DE69528077T2

DE69528077T2 - Verfahren zur Herstellung von Liposomen, die hydrophobische Artzneistoffe enthalten

Info

Publication number: DE69528077T2
Application number: DE69528077T
Authority: DE
Inventors: Trevor P. Castor; Ling Chu
Original assignee: Aphios Corp
Current assignee: Aphios Corp
Priority date: 1994-11-18
Filing date: 1995-11-20
Publication date: 2003-04-17
Anticipated expiration: 2015-11-21
Also published as: CA2205500A1; JPH10509459A; WO1996015774A1; DE69528077D1; JP4107680B2; AU4246296A; EP0792143A1; EP0792143B1; ATE223205T1

Description

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Herstellung von Liposomen, wobei die Liposomen hydrophobe Arzneistoffe, wie beispielsweise Taxoide, Camptothecine, Doxorubicin, Michellamm B, Vincristin, Bryostatin-1, Haioman und Cisplatin umfassen. Das Verfahren und die Vorrichtung umfassen kritische, superkritische oder nahezu kritische Fluids.

Ausgangspunkt der Erfindung

Liposomen sind mikroskopische Vesikeln mit einfachen oder mehrfachen bzw. vielfachen Phospholipid-Bilayers bzw. Doppelschichten, die hydrophile Verbindungen in ihren wässrigen Kernen einfangen können. Hydrophile Verbindungen können sich in die Phospholipid-Bilayers verteilen. Liposomen wurden in Abmessungen von nur Zehnteln Angström bis zu einigen Mikrometern gebildet. Die meisten Liposomen sind nicht toxisch, nicht antigen und biologisch abbaubar, weil sie die molekularen Eigenschaften von Säugetiermembranen aufweisen.
Liposomen werden als Träger für Arzneistoffe verwendet. Liposomen können mit unterschiedlichen Merkmalen hergestellt werden, die die Leistungsfähigkeit eines Arzneistoffs erhöhen, die Toxizität einer Arzneistoffs reduzieren und die therapeutische Wirkung des Arzneistoffs verlängern können.
Liposomen mit vielfachen Doppelschichten sind als multilamellare Vesikeln (multilamellar vesicies = MLVs) bekannt. MLVs sind ausgezeichnete Kandidaten für Arzneimittel mit verzögerter Freisetzung, weil die zwischen den Schichten eingefangenen Flüssigkeiten nur freigesetzt werden, wenn jede Membrane abgebaut wird. Liposomen mit einer einzigen Doppelschicht sind als unilamellare Vesikeln (unilamellar vesicies = UV) bekannt. UVs können extrem klein (SUVs) oder groß (LUVs) sein.
Liposomen werden im Labor durch Beschallung, Tensid-Dialyse, Ethanol-Injektion, French- Press-Extrusion, Ether-Infusion und Umkehrphasenabdampfung hergestellt. Diese Verfahren lassen oftmals Rückstände, wie beispielsweise Tenside oder organische Mittel, bei dem endgültigen Liposom zurück. Vom Standpunkt der Produktion her ist es klar zu bevorzugen, Verfahren anzuwenden, die keine organischen Lösungsmittel verwenden, weil diese Materialen anschließend entfernt werden müssen.
Einige der Verfahren erlegen raue oder extreme Bedingungen auf, die eine Denaturierung des Phospholipid-Ausgangsmaterials und der eingekapselten Arzneistpffe bzw. Arzneimittel zur Folge haben können. Diese Verfahren sind nicht einfach zur Massenproduktion großer Volumina von Liposomen erweiterbar.
Es existieren mehrere Verfahren zur Herstellung von ML Vs, LUVs und SUVs ohne Verwendung organischer Lösungsmittel. MLVs, frei von organischen Lösungsmitteln, werden üblicherweise durch Schütteln von Fetten bzw. Lipiden in Gegenwart von Wasser hergestellt. Die MLVs werden dann mehreren Zyklen von Einfrieren und Auftauen unterworfen, um die Einfangleistungsfähigkeiten für wasserlösliche Arzneistoffe zu erhöhen. MLVs werden ebenfalls als Ausgangsmaterialien für die LUV- und SUV-Produktion verwendet.
Ein Ansatz zur Erzeugung von LUVs, frei von organischen Lösungsmitteln, schließt die Hochdruckextrusion von MLVs durch Polycarbonat-Filter mit kontrollierter Porengröße ein. SUVs können aus MLVs durch Beschallungs-, French-Press- oder Hochdruckhomogenisierungstechniken hergestellt werden. Die Hochdruckhomogenisierung weist bestimmte Einschränkungen auf. Eine Hochdruckhomogenisierung ist nur zur Ausbildung von SUVs von Nutzen. Zusätzlich kann eine Hochdruckhomogenisierung exzessiv hohe Temperaturen mit sich bringen. Extrem hohe Temperaturen sind mit Gerätefehlern verbunden. Eine Hochdruckhomogenisierung stellt die Sterilität des Endproduktes nicht sicher. Die Hochdruckhomogenisierung ist wegen einer Ventilverstopfung und einem schlechten Lösungsrecycling mit einer schlechten Verarbeitbarkeit verbunden.
Die EP-A-0 616 801 offenbart ein Verfahren zur Herstellung von Liposomen zum Einkapseln hydrophiler Substanzen, das Folgendes umfasst: (i) Herstellen eines Gemisches aus zumindest einem Phospholipid und zumindest einer hydrophilen Substanz in einer mobilen Trägerphase, die aus CO&sub2; besteht, und einem polaren organischen Co-Lösungsmittel (ii) Bringen des Gemischs auf Temperatur- und Druckbedingungen, die höher sind als die kritische Temperatur und Druck einer reinen CO&sub2;-Phase, (iii) Expandieren des "komprimierten" Gemisches unter normalen Druckbedingungen, (iv) Trennen der wässrigen Phase, die die hydrophile Substanz in den Liposomen eingekapselt aufweist, von dem organischen Lösungsmittel und (v) Auftrennen der erwünschten Fraktion der Liposomen nach ihrer Größe.
Die Verwendung von Liposomen zur Abgabe bzw. zum Transport und kontrollierten Freisetzung therapeutischer Arzneistoffe erfordert relativ große Mengen an Liposomen, die zur Verwendung in vivo geeignet sind. Ostro, M. J. und Cullis, P. R., "Use of Liposomes as Injectable Drug Delivery Systems", American Journal of Hospital Pharmacy, 46: 1576-1587; (1989). Vorliegende Verfahren im Labormaßstab weisen nicht die erforderliche Reproduzierbarkeit bezüglich Quantität und Qualität des eingekapselten Arzneistoffs, des Lipidgehalts und der Unversehrtheit und der Liposomen-Größenverteilung und des eingefangenen Volumens auf. Die multidimentionalen Eigenschaften des Arzneistoffs und des Liposoms ebenso wie die potentielle Variabilität des Ausgangsmaterials beeinflussen die Reproduzierbarkeit.
Gegenwärtige Liposomen-Produkte sind nicht stabil. Es ist wünschenswert, Endformulierungen bzw. Endzubereitungen zu haben, die für 6 Monate bis 2 Jahre bei Raumtemperatur oder bei Kühlschranktemperatur stabil sind. Die Stabilitätserfordernisse wurden durch Techniken zur Dehydrierung von Liposomen gelockert. Dehydrierte Liposomen können an Krankenhäuser frei von Arzneistoffen abgegeben und mit dem Arzneistoff unmittelbar vor der Anwendung durch den Krankenhausapotheker vermischt werden. Jedoch erhöht die Herstellung des Liposoms, das einen Arzneistoff enthält, durch einen Apotheker die Kosten der Therapie und ergibt ein zusätzliches Potential für Fehler bei der Herstellung.
Die vorliegenden Liposomen-Produkte sind schwer zu sterilisieren. Die Sterilität wird gegenwärtig durch unabhängiges Sterilisieren der Bestandteile - Lipid, Puffer, Arzneistoff und Wasser - durch einen Autoklaven oder durch Filtration und darauf Vermischen in einer sterilen Umgebung erreicht. Dieses Sterilisationsverfahren ist schwierig, zeitaufwändig und teuer, weil das Produkt nachweislich nach mehreren Bearbeitungsschritten steril sein muss.
Die Hitzesterilisierung des Endproduktes ist nicht möglich, weil ein Erhitzen von Liposomen die Liposomen irreparabel schädigt. Eine Filtration durch 0,22 Mikrometer Filter kann die Merkmale der vielschichtigen Liposomen ebenfalls verändern. Eine Gammastrahlenbehandlung, die üblicherweise nicht in der pharmazeutischen Industrie angewendet wird, kann die Liposomen-Membranen zerstören. Die Picosekunden- Lasersterilisation befindet sich noch im experimentellen Stadium und wurde bis jetzt noch nicht zur Sterilisation irgendeines im Handel erhältlichen pharmazeutischen Mittels angewendet.
Liposomen wurden als Arzneistofftransportträger für einige hydrophobe Arzneistoffe verwendet. Beispiele hydrophober Arzneistoffe sind Taxoide, Camptothecine, Doxorubicin, Michellamin β, Vincristin und Cisplatin. Der Begriff "Taxoid" bezieht sich auf Paclitaxel, Cephalomannin, Baccatin III, 10-Deacetylbaccatin III, Deacetylpaclitaxel und Deacetyl-7- epipaclitaxel und Derivate und Vorläufer hiervon. Paclitaxel ist ein Beispiel für ein Taxoid. Paclitaxel, ebenfalls als TAXOL bekannt (NSC 125973) ist ein Diterpen-Pflanzenprodukt, das aus der westlichen Eibe Taxus brevifolia gewonnen wird. Die Formel für Taxol ist nachstehend dargelegt:

(a) Paclitaxel

Dieser Arzneistoff, der sich gegenwärtig in klinischen Versuchen befindet, zeigte eine auffällige 30 bis 40%ige Reaktionsrate gegen fortgeschrittene Fälle von Ovarkrebs und mehrere andere Krebsarten. Gegenwärtig wird Paclitaxel mit organischen Lösungsmittel aus der vermahlenen Rinde von T. brevifolia extrahiert. Dieser Arzneistoff ist eine Mangelware.
Es existiert ein Bedarf zur Maximierung der therapeutischen Reaktion auf diesen Arzneistoff, um die Vorteile einer Paclitaxel-Therapie zu so vielen Individuen wie möglich zu bringen. Es ist ebenfalls notwendig, die Nebenwirkungen dieses Arzneistoffes zu minimieren, die auf dessen natürliche Toxizität zurückzuführen sind.
Cephalomannin ist ein weiteres Taxoid, und Cephalomannin wird ebenfalls zur Behandlung von Krebs verwendet. Cephalomannin weist die unten dargelegte Formel auf:

(b) Cephalomannin

Camptothecin wird aus einem Baum, nämlich Camptothecin acuminata, gewonnen. Wie hierin verwendet, betrifft der Begriff "Camptothecine" Camptothecin und dessen methoxylierte Analoga und carboxylierte Analoga und Vorläufer, die eine ähnliche biologische Aktivität bzw. Wirksamkeit und hydrophobe Eigenschaften aufweisen. Camptothecin wird ebenfalls zur Behandlung von Krebs verwendet; Die Formel für Camptothecin ist nachstehend dargelegt:

(c) Camptothecin (CPT)

Wie Paclitaxel ist Camptothecin in Wasser unlöslich und eine Mangelware. Das Natriumsalz von Camptothecin wurde in anfänglichen klinischen Studien verwendet. Kürzliche klinische Studien legen nahe, dass mehrere Camptothecin-Analoga eine Wirksamkeit gegen einen breiten Bereich von menschlichen/Tier-Tumoren aufweisen. Es wird angenommen, dass diese Zusammensetzung als ein Inhibitor des Enzyms Topoisomerase I dient. Auf Grund der Toxizität und der hydrophoben Natur dieser Verbindung wurden bestimmte Nebenwirkungen beobachtet. Diese Nebenwirkungen schließen Neutropenie, Schwindel, Übelkeit und Durchfall ein.
Es existiert ein Bedarf nach Herstellungsverfahren, die kosteneffektiv und in großem Maßstab durchführbar sind zur Herstellung von Liposomen, die hydrophobe Arzneistoffe enthalten, und die der wachsenden Nachfrage auf dem Markt entsprechen können. Es existiert ein Bedarf nach einem Verfahren und einem Gerät bzw. Vorrichtung, das zur kontinuierlichen Verarbeitung in der Lage ist und das zum Recycling von nicht-eingefangenen Arzneistoffen, Lipiden und Lösungsmitteln in der Lage ist. Es existiert ein Bedarf nach einem Verfahren und einem Gerät, das gleichförmige Liposomen-Produkte erzeugt.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Herstellung von Liposomen, die hydrophobe Arzneistoffe enthalten, und die aus der Gruppe ausgewählt sind, die Taxoide einschließlich Paclitaxele, Cephalomannin, Camptothecine, Doxorubicin, Michellamin B, Vincristin, Bryostatin-1, Haioman und Cisplatin einschließen. Die Verfahren und die Vorrichtung sind zur Herstellung von Liposomen pharmazeutischer Güte in großem Maßstab geeignet, die steril, von vorherbestimmter Größe und im Wesentlichen frei von organischen Lösungsmitteln sind.
Die Camptothecine einer Ausführungsform der Erfindung sind vorzugsweise Camptothecin.
Die vorliegende Erfindung betrifft mehrere unterschiedliche Verfahren zur Herstellung von Liposomen unter Verwendung von kritischen, superkritischen oder nahezu kritischen Flüssigkeiten bzw. Fluids.
Ein Verfahren umfasst die Schritte, eine Lösung oder ein Gemisch aus einem Phospholipid, einem hydrophoben Arzneistoff, einer wässrigen Phase und einem kritischen, superkritischen oder nahezu kritischen Fluid auszubilden. Die Lösung oder das Gemisch wird dekomprimiert, um das kritische, superkritische oder nahezu kritische Fluid vom Phospholipid und dem wässrigen Medium zu trennen, um ein oder mehrere Liposomen zu bilden.
Dieses Verfahren wird in mehreren Beispielen als Dekompressionsverfahren zur Bildung von Liposomen bezeichnet. Vorzugsweise beeinflusst die Geschwindigkeit der Druckreduzierung die Größe der gebildeten Liposomen.
Wie hierin verwendet, betrifft der Begriff "Phospholipid" Zusammensetzungen, die Ester von Fettsäuren sind, bei denen der Alkoholbestandteil des Moleküls eine Phosphatgruppe als integralen bzw. daran gebundenen Bestandteil enthält. Phospholipide umfassen die Glycerophosphatide, einschließlich Glycerol, und die Sphingomyeline, die Sphingosin enthalten. Bevorzugte Phospholipide umfassen Phosphatidylcholin, Phosphatidylethanolamin, Phosphatidylserin und Sphingomyelin; und synthetische Phospholipide, die Dimyristoylphosphatidylcholin, Dipalmitorylphosphatidylcholin, Distearoylphosphatidylcholin, Distearoylphosphatidylglycerol, Dipalmitorylphosphatidylglycerol, Dimyristoylphosphatidylserin, Distearoyiphosphatidylserin und Dipalmitorylserin umfassen.
Vorzugsweise enthält ein Phospholipid gemäß einer Ausführuhgsform der Erfindung Cholesterin.
Auf dem Gebiet der physikalischen Chemie bedeutet der Begriff "kritische Flüssigkeit" bzw. "kritisches Fluid" ein Gas an oder über seiner kritischen Temperatur und an oder über seinem kritischen Druck. Der Begriff "superkritisches Fluid" betrifft ein Gas über seiner kritischen Temperatur und über seinem kritischen Druck. Superkritische Fluids werden manchmal in dieser Anmeldung durch die Abkürzung "SCF" bezeichnet. Der Begriff "nahezu kritisch" wird in dem Sinn verwendet, als er sich dem kritischen Zustand annähert oder diesem nahe ist. Ein Beispiel, ohne Beschränkung, eines nahezu kritischen Fluids ist ein Gas mit einer Temperatur unterhalb seiner kritischen Temperatur und einem Druck bei oder oberhalb des kritischen Drucks. Ein derartiges Gas weist Eigenschaften auf, die sich denjenigen eines superkritischen oder kritischen Fluids annähern, insbesondere in den Solvatisierungseigenschaften.
Im industriellen Rahmen ist es üblich, wo kritische, superkritische und nahezu kritische Fluids verwendet werden, insbesondere, wo Lösungsmitteleigenschaften angewendet werden sollen, den Begriff "kritisch" so zu verwenden, dass er superkritische, kritische und nahezu kritische Fluids mit einschließt. Diese Anmeldung wird den Begriff "SCoCoNC-Fluid" verwenden, um superkritische, kritische oder nahezu kritische Fluids zu repräsentieren. Die Verwendung des Begriffes "kritisch" bezüglich Liposomen und Liposomen-Bildung betrifft Liposomen, die mit einem superkritischen Fluid oder nahezu kritischen Fluid ebenso wie mit einem kritischen Fluid gebildet wurden. Flüssigkeiten bzw. Fluids werden manchmal in den Beispielen aus Gründen der Einfachheit als "kritisch" bezeichnet, obwohl derartige Fluids superkritisch, kritisch oder nahezu kritisch sein können.
Die Solvatisierungseigenschaften von SCoCoNC -Fluids werden durch Cosolventien bzw. Verschnittmittel und Schleppmittel beeinflusst. Die Begriffe "Cosolventien" und "Schleppmittel" werden in austauschbarer Weise verwendet und bedeuten Zusammensetzlingen, die im SCoCoNC löslich sind und dem SCoCoNC erwünschte Löslichkeitsmerkmale verleihen, und dem sie bezüglich Phosphohpiden und wässrigen Phasen zugesetzt werden. Nicht-polare Cosolventien bzw. Verschnittmittel betreffen Zusammensetzungen, die kein Dipolmoment oder ein nur geringes Dipolmoment aufweisen, das sich ungefähr von 0,0 bis 0,1 Debyes bewegt. Polare Cosolventien beziehen sich auf Zusammensetzungen mit einem Dipolmoment, das sich ungefähr von 0,1 bis 1,7 Debyes bewegt.
Wie hierin verwendet, betrifft der Begriff "wässrige Phase" eine Zusammensetzung, die insgesamt oder teilweise Wasser umfasst;
Vorzugsweise ist das SCoCoNC-Fluid aus der Gruppe von Zusammensetzungen ausgewählt, die zur Bildung von kritischen Fluids in der Lage sind, die Kohlendioxid, die Distickstoffoxid; Halogen-Kohlenwasserstoffe, wie beispielsweise Freone; Alkane, wie beispielsweise Propan und Ethan; und Alkene, wie beispielsweise Ethylen umfassen.
Der "Arzneistoff" wird im Sinne eines therapeutischen Wirkstoffes, einer Chemikalie oder eines Arzneistoffes verwendet, der zum Bewirken einer wünschenswerten Reaktion in einem individuellen Patienten in der Lage ist. Der Begriff "hydrophob" wird in dem Sinne verwendet, als eine schlechte Löslichkeit in Wasser und eine starke Löslichkeit in Kohlenwasserstoff-Lösungen gezeigt wird.
Vorzugsweise wird ein Gemisch der wässrigen Phase und eine Lösung des Phospholipids in einem SCoCoNC-Fluid in einer Kammer eines ersten Gefäßes bereit gehalten. Die Lösung oder das Gemisch wird dann dekomprimiert, wenn die Lösung in eine zweite Kammer oder ein zweites Gefäß geleitet wird. Die zweite Kammer ermöglicht die Entfernung des SCoCoNC-Fluids aus den gebildeten Liposomen-Zusammensetzungen, und zwar bei einer anderen Temperatur und einem anderen Druck als in der ersten Kammer.
Vorzugsweise wird das SCoCoNC-Fluid recycelt. In dem Ausmaß, in dem Phospholipide und die wässrige Phase mit dem SCoCoNC-Fluid übergetragen werden, können solche Bestandteile ebenfalls recycelt werden. Aus Einfachheitsgründen werden Liposomen, die mit einem SCoCoNC-Fluid gebildet werden, als "kritische Fluid-Liposome" oder "CFLs" bezeichnet.,
Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst ein Verfahren zur Ausbildung von Liposomen, die einen hydrophoben Arzneistoff enthalten, gemäß des Dekompressionsverfahrens zur Ausbildung von Liposomen. Das Verfahren umfasst die Verwendung eines ersten Gefäßes bzw. Behälters, in dem ein oder mehrere Phospholipide, eine wässrige Phase, ein oder mehrere hydrophobe Arzneistoffe und ein SCoCoNC-Fluid kombiniert werden, so dass ein Gemisch oder eine Lösung gebildet werden. Der hydrophobe Arzneistoff ist aus der Gruppe ausgewählt, die Taxoide, einschließlich Cephalomannin, Camptothecine, Doxorubicin, Michellamin B, Vincristin, Bryostatin-1, Haioman und Cisplatin umfasst. Das Verfahren umfasst weiterhin die Verwendung eines zweiten Gefäßes in Verbindung mit dem ersten Gefäß. Das Verfahren umfasst weiterhin die Verwendung einer Druckreduzierungseinrichtung, die dazu in der Lage ist, den Druck der Lösung oder des Gemisches zu reduzieren. Druckverminderungseinrichtungen können zwischen dem ersten und dem zweiten Gefäß angeordnet sein oder können mit dem zweiten Gefäß einstückig ausgebildet sein. Das zweite Gefäß nimmt die Lösung oder das Gemisch der Phospholipide, eine wässrige Phase und den hydrophoben Arzneistoff auf, die nach der Druckreduzierung Liposomen bilden.
Vorzugsweise wird das SCoCoNC-Fluid aus den Druckabbaueinrichtungen und/oder dem zweiten Gefäß entfernt und recycelt.
Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst ein Verfahren zur Bildung von Liposomen, wobei das Verfahren einen Injektionsschritt aufweist. Dieses Verfahren wird in mehreren Beispielen als das Injektionsverfahren zur Bildung von Liposomen bezeichnet. Dieses Verfahren umfasst die Schritte, eine Lösung oder ein Gemisch eines hydrophoben Arzneistoffes, eines Phospholipids und SCoCoNC zu bilden. Der hydrophobe Arzneistoff ist aus der Gruppe ausgewählt, die Taxoide, einschließlich Cephalomannin, Camptothecine, Doxorubicin, Michellamm B, Vincristin, Bryostatin-1, Haioman und Cisplatin umfasst. Die Lösung oder das Gemisch wird dann über eine Spitze oder eine Öffnung in eine wässrige Phase injiziert, um ein oder mehrere Liposomen zu bilden, die den genannten Arzneistoff enthalten. Zum Zeitpunkt der Injektion oder danach wird die Lösung oder das Gemisch dekomprimiert. Als Folge der Dekompression wird das SCoCoNC-Fluid von den Phospholipiden und der wässrigen Phase getrennt, so dass sich Liposomen bilden. Das freigesetzte SCoCoNC wird entweder entlüftet oder recycelt.
Ein bevorzugtes Verfahren verwendet ein SCoCoNC-Fluid, ausgewählt aus der Gruppe von Zusammensetzungen, die zur Ausbildung eines kritischen Fluids in der Lage sind, umfassend Kohlendioxid, Distickstoffoxid, Halogen-Kohlenwasserstoffe, wie beispielsweise Freon; Alkane, wie beispielsweise Propan und Ethan; und Alkene, wie beispielsweise Ethylen.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bildung von Liposomen gemäß des obigen Verfahrens. Das Verfahren umfasst die Verwendung eines ersten Gefäßes, das eine Lösung oder ein Gemisch eines hydrophoben Arzneistoffes, eines Phospholipids und eines SCoCoNC-Fluids aufweist. Der hydrophobe Arzneistoff wird aus der Gruppe ausgewählt, die Taxoide, einschließlich Cephalomannin, Camptothecine, Doxorubicin, Michellamin B, Vincristin, Bryostatin-1, Haioman und Cisplatin umfasst. Das Verfahren umfasst weiterhin die Verwendung eines zweiten Gefäßes, das eine wässrige Phase enthält. Das erste Gefäß und das zweite Gefäß werden mittels einer Injektionseinrichtung zur Injektion des Gemisches in die wässrige Phase verbunden. Nach Injektion in die wässrige Phase und Dekompression werden Liposome, die einen hydrophoben Arzneistoff enthalten, gebildet.
Vorzugsweise wird das SCoCoNC-Fluid aus dem Phospholipid nach Injektion und Dekompression in die wässrige Phase freigesetzt. Vorzugsweise wird das SCoCoNC-Fluid zum ersten Gefäß recycelt, um zusätzliche Losungen oder Gemische zu bilden.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst ein Verfahren zur Herstellung von Liposomen, das die Ausbildung eines Gemisches von multilamellaren Vesikeln und einem SCoCoNC-Fluid umfasst. Die multilamellaren Vesikeln enthalten einen hydrophoben Arzneistoff. Das Gemisch wird dekomprimiert, um das SCoCoNC-Fluid zu entfernen, um ein oder mehrere Liposomen einer vorherbestimmten Größe zu bilden. Die Größe des Liposoms kann durch die Dekompressionsgeschwindigkeit gesteuert werden.
Vorzugsweise werden die multilamellaren Vesikeln durch Hydrieren eines Gemisches aus einem hydrophoben Arzneistoff und einem Phospholipid in einer wässrigen Phase hergestellt.
Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst ein Verfahren zur Bildung von Liposomen aus multilamellaren Vesikeln. Das Verfahren umfasst die Verwendung eines ersten Gefäßes, das ein Gemisch aus multilamellaren Vesikeln und ein SCoCoNC-Fluid enthält. Das erste Gefäß steht mit einem zweiten Gefäß in Verbindung, wobei das zweite Gefäß dazu in der Lage ist, das Gemisch zu dekomprimieren, um das SCoCoNC-Fluid zu entfernen. Während der Dekompression werden ein oder mehrere Liposomen gebildet.
Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst weiterhin die Ausbildung eines dritten Gefäßes zur Bildung von multilamellaren Vesikeln durch Hydrieren von Phospholipiden in einer wässrigen Phase. Das Phospholipid enthält einen hydrophoben Arzneistoff.
Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst weiterhin Steuereinrichtungen zur Bestimmung der Dekompressionsgeschwindigkeit. Die Dekompressionsgeschwindigkeit bestimmt die Größe der Liposomen.
Vorzugsweise wird das aus der Liposomen-Zubereitung im Dekompressionsgefäß entfernte SCoCoNC zum ersten Gefäß recycelt, um zusätzliche Gemische multilamellarer Vesikeln und von SCoCoNC-Fluid zu bilden.
Ein Kontakt mit SCoCoNC-Fluid kann eine Zerstörung der zellulären Strukturen insbesondere nach rascher Dekompression verursachen. Somit sind die Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung größtenteils selbst-sterilisierend.
Die Verfahren der vorliegenden Erfindung sind dazu in der Lage Liposomen zu bilden, die einen hydrophoben Arzneistoff tragen. Diese Arzneistoffe können wirksam in Liposomen mit nur geringem Verlust angeordnet werden. Der Liposomen-Träger maximiert die therapeutische Reaktion auf diese Arzneistoffe und minimiert die Toxizitäten, die mit den biologischen Aktivitäten der Verbindungen und den hydrophoben physikalischen Eigenschaften verbunden sind. Der hydrophobe Arzneistoff wird in die Inhaltsstoffe eingebaut, die zur Bildung des Liposoms verwendet werden.
Die gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellten Liposomen weisen eine enge.
Größenverteilung auf. Das heißt, ein Liposom, das einen hydrophoben Arzneistoff enthält, kann hergestellt werden, bei dem 80-100% der Liposomen eine Größe aufweisen, die 10% der durchschnittlichen Größe der Gesamt-Liposomen-Population beträgt.
Die bevorzugte Größe für Liposomen liegt zwischen 50-350 nm Durchmesser. Eine Liposomen-Zubereitung mit einer Größenverteilung, bei der die durchschnittliche Größe 100- 300 nm, besonders bevorzugt 150-290 nm, beträgt, kann hydrophobe Arzneistoffe effizienter einbauen. Liposomen-Zubereitungen mit einer Größenverteilung, bei der die durchschnittliche Größe 150-250 nm ist, kann eine größere Stabilität zeigen.
Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung ermöglichen die Wiedergewinnung von Ausgangsmaterialien, Lipiden und Lösungsmittel, die nicht in das Endliposom-Produkt eingebaut werden. Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung umfassen einen wirksamen Arzneistoffeinbau und Wiedergewinnung nicht-eingekapselter Arzneistoffe. Die Betriebsparameter des Gerätes und der Verfahren stimmen mit anderen industriell angewendeten Verfahren überein. Das Verfahren und die Vorrichtung sind dazu in der Lage, kontinuierlich zu arbeiten.
Diese und weitere Vorteile werden für den Fachmann in Bezug auf die Zeichnungen und die ausführliche Beschreibung, die nunmehr folgt, erkenntlich werden.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 zeigt schematisch eine Vorrichtung, die Merkmale der vorliegenden Erfindung verkörpert;
Fig. 2 ist eine Explosionsansicht einer Düsenanordnung;
Fig. 3(a) und (b) beschreibt graphisch eine Teilchengrößenanalyse von Liposomen, die mit dem SCoCoNC-Fluid Kohlendioxid mit zwei Düsengrößen gebildet wurden, nämlich (a) 0,5 mm und (b) 0,06 mm;
Fig. 4 (a) und (b) beschreibt graphisch eine Teilchengrößenanalyse von Liposomen, die mit dem SCoCoNC-Fluid Distickstoffoxid und Ethanol mit zwei Düsengrößen, nämlich (a) 6,0 mm und (b) 0,22 gebildet wurden;
Fig. 5 ist ein Balkendiagramm, das die Wirkung des Druckes auf die Liposomen- Größe darstellt; und
Fig. 6 ist ein Balkendiagramm, das die Wirkung einer Art eines kritischen Fluids auf die Liposomen-Größe darstellt.
Fig. 7 zeigt ein HPLC-Chromatogramm von Paclitaxel und Cephalomannin.
Fig. 8 beschreibt ein HPLC-Chromatogramm von Camptothecin bei einer Konzentration von 0,04 mg/ml.
Fig. 9 beschreibt graphisch in Form eines Balkendiagramms die liposomale kritische Fluid-Größenverteilung und Intensität einer liposomalen Lösung, die aus einer Gelausschlusschromatographie (GEC = Gel Exclusion Chromatography)-Säule eluiert wurde.
Fig. 10 zeigt graphisch das Konzentrationsprofil von Paclitaxel und Cephalomannin, das aus einer Gelausschlusschromatograpme(GEC)-Säule eluiert worden ist.
Fig. 11 zeigt graphisch in Form eines Balkendiagramms die Liposomen- Größenverteilung und Intensitätsverteilung einer liposomalen Lösung, die aus einer GEC-Säule eluiert wurde, wobei die Liposomen durch Beschallung hergestellt wurden.
Fig. 12 zeigt graphisch das Konzentrationsprofil von Paclitaxel und Cephalomannin, das Liposomen aus einer GEC-Säule enthält, wobei die Liposomen durch Beschallung hergestellt sind.
Fig. 13 zeigt ein HPLC-Chromatogramm von liposomal eingekapseltem Camptotecin.
Die Fig. 14(a) und 14(b) zeigen die Paclitaxel-Konzentration als eine Funktion der Zeit für eine Liposomen-Zubereitung, wobei Fig. 14(a) eine Lagerung bei 4ºC repräsentiert und Fig. 14(b) eine Lagerung bei Raumtemperatur (R. T.) repräsentiert.
Die Fig. 15(a) und 15(b) zeigen das Paclitaxel-Konzentratiorisprofil als eine Funktion der Zeit für eine Liposomen-Zubereitung, wobei Fig. 15(a) eine Lagerung bei 4ºC repräsentiert und Fig. 15(b) eine Lagerung bei Raumtemperatur darstellt (R. T.).
Fig. 16 zeigt das Toxizitätsprofil von Zellen, auf die die Liposomen, die gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt wurden, die jedoch ohne Paclitaxel hergestellt wurden, als Kontrollstudie aufgebracht wurden.
Fig. 17 zeigt das Toxizitätsprofil von Zellen, auf die Paclitaxel aufgebracht wurde, als eine Prozentzahl des Zellüberlebens als Funktion der Dosiskonzentration.
Fig. 18 zeigt das Toxizitätsprofil von Zellen, auf die Liposome aufgebracht wurden, die gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt wurden und die Paclitaxel enthielten, als einen Prozentsatz des Zellüberlebens als eine Funktion der Dosiskonzentration.
Fig. 19 zeigt graphisch in Form eines Balkendiagramms einen Vergleich des prozentualen spezifischen in-vitro-Effektes von 1,0 ug/ml Liposomen, die Paclitaxel gemäß der vorliegenden Erfindung und Cremophor-formuliertes Paclitaxel (CP) für drei Brustkrebs-Zelllinien enthalten.
Fig. 20 zeigt die anti-Tumor-Aktivitäten von LEP, CP (in Konzentrationen von 0,295 mg/ml Paclitaxel) und leeres Liposom (EL) auf eine Brustkarzinom-Zelllinie, nämlich MDX-MB-231, die einer nackten Maus (nude mice) xenotransplantiert wurde.

Ausführliche Beschreibung der Zeichnungen

Die vorliegende Erfindung wird ausführlich als Verfahren zur Herstellung bzw. Bildung von Liposomen beschrieben werden. Das Verfahren weist Anwendungen zum Transport von Arzneistoffen, Pharmazeutika, Kosmetika und zur Nahrungsmittelverarbeitung auf.
Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist in Fig. 1 dargestellt. Ein Verfahren zur Herstellung von Liposomen verwendet die Vorrichtung, die im Allgemeinen durch die Ziffer "11" bezeichnet wird, und die die nachfolgenden Hauptelemente umfasst: ein erstes Gefäß 15; ein zweites Gefäß 17; eine Quelle des SCoCoNC-Fluids, die im Allgemeinen als Ziffer "19" bezeichnet wird; und eine Niederdruck-Fallen- bzw. Abscheideanordnung, die im Allgemeinen durch die Ziffer "21" bezeichnet wird.
Das erste Gefäß 15 ist so angepasst, dass es zur Aufnahme einer oder mehrerer der nachfolgenden Artikel oder Zusammensetzungen geeignet ist; Phospholipide, multilamellare Vesikeln (MLVs), wässrige Phasen, SCoCoNC-Fluids und therapeutische Wirkstoffe.
Bei einer Ausführungsform ist das erste Gefäß 15 dazu in der Lage, Phospholipide und eine wässrige Phase aufzunehmen. Das erste Gefäß 15 steht mit der Quelle für das SCoCoNC- Fluid 19 in Verbindung, um SCoCoNC-Fluid über eine Leitung 25 aufzunehmen. Der Begriff "Verbindung" wird in dem Sinn verwendet, dass ein Anschluss besteht, der es ermöglicht, dass das Fluid in das Gefäß hinein oder aus diesem herausgeleitet wird, eine Leitung oder dergleichen, oder mit diesem in Berührung steht.
Die Leitung 25 steht mit dem Kompressor 27 und dem Aufbewahrungsgefäß 29 in Verbindung. Das Aufbewahrungsgefäß 29 enthält SCoCoNC-Fluid, wobei das Fluid durch den Kompressor 27 durch die Leitung 25 gezwungen wird. Die Strömung des SCoCoNC- Fluids durch die Leitung 25 wird durch die Ventile 25a und 25b gesteuert. Der Druck in der Leitung 25 wird durch eine Druckanzeige oder ein Messgerät 31 überwacht.
Das erste Gefäß 15 nimmt SCoCoNC-Fluid aus der Leitung 25 auf, wobei das SCoCoNC- Fluid ein Gemisch mit Phospholipiden und einer wässrigen Phase bildet. Ein erstes Gefäß bzw. Behälter 15 steht mit einem zweiten Behälter 17 über eine Leitung 33 in Verbindung.
Der Gegendruckregulator 3 3a steuert den Druck in der Leitung 33. Der Gegendruckregulator. 33a reduziert den Druck von Gemischen, die durch die Leitung 33 strömen und die vom zweiten Behälter bzw. Gefäß 17 aufgenommen werden. Bei einer Ausführungsform endet die Leitung 33 in einer Düse 33b innerhalb des zweiten Behälters 17.
Der zweite Behälter 17 steht mit der Austrittsleitung 35 in Verbindung. Das Ventil 35a steuert die Strömung des Fluids durch die Leitung 35.
Das Ventil 37a steuert die Strömung des Fluids in Leitung 37. Liposomen, die sich im zweiten Behälter 17 sammeln, werden durch die Austrittsleitung 35 entnommen.
Der zweite Behälter 17 steht mit der Fallen- bzw. Abscheideanordnung 21 in Verbindung. Die Fallenanordnung 21 besteht aus zwei Hauptelementen: einem ersten Fallenbehälter 41 und einem zweiten Fallenbehälter 43. Der erste Fallenbehälter 41 steht mit dem zweiten Behälter 17 über Leitung 45 in Verbindung.
Der Gegendruckregulator 45a steuert den Druck in der Leitung 45. Die Strömung durch die Leitung 45 wird durch Ventil 45a gesteuert. Der Druck in der Leitung 45 wird durch das Druckmessgerät 47 überwacht.
Der erste Fallenbehälter 41 nimmt das SCoCoNC-Fluid und alle mitgeführten Phospholipide, wässrigen Phasen und Liposomen aus dem zweiten Behälter 17 auf. Liposome, Phospholipide und die wässrige Phase werden aus dem ersten Abscheidebehälter 41 über die Leitung 49 entfernt. Das Ventil 49a steuert die Bewegung der Fluids durch die Leitung 49.
Der Nebenanschluss 51 steht mit Leitung 49 und Leitung 45 in Verbindung. Der Nebenanschluss 51 ermöglicht das Sterilisieren und Reimgen der Reagenzien, die durch die Leitung 49 gepumpt und in den Abscheidebehälter 41 zurückgespült werden. Das Ventil 51a steuert den Strom der Fluids in der Leitung 51.
Der erste Abscheidebehälter 41 Steht mit dem zweiten Abscheidebehälter 43 über eine Leitung 55 in Verbindung. Der zweite Abscheidebehälter 43 stellt einen zweiten Behälter bereit, um das SCoCoNC-Fluid und alle mitgeführten Liposome, Phospholipide und wässrige Phase als Gemische aufzunehmen, die aus der zweiten Kammer 17 und dem ersten Abscheidebehälter 41 während des Druckabbaus strömen.
Der zweite Abscheidebehälter 43 wird in einem Eisbadbehälter 57 gehalten. Der Eisbadbehälter 57 ist mit Eis bepackt, um die Temperatur innerhalb des zweiten Abscheidebehälters 43 zusteuern und aufrechtzuerhalten.
Die Leitung 59, in Verbindung mit dem zweiten Abscheidebehälter 43, erlaubt die Entfernung von Liposomen und eingebauten Phospholipiden und wässriger Phase. Das Ventil 59a steuert die Strömung der Fluids in der Leitung 59.
Der zweite Abscheidebehälter 43 ist mit der Atmosphäre durch die Leitung 63 verbunden. Eine Strömung durch die Leitung 63 wird durch Ventil 63a gesteuert. Eine Strömung durch die Leitung 63 wird durch das Strömungsmessgerät 65 überwacht.
Der erste Behälter 15 steht mit einer Anordnung zum Mischen von Phospholipid in Verbindung, die im Allgemeinen durch die Bezugsziffer 67 bezeichnet wird. Die Phospholipid-Mischvorrichtung 67 umfasst die nachfolgenden Hauptelemente: Feststoffbehälter 69, Kreislauf- bzw. Umwälzpumpe 71, einen statischen In-Line-bzw. Reihenmischer 73 und ein Drei-Wege-Ventil 75.
Der Feststoffbehälter 69 ist zur Aufnahme von hydrophoben Arzneistoffen und Phospholipiden in fester Form vorgesehen, die durch das SCoCoNC-Fluid solubilisiert werden sollen. Vorzugsweise liegen die hydrophoben Arzneistoffe in pulverförmiger Form vor. Der Feststoffbehälter 69 nimmt SCoCoNC-Fluid aus der Leitung 77 auf. Die Leitung 77 steht mit einer Umwälzpumpe 71 in Verbindung. Die Umwälzpumpe 71 befindet sich mit dem Drei-Wege-Ventil 75 über Leitung 79 in Verbindung. Das Ventil 79a steuert die Bewegung des Fluids in der Leitung 79.
Das Drei-Wege-Ventil 75 steht mit dem statischen In-Line-Mischer 73 über Leitung 81 in Verbindung. Der statische In-Line-Mischer 73 ist mit dem Feststoffbehälter 69 über Leitung 83 verbunden.
Der Feststoffbehälter 69, die Umwälzpumpe 71, der statische In-Line-Mischer 73 und das Drei-Wege-Ventil 75 der Phospholipid-Mischvorrichtung 67 definieren einen Fluidkreislauf. Die Phospholipid-Mischvorrichtung 67 steht mit einem SCoCoNC-Fluid- Aufbewahrungsgefäß 29 über Leitung 25 in Verbindung, die die Leitung 81 zwischen dem Drei-Wege-Ventil 75 und dem statischen In-Line-Mischer 73 verbindet, so dass das Fluid in die erste Kammer 15 und in die Phospholipid-Mischvorrichtung 67 umgeleitet werden kann.
Die Phospholipid-Mischvorrichtung 67 weist eine Entlüftung 89 auf. Das Ventil 89a steuert die Bewegung des Fluids in der Entlüftung 89.
Die Phospholipid-Mischvorrichtung 67 weist einen Abfluss 91 in Verbindung mit Leitung 77 auf. Das Ventil 91a steuert die Bewegung des Fluids durch den Abfluss 91.
Die Phospholipid-Mischvorrichtung 67 weist eine Injektionsöffnung 93 in Verbindung mit dem Drei-Wege-Ventil 75 auf. Durch die Injektionsöffnung 93 können Materialien in den ersten Behälter über Leitung 112 und in die Phospholipid-Mischvorrichtung 67 injiziert werden.
Die Phospholipid-Mischvorrichtung 67 weist ein Druckmessgerät 95 in Verbindung mit einer Leitung 83 auf. Durch das Druckmessgerät 95 kann der Druck in der Leitung 83 überwacht werden.
Der erste Behälter 15, der zweite Behälter 17, eine Niederdruck-Abscheidevorrichtung 21 und die Phospholipid-Mischvorrichtung 67 stehen mit einer Waschvorrichtung, die im Allgemeinen durch die Ziffer 97 bezeichnet wird, in Verbindung. Die Waschvorrichtung 97 umfasst die nachfolgenden Hauptelemente: eine Luftquelle 99, eine Wasserquelle 101, eine Natriumhydroxid-Quelle 103, eine Quelle für eine Hypochlorit-Lösung 105 und eine Methanol-Quelle 107. Die Leitung 109 steht mit jeder Quelle über Leitungsabzweigungen bzw. Äste 11 1a bis e in Verbindung. Die Leitung 109 steht mit der Leitung 25 in Verbindung, so dass die Waschreagenzien in den ersten Behälter 15, den zweiten Behälter 17, die Niederdruck-Abscheidevorrichtung 21 und die Phospholipid-Mischvorrichtung 67 eintreten können.
Waschreagenzien, wie beispielsweise Wasser, Natriumhydroxid-Lösung, Methanol- und Hypochlorit-Lösungen werden durch die Leitung 109 durch Pumpe 113 angetrieben. Die Strömung der Fluids in der Waschvorrichtung 97 wird durch die Ventile 115a, b, c, d, e, f, g und h gesteuert.
Die erste Kammer 15, die zweite Kammer 17, die Phospholipid-Mischvorrichtung 67, der erste Abscheidebehälter 41 der Niederdruck-Vorrichtung 21 und die Verbindungsleitungen sind in der Box 117 untergebracht. Die Box 117 wird durch das Heizgerät 119 erhitzt. Das Heizgerät 119 wird durch den Temperatursensor 121b gesteuert, der sich in der Leitung 83 befindet. Die Temperatur wird ebenfalls durch Temperaturregler 121a bzw. 121c auf der Außenseite der ersten Kammer 15 und auf der Außenseite der zweiten Kammer 17 abgetastet.
Bei Betrieb werden Reinigungslösungsmittel durch die Pumpe 113 zugeführt. Die Pumpe 113 ist eine eng gekoppelte Zahnradpumpe, die für 6000 ml/min gegen einen Strömungsdruck von 670 kPa (100 psig) ausgelegt ist. Die Reinigungslösungsmittel, die in den Behältern 101,103, 105 und 107 enthalten sind, schließen 0,1 N NaOH, 10 Vol.% Hypochlorit-Lösung und 95% Methanol und entionisiertes Wasser ein. Entionisiertes Wasser wird als Spüllösungsmittel in einer Geschwindigkeit von 1200 ml/min bereitgestellt. Geräte-Druckluft, die in Behälter 99 (100 SCFM @ 670 kPa (100 psig)) enthalten ist, wird als Verdrängungsmittel und zum Trocknen des Lösungsmittels verwendet.
Das System wird periodisch durch Zirkulieren von fünf Systemvolumina jeweils der Hypochlorit-Lösung zur Inaktivierung aller vorhandenen Mikroorganismen; von entionisiertem Wasser als Spülung; von Ätzmittel zur Entfernung von Proteinen; von entionisiertem Wasser als Spülung; von Methanol zum Solubilisieren von Lipiden; und von entionisiertem Wasser als Spülung gereinigt. Das System wird mit Druckluft getrocknet. Die Vorrichtung wird zwischen Durchläufen gereinigt, indem Methanol im Kreislauf geführt und dann durch die Vorrichtung 11 entleert wird, indem die zweite Kammer 17 und die Niederdruck-Abscheidevorrichtung 21 mit Wasser gespült und dann mit Druckluft bzw. komprimierter Luft getrocknet wird.
Im Anschluss an eine Reinigung wird die Vorrichtung 11 getrocknet und auf Betriebstemperatur gebracht. Alle Ventile werden in der geschlossenen Position angeordnet. In der normalen Betriebsart wird der Feststoffbehälter 69 zuerst aus der Vorrichtung entfernt, mit einer bekannten Menge an Phosphatidylcholin (PC)/Phosphatidylethanolamin(PE)- Gemisch und einem oder mehreren hydrophoben Arzneistoffen befüllt und darauf wieder online in der Phospholipid-Mischvorrichtung 69 angeordnet. Das Drei-Wege-Ventil 75 wird dann gedreht, um die Injektionsöffnung 93 mit Leitung 79 in Verbindung zu bringen. Das Ventil 79a und das Entlüftungsventil 89a werden geöffnet.
Ein optionales Volumen eines Verschnittmittels oder Schleppmittels, wie beispielsweise Ethanol, wird dann über die Injektionsöffnung 93 mittels einer Injektionsspritze (nicht dargestellt) eingebracht. Das Drei-Wege-Ventil 75 wird dann gedreht bzw. betätigt, um die Phospholipid-Mischvorrichtung 67 mit dem ersten Behälter 15 in Verbindung zu bringen, und das Belüftungsventil 89a wird geschlossen. Das Ventil 25a wird dann geöffnet, wodurch das SCoCoNC-Fluidsolvens dem Kompressor 27 zugeführt wird. Der Kompressor 27 wird angeschaltet und unmittelbar danach wird das Ventil 25b geöffnet, wodurch das SCoCoNC- Fluid das erste Gefäß 15 und in die Phospholipid-Mischvorrichtung 67 eingeführt wird. Wenn der Betriebsdruck erreicht ist, wird der Kompressor 27 abgeschaltet und das Ventil 25b geöffnet.
Nach der Stabilisierung des Systems wird Pumpe 71 angeschaltet und deren Geschwindigkeit eingestellt. Mit geöffnetem Ventil 79a saugt die Pumpe 71 sowohl das Cosolvens vom Boden des ersten Behälters 15 als auch die SCoCoNC-Fluid-Phase aus dem Oberteil des ersten Behälters 15. Das Gemisch wird dann gegen den Uhrzeigersinn gepumpt, durch einen statischen in-line-Mischer 73 vermischt und durch das Drei-Wege-Ventil 75 dem ersten Behälter 15 zugeleitet.
In den meisten Fällen wird eine wässrige Phase (entweder entionisiertes destilliertes Wasser oder eine gepufferte Lösung, wie beispielsweise 150 mM Phosphatsalzpuffer bei pH = 7,0) durch eine Injektionsspritze in das zweite Gefäß 17 über eine Probenöffnung 35 und Ventil 35a eingebracht.
Als Alternative kann eine wässrige Phase in den ersten Behälter 15 eingebracht werden, so dass ein Gemisch der wässrigen Phase und des Phospholipids, gelöst in einem SCoCoNC- Fluid, gebildet wird. Als weitere Alternative werden ML Vs in den ersten Behälter 15 eingebracht, um ein Gemisch eines SCoCoNC und von MLVs zu bilden. Lösung und Gemisch werden mit ausreichender Vorlaufzeit vor der Dekompression eingebracht, so dass die Lösung oder das Gemisch dieselbe Temperatur wie der erste Behälter 15 und die Phospholipid-Mischvorrichtung 67 erreichen.
Nachdem die Mischpumpe 71 abgestellt wird, wird das Ventil 45b, der Gegendruckregulator 45a, das Ventil 63a vollständig geöffnet. Der Gegendruckregulator 33a wird langsam geöffnet, um den Druck im ersten Behälter 15 und in der Phospholipid-Mischvorrichtung 67 abzusenken. Das Produkt wird aus dem zweiten Behälter 17, dem ersten Abscheidebehälter 41, dem zweiten Abscheidebehälter 43 über die Leitung 35, 49 bzw. 59 gewonnen. Das Volumen jeder gesammelten Probe wird gemessen und aufgezeichnet. Typischerweise werden 95-100% der Zufuhr (wässrige und Cosolvens-Phasen) im ersten Abscheidebehälter 41 wiedergewonnen und nichts davon im zweiten Abscheidebehälter 43. Die gesammelten Proben werden bei 4ºC aufbewahrt.
Die Liposomen-Zubereitungen, die gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt wurden, weisen eine enge Größenverteilung auf, d. h. 80-100% der Liposomen einer Zubereitung weisen die durchschnittliche Größe der Population auf. Eine Liposomen-Zubereitung kann ausgebildet werden, bei der die Größe sich zwischen 50-350 nm Durchmesser bewegt. Liposomen mit einem Durchmesser von zwischen 100-300 nm können hydrophobe Arzneistoffe effizienter einbauen als kleinere Liposomen. Liposomen mit einem Durchmesser von 150-250 nm können eine größere Stabilität als kleinere Liposomen zeigen.
Weitere Merkmale des vorliegenden Verfahrens werden in den nachfolgenden Beispielen dargestellt.

Beispiel 1

Auswirkung der Düsengröße und des Düsendesigns auf die kritische Fluid-Bildung von Liposomen

Kritische Fluid-Liposomen werden gebildet, indem zunächst Phospholipide in SCoCoNC- Fluid mit/ohne einem Schleppmittel zur Bildung eines Gemisches solvatisiert werden. Das Gemisch wird langsam in einer wässrigen Phase dekomprimiert. Die Anzahl, Größe und Eigenschaften von kritischen Fluid-Liposomen, die gebildet werden, werden von mehreren Parametern bestimmt, wie beispielsweise der Größe und dem Design bzw. Aufbau der Dekompressionsdüse, den Dekompressionskräften, der Dichte des kritischen Fluids (Temperatur und Druck), den Grenzflächenkräften, der Ladungsverteilung und den * Eigenschaften des eingekapselten Produktes und der Pufferlösung. Die Auswirkung der Düsengröße auf die kritische Fluid-Bildung von Liposomen in destilliertem, entionisiertem (DDT) Wasser ist in Tabelle 1 aufgelistet und in den Fig. 3(a) und (b) dargestellt. Fig. 3 stellt graphisch die Teilchendurchmesserverteilung von Liposomen dar, die durch das SCoCoNC- Fluid Kohlendioxid mit zwei unterschiedlichen Düsen gebildet wurden. Fig. 3(a) stellt die Verteilung der Liposomen dar, die mit einer Düse mit einem Innendurchmesser von 0,50 mm gebildet wurden, und Fig. 3(b) stellt die Verteilung von Liposomen dar, die mit einer Düse mit einem Innendurchmesser von 0,06 mm gebildet wurden. Tabelle 1
Die mit einem Düsendurchmesser von 0,5 Millimetern (mm) gebildeten Liposomen waren durch Phasenkontrastmikroskopie leicht erkennbar. Liposomen, die mit dem superkritischen Fluid Kohlendioxid bei 26.800 kPa (4.000 psig) und 60ºC gebildet wurden, wiesen eine durchschnittliche Größe von 478 Nanometern (nm) auf. Die Teilchengrößenanalyse wurde durch einen Größenverteilungsprozessor (SDP = size distribution processpr) in einem Coulter N4MD Gerät auf Laserbasis durchgeführt. Der SDP ermöglicht eine multimodale Größenanalyse und zeigt den relativen Anteil von Teilchen in jeder diskreten Größenklasse. Die einzelne Liposomen-Population wies eine Standardabweichung (S. D. = Standard deviation) von 180 nm und einem 37%igen Varianzkoeffizienten (coefficient of variance = C. V.) auf.
Liposomen, die mit einer 0,06 mm ID-Düse ausgebildet waren, waren kleiner und gleichförmiger bei einer durchschnittlichen Teilchengröße von 326 nm (einer Standardäbweichung von 150 nm und einer C. V. von 44%). Auf Grundlage der Daten in Tabelle 1 erscheint der Liposomen-Radius vom Düsenradius zu 1/5 Potenz abzuhängen:
R&sub2;' = R&sub1;·(r&sub2;/r&sub1;)1/5
wobei R' der Radius des gebildeten Liposoms ist, r der Innenradius der Spitze der Kompressionsdüse ist.
Um die Auswirkung des Düsenradius auf die Größe von kritischen Fluid-Liposomen (CFLs) zu evaluieren, wurde das Düsendesign so verändert, dass sie einen 0,22 Mikrometer (um) Filter enthielt. Unter Bezugnahme auf Fig. 2 umfasst die Filterdüsenanordnung, die im Allgemeinen durch die Ziffer 211 bezeichnet wird, die nachfolgenden Hauptelemente: ein Gehäuse 213, das einen Innenkörper 215 und einen Außenkörper 217 umfasst und eine Filtermembran 219. Die Filtermembran wird am Ende der Leitung 33 im Gehäuse 213 zurückgehalten. Der Innenkörper 215 und der Außenkörper 217 passen durch zusammenpassende Gewindeabschnitte zusammen, so dass ein einheitliches Gehäuse 213 gebildet wird. Die Filtermembran 219 weist eine anorganische Membran mit sehr gleichförmigen und nicht gewundenen Poren auf (Alltech Associates, Inc., Deerfield, IL). Die Filtermembran 219 wurde auf einem Sieb 221 mit 316 SS Mesh gelagert und mit Teflon- Dichtungsringen 223 abgedichtet.
Die Größen der Liposome, die durch das superkritische Fluid N&sub2;O durch die 0,06 mm Nadelspitze und das 0,22 um Filterpapier gebildet wurden, sind in Tabelle 2 aufgelistet und in Fig. 4 dargestellt. Fig. 4 stellt graphisch die Teilchengrößenverteilungder Liposomen dar, die mit dem SCoCoNC-Fluid Distickstoffoxid und Ethanol mit zwei unterschiedlichen Düsengrößen gebildet wurden. Fig. 4(a) beschreibt die Verteilung der Liposomen, die mit einer Düse von 0,06 mm gebildet wurden und Fig. 4(b) beschreibt die Verteilung von Liposomen, die mit einer Düse von 0,22 um gebildet wurden. Tabelle 2
Gemäß Gleichung 1 sollten LIP-53-Liposomen eine von 312 nm auf 102 nm in LEP-69 reduzierte Größe aufweisen. Es existiert eine zumindest 50%ige Übereinstimmung zwischen diesen beiden Experimenten und Gleichung 1 dahingehend, dass der 0,22 um Filter die 0,6 mm kritischen Fluid-Liposomen um zumindest 50% auf 105 nm reduzierte.
Eine 100%ige Größenreduktion war nicht möglich, weil der 0,22 um Filter vielfache punktförmige Ausgänge aufweist, was es benachbarten Blasen ermöglichen konnte, zu größeren Blase zu agglomerieren. Die meisten der verbleibenden Experimente wurden, soweit nichts anderes erwähnt ist, mit der 0,06 mm Öffnung durchgeführt.

Beispiel 2

Auswirkung des Drucks auf die kritische Fluid-Bildung von Liposomen

Die Auswirkung des kritischen Fluid-Drückes auf die Größe der Liposomen, die durch die Injektionstechnik gebildet wurden, ist in Tabelle 3 aufgelistet und als Balkendiagramm in Fig. 5 dargestellt. Wie in Fig. 5 dargestellt, zeigt der linke Balken für jeden Druck mit Linien, die sich von unten links nach oben rechts erstrecken, Liposomen mittlerer Größe (100-400 mm). Der rechte Balken, mit Linien, die sich von unten rechts nach oben links erstrecken, beschreibt Liposomen von größerer Ausdehnung (größer als 400 nun). Diese CFLs wurden alle mit einer 0,06 mm Dekompressionsdüse gebildet. Tabelle 3
Die Zunahme der Liposomen-Größe mit dem anfänglichen Dekompressionsdruck stimmt mit der Beziehung der Blasengröße und des Formungsdruckes überein. Diese Beziehung wird jedoch durch die Menge der Phospholipide, die in der kritischen Fluid-Phase solubilisiert sind und durch die Dekompressionsgeschwindigkeit kompliziert. Das erstere ist signifikant, weil die zumeist gleichförmig großen Liposomen (100% bei 352 mn) bei 20.100 kPa (3.000 psig) erzielt wurden, wobei der optimale Druck zum Solubilisieren von Lecithin im superkritischen Fluid Kohlendioxid bei 60ºC liegt.
Die in Tabelle 3 aufgelisteten Experimente wurden durch Zirkulieren des kritischen Fluids für 60 Minuten und darauf langsam dekomprimieren vom aufgelisteten Druck zu atmosphärischen Bedingungen durchgeführt. Die Liposomen wurden somit von einem variablen Druck, der sich von einem Initialdruck von 33.500 kPa (5.000 psig) bis zu 0 kPa (0 psig) in LIP-44 bewegte, gebildet.
Um die Auswirkung variierender Dekompressionsdrücke zu evaluieren, wurde eine Experimentenreihe durchgeführt, bei der die Liposomen über spezifische Druckintervalle gebildet wurden. Die Ergebnisse dieser Experimente sind in Tabelle 4 nachstehend aufgelistet. Tabelle 4
Beispielsweise wurden bei LIP-64 SCF N20 mit einem polaren Cosolvens bei 20100 kPa (3.000 psig) und 60ºC mit Eidotter-Lecithin 60 Minuten lang in Berührung gebracht und dann langsam in DDI-Wasser von 20100 auf 13400 kPa (von 3.000 bis 2.000 psig) dekomprimiert und die liposomale Lösung wurde entfernt und durch frisches DDI-Wasser ersetzt.
In LIP-65 wurden Liposomen durch langsames Dekomprimieren des verbleibenden kritischen Fluidgemisches von 13400 kPa auf 7.370 kPa (von 2.000 psig auf 1.100 psig) gebildet.
Zuletzt wird das kritische Fluidgemisch in LIP-66 von 7.370 kPa (1.100 psig) auf atmosphärische Bedingungen dekomprimiert.
Es sollte erwähnt werden, dass gleiche Volumina an wässrigen Phasen in jeder der drei Stadien der Dekompression verwendet wurden. Die Teilchengrößen-Analysen zeigen an, dass eine unimodale, relativ kleine Verteilung der Liposomen bei Drücken oberhalb des kritischen Druckes von N&sub2;O gebildet wurde, der 6968 kPa (1.040 psig) beträgt. Ein signifikanter Anteil größerer Liposomen wurden beim Dekomprimieren von 6700 kPa (1.000 psig) bis auf atmosphärische Bedingungen gebildet. Ähnliche Teilkompressionswirkungen auf die Liposomen-Größe sind in Tabelle 4 für Ethylen/Ethanol- und Propan/Ethanol-Gemische dargestellt.
Es sollte erwähnt werden, dass Distickstoffoxid/Ethanol-Dekompressionsreihen mit Hühnereidotter-Lecithin und mit einer 0,06 mm Dekompressionsdüse durchgeführt wurden; die verbleibenden Dekompressionsreihen in Tabelle 4 wurden mit reinem Phosphatidylcholin in Ethanol mit einer 0,5 mm Dekompressionsdüse durchgerührt. Die größeren Lipsomen im letzten Stadium der Teildekompression wurden vermutlich deswegen gebildet, weil die Dichte des kritischen Fluids sich unterhalb des kritischen Druckes schnell verändert.
Bei Betrieb nimmt die Dekompression bei Drücken um und unterhalb des kritischen Druckes viel mehr Zeit in Anspruch, um das DDI-Wasser oder die wässrige Pufferlösung in der Dekompressionskammer zurückzuhalten und ebenfalls nimmt das Austragsvolumen von Gas dramatisch zu. Die rasche Zunahme des Gasvolumens hat vielleicht wegen der Joule- Thompson-Kühleffekte die Bildung von größeren Blasen und Liposomen zur Folge, die auf die Gasexpansion zurückzuführen sind. Die LIP-112-Probe, aufgelistet in Tabelle 4, war tatsächlich nach der dritten Stufe der fraktionellen Propan/Ethanol-Dekompression gefroren.

Beispiel 3

Auswirkung des Typs des kritischen Fluids auf die kritische Fluid-Bildung von Liposomen Liposomen, die durch mehrere kritische Fluids gebildet wurden, werden bezüglich der Teilchengrößen-Verteilungen in Tabelle 5 charakterisiert und durch die Balkendiagramme in Fig. 6 verglichen. Wie in Fig. 6 dargestellt, spiegelt für jedes kritische Fluid der linke Ballken mit Linien, die sich von unten links nach oben rechts erstrecken, kleine bis mittlere Liposomen-Größen wider. Die rechte Balken, mit Linien, die sich von unten rechts nach oben links erstrecken, spiegeln große Liposomen wider. Diese Experimente wurden alle durchgeführt, indem Hühnereidotter-Lecithin mit der kritischen Fluid-Phase (ohne Co- Solventien) bei 20100 kPa (3.000 psig) und 60ºC für 60 Minuten in Berührung gebracht wurden und dann langsam durch die 0,06 mm Dekompressionsdüse dekomprimiert wurden. Tabelle 5
Superkritisches Ethylen in LIP-63 erzeugte eine unimodale, wenn auch breite Verteilung (eine durchschnittliche Teilchengröße von 320 nm und eine Standardabweichung von 300 nm) der Liposomen. Eine Dekompression bei subkritischem Druck könnte bimodale Verteilungen für die verbleibenden getesteten kritischen Fluids zur Folge haben.

Beispiel 4

Auswirkung eines polaren Schleppmittels oder Cosolvens auf die kritische Fluid-Bildung von Liposomen

Im Allgemeinen steuern polare Schleppmittel die Größe und Gleichförmigkeit von kritischen Fluid-Liposomen, wie in Tabelle 6 nachstehend dargestellt ist: Tabelle 6
Die Mikrometer-große Liposomen-Population in LGP-51, SCF N&sub2;0 ohne polares Cosolvens wurde am wahrscheinlichsten während der Dekompression unterhalb des kritischen Punktes von Distickstoffoxid gebildet. Der Zusatz von 2 Vol.% Ethanol in LIP-53 erzeugt eine enge unimodale Verteilung der Liposomen mit einer durchschnittlichen Größe von 312 nm, einer Standardabweichung von 54 nm und einem 17%igen Varianzkoeffizienten. Desgleichen verursachten 2 Vol.-% Methanol in LIP-52 und 2 Vol.-% Aceton in LIP-53 die Elimination der Liposomen-Population mit Mikrometergröße. Diese beiden Additive bildeten jedoch Verteilungen mit Durchschnittsgrößen um 100 nm und 300 nm. Beide Verteilungen waren für SCF N&sub2;O mit diesen beiden polaren Cosolventien relativ eng. Die zugesetzten polaren Schleppmittel steuern die Größe der Distickstoffoxid-CFLs am wahrscheinlichsten durch Absenken der Grenzflächenspannung zwischen dem Distickstoffoxid und Wasser (5% Ethanol in Wasser reduziert die Oberflächenspannung von 72 Dynes/cm bei 25ºC auf 53 Dynes/cm; 5% Aceton in Wasser reduziert die Oberflächenspannung auf 56 Dynes/cm). Eine geringere, gleichförmigere Grenzflächenspannung steuert die Größe der Blasen und der gebildeten Liposomen. Die erhöhte Löslichkeit von Lecithin in SCF N&sub2;O mit polaren Schleppmitteln könnte ebenfalls für die Reduktion der Größen und Verteilungen der CFLs verantwortlich sein.
Polare Schleppmittel weisen eine ähnliche Auswirkung auf CFLs auf, die durch nahezu kritisches Propan gebildet wurden, wie in Tabelle 7 dargestellt ist. Der Zusatz von 2 Volumen% Ethanol-Cosolvens eliminiert die Mikrometer-große Liposomen-Population, die mit nahezu kritischem Propan gebildet werden, und erzeugt eine einzige Liposomen- Population mit einer Durchschnittsgröße von 196 nm und einer Standardabweichung von 300 mn. Diese Elimination und Größenreduktion wird wahrscheinlich durch die Veränderung der Propan-Wasser-Grenzflächeneigenschaften verursacht, weil Lecithin in nahezu kritischem Propan selbst sehr gut löslich ist. Die Größen der CFLs hängen ebenfalls von den Puffern, die verwendet wurden, und den Proteinen, die eingekapselt wurden, ab. Aceton weist einen äußerst dramatischen Einfluss auf Propan-CFLs auf und reduziert die Liposomen auf eine einzige Population mit einer Durchschnittsgröße von 85 nm und einer Standardabweichung von 83 nm. Es ist sehr gut möglich, dass Methanol wegen des Vorhandenseins von Salz (0,09 M NaCl) in LIP-76 keine ähnliche Auswirkung aufwies. Tabelle 7
* Liposomen, die in Phosphatsalzpuffer mit Cytochrom-C gebildet wurden.
** Liposomen, die in einem Phosphatpuffer mit Cytochrom-C gebildet wurden.
Es scheint einen nur geringen oder keinen Einfluss polarer Cosolventien auf Liposomen zu geben, die durch Freon-22 gebildet werden, wie in Tabelle 8 dargestellt ist. Es sollte jedoch erwähnt werden, dass diese drei Experimente bei unterschiedlichen Drücken: LIP-60 bei 20100 kPa (3.000 psig), LIP-73 bei 26800 kPa (4.000 psig) und LIP-75 bei 33500 kPa (5.000 psig) durchgeführt wurden. Der Initialdruck mag einen signifikanten Einfluss auf die Liposomen-Größe und -verteilung aufweisen. Tabelle 8

Beispiel 5

Auswirkung der Betriebsart auf die kritische Fluid-Bildung von Liposomen

Größenverteilungen von Liposomen, die durch kritische Fluid-Injektion und Dekompressionstechniken gebildet wurden werden in Tabelle 9 verglichen und aufgelistet. Tabelle 9
Beide Experimente, die in Tabelle 9 aufgelistet sind, wurden mit einer 150 mM Phosphatsalzpufferlösung durchgeführt, die 1 mg/ml Cytochrom-C und 9,1 mg/ml Hühnereidotterlecithin enthielt. Weiterhin wurde eine langsame Dekompressionsgeschwindigkeit von ungefähr 6700 kPa (1.000 psig)/min durch eine 0,06 mm Düsenspitze für beide Experimente aufrechterhalten. Die Daten in Tabelle 9 legen nahe, dass die Dekompression des kritischen Fluids eine kleinere Teilchengrößenverteilung als die kritische Fluid-Injektionstechnik zur Folge hat.
Die Auswirkung der Dekompressionsgeschwindigkeit auf die Größenverteilung der Liposomen, die durch die kritische Fluid-Dekompressionstechnik gebildet wurden, wird in Tabelle 10 verglichen. Beide Experimente wurden mit identischen Konzentrationen an Protein und Lecithin in einem Phosphatsalzpuffer mit einer 0,50 nun Düsenspitze durchgeführt. Die Daten legen nahe, dass die rasche Dekompression (ungefähr 1.000 psi/sek) keine signifikante Auswirkung auf die Liposomen-Größe aufweist; tatsächlich scheint eine langsame Dekompression (ungefähr 6700 kPa (1.000 psi/min) eine gute Steuerung dahingehend zu ergeben, dass in LIP-100 eine kleine (Durchschnittsgröße von 92 nm), unimodale Verteilung erzielt wurde. Tabelle 10

Beispiel 6

Einkapselungseigenschaften der Liposome

Einkapselungsvorschriften sind typischerweise dahingehend "passiv", als sie auf der Fähigkeit der Liposomen beruhen, wahrend der Vesikel-Bildung ein bestimmtes wässriges Volumen aufzunehmen. Als Folge können die Einfangleistungsfähigkeiten dramatisch variieren und sich von weniger als 1% für kleine unilamellare Vesikeln (SUVs) bis sogar 88% für einige multilamellare Vesikeln (MLVs) bewegen. Die Einfangleistungsfähigkeiten sind eine Funktion der Größe und der Art des Verfahrens (und somit der Liposomen- Herstellungstechnik).
Die Liposomen können ebenfalls befüllt werden, indem auf ihrer Fähigkeit aufgebaut wird, bestimmte Arzneistoffe in Reaktion auf transmembrane Ionengradienten abzusondern bzw. zu maskieren. Diese (aktive) Vorschrift, die ebenfalls als "Remote loading" bzw. "Fernbefüllung" bezeichnet wird, schließt die Aufnahme geladener amphiphatischer Arzneistoffe in vorgeformte Liposomen, die einen Transmembran-pH-Gradienten (niedriger intraliposomaler pH, wenn der involvierte Arzneistoff ionisch ist) oder einen Transmembran- Potential-Gradienten mit exogenen Ionophoren wie beispielsweise Kalziumionen aufweisen, ein. Beispielsweise können Einfangleistungsfähigkeiten von 98% und Arzneistoff: Lipid- Verhältnisse von sogar 1 : 2,2 (g/g) für Doxorubicinhydrochlorid in einem LUV-System (Mayer et al., 1985) leicht erreicht werden. Anders als die "passive" Vorschrift ist die Einfangleistungsfahigkeit unabhängig von der Lipidkonzentration. Die Transmembran-Ionengradienten erreichen nicht nur eine effiziente Arzneistoffverkapselung, sondern senken auch die Geschwindigkeit des Arzneistoffausflusses aus den Vesikeln um das 30-Fache.
Ein alternatives Verfahren zur Gewinnung von hohen Einfangleistungsfähigkeiten und hohen Arzneistoff zu Lipid-Verhältnissen besteht darin, eine hydrophobe Gruppe chemisch an den Arzneistoff zu binden (beispielsweise eine Fettsäure oder Phospholipid) und dies erzeugt ein Molekül, das in der Liposomen-Membran sehr gut löslich ist. Hydrophobe Arzneistoffe können in der Lipidphase vor der Liposomen-Bildung aufgelöst werden. Liposomen, die mit SCoCoNC-Fluids hergestellt wurden, können mit einer, erwünschten Zusammensetzung in irgendeiner Weise befüllt werden, die bei Liposomen verwendbar ist, die durch herkömmliche Techniken hergestellt sind. Das Einfüllen von Cytochrom-C in Liposomen, die durch Beschallung und kritische Fluids gebildet wurden, ist in Tabelle 11 zusammengefasst. Die Befüllung war in dem Sinn passiv, als Cytochrom-C in der wässrigen Phase während der Bildung des Liposoms vorlag: Tabelle 11

Beispiel 7

Stabilität kritischer Fluid-Liposome

Die Stabilität der kritischen Fluid-Liposome hängt von einer Vielzahl von Parametern ab, wie beispielsweise der Ausgangsmaterial-Zusammensetzung, der Reinheit und Sauerstoffempfindlichkeit, der Sterilität des Endproduktes, der Kompatibilität zwischen dem eingekapselten Arzneistoff und den liposomalen Materialien, dem pH der wässrigen Phase und der Ionenstärke und -zusammensetzung und der Herstellungstechnik. Ein Stabilitätsmangel hat Auswirkungen auf die Liposomen-Größe und die Arzneistoffzurückhaltefähigkeit. Für pharmazeutische Anwendungen sind liposomale Zubereitungen wünschenswert, die eine Lagerfähigkeit bei 4ºC zwischen 6-24 Monaten aufweisen.
Liposomen sind während herkömmlichem Gefriertrocknen und Rehydrieren Gegenstand einer massiven Fusion und Auslaufen bzw. Undichtigkeit. Durch Beschichten jeder Seite der Lipidmembran mit äquimolaren Konzentrationen von Zuckern wie beispielsweise Glukose, können frei fließende pulverförmige liposomale Zubereitungen gebildet werden, die 90% oder mehr der eingefangenen Materialien ohne Veränderung der Größe der Liposomen zurückhalten können (Crowe et al., 1985). Stabilitätsprobleme können auch durch "fernbeladene" Vorgeformte Liposomen zum Verwendungszeitpunkt vermieden werden (Bally et al., 1985). Die Fernbeladung kann einfach durch Veränderung des pHs einer vorgeformten liposomalen Zubereitung erreicht werden, um einen Transmembran-pH-Gradienten zu erzeugen, bevor der therapeutische Arzneistoff in der erforderlichen Dosis zugesetzt wird. Eine reproduzierbare und vollständige Aufnahme des Arzneistoffs wird innerhalb von 5 Minuten erreicht, was eine injizierbare liposomale Formulierung ergibt (Ostro et al., 1989). Die Stabilität liposomaler Formulierungen kann weiterhin durch Verwendung synthetischer gesättigter Lipide oder durch Zusatz von Antioxidantien wie beispielsweise Alpha- Tocopherol und Beta-Hydroxytoluol verbessert werden, um einen Phospholipid-Abbau zu vermeiden.
Die Stabilität kritischer Fluid-Liposome wurde überprüft, um zu evaluieren, ob kritische Fluids die Stabilität von liposomalen Formulierungen erhöhen oder senken. Diese Überprüfung wurde durch Messen der Teilchengrößenverteilung als Funktion der Zeit durchgeführt. Keine speziellen Vorkehrungen, wie beispielsweise die Zubereitung von kritischen Fluid-Liposomen unter einer Inertgas-Decke die Verwendung von Antioxidantien oder aseptische Verarbeitungs- und Sammelverfahren wurden bei der Herstellung von kritischen Fluid-Liposomen angewendet. Die Stabilität liposomaler kritischer Fluid- Formulierungen über die Zeit hinweg ist in Tabelle 12 aufgelistet. Tabelle 12
Superkritische Kohlendioxid-Liposomen zeigen bei einer Aufbewahrungstemperatur von 4ºC über eine sechs (6) monatige Zeitspanne eine gute bis ausgezeichnete Stabilität, wie durch die Daten in Tabelle 12 dargestellt ist.
Die Liposomen mit kleinerem Durchmesser, gebildet durch die 0,06 mm Düse, scheinen stabiler als die größeren Liposomen zu sein, die von der 0,50 mm Düse gebildet wurden.
Als zweiter Vergleichspunkt für kritische Fluid-Liposomen kann die relative Stabilität der Liposomen, die durch Schallenergie gebildet wurden, aus der Auflistung in Tabelle 13 gefolgert werden. Tabelle 13
Die durch Schallenergie in entionisiertem destilliertem Wasser (DDI) gebildeten Liposomen zeigen nach dreiundzwanzig (23) Tagen Aufbewahrung bei 4ºC einen kleinen Agglomerationsanteil.
Die Zeitstabilität der Liposomen, die durch andere kritische Flüssigkeiten gebildet wurden, sind in Tabelle 14 dargestellt. Die Daten zeigen, dass die effektivsten kritischen Fluids in Reihenfolge abnehmender Stabilität Folgende waren: (1) Propan; (2) Freon-22; (3) Distickstoffoxid; (4)Ethan; (5) Freon-23: und (6)Ethylen. Tabelle 14
Im Allgemeinen verbesserten polare Cosolventien die Stabilität von kritischen Fluid- Liposomen. Diese Verbesserung wird in Tabelle 15 dargestellt, die zeigt, dass die Stabilität von kritischen Distickstoffoxid-Liposomen mit Methanol als Zusatzstoff bei weitem besser ist; sowohl Ethanol als auch Aceton-Additivesind besser als keines und weisen eine ähnliche Auswirkung auf die Stabilität von kritischen Fluid-N&sub2;O-Liposomen auf. Tabelle 15

Beispiel 8

Paclitaxel- und Camptothecin- enthaltende CFLs: Betriebsbedingungen

Die Vorrichtung des in Fig. 1 dargestellten Typs wurde bei einem durchschnittlichen Druck von 20100-26800 kPA (3.000-4.000 psig), einer durchschnittlichen Temperatur von ungefähr 50-60ºC und einer Zirkulationszeit von 60 Minuten betrieben.
Zwei Gase, nämlich Ethylen und Propan, wurden in diesem Beispiel verwendet. Dieses Beispiel umfasst Paclitaxel und Camptothecin, wobei klar sein sollte, dass andere hydrophobe Arzneistoffe, die ohne Beschränkung Cephalomannin, Doxorubicin, Michellamin B, Vincristin, Bryostatin-1, Haioman und Cisplatin einschließen, in ähnlicher Weise geeignet sein würden.
Unter den Betriebsbedingungen war Propan ein nahezu kritisches Fluid. Die kritische Temperatur von Propan ist 96ºC. Bei den Betriebsbedingungen für dieses Beispiel wird Propan als nahezu kritisches Fluid betrachtet, das Lösungsmitteleigenschaften zeigt, die denjenigen eines kritischen Fluids nahekommen. Die thermodynamischen Eigenschaften von Propan oder Ethylen sind in Tabelle 16 aufgelistet. Tabelle 16

Phospholipide als Ausgangsmaterialien

Frisch eingefrorener Hühnereidotter (Sigma Chemical Co., St, Louis, MO), der aus 60% Phosphatidylcholin (PC) und 16,5% Phosphatidylethanolamin (PE), Sojaphosphatidylcholin (> 95% Reinheit) (Avanti Polar Lipids, Inc., Alabaster, AL) bestand, wurde als liposomale Ausgangsmaterialien verwendet. Reines Cholesterin (> 99% Reinheit) wurde ebenfalls verwendet.

Taxol und Camptothecin Ausgangsmaterialien

Taxol wurde durch Extraktion aus Ausgangsmaterialien gewonnen. Camptothecin wurde vom National Cancer Institute (NCI), Washington, DC, bezogen. Ein Gemisch aus Paclitaxel und Cephalomannin wurde vom NCI bezogen. Eine HPLC-Analyse dieses Gemisches zeigte, dass der Gewichtsprozentsatz von Paclitaxel und Cephalomannin im Gemisch 20% bzw. 30% betrug.

Analytische Verfahren

Liposomen, die durch kritische Fluids und Beschallung gebildet wurden, wurden bezüglich Größe, Stabilität und Leistungsfähigkeit der Einkapselung charakterisiert. Ein Submicronteilchen-Analysegerät (Coulter Electronics, Inc. Model N4MD) wurde zur Messung der durchschnittlichen Teilchengröße, der Größenhäufigkeitsverteilung und der Standardabweichung der Teilchengröße verwendet. Dieses computergesteuerte, vielwinklige Gerät verwendet einen Laserstrahl, um die Lichtstreuung durch die Teilchen in dessen Lichtweg abzutasten, die auf die Brown'sche Bewegung der Teilchen zurückzuführen ist und eine Photonenkorrelations-Spektroskopie, um eine Teilchengrößen-Analyse bereitzustellen.
Eine HPLC-Analyse für den Paclitaxel-Gehalt in der Liposomen-Zubereitung wurde auf einer 15 cm langen Pentafluorphenyl-(PFP-)Säule (Es Industries, Inc.) mit einer Waters 501 HPLC Pumpe und einem Waters 991 Photodioden Array Detector durchgeführt. Die Durchflussgeschwindigkeit und die Temperatur wurden bei 1,5 ml/min bzw. 27ºC kontrolliert. Die mobile Phase bestand aus 44% Acetonitril, 56% Wasser und ungefähr 0,1% (Volumen) Phosphorsäure. Dieses System ergab Retentionszeiten für Paclitaxel und Cephalomannin um jeweils 12,5 und 9,5 Minuten herum mit einer UV-Detektion bei 228 um. Das HPLC-Chromatogramm des Paclitaxel/Cephalomannin-(Taxoid-)Gemisches ist in Fig. 7 dargestellt.
Der Camptothecin-Gehalt der Liposomen wurde durch HPLC unter Verwendung einer 15 cm langen Umkehrphasen-Pentafluorphenyl-(PFP-)Säule untersucht. Unter Verwendung einer mobilen Phase, die aus 80% Methanol, 20% Wasser und 0,1% (Vol.) Phosphorsäure bestand und bei einer Durchflussgeschwindigkeit von 1,0 ml/min. eluiert Camptothecin in ungefähr 2,9 Minuten. Bei einer Wellenlänge von 370 nm ist die chromatographische Abtastung der Camptothecin-Lösung bei einer Konzentration von 0,04 mg/ml in Fig. 8 dargestellt.
Eine Gelausschluss-Chromatographie (GEC) wurde dazu verwendet, nicht-eingekapseltes Taxoid von den Liposomen abzutrennen und die Beladungseffizienz von Taxoid in den Liposomen zu bestimmen. Eine 16 mm ID · 70 cm lange Säule, die mit Sephacryl S-1000 (Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, NJ) bepackt war, mit einem Ausschlussdurchmesser von 260 nm bis 300 nm, wurde zur Fraktionierung von Liposomen und zur Trennung von Liposomen von allen nicht-eingekapselten gelösten Substanzen verwendet. Die gepackte GEC-Säule wurde mit Liposomenlösung gesättigt. Dieser Schritt ist notwendig, um zu vermeiden, dass die Liposomenformulierungen an den Sephacryl S-1000 Perlen festkleben. Die eluierten Fraktionen wurden durch einen Fraktionssammler (ISCO, Inc. Lincoln, NE) gesammelt. Die Teilchengrößen-Analyse und der Taxoid-Gehalt der eluierten Lösung wurden jeweils durch den Coulter Particle Analyzer und durch HPLC untersucht.
Eine Zentrifugation wurde mit Liposomen bei 10.000 g 15 Minuten lang durchgeführt, gefolgt von Filtration durch einen 0,22 mm Filter. Eine HPLC-Analyse für Paclitaxel wurde vor und nach der Filtration durchgerührt. Dieses relativ einfache Verfahren gibt einen Hinweis darauf, ob Paclitaxel in die Liposomen eingebaut ist.

A. Liposomen, die durch Injektion geformt werden

Liposomen, die Paclitaxel oder Paclitaxel und Cephalomannin oder Camptothecin enthalten, wurden wie in Beispiel 1 beschrieben gebildet. Derartige Liposomen wurden unter Verwendung einer 0,5 mm Düse bei einem Druck von 26.800 kPa (4.000 psig) und bei einer Temperatur von 60ºC hergestellt. Taxol oder Paclitaxol und Cephalomannin oder Camptothecin wurden in pulverförmiger Form mit Phospholipiden in einer Phospholipid- Kammer (69) der in Fig. 1 dargestellten Vorrichtung angeordnet. Die Vorrichtung wurde in Betrieb gesetzt, um das Phospholipid und den Arzneistoff im SCoCoNC-Fluid zur Bildung eines Arzneistoffgemisches zu lösen. Dieses Gemisch wurde in eine wässrige Phase zur Bildung von Liposomen injiziert.

B. Liposomen, die durch Dekompression gebildet wurden

Liposomen, die Paclitaxel oder Paclitaxel und Cephalomannin oder Camptothecin enthielten, wurden wie in Beispiel 1 beschrieben gebildet. Das heißt, Phospholipid, Arzneistoff und wässrige Phase und ein SCoCoNC-Fluid werden in einem wie in Fig. 1 beschriebenen Gerät gründlich vermischt. Dieses Gemisch wird in einem ersten Behälter gehalten und in einer Fluid-Verbindung mit einem zweiten Behälter über eine Düse angeordnet. Nach Druckabbau des Gemisches werden Liposomen, die den Arzneistoff enthalten, gebildet, wenn sich das Gemisch vom ersten Behälter zum zweiten bewegt oder nach Druckabbau des Gemisches nach Eintritt in den zweiten Behälter.
C. Liposome, die aus multilamellaren Vesikeln gebildet werden Liposome, die einen hydrophoben Arzneistoff enthalten, würden aus multilamellaren Vesikeln hergestellt werden, indem zunächst ein multilamellares Vesikel gemäß irgendeines in der Technik bekannten Verfahrens hergestellt würde. Ein bevorzugtes Verfahren wäre ein Gemisch eines Phospholipids und des hydrophoben Arzneistoffes. Dieses Gemisch würde in einer wässrigen Lösung zur Bildung von multilamellaren Vesikeln hydratisiert werden. Die multilamellaren Vesikeln würden mit einem SCoCoNC-Fluid vermischt und dekomprimiert werden, um Liposomen einer gleichförmigen Größe zu bilden.

Beispiel 9

Vergleich der Liposomen-Größenverteilung

Die Größenverteilung von Liposomen, die durch kritische Fluid-Injektions- und Dekompressionstechniken gebildet wurden, werden in Tabelle 17 verglichen. Alle experimentellen Daten, die in Tabelle 17 aufgelistet sind, wurden mit durchschnittlichem Druck und Temperatur um 26.800 kPa (4.000 psig) bzw. 60ºC durchgeführt. Die Ergebnisse in Tabelle 17 weisen darauf hin, dass die Dekompressionstechnik eine kleinere Teilchengrößen-Verteilung als die Injektionstechnik zur Folge hatte. Die Differenz der Größenverteilung in den Liposomen, die gebildet wurden, indem zwei unterschiedliche Betriebsarten verwendet wurden, können möglicherweise durch den Mechanismus erklärt werden, durch den die Liposomen gebildet werden. Tabelle 17
+ Propan wurde als SCoCoNC-Fluid verwendet
- Ethylen wurde als SCoCoNC-Fluid verwendet
Ohne an eine spezielle Theorie gebunden sein zu wollen, kann bei der Injektionstechnik Phopholipid, das im SCoCoNC-Fluid solvatisiert ist, sich an der Phasengrenze von kritischen Fluid/Wasser-Blasen als Folge des Druckabbaus ablagern. Während diese Blasen nach Ablösen von der Düse in die wässrige Lösung entstehen, schälen sich die kristallisierten Bilayer der Phospholipide ab und versiegeln sich selbst und bilden Liposome. Die Größenverteilung der Liposome hängt von mehreren Betriebsparametern ab, wie beispielsweise: Größe und Design bzw. Aufbau der Düse, Geschwindigkeit der Dekompression, Grenzflächenspannung zwischen dem SCoCoNC-Fluid und dem wässrigen Medium und Druck und Temperatur im Sammelgefäß. In dieser Betriebsart tritt der Solvatationsprozess der Phospholipide durch das kritische Fluid im Hochdruckkreislauf auf. Folglich kann der Liposom-Bildungsprozess in der Dekompressionskammer bei einer anderen Temperatur- und Druckumgebung als derjenigen durchgeführt werden, die zur Solvatisierung der Phospholipide erforderlich ist. Diese Technik ist für die Einkapselung therapeutischer Proteine und Verbindungen, die thermolabil sind, sehr gut geeignet. Durch ihre Art ist die Injektionstechnik ebenso für therapeutische Verbindungen sehr gut geeignet, die scherempfindlich sind.
Bei der Dekompressionstechnik werden die solvatisierten Phospholipide in Form einer Bilayer im kritischen Fluid kontinuierlich in die wässrige Lösung in der Einweichkammer dispergiert, und vesikulieren anschließend zu Liposomen. Wenn der Gleichgewichtszustand zwischen dem kritischen Fluid und den Phospholipiden während der Zirkulation unter konstanter Temperatur und Druck erreicht ist, wird eine bestimmte Menge solvatisierter Phospholipide im kritischen Fluid als Bilayer-Fragmente zurückbleiben und im Hochdruckkreislauf zirkulieren. Während des Dekompressionsverfahrens wird das Gemisch aus kritischen Fluid-Lipid-Fragmenten und wässriger Phase unter großen Dekompressionskräften, die durch eine Volumenexpansion des kritischen Fluids erzeugt werden, durch das Tauchrohr/Düse gezwungen. Existierende Liposomen- und Bilayer- Bruchstücke von Phospholipiden können eine Kollision miteinander durchmachen, die auf große Scherkräfte zurückzuführen ist, und werden zu kleineren Fragmenten von Phospholipiden zerrissen. Die Größe dieser Bilayer-Fragmente hängt vom Druck und der Dekompressionsgeschwindigkeit ab. Diese thermodynamisch instabilen Bilayer-Fragmente werden sich dann schnell selbst versiegeln, so dass sich im Dekompressionsbehälter Liposomen bilden.
Um die Wirkungen des Dekompressionsdrucks auf die Liposomen-Größenverteilung zu evaluieren, wurden zwei Teildekompresssionsexperimente durchgeführt. Bei diesen Experimenten wurde eine Probenlösung bei zwei unterschiedlichen Druckintervallen gesammelt, wobei das erste Betriebsdruck, d. h. 23450 kPa, bis 6030 kPa (von 3.500 psig auf 900 psig) umfasste, was leicht oberhalb der kritischen Drücke von Ethylen und Propan liegt, und das zweite 6030 kPa (900 psig) bis atmosphärischen Druck umfasste. Die Ergebnisse dieser Experimente sind in Tabelle 18 aufgelistet. Diese Experimente werden unter demselben Betriebsdruck und Temperatur und mit derselben Düse an der Spitze des Dekompressionsrohrs durchgeführt. Tabelle 18
Die Ergebnisse aus Tabelle 18 zeigen, dass es möglich ist, Liposomen mit gleichförmiger Größenverteilung zu erzielen, indem der Dekompressionsdruckbereich und die Düsengröße in geeigneter Weise ausgewählt werden, vorausgesetzt, dass die anderen Bedingungen gleich bleiben.

Beispiel 10

Charakterisierungen von Liposom eingekapseltem Taxol

Die Liposomenproben aus Liposomen-Bildungsverfahren, die Injektion und Dekompression umfassen, wurden bei 2000 UpM 30 Minuten lang zentrifugiert, um alle nicht-verkapselten gelösten Stoffe zu entfernen und um große Phospholipid-Kristalle in der Liposomen- Suspension zu entfernen. Ein HPLC-Assay wurde durchgeführt, um den Paclitaxel- und Cephalomannin-Gehalt von Liposomen im Überstand des Zentrifugenrohrs zu bestimmen. Für Vergleichszwecke wurden Liposomen, die durch Beschallung gebildet wurden, ebenfalls zentrifugiert und die suspendierten Liposomen wurden bezüglich ihres Paclitaxel- und Cephalomannin-Gehaltes untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 19 nachstehend dargestellt. Tabelle 19
Die Daten zeigen klar an, dass die durch Injektion oder Dekompresson gebildeten Liposome Paclitaxel und Cephalomannin einkapseln. Die Daten legen ebenfalls nahe, dass Injektions- und Dekompressionsverfahren Paclitaxel effektiver einschließen als diejenigen Liposomen, die durch das Beschallungsverfahren gebildet wurden. In LEP-166, gebildet durch Beschallung, scheint es, dass eine große Menge von nicht-verkapseltem Paclitaxel in der Lösung vorlag, nämlich mehr als 45%, und dass nicht-eingebautes Paclitaxel und Cephalomannin nach Zentrifugation ausfiel.
Der Einbau von Paclitaxel in Liposomen wurde unter Verwendung einer Gelausschluss- Chromatographie (GEC) zur Fraktionierung von Liposomen in unterschiedliche Größen überprüft und um zu bestimmen, ob das Paclitaxel sich mit den Liposomen bewegt. Das Elutionsmittel aus der GEC-Säule wurde erneut durch HPLC untersucht. Die Teilchengrößen- Analyse, die eine Teilchengrößen-Verteilung der eluierten Probe einschloss, wurde ebenfalls durch das Coulter Teilchengrößen-Analysegerät überprüft.
Eine GEC-Chromatographie der Einkapselung von Paclitaxel durch Lipbsome, die durch Injektionsprozesse erzeugt wurden, ist in Fig. 9 dargestellt. Aus Fig. 9 ergibt sich offenkundig, dass Liposomen aus der Säule zwischen 18 und 40 ml eluiert Wurden. Die Volumenfraktionen, die unter diesen Peaks gesammelt wurden, waren trübe. Die Teilchengrößen-Intensität (Zähler pro Sekunde) nimmt dramatisch von 1,05 · 10&sup4; bei ungefähr 18 ml auf 2,6 · 10&sup6; bei 23 ml zu und gipfelt bei ungefähr 3,0 · 10&sup6;. Die Intensität nimmt bei ungefähr 54 ml schließlich auf 3,0 · 10&sup4; ab. Die durchschnittliche Größe der korrespondierenden Liposomen, die aus der Säule eluiert wurden, gipfelt ungefähr bei 30 ml bei 260 nm und wird schrittweise auf 31 nm bei ungefähr 48 ml reduziert. Die ersten beiden Volumenfraktionen von LIP-154 waren unimodal und die verbleibenden drei waren bimodal, wobei ein kleiner Anteil von Liposomen (4-20%) im 650-900 nm Bereich lagen.
Die Teilchengrößen-Analyse für LIP-154, das eine ursprüngliche Intensität von 2,6 · 10&sup6; oder 3,0 · 10&sup6; aufwies, wurde bei einer 1 : 10- oder 1 : 20-Verdünnung in steril filtriertem Wasser gemessen, um einen Intensitätslevel innerhalb des Betriebsbereichs des Gerätes zu erzielen. Es ist sehr gut möglich, dass der GEC-Prozess eine Liposomen-Agglomeration verursacht, indem kleine Liposomen innerhalb des Bereichs ihres Ladungsabstoßungsdurchmesser gebracht werden, so dass von der-Waals Kräfte eine Anziehung bewirken können. Unsere Experimente zeigen ebenfalls, dass eine bestimmte Menge an Paclitaxel und Cephalomannin, die in der Bilayer der Liposome eingeschlossen war, auf die GEC-Säule während der Größenfraktionierung übertragen werden kann.
Eine HPLC-Analyse von Paclitaxel und Cephalomannin für eluierte Lösungen von LIP-154 aus der GEC-Säule wurde durchgeführt. Diese Daten werden graphisch in Fig. 10 dargestellt, wobei die Konzentration von Paclitaxel mit einem offenen Kreis dargestellt ist und die Konzentration von Cephalomannin mit einem geschlossenen bzw. ausgefüllten Kreis dargestellt ist. Es ist offensichtlich, dass eingefangenes Paclitaxel überwiegend mit Liposomen im Größenbereich von ungefähr 150-290 oder 160-270 eluiert wurde. Der eluierte Peak bei 18 ml weist tatsächlich identische Konzentrationen von Paclitaxel und Cephalomannin auf, nämlich um 3 mg/ml herum. Sowohl Paclitaxel als auch Cephalomannin-Konzentrationen nahmen scharf zu und gipfelten um 33 mg/ml bei 35 ml. Die Daten, die die Liposomen-Größe und Intensitäts-Verteilung aus der GEC-Säule repräsentieren, sind im Balkendiagramm dargestellt, das in Fig. 9 ausgebildet ist. Daten, die die Größe (in nm) repräsentieren, sind mit einem Balken mit Punkten dargestellt, Daten, die die Intensität repräsentieren (· 10&sup4; Zähler pro Sekunde) sind durch einen quer gestreiften Balken dargestellt. Diese Konzentration entspricht ebenfalls dem höchsten Intensitätsniveau der Teilchen, die in Fig. 9 dargestellt sind.
Fig. 11 und Fig. 12 zeigen die analytischen Ergebnisse der GEC-Fraktionierung von LIP-166, das durch ein Beschallungsverfahren (siehe Tabelle 19) hergestellt wurde. Fig. 11 stellt in Form eines Balkendiagramms die Intensität und Größe der durch Beschallung hergestellten Liposomen dar. Die Größe wird durch ein Diagramm mit Punkten und die Intensität (· 10&sup4; Zähler/Sekunde) wird durch quer gestreifte Balken repräsentiert, wobei eine große Menge der Liposomen aus der GEC-Säule bei 20-40 ml eluierte und Lösungen unter diesen Peaks waren ebenfalls trübe bzw. unklar. Eingefangenes Paclitaxel und Cephalomannin wurden mit Liposomen von ungefähr 180 nm aus der GEC-Säule eluiert. Diese Ergebnisse sind in Fig. 12 dargestellt. Die Paclitaxel-repräsentierenden Daten werden durch eine offene Raute dargestellt und die Daten, die Cephalomannin repräsentieren, werden durch eine geschlossene Raute dargestellt. Diese Ergebnisse sind mit Ergebnissen konsistent, die bei LIP-154 gewonnen wurden, das durch das Injektionsverfahren hergestellt wurde. Jedoch war bei LIP-166 die Menge von Paclitaxel und Cephalomannin, die in den Liposomen enthalten war, viel geringer, und zwar ungefähr zehnmal, als diejenige vom Injektionsverfahren. Die Mehrzahl der Teilchen (86%) in LEP-166, gebildet durch Beschallung, sind im 38 nm Bereich und es wäre nicht anzunehmen, dass diese einen hohen Paclitaxel-Gehalt aufweisen, weil Liposomen mit kleiner Größe Paclitaxel nicht so effektiv wie größere Liposomen einfangen.
Tabelle 20 präsentiert die Ergebnisse zweier zusätzlicher Experimente, nämlich LIP-175 und LIP-176, bei denen Paclitaxel in kritische Fluid-Liposomen eingekapselt war. Bei diesen zwei Experimenten wurde Cholesterin und Eidotter-PC in einem 1 : 2-Gewichtsverhältnis vermischt. Die Teildekompressionstechnik wurde während des Druckabbauverfahrens angewendet. Ethylen und Propan wurden als kritisches Fluid für LIP-175 bzw. LIP-176 verwendet. Tabelle 20
Eine gleichförmige Größenverteilung der Liposomen aus dem ersten Stadium der Teildekompresson wurde wiederum in beiden Experimenten erzielt. Jedoch ist die Paclitaxel- Konzentration in dieser Liposomen-Population relativ gering. In unserer Größenausschluss- Chromatographie-Studie für LIP-154 (Fig. 9 und 10) wurde gezeigt, dass Paclitaxel größtenteils mit Liposomen im Größenbereich von 160-270 nm eluierte. Dies legt nahe, dass eine optimale Größe der Liposomen zur Einkapselung von Paclitaxel und Cephalomannin im Bereich von 150-290 nm liegen kann. Im zweiten Bereich der Dekompression sind die Teilchen in zwei größeren Populationsgrößen in sowohl LIP-175 als auch LIP-176 verteilt. Dies kann auf die schnelle Volumenexpansion des kritischen Fluids unterhalb seines kritischen Druckes zurückzuführen sein, die beträchtlich größer als die im ersten Dekompressionsstadium ist. Lipsomen, die im Hochdruckkreislauf vor der Dekompression gebildet wurden, machen eine schnelle Spaltung und Fusionsverfahren durch und vesikulieren zu größeren Liposomen.

Beispiel 11

Charakterisierungen von in Liposomen eingekapseltem Camptothecin

Die Proben von liposomal eingekapseltem Camptothecin, hergestellt durch Dekompression gemäß Beispiel 1, wurden bei 2000 UpM für ungefähr 30 Minuten zentrifugiert. Die Teilchengrößen-Verteilung wurde auf dem Coulter N4MD Submicron Particle Analyzer gemessen. Die HPLC-Analyse wurde vor und nach der Zentrifugation durchgeführt, wie im Abschnitt "analytische Verfahren" beschrieben ist. Fig. 13 repräsentiert ein typisches HPLC- Chromatogramm von liposomal eingekapseltem Camptothecin. Dieselbe Analyse wurde ebenfalls für Liposomen durchgeführt, die Camptothecin enthalten, das durch Beschallung hergestellt wurde, wobei dieselbe Formulierung von Ei-PC mit Cholesterin in der wässrigen Lösung dispergiert wurde. Die Lösung wurde mit einer Branson Sonifier Probe (Model 450, Branson Ultrasonics Corp. Danbury, CT) 30 Minuten lang in einem Eisbad beschallt.
Die Ergebnisse in Tabelle 21 legen nahe, dass die Dekompressionsverfahren Camptothecin effektiver als die Beschallung einkapselten. Bei der Beschallung wird der größte Teil des Camptothecins aus der wässrigen Lösung nach Zentrifugation abgeschieden. Tabelle 21
Tabelle 22 legt nahe, dass die Größe der durch die Kompressionsverfahren erzeugten Liposomen im Allgemeinen größer als diejenige ist, die durch das Beschallungsverfahren erzeugt wurde. Tabelle 22

Beispiel 12

Stabilitätsvergleich von Liposomen, in die Taxol unter Verwendung von Injektions- oder Dekompressionsverfahren und Beschallung eingekapselt wird

Die In-vitro-Stabilität von Liposomen hängt im Allgemeinen von mehreren Parametern ab, wie beispielsweise der Phospholipid-Zusammensetzung und Reinheit, der Sauerstoff- Empfindlichkeit, der Kompatibilität zwischen eingekapselten Arzneistoffen und Liposomen und den Bedingungen des wässrigen Mediums. Viele verschiedene Veränderungen können in den Liposomen über die Zeit hinweg stattfinden. Die Phospholipide können einen chemischen Abbau, wie beispielsweise Oxidation und Hydrolyse durchmachen. Liposomen, die in einer wässrigen Suspension gehalten werden, können aggregieren, fusionieren bzw. verschmelzen oder ihren Inhalt verlieren.
Zwei Proben (jeweils 10 ml) aus Experimenten, nämlich LIP-237 und LIP-247, wurden gesammelt und jeweils bei 4ºC und 22ºC (Raumtemperatur) aufbewahrt. Beide Experimente verwendeten identische Betriebsbedingungen (P = 20100 kPa (3.000 psi) und T = 50ºC) und dieselben Phospholipid-Materialien (Soja-PC und -CH). Jedoch wurde im LIP-237-Durchlauf ein Paclitaxel-Gemisch (20% Reinheit) verwendet, und bei LIP-247 wurde reines Paclitaxel mit > 99%iger Reinheit verwendet. Der anfängliche Paclitaxel-Gehalt in LIP-23 7 und LIP- 247 betrug 40 und 133 ppm, gemessen jeweils durch HPLC. Die HPLC-Analyse wurde periodisch für LIP-237 und LIP-247 bei zwei unterschiedlichen Lagerungsbedingungen durchgeführt. Keine speziellen Vorkehrungen wie beispielsweise Herstellung von kritischen Fluid-Liposomen unter einer Inertgas-Decke, Verwendung von Antioxidantien oder aseptische Verarbeitungs- und Sammelverfahren wurden in diesen Experimenten verwendet.
Tabelle 23 vergleicht die Stabilität der Größenverteilungsanalyse von LIP-237 und LIP-247, die durch die kritische Fluid-Injektionstechnik hergestellt wurden, mit LIP-166, hergestellt durch das herkömmliche Besehallungsverfahren (alle bei 4ºC aufbewahrt) als eine Funktion der Zeit. Die Daten legen nahe, dass durch Injektionsverfahren gebildete Liposomen eine höhere physikalische Stabilität als diejenigen zeigen, die durch Beschallung gebildet wurden. Liposomen, die durch Beschallung hergestellt wurden, nämlich LIP-166, wiesen eine große Menge kleiner Teilchen auf, nämlich 77% bei 38 nm und diese Liposomen schienen zu fusionieren und zusammen zu aggregieren, so dass sie in nur 10 Tagen relativ große Teilchen bildeten. Liposomen, die durch das Injektionsy erfahren (LIP-247) hergestellt wurden, behielten ihre initiale Größe sogar nach 40 Tagen. Liposomen, die durch das Injekfionsverfahren LIP-237 gebildet wurden, zeigen nach 35 Tagen Anzeichen einer Aggregation; die Mehrzahl dieser Liposome verdoppelte ihre Größe nach 60 Tagen. Das relativ unreine Taxoid-Gemisch, das in diesem Durchlauf verwendet wurde, mag diese frühe Aggregation verursacht haben. Bei Raumtemperatur-Lagerbedingungen zeigten alle liposomalen Paclitaxel-Beispiele verschiedene Grade der Zerstörung. Tabelle 23
Die Fig. 14 und 15 veranschaulichen die Paclitaxel-Konzentrationsprofile für LEP-237 und LIP-247, jeweils als eine Funktion von Zeit und Temperatur. Die Fig. 14a und 15a beschreiben Proben, die bei 4ºC aufbewahrt wurden, und die Fig. 14b und 15b beschreiben Proben, die bei Raumtemperatur aufbewahrt wurden.
Die Ergebnisse legen nähe, dass bei Lagerbedingungen von 4ºC Paclitaxel in der Liposomen- Suspension für über 2 Monate stabil bleiben kann. Bei Lagerbedingungen bei Raumtemperatur begann die Zerstörung bzw. Verschlechterung nach zwei Tagen. Diese Ergebnisse demonstrieren, dass Injektions-Liposomen-Bildungsverfahren physikalisch und chemisch stabile Paclitaxelformulierungen auf Wasserbasis erzeugen können. Derartige Liposomen weisen vorzugsweise eine Größenverteilung von 150-250 nm und besonders bevorzugt, 200-225 nm auf.

