DE4328331A1

DE4328331A1 - Kontinuierliches Hochdruckextrusionsverfahren zur Herstellung von Liposomen und Emulsionen

Info

Publication number: DE4328331A1
Application number: DE19934328331
Authority: DE
Inventors: Andreas Dr Sachse; Thomas Schneider; Georg Dr Roesling
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1993-08-18
Filing date: 1993-08-18
Publication date: 1995-02-23

Description

Erfindungsgegenstand:

Die Erfindung betrifft ein kontinuierliches Verfahren zur Herstellung von Liposomen oder Emulsionen durch Hochdruckextrusion entsprechender Vordispersionen über geeignete Filter.

Stand der Technik:

Vor allem in der pharmazeutischen Industrie besteht ein großes Interesse an Methoden und Geräten zur Herstellung disperser Systeme. Dies gilt vor allem deshalb weil man bei der Suche nach neuen Möglichkeiten des Arzneistofftransports zu sogenannten Arzneistoffträgersystemen (drug-delivery systems) gelangte, die den dispersen Systemen (z. B. fest/flüssig oder flüssig/flüssig) zugehörig sind. Hierunter zu nennen sind z. B. Emulsionen (flüssig/flüssig) für die parenterale Ernährung oder Darreichung schlecht wasserlöslicher Arzneistoffe sowie Liposomensuspensionen, welche als zielgerichtete Arzneistoffträger Verwendung finden können und daher besonderes Interesse erlangten.

Aufgrund der hydrophoben Wechselwirkungen entstehen nach Dispersion von Phospholipiden in Wasser spontan geschlossene Lipidvesikel, welche Liposomen genannt werden. Bei diesen handelt es sich um sphärische oder elliptische Hohlkörper mit einer oder mehreren Lipiddoppelschichten ("bilayer"), welche eine wäßrige Phase einschließen. Gemäß ihrer Größe unterscheidet man hierbei kleine, unilamellare (small unilamellar vesicles [SUV] mit Radien von 25 bis 50 nm) und große, unilamellare Vesikel (large unilamellar vesicles [LUV] mit Radien größer 50 nm bis zu 10 µm) [1]. Ferner unterscheidet man multilamellare Liposomen (multilamellar vesicles [MLV]), bei denen mehrere konzentrisch angeordnete bilayer vorliegen sowie multivesikuläre Liposomen (multivesicular vesicles [MVV]), welche in ihrem Lumen wiederum vesikuläre Strukturen aufweisen.

Neben ungeladenen Phospholipiden wie beispielsweise Phosphatidylcholin (PC) und Phosphatidylethanolamin (PE) oder geladenen wie Phosphatidylserin (PS) und Phosphatidylglycerol (PG), kann die Liposomenmembran beispielsweise auch Cholesterol (CH) und andere Ladungsträger wie Dicetylphosphat (DCP), Cholesterolhemisuccinat (CHHMS) oder Stearinsäure (SS) enthalten.

Die Liposomen eignen sich sowohl zum Einschluß hydrophiler als auch lipophiler Arzneistoffe, wobei Umfang und Ort des Einschlusses von den physikochemischen Eigenschaften des Arzneistoffs und der Lipidzusammensetzung der Liposomen abhängig ist.

Alle Verfahren zur Herstellung von Liposomen beinhalten als wichtigsten Schritt die Dispersion des Lipids bzw. Lipidgemisches in einer wäßrigen Phase. Ausgehend hiervon, kann man sämtliche Herstellungsverfahren gemäß der drei Hauptdispersionsprinzipien einteilen. Hierbei unterscheidet man mechanische Dispersion (mechanical dispersion), Zwei-Phasen Dispersion (two-phase dispersion) und Detergenz-Solubilisation (detergent solubilization) [2].

Die Vor- und Nachteile der beiden letztgenannten Dispersionsprinzipien sind an anderer Stelle ausführlich diskutiert [1, 2, 3, 4]. Bei den Methoden, die eine Zwei- Phasen Dispersion beinhalten, sind vor allem die begrenzte Löslichkeit einiger Lipide in organischen Lösungsmitteln sowie der hohe Aufwand bei der Entfernung der verwendeten Lösungsmittel (z. B. Chloroform, Methanol, Dieethylether), zur Absenkung der Restlösemittelkonzentration auf tolerierbare Konzentrationen (Toxizität), nachteilig. Die Detergenz-Solubilisationsmethoden weisen den Nachteil des nur schwierig aus der Präparation zu entfernenden Restdetergenzgehalts auf.

Bei den sogenannten mechanischen Dispersionsverfahren wird demgegenüber auf die Verwendung organischer Lösungsmittel oder Detergenzien während der Dispersion des Lipids in der Wasserphase verzichtet. In der Regel wird hierbei zunächst ein Lipidfilm durch Rotationsverdampfung einer organischen Lösung (z. B. Chloroform Methanol, Diethylether) des Lipids bzw. Lipidgemischs gebildet. Zur vollständigen Entfernung des Restlösemittels erfolgt danach oftmals eine 12-24stündige Lyophilisation bei hohem Vakuum. Durch anschließende Zugabe einer wäßrigen Phase und bloßes Schütteln (sog. hand-shaken method nach Bangham [5]) erhält man eine MLV-Suspension. Diese Zubereitung ist hinsichtlich der Liposomengröße und Lamellarität äußerst heterogen und die erzielbaren Einschlüsse für hydrophile Arzneistoffe liegen i.d.R. unter 10%. Lipophile Arzneistoffe, welche in den Lipidbilayer eingebaut werden, können mit dieser Methode demgegenüber quantitativ eingeschlossen werden, solange ein kritisches Arzneistoff/Lipidverhältnis nicht überschritten wird [2].

Zur Weiterverarbeitung entsprechender MLV-Suspension existieren mehrere mechanische Verfahren, die nachstehend näher beschrieben werden. Hierbei kann man i.d.R. zwischen Verfahren bei denen SUV oder LUV erhalten werden unterscheiden.

Die älteste und am weitesten verbreitete Methode zur Herstellung von SUV ist die sogenannte sonication method (Ultrabeschallungsmethode). Hierbei werden MLV durch Ultrabeschallung (Ultraschallstab oder Ultraschallbad) zerkleinert. Die so erhaltenen Liposomen weisen mittlere Durchmesser zwischen 20 und 60 nm auf und die Einschlußkapazität (encapsulation efficiency) liegt unter 1% [6]. Die Nachteile der Ultrabeschallung liegen vor allem in der hohen Wärmezufuhr, die zu einer Zersetzung des Lipids bzw. des Arzneistoffs führen kann sowie in der Schwierigkeit auch größere Probenmengen reproduzierbar zu verarbeiten. Bei der Verwendung des Ultraschallstabs besteht darüberhinaus der Nachteil der Verunreinigung der Probe mit Titansplittern sowie der Bildung eines Aerosols [1, 2].

Eine weitere Methode zur Herstellung von kleinen uni- oder oligolamellaren Liposomen ist die french press method, deren Name auf die dabei verwendete Hochdruckapparatur (french press) zurückgeht. Diese Anlage besteht aus einer elektrischen, hydraulischen Presse und einer Hochdruckzelle, die je nach Ausführung ein maximales Fassungsvolumen von 4 oder 40 ml aufweist [2]. Bei diesem diskontinuierlichen Verfahren wird über einen Kolben ein hoher Druck auf das in der Druckkammer befindliche Gemisch ausgeübt und dieses über eine verstellbare Öffnung aus der Kammer gepreßt. In Abhängigkeit von den verwendeten Drücken (i.d.R. bis zu 140 MPa), lassen sich so nach mehrmaliger Scherung in der Druckzelle Liposomen mit Durchmessern zwischen 30 und 80 nm herstellen. Nachteilig an dieser Methode ist neben dem begrenzten Volumen der zu verarbeitenden Dispersionen (< 50 ml) vor allem die Tatsache, daß die fertigen Liposomensuspensionen in der Regel mit Abriebrückständen der Druckkammer (Dichtungen etc.) oder einem Anteil nicht zerkleinerter MLV (10-15%) kontaminiert sind. Darüberhinaus ist es schwierig den Temperaturanstieg in der Kammer zu kontrollieren, so daß zwischen den einzelnen Durchgängen die Apparatur erst abgekühlt werden muß [1].

In jüngerer Zeit fanden auch sogenannte Hochdruckhomogenisatoren Eingang in die Liposomentechnologie. So wurde die Herstellung von SUV mit einem Kleinstmengenringspalthomogenisator (Micron-LAB 40, Fa. APV Gaulin, Lübeck) aus MLV- oder Lipiddispersionen (ohne vorherige Filmbildung) beschrieben [7]. Dieses Gerät arbeitet nach dem Prinzip der Hochdruckentspannung in einer Ringspalteinheit und ist auch zur Herstellung von Emulsionen geeignet. Hierbei wird ein zu behandelndes Flüssigkeitsvolumen (< 40 ml) in den Zylinderraum der Anlage gegeben, die Bauteile hydraulisch gespannt und der gewünschte Homogenisierdruck (10 - 160 MPa) eingestellt. Durch anschließendes Starten eines Arbeitshubs wird die Flüssigkeit durch ein Präzisions-Homogenisierventil gedrückt und in einem Produktbehälter gesammelt [8].

Bei diesem Verfahren ist die Größe der erhaltenen Emulsionströpfchen oder Liposomen eine Funktion der eingesetzten Stoffkonzentration bzw. -art, Temperatur, Passagenanzahl, Spaltgeometrie und des Homogenisierdrucks.

Dieses Verfahren erlaubt die reproduzierbare Herstellung kleiner Mengen homogener SUV-Dispersionen mit sehr kleinen mittleren Durchmessern (< 50 nm).

Nachteilig bei diesem Verfahren ist vor allem das Auftreten von Geräteabrieb (Ringspalt etc.) sowie die schwierige Kontrolle der Produkttemperatur [7]. Bereits die entsprechenden Geräte für Laboranwendungen sind extrem schwer (Micron-LAB 40 = ca. 330 kg Bruttogewicht) und Geräte mit größeren Arbeitsvolumen und damit Durchsatzleistungen (l/h) sind darüberhinaus nur bei niedrigeren Arbeitsdrücken einsetzbar.

Neben den vorher beschriebenen Verfahren zur Herstellung von SUV gibt es auch mehre mechanische Verfahren zur Herstellung von LUV, die ebenfalls unter Verwendung von Vordispersionen (Liposomen oder Lipid) arbeiten.

Das älteste zu dieser Kategorