이클의 완료 하에, 상기 바이얼들이 약 720,000 mTorr의 챔버 압력 하에 질소 가스로 다시채워지며, 마개로 씌워지고 상기 트레이 드라이어로부터 제거되어 Lot TP-CPX1-002-041305T로 표지되었다. 이후, 여러 개의 상기 동결건조된 바이얼들이 촉진된 안정성을 위하여 25℃ 및 40℃에 놓여졌으며, 나머지 바이얼들은 -20℃에서 저장되었다.
사이클 3: 동결건조를 위한 시료들이 50 cc의 글래스 튜빙 바이얼들 내로만 채워졌다는 점을 제외하고는 사이클 2에서처럼 유사한 방식으로 제조되었다. 상기 봉합된 바이얼들은 CPX-1 약물 산물인 Lot TP-CPX1-003-051105T로 표지되었다. 이후, 여러 개의 상기 동결건조된 바이얼들이 촉진된 안정성을 위하여 25℃ 및 40℃에 놓여졌으며, 나머지 바이얼들은 -20℃에서 저장되었다.
사이클 4: 동결건조를 위한 시료들이 CPX-1이 50 cc의 글래스 튜빙 바이얼들 내로 채워졌다는 점을 제외하고는 사이클 2에서처럼 유사한 방식으로 제조되었다. 상기 봉합되어 동결건조된 바이얼들은 CPX-1 약물 산물인 Lot TP-CPX1-004-051805T로 표지되었고, -20℃, 5℃, 25℃ 및 40℃에서 안정성 연구들을 위해 저장되었다.
사이클 5: 동결건조를 위한 시료들이 50 cc의 글래스 튜빙 바이얼들 내로만 채워졌다는 점을 제외하고는 사이클 2에서처럼 유사한 방식으로 제조되었다. 상기 봉합되어 동결건조된 바이얼들은 CPX-1 약물 산물인 Lot TP-CPX1-005 062705T-300로 표지되었다. 상기 CPX-1 리포좀 약물 산물 바이얼들은 -20℃, 5℃ 및 25℃에서 안정성 챔버들 내에 저장되었다.
첫 번째 동결건조 사이클 실행(run). 첫 번째 동결건조 사이클 실행(사이클 1)의 주요 목표는 상기 제형화된 벌크 CPX-1 리포좀 약물 산물(CPX-1)이 급격하지 않은 두 단계 일차 건조 단계(dry phase)로 성공적으로 동결건조될 수 있는 지를 결정하는 것이었다. 이러한 동결건조 실행의 성공은 상기 약물 산물의 온도 및 압력 프로파일들을 분석하고 상기 동결건조된 케이크들의 외관을 시각적으로 관찰함으로써 평가되었다.
사이클 1에 대한 동결건조 산물 프로파일은 벌크 아이스가 -10℃ 일차 건조 단계 동안 제거된다는 것을 나타냈다. 이것은 상기 산물 온도가 선반온도(shelf temperature)를 약간 초과하였다는 점에서 명백하였다. 또한, 실제 압력(true pressure)에 수증기의 부분 압력을 더하여 측정하는 열전대 압력이 정전용량 압력계 압력(capacitance manometer pressure)의 열전대 압력, 또는 실제 압력 쪽으로 감소하였다. 추가하여, 상기 동결건조된 약물 산물 바이어들은 약간 건조하거나 또는 케이크 붕괴에 대한 어떤 증거도 나타내지 않았다. 하지만, 몇몇 분석물 농축 또는 층화(stratification)가 관찰되었다. 사이클을 최적화시키기 위해, 상기 열적 처리 상 및 일차 건조 단계들이 두 번째 실행에서 변화되었다.
두 번째 동결건조 사이클 실행. 두 번째 동결건조 실행(사이클 2)는 사이클 1에서 처럼 유사하게 부드러운 일차 및 이차 건조 단계들을 이용하여 실행되었다. 동결 건조기 내에 아이스의 로딩을 최대화시키기 위해, 탈이온수로 채워진 바이얼들이 점유되지 않은 선반 공간 내로 로딩되었다. 상기 동결건조 실행의 성공도 상기 온도 및 압력 프로파일들 및 상기 동결건조된 케이크들의 시각적 검사에 의해 평가되었다.
비록 4.5일 사이클 동안 50 cc 글래스 튜빙 바이얼 및 60 cc 글래스 주형된 바이얼에 대한 상기 산물 온도 및 압력 프로파일들이 유사하였을 지라도, 50 cc 튜빙 바이얼들 내 상기 약물 산물은 보다 균일하게 건조되어 동결된 것으로 보였다. 이차 건조 선반온도에 도달하고 약 8.5 시간 후에, 상기 산물 온도는 아이스 배리어(ice barrier)를 가로지름에 따라 상기 벌크 아이스 승화의 완료(즉, 상기 산물 온도가 0℃를 초과함)를 보여준다. 하지만, 상술한 바이얼들은 충분히 건조되지 않았다. 상기 산물 온도는 일차 건조 단계의 끝에 선반온도 아래였고, 열전대 압력과 정전용량 압력계 압력 간의 차이는 상기 실행(run)의 시작부터 이차 건조 단계의 끝까지 변화되지 않았는데, 이는 상기 바이얼들 내에 실질적인 벌크 아이스의 존재를 나타낸다.
일차 건조 단계에서 이용된 상기 선반온도들은 상기 산물 승화율(sublimation rate)이 완료를 향하여 나아가기에 충분한 에너지를 전하지 못하였기 때문에, 아이스 승화를 증가시키지만 붕괴 온도를 초과하지 않는 선반온도 및 챔버 압력을 이용하여 일차 건조 단계가 완료를 향하여 나아가도록 세 번째 동결건조 사이클이 개발되었다.
세 번째 동결건조 사이클 실행. 사이클 2로부터 얻어진 결과들 및 열적 분석들에 기반하여, 사이클 3을 위한 선반온도 및 챔버 압력이 일차 건조를 촉진하지만 -20℃의 추정 붕괴 온도 아래의 산물 온도들을 유지하도록 조정되었다. 아이스 로딩을 최대화시키기 위해, 상기 사이클은 완전히 로딩된 실행 조건들(run conditions) 하에서 행해졌다.
사이클 3에 대해 얻어진 프로파일 구성(plot)은 100 mTorr 압력에서 -20℃의 개시 일차 건조 선반온도가 완전히 로딩된 실행 조건들 하의 40시간 내에 벌크 아이스의 승화를 충분하게 유발시키지 못한다는 것을 나타냈다. 또한, 상기 단계의 제한된 지속으로 인해 -10℃ 일차 건조 단계의 끝까지 열전대 압력 트레이스도 정전용량 압력계 압력을 향하여 유의하게 감소하지 않았다. 하지만, 상기 프로파일은 두 번째 -10℃ 일차 건조 선반온도 및 지속이 상기 벌크 아이스 모두가 승화될 때까지 -20℃의 붕괴 온도 아래의 산물 온도를 유지시킬 수 있다는 것을 확증하였는데, 이는 상기 단계의 끝에서 상기 선반온도를 최종적으로 초과하는 산물 온도에서의 급격한 증가로 명백하게 보여졌다.
네 번째 동결건조 사이클 실행. 일차 건조 단계를 위한 선반온도(들)을 최종 결정하기 위해, 네 번째 동결건조 사이클(사이클 4)은 완전히 로딩된 실행 조건들 하에서 -20℃에서 6시간 동안의 개시 일차 건조 단계와 함께 더 긴 지속을 위한 -10℃의 선반온도를 이용하였다.
상기 동결건조 사이클 프로파일 및 시각 관찰에 기반하여, 개시 일차 건조 단계를 위한 상기 -20℃ 선반온도는 바이얼들을 건조시키는 데 거의 이점이 없는 것처럼 보였다. 산물 온도 프로브들은 -10℃에서 선반온도를 초과함에 따라 약 60시간의 홀드 타임(hold time)을 보였다. 산물 온도 프로파일이 선반온도의 프로파일과 매우 유사하였기 때문에 이차 건조 단계 동안의 열전대 압력은 상기 바이얼들이 상대적으로 낮은 잔류 수분을 가진다는 것을 나타냈다.
약물 물질들의 포집, 리포좀 입자 크기 및 평균 잔류 수분이 상기 동결건조된 산물의 바이얼들에 대해 평가되었다. 이용된 칼 피셔(Karl Fischer) 방법은 3.1%의 평균 잔류 수분 함량을 회수하였는데, 이는 과도하게 건조된 리포좀 산물이 아니었다. 또한, 입자 크기 및 이리노테칸의 포집 퍼센트에 대한 분석들은 상기 동결건조된 산물이 전동결건조된 재료와 비교하여 변화되지 않았다는 것을 나타냈다. 하지만, -20℃에서 13주 동안 저장되는 경우 포집되지 않은 플록수리딘의 퍼센트는 전동결건조된 벌크에서의 7.0%로부터 상기 동결건조된 산물에서 8.6%까지 증가하였다. 또한, 25℃에서 4주 동안 상기 산물에 스트레스를 가한 후, 포집되지 않은 플록수리딘의 퍼센트는 11.8%까지 증가하였는데, 이는 이러한 약물 산물에 있어서 10% 미만의 포집되지 않은 플록수리딘에 대한 잠정적인 설명을 벗어나는 범위였다.
다섯 번째 동결건조 사이클 실행. 다섯 번째 동결건조 사이클 실행(사이클 5)의 목표는 +20℃부터 +10℃까지 이차 건조 단계를 위한 선반온도를 감소시켜 완전히 로딩된 실행 조건들 하에서 플록수리딘 누출을 최소화하며 적합한 잔류 수분을 획득하는 것이다. 이러한 재료를 위한 상기 수분 함량은 주기적으로 압력 상승 측정(pressure rise measurement)을 실시하여 이차 건조 단계 동안 평가되었다.
사이클 5에 대한 약물 산물 프로파일은 72시간 내지 84시간의 -10℃ 일차 건조 단계에 따라 벌크 아이스가 크게 승화되었음을 보였다. 더 나아가, 압력 검출기 차이 및 압력 상승 연구들에 기반하여 12시간 동안 50 mTorr에서 +10℃의 선반온도를 이용함으로써 상기 재료가 충분하게 건조된 것처럼 보인다.
이러한 동결건조된 재료의 적합성(suitability)을 평가하기 위해, 사이클 4 및 사이클 5 양자로부터 동결건조된 약물 산물 바이얼들에 대한 재구축 시간이 18 게이지 바늘과 30 cc 주사기로 마개를 통해 주입된 19 mL의 물을 이용하여 평가되었다. 평균 재구축 시간은 사이클 4 및 사이클 5에 대해 각각 40초 및 93초로 결정되었다. 더 나아가, 사이클 5에 대한 칼 피셔 결과들은 사이클 4로부터 유래된 바이얼들의 평균 잔류 수분과 잘 합치되는 3.2%의 평균 잔류 수분을 회수하였다.
약물 물질들의 포집 및 리포좀 입자 크기도 평가되었다. 사이클 5 동결건조된 약물 산물에 있어서, 포집되지 않은 이리노테칸의 퍼센트는 -20℃에서 7주 간의 저장 후 0.4%였으며, 25℃에서 4주 간의 저장 후 0.9%였다. 상기 동결건조된 약물 산물에서 입자 크기는 -20℃에서 저장된 약물 산물과 비교하여 5℃에서 8주 동안 저장된 후 아주 조금 증가하였지만, 25℃에서 4주 동안만 저장한 후에는 거의 10 nm까지 증가하였다. 당연하게도, 포집되지 않은 플록수리딘의 퍼센트는 상기 입자 크기 변화들과 유사한 경향을 나타냈다. 포집되지 않은 플록수리딘의 퍼센트는 -20℃에서 7주 후에 5.5%, 5℃에서 8주 후에 7.7%, 그리고 25℃에서 4주 후에 18.7%였다.
이차 건조 단계 동안 감소된 선반온도를 이용하였던 상기 다섯 번째 동결건조 사이클 실행을 통해 포집된 산물의 증가된 보유능과 함께 허용가능한 동결건조된 CPX-1 리포좀 약물 산물을 생산하는 데 성공하였다.
실시예 2
시간에 따른 입자 크기 프로파일은 동결건조된 리포좀에서 변화되지 않는다
이중-로딩된 CPX-1 및 CPX-351 리포좀들의 크기 분포 상에 동결, 동결건조 및 저장의 충격을 조사하기 위해 실험들이 실시되었다. CPX-351은 7:2:1 몰 비율의 디스테아로일 포스포콜린(DSPC):디스테아로일 포스파티딜글리세롤(DSPG):콜레스테롤(CHOL)로 구성된 리포좀들 내 1:5 몰 비율의 다우노루비신과 시타라빈의 제형이다. 다우노루비신은 1.68의 예측된 LogP를 가진다. 시타라빈은 -2.17의 예측된 LogP를 가진다.
공동-로딩된 리포좀들의 입자 크기 분포는 상기 리포좀들의 동결 및 동결건조 전과 후에 측정되었을 뿐 아니라 상기 동결건조된 제조물들을 한 달 및 6개월 동안 저장한 후에도 측정되었다.
CPX-1 리포좀들은 300 mM 수크로오스, 20 mM 포스페이트로 구성된 외부 완충액(pH 7.0)으로 제조되었다. 900 μL의 분취액을 2 mL 바이얼들에 첨가하고 금속 팬(-20℃로 미리 냉장됨) 내로 위치시킨 후 -20℃에서 하룻밤 동안 저장하였다. 동결 후, 상기 시료들이 동결 건조기(-20℃로 미리 냉장됨)로 옮겨졌다. 진공이 가해졌고 선반온도는 -20℃로 7시간 동안 유지된 후, -10℃까지 증가되어 대략 16시간 동안 유지되었다. 세 번째 온도 단계를 위해, 상기 선반온도는 다음 3시간 동안 4℃까지 추가적으로 올린 후 상온에서 3시간의 건조로 끝마쳤다. 건조된 시료들은 1 mL의 H2O로 수화되어 손쉽게 상기 동결건조된 케이크로 녹여졌다. 이후, 시료들은 동적 광산란(Dynamic Light Scattering, DLS)을 이용하여 분석되었다.
미리 녹여진 CPX-1 리포좀들은 110 nm의 평균 크기 직경을 나타냈다(도 1). 동결건조 및 재수화 후 즉시 측정된 리포좀 크기는 116 nm인 것으로 관찰되었다(도 2). CPX-1 동결건조된 리포좀들 중 2개의 시료들이 한 달 또는 6개월 동안 5℃에서 저장되었고, 재수화된 조성물들의 리포좀 크기가 관찰되었다. 각 리포좀 평균 크기는 117 nm 및 123 nm였다(각각, 도 3 및 도 4). 도 1 내지 도 3은 체적 분포를 보여준다. 도 4b는 비교할만한 체적 분포를 보여준다. 다른 덜 바람직한 로그들을 이용한 결과들이 도 4a 및 도 4c에 제시되어 있다. 특별하게 언급되지 않는 한, 평균 직경은 체적 분포를 의미한다.
또한, 도 1 내지 도 4에 제시된 결과들과 유사한 실험들이 CPX-351 리포좀들에 대해서도 실시되었다.
위에서 언급된 바와 같이, CPX-351은 항종양성 약물들인 시타라빈과 염산다우노루비신의 고정된 조합으로 이루어진 리포좀 제형이다. 리포좀들은 7:2:1 몰 비율인 DSPC, DSPG 및 CHOL, 그리고 글루콘산 구리 트리에탄올아민 완충액(pH 7.4)를 이용하여 제조된다. 상기 조 리포좀들(crude liposomes)은 평균 리포좀 직경이 200 nm 이하의 D99 값과 함께 80 nm 내지 110 nm에 존재해야만 하는 리포좀 입자들의 크기 분포(동적 광산란에 의한 분석)를 제공하도록 분출된다. 시타라빈은 수동 로딩 기작에 의해 포집된다. 다우노루비신은 능동 구리 매개된 기작에 의해 포집되어 5:1의 몰 비율을 가지는 시타라빈:다우노루비신을 얻는다. 어떠한 포집되지 않는(non-encapsulated) 약물 물질들은 제거되고 벌크 완충액은 정용여과(diafiltration)에 의해 교체된다. 다양한 용량의 300 mM 수크로오스가 교체되어 CPX-351을 마무리 짓고 이후 동결건조 최적화를 통해 실행된다. 건조된 CPX-351 시료들은 19 mL의 H2O로 재구축되어 손쉽게 리포좀 분산액을 재형성한다. 이후, 시료들은 동적 광산란(DLS)을 이용하여 분석된다.
미리 동결건조된 CPX-351 리포좀들은 약 100 nm의 평균 크기 직경을 나타냈다. 동결 및 이후 동결건조/재수화를 거친 후 즉시 측정된 리포좀 크기는 배치 1(Batch 1)에 대해 각각 99 nm 및 100 nm인 것으로 관찰되었다(하기 표 1에서 "1C001"). 두 번째 배치인 1D002에 있어서, CPX-351 리포좀 크기는 동결 및 이후 동결건조/재수화를 거친 후 즉시 측정된 리포좀 크기는 각각 104 nm 및 105 nm인 것으로 관찰되었다.
상술한 결과들은 이리노테칸 플러스 플록수리딘, 또는 시타라빈 플러스 다우노루비신 중 어느 하나가 공동 로딩된 DSPC/DSPG 저농도 콜레스테롤 리포좀들이 동결 뿐 아니라 동결건조 하에서, 그리고 장기간의 저장 기간 동안 크기 분포 프로파일을 효과적으로 유지한다는 것을 보인다. 또한, 상기 결과들은 저농도 콜레스테롤로 제조된 상술한 겔상 리포좀들이 특히 높은 레벨의 콜레스테롤의 부재 하에서 동결 및 동결건조로부터 공통적으로 초래되는 응집 및 융합에 대해 저항성을 가진다는 것을 나타낸다.
CPX-351 리포좀 크기 상에 동결 및 동결건조의 영향들.
CPX-351 리포좀들 1C001(배치 1) 1D002(배치 2)
동결됨 동결건조됨/재수화됨 동결됨 동결건조됨/재수화됨
평균 직경(nm) 99 100 104 105
D10(nm) 68 68 74 71
D90(nm) 135 137 137 142
D99(nm) 178 182 178 191
실시예 3시간에 따른 약물 포집 퍼센트는 동결건조된 리포좀들에서 변하지 않는다
이중-로딩된 CPX-1 및 CPX-351 리포좀들로부터 약물 누출의 정도에 관한 동결 및/또는 동결건조 그리고 저장의 충격을 조사하기 위한 실험들이 실시되었다.
공동-로딩된 CPX-1 리포좀들에 포집된 이리노테칸 및 플록수리딘의 양은 동결건조 후("개시(initial)") 즉시 측정되었을 뿐 아니라 5℃에서 6개월 및 9개월 동안 저장 후에도 측정되었다. 안정성 연구들은 이리노테칸의 포집 퍼센트(%)가 동결건조 후 즉시 측정되었을 경우에 99%이고, 저장 6개월 후에는 97%, 그리고 저장 9개월 후에 97%라는 것을 증명하였다(하기 표 2). 유사하게도, 플록수리딘의 포집 퍼센트는 동결건조 후 즉시 측정되었을 경우에 98%이고, 5℃에서 저장 6개월 및 9개월 후 모두에서 98%였다(하기 표 3).
CPX-351 리포좀들에 있어서, 약물 포집 퍼센트 상의 동결 및 동결건조의 효과들도 연구되었다. 하기 표 4에서 볼 수 있듯이, 공동 로딩된 CPX-351 리포좀들에서 포집된 시타라빈의 양은 2개의 분리 배치들(1C001 및 1D002)에서 동결("동결됨(Frozen)") 후 바로 측정된 경우 100%인 것으로 측정되었고 동결건조 후("동결건조됨(Lyophilized)") 측정된 경우 98%로 측정되었다. 다우노루비신의 포집 퍼센트는 양 배치들에서 동결 및 동결건조 후 바로 측정된 모든 경우에 99%였다. CPX-351이 5℃ 또는 25℃에서 저장되는 경우 약물 포집도 안정적이다(표 5 및 표 6 참조).
상술한 결과들은 외부 용액 내에 동결방지제와 적은 양의 콜레스테롤이 삽입된 CPX-1 및 CPX-351 겔-상 리포좀들 모두가 포집된 약물들 모두의 최소 누출과 함께 효과적으로 동결, 탈수 및 재구축될 수 있다는 것을 명확하게 증명한다.
재구축된 CPX-1 리포좀들에서 이리노테칸의 포집 퍼센트.
안정성 간격
테스트 개시 6개월 9개월
이리노테칸 - % 포집 99% 97% 97%
재구축된 CPX-1 리포좀들에서 플록수리딘의 포집 퍼센트.
안정성 간격
테스트 개시 6개월 9개월
플록수리딘 - % 포집 98% 95% 95%
재구축된 CPX-351 리포좀들에서 시타라빈과 다우노루비신의 포집 퍼센트.
CPX-351 리포좀들 1C001 1D002
동결됨 동결건조됨 동결됨 동결건조됨
시타라빈 % 포집 100 98 100 98
다우노루비신 % 포집 99 99 99 99
CPX-351: 시타라빈 포집 퍼센트.
동결건조 후 시간 5℃에서 저장됨 25℃에서 저장됨
배치 1C001 개시 98 98
3개월 98 98
6개월 98 98
9개월 98 -
배치 1D001 개시 98 98
3개월 98 99
6개월 98 99
9개월 98 -
CPX-351: 다우노루비신 포집 퍼센트.
동결건조 후 시간 5℃에서 저장됨 25℃에서 저장됨
배치 1C001 개시 99 99
3개월 99 99
6개월 99 99
9개월 99 -
배치 1D001 개시 99 99
3개월 99 99
6개월 99 99
9개월 99 -

Claims (28)

  1. 동결건조된 겔-상 리포좀 조성물로, 상기 겔-상 리포좀들은 최소 25℃의 용융상 온도(melting phase temperature, Tc)를 나타내고 최소 2개의 치료제들 및/또는 진단제들과 안정적으로 결합되어 있으며 실질적으로 어떠한 내부 동결방지제를 포함하지 않고,
    상기 겔-상 리포좀 조성물이 재구축(reconstitution)되는 경우, 동결건조 전의 상기 조성물과 비교시 상기 리포좀들의 평균 직경이 유지되며 상기 제제들이 상기 리포좀들 내에 보유되어 있는 것인 동결건조된 겔-상 리포좀 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 포집된 제제들은 고정된 비율(ratio)로 존재하고 상기 조성물이 재구축되는 경우 상기 제제들의 비율이 동결건조 전의 상기 조성물과 비교시 25%까지만 변화하는 것인 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 리포좀들은 최소 37℃인 상 전이온도(phase transition temperature, Tc)를 가지는 것인 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 리포좀들의 평균 직경은 동결건조 전에 측정된 상기 값(value)과 비교시 상기 리포좀들의 동결건조 후 및 상기 리포좀들의 재구축 시에 25%까지만 증가하는 것인 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 리포좀의 평균 직경은 동결건조 전에 측정된 상기 값과 비교시 상기 리포좀들의 동결건조 후 및 상기 리포좀들의 재구축 시에 15%까지만 증가하는 것인 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 리포좀의 평균 직경은 동결건조 전에 측정된 상기 값과 비교시 상기 리포좀들의 동결건조 후 및 상기 리포좀들의 재구축 시에 10%까지만 증가하는 것인 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 각 제제의 최소 75%가 상기 리포좀들의 재구축 시에 보유되는 것인 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 각 제제의 최소 85%가 상기 리포좀들의 재구축 시에 보유되는 것인 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 각 제제의 최소 90%가 상기 리포좀들의 재구축 시에 보유되는 것인 조성물.
  10. 제1항에 있어서, 상기 리포좀들의 크기 분포는 상기 리포좀들의 동결건조 후 및 상기 리포좀들의 재구축 시에 25%까지만 변화하는 것인 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 상기 리포좀들의 크기 분포는 상기 리포좀들의 동결건조 후 및 상기 리포좀들의 재구축 시에 15%까지만 변화하는 것인 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 상기 리포좀들의 크기 분포는 상기 리포좀들의 동결건조 후 및 상기 리포좀들의 재구축 시에 10%까지만 변화하는 것인 조성물.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 리포좀들은 20몰%(mol%)의 콜레스테롤까지만 포함하고 최소 1몰%의 포스파티딜글리세롤(phosphatidylglycerol, PG) 및/또는 포스포이노시톨(phosphoinositol, PI)을 포함하는 것인 조성물.
  14. 제1항 내지 제12항 중 어느 하나의 항에 있어서, 동결방지제는 상기 리포좀들의 외부에 존재하는 것인 조성물.
  15. 제14항에 있어서, 상기 동결방지제는 수크로오스인 것인 조성물.
  16. 제1항 내지 제12항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 제제들은 최소 1.0까지 다른 로그 분배계수(log partition coefficients)를 가지는 것인 조성물.
  17. 제1항 내지 제12항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 제제들은 항종양제(antineoplastic agents)인 것인 조성물.
  18. 제17항에 있어서, 상기 항종양제들 중 최소 하나는 뉴클레오시드 유사체(nucleoside analog)이거나, 또는
    상기 항종양제들 중 최소 하나는 안트라사이클린(anthracycline)인 것인 조성물.
  19. 제18항에 있어서, 상기 항종양제들은 다우노루비신(daunorubicin)과 시타라빈(cytarabine)인 것인 조성물.
  20. 제19항에 있어서, 다우노루비신:시타라빈의 비율은 몰 농도 기반으로 1:5인 것인 조성물.
  21. 제18항에 있어서, 상기 항종양제들은 이리노테칸(irinotecan)과 플록수리딘(floxuridine)인 것인 조성물.
  22. 제21항에 있어서, 상기 이리노테칸과 플록수리딘의 몰 비율은 몰 농도 기반으로 1:1인 것인 조성물.
  23. 제1항 내지 제12항 중 어느 하나의 항의 조성물을 제조하는 방법으로, 상기 방법은 최소 25℃의 용융상 온도(Tc)를 나타내고 최소 2개의 치료제들 및/또는 진단제들과 안정적으로 결합되어 있으며 실질적으로 어떠한 내부 동결방지제를 포함하지 않는 겔-상 리포좀들을 포함하는 수용성 배지를 동결건조에 종속시키는 단계를 포함하는 것인 방법.
  24. 제23항에 있어서, 겔-상 리포좀들을 포함하는 상기 배지는 상기 배지의 유리전이온도(glass transition temperature, Tg) 미만인 온도에서 동결되는 것인 방법.
  25. 치료제들 및/또는 진단제들을 대상자(subject)에게 투여하기 위한 약제학적 조성물을 제조하는 방법으로, 상기 방법은 제1항 내지 제12항 중 어느 하나의 항의 리포좀 조성물을 약제학적 담체에 재구축시켜 재구축된 조성물을 얻는 단계를 포함하는 것인 방법.
  26. 치료체들 및/또는 진단제들을 동물 대상자에게 투여하는 방법으로, 상기 방법은 제25항의 재구축된 조성물을 상기 대상자에게 투여하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  27. 제26항에 있어서, 상기 투여(administering)는 비경구 투여인 것인 방법.
  28. 제26항 또는 제27항에 있어서, 상기 대상자는 인간인 것인 방법.
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