Beispiel 13

Cytotoxizitäts-Studien von in Liposom eingekapseltem Taxol

A. Toxizität von Liposomen, in die Taxol eingekapselt ist, gegen Colonkarzinom- Zelllinien

Eine unabhängige Studie der Cytotoxizität von Liposomen, die Paclitaxel einkapseln, und die durch Dekompressionsverfahren hergestellt wurden, wurde durchgeführt. Proben von LIP-175 und LEP-176, die alle durch die kritische Fluid-Dekompressionstechnik hergestellt wurden, wurden gegen die menschliche Colonkarzinom-Zelllinie HCT 116 getestet. Eine Probe von LIP-170, die kein Paclitaxel oder Cephalomannin enthielt, wurde ebenfalls gegen dieselbe Zelllinien als Kontrolle getestet.
In den Cytotoxizitäts-Studien wurde eine Verdünnung von 5 Größenordnungen des liposomal eingekapselten Paclitaxels angewendet. Nach Aussaat auf Platten für 4 Stunden wurden die Zellen mit Liposomen, die Paclitaxel eingekapselt aufwiesen, und mit Paclitaxel als Kontrolle in 0,5% DMSO-Puffer behandelt. Die Liposomen wurden auf den Zellen 3 Tage belassen und nach dieser Zeit wurden die Platten erneut gespeist und MTT wurde zugesetzt. Die Reduktion des MTT zu einem lilafarbenen Formazan-Produkt stimmt in linearer Weise mit der Anzahl lebender Zellen in den Well- bzw. Bohrungs- bzw. Vertiefungs-Platten überein. Deswegen kann durch Messen der Extinktion dieses Reduktionsproduktes der Prozentsatz des Zellüberlebens bei einer vorgegebenen Dosis von Paclitaxel quantifiziert werden.
Die Ergebnisse dieser Studien wurden mit Prozent Zellüberleben als Funktion der Paclitaxel- Konzentration des Paclitaxels in den Liposomen geplottet. Die Ergebnisse von Liposomen, die gemäß der vorliegenden Verfahren gebildet wurden, und zwar ohne Paclitaxel, sind in Fig. 16 dargestellt. Die Ergebnisse mit Paclitaxel, jedoch ohne Liposomen, sind in Fig. 17 dargestellt. Die Ergebnisse von Liposomen mit Paclitaxel sind in Fig. 18 dargestellt. Die Daten legen nahe, dass Liposomen, die Paclitaxel enthalten, eine ähnliche Arzneistoffaktivität bzw. -wirksamkeit im Vergleich mit derjenigen von Paclitaxel ohne Liposomen aufweisen.

B. Toxizitätsauswertung von LEP gegen Brustkarzinom-Zelllinien

Die Effektivität von liposomalem Paclitaxel zur Hemmung des Wachstums von drei Brustkarzinom-Zelllinien in Gewebskultur wurde bestimmt. Drei (3) Brustkrebs-Zelllinien, nämlich MCF-3, BT-20 und MDA-MB-231 wurden getestet.
Die Zelllinien wurden in Gewebskulturkolben gezüchtet. Eine bekannte Anzahl von Zellen wurde in 24 Well Gewebskulturplatten ausplattiert und über Nacht in einem Gewebskultur- Inkubator bei 37ºC mit 5% CO&sub2; wachsen gelassen. Die Zellen wurden dann mit 1,0 ug/ml Konzentration von liposomalem Paclitaxel, 1,0 ug/ml Cremophor-Paclitaxel und leeren Liposomen (empty liposomes = EL), verdünnt in Zellkulturmedien, behandelt. Eine Kontrollgruppe der Zellen wurde unbehandelt gelassen. Zellkulturmedien wurden am dritten Tag folgend der Behandlung ergänzt. Die Behandlung wurde für sieben (7) Tage fortgesetzt.
Die Zellen in jeder Well wurden unter Verwendung von Trypan-Blau gezählt. Die Zelllebensfähigkeit und die Zellwachstumshemmung wurden aus der Anzahl toter gegenüber lebenden Zellen und aus der Gesamtzahl von Zellen, die pro Well gewachsen waren, berechnet. Der Prozentsatz des spezifischen Abtötens für liposomales Paclitaxel und Cremophor-Paclitaxel (CP) gegen solche Brustkrebs-Zelllinien wurde auf Grundlage des Prozentsatzes berechnet, der durch liposomales Paclitaxel und Cremophor-Paclitaxel abgetötet wurde, unter Abzug der Daten aus den entsprechenden leeren Liposom-Daten. Die Ergebnisse sind in Form eines Balkendiagramms in Fig. 19 dargestellt. Die Daten, die liposomales Paclitaxel repräsentieren, sind mit einem soliden Balken dargestellt. Die Daten, die Cremophor-Paclitaxel repräsentieren, sind mit einem schattierten Balken dargestellt. Die Daten legen nahe, dass bei 1,0 ug/ml liposomales Paclitaxel eine viel größere spezifische invitro-Wirkung als Cremophor-Paclitaxel aufwies.

Beispiel 14

In-Vivo-Studien von liposomal eingekapseltem Paclitaxel (LEP)

Das Ziel dieser Studie war die Wachstumshemmung von Brustkarzinom-Xenotransplantaten in nackten Mäusen durch intraperitoneale (i. p.) Verabreichung von liposomal eingekapseltem Paclitaxel (LEP) zu bestimmen. Die Brustkrebs-Zelllinie MDX-MB-231 wurde auf Grundlage der Ergebnisse von in-vitro-Studien ausgewählt, die in Beispiel 13 dargestellt sind. Liposomales Paclitaxel aus Experiment LIP-247 wurde in dieser in-vivo-Studie verwendet.
Brustkarzinom-Xenotransplantate wurden in nackten Mäusen zum Wachstum gebracht. Die Mäuse wurden zufallsbedingt in vier Gruppen aufgeteilt. Jede Gruppe bestand aus fünf (5) Mäusen. Die Tumorgröße wurde durch eine Schublehre gemessen und in Volumen (mm³) ausgedrückt. Die Behandlung begann, wenn der Tumor eine messbare Größe erreichte, nämlich ungefähr bei 100 mm³. Liposomales Paclitaxel und Cremophor-Paclitaxel wurden in einer Konzentration von 0,295 mg Paclitaxel in 0,5 ml gegeben und eine äquivalente Menge an leeren Liposomen wurde für die Kontrollgruppe via Injektion i. p. an zwei (2) Tagesintervallen für insgesamt fünf (5) Injektionen verabreicht. Mittleres Volumen ± Standardfehler des Mittelwerts (Standard error of the mean = SEM) wurden zu jedem Zeitpunkt aufgezeichnet, wenn Messungen vorgenommen wurden. Alle Mäuse wurden 4 Wochen nach der ersten Injektion getötet.
Die Xenotransplantate der nackten Mäuse mit Brustkarzinom-Zelllinien, MDX-MB-231 wurden nach Behandlung mit LEP, liposomalem Paclitaxel, Cremophor-Paclitaxel und leerem Liposom (als Kontrolle) und Cremophor (als Kontrolle) evaluiert. Die Ergebnisse, Tumorvolumen gegen Wochen der Behandlung, sind graphisch in Fig. 20 dargestellt. Die Ergebnisse aus Mäusen, die Liposomal-Paclitaxel erhielten, wurden mit einem eingeschlossenen Rechteck geplottet; die Ergebnisse von Mäusen, die Cremophor-Paclitaxel empfingen, wurden mit einem eingeschlossenen Dreieck geplottet; die Ergebnisse von Mäusen, die leere Liposomen empfingen, wurden mit geschlossenen Kreisen geplottet; und die Ergebnisse von Mäusen, die Cremophor alleine erhielten, wurden mit offenen Kreisen geplottet. Nach 5 Dosen von liposomalem Paclitaxel, Cremophor-Paclitaxel und leeren Liposomen zeigten Mäuse, die liposomales Paclitaxel empfingen, eine bessere Anti-Tumor- Wirkung als bei Cremophor-Paclitaxel
Die Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung ermöglichen die Wiedergewinnung von Ausgangsmaterialen, Lipiden und Lösungsmittel, die nicht in das endgültige Liposomen- Produkt eingebaut werden. Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung umfassen einen effizienten Arzneistoff-Einschluss und eine Wiedergewinnung von nicht-eingekapselten Arzneistoffen. Die Betriebsparameter der Vorrichtung und Verfahren sind mit anderen industriell anwendbaren Verfahren konsistent. Das Verfahren und die Vorrichtung können kontinuierlich betrieben werden.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von Liposomen, das Folgendes umfasst:

a) Ausbildung einer Lösung oder eines Gemisches aus einem Phospholipid, einem oder mehreren hydrophoben Arzneistoffen und einer wässrigen Phase, in einem kritischen, superkritischen oder nahezu kritischen Fluid, wobei der Arzneistoff aus der Gruppe von hydrophoben Arzneistoffen ausgewählt ist, die Taxoide, einschließlich Cephalomannin, Camptothecine, Doxorubicin, Michellamin B, Vincristin, Bryostatin- 1, Haioman und Cisplatin umfasst;

b) Reduzieren des Druckes der Lösung oder des Gemisches, um das kritische, superkritische oder nahezu kritische Fluid von dem Phospholipid und der wässrigen Phase abzutrennen, wobei das Phospholipid und die wässrige Phase ein oder mehrere Liposomen bilden, die den Arzneistoff enthalten.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das kritische, superkritische oder nahezu kritische Fluid aus der Gruppe von Zusammensetzungen ausgewählt ist, die zur Bildung einer kritischen Fluids geeignet ist, und die Kohlendioxid, Distickstoffoxid, Halogen- Kohlenwasserstoffe, Propan, Ethylen und Ethan umfasst.

3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Gemisch oder die Lösung dekomprimiert wird, wenn das Gemisch oder die Lösung aus einer Düse austritt.

4. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Düse ein oder mehrere Öffnungen aufweist, wobei die Öffnung einen Durchmesser im Bereich von 0,06 mm bis 0,5 mm aufweist.

5. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das kritische, superkritische oder nahezu kritische Fluid Schleppmittel umfasst.

6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei die Schleppmittel aus der Gruppe von Zusammensetzungen ausgewählt sind, die aus Methanol, Ethanol und Aceton besteht.

7. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Phospholipide Phosphatidylcholin, Phosphatidylemanolamin, Phosphatidylserin und Sphingomyelin sind.

8. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Phospholipide synthetische Phospholipide sind, die aus Dimyristoyl-phosphatidylcholin, Dipalmitorylphosphatidylcholin, Distearoylphosphatidylcholin, Distearoylphosphatidyl-glycerol, Dipalmitorylphosphatidylglycerol, Dimyristoyl-phosphatidylserin, Distearoyiphosphatidylserin und Dipalmitorylphosphatidylserin bestehen.

9. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Phospholipide kleine Mengen an Cholesterin enthalten.

10. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Liposom in seiner Lipid-Doppelschicht einen hydrophoben Arzneistoff eingebaut hat.

11. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Taxoid Paclitaxel ist.

12. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Camptothecine ein Camptothecin sind.

13. Verfahren zur Herstellung von Liposomen, das Folgendes umfasst:

a) Ausbilden einer Lösung oder eines Gemisches aus einem Phospholipid, einem Arzneistoff und einem kritischen, superkritischen oder nahezu kritischen Fluid, wobei der Arzneistoff aus der Gruppe von hydrophoben Arzneistoffen ausgewählt ist, die Taxoide, einschließlich Cephalomannin, Camptothecine, Doxorubicin, Michellamin B, Vincristin, Bryostatin 1, Haioman und Cisplatin umfasst;

b) Injizieren der Lösung oder des Gemisches in eine wässrige Phase zur Bildung einer oder mehrerer Liposomen;

c) Dekomprimieren der Lösung oder des Gemisches, wenn die Lösung oder das Gemisch injiziert wird.

14. Verfahren nach Anspruch 13, wobei die Lösung oder das Gemisch in die wässrige Phase durch eine Düse injiziert wird.

15. Verfahren nach Anspruch 14, wobei die Düse zumindest eine Öffnung mit einem Durchmesser im Bereich von 0,06 mm bis 0,5 mm aufweist.

16. Verfähren nach Anspruch 13, wobei das kritische, superkritische oder nahezu kritische Fluid aus der Gruppe von Zusammensetzungen ausgewählt ist, die zur Bildung von kritischen Fluids in der Lage sind und die Kohlendioxid, Distickstoffoxid, Halogen- Kohlenwasserstoffe, Propan, Ethylen und Ethan umfasst.

17. Verfahren nach Anspruch 13, wobei das kritische, superkritische oder nahezu kritische Fluid weiterhin Schleppmittel umfasst.

18. Verfähren nach Anspruch 17, bei dem das Schleppmittel aus den Zusammensetzungen ausgewählt ist, die aus Methanol, Ethanol und Aceton bestehen.

19. Verfahren nach Anspruch 13, bei dem die Phospholipide Phosphatidylcholin, Phosphatidylethanolamin, Phosphatidylserin und Sphingomyelin sind.

20. Verfahren nach Anspruch 13, wobei die Phospholipide synthetische Phospholipide sind, die einschließen, jedoch nicht beschränkt sind auf: Dimyristoyiphosphatidylcholin, Dipalmitoryl-phosphatidylcholin, Distearoylphosphatidylcholin, Distearoylphosphatidylglycerol, Dipalmitorylphosphatidylglycerol, Dimyristoylphosphatidylserin, Distearoylphosphatidylserinund Dipalmitoryl-phosphatidylserin.

21. Verfahren nach Anspruch 13, wobei die Phospholipide Cholesterin enthalten.

22. Verfahren nach Anspruch 13, wobei das Liposom einen hydrophoben Arzneistoff in dessen Lipid-Doppelschicht eingebaut aufweist.

23. Verfahren nach Anspruch 13, wobei das Taxoid Paclitaxel ist.

24. Verfahren nach Anspruch 13, wobei die Camptothecine Camptothecin sind.

25. Verfahren zur Herstellung von Liposomen, das Folgendes umfasst:

a) Ausbilden eines Gemisches eines multilamellaren Liposoms und eines kritischen, superkritischen oder nahezu kritischen Fluids, wobei das Liposom mit einer mehrfachen Doppelschicht einen hydrophoben Arzneistoff aufweist, und wobei der Arzneistoff aus der Gruppe ausgewählt ist, die Taxoide, einschließlich Cephalomannin, Camptothecine, Doxorubicin, Michellamin B, Vincristin, Bryostatin- 1, Haloman und Cisplatin umfasst;

b) Reduzieren des Druckes des Gemisches, um das kritische, superkritische oder nahezu kritische Fluid aus dem Gemisch abzutrennen, um Liposome einer gleichförmigen Größe zu bilden, die den Arzneistoff enthalten.

26. Als Herstellungsprodukt, eine Vielzahl von Liposomen, die einen hydrophoben Arzneistoff mit einer Größenverteilung von 50 bis 350 nm aufweisen und durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 13 oder 25 hergestellt sind.

27. Herstellungsprodukt nach Anspruch 26, wobei die Liposomen eine Größenverteilung von 100 bis 300 nm aufweisen.

28. Herstellungsprodukt nach Anspruch 26, wobei die Liposomen eine Größenverteilung von 150 bis 250 nm aufweisen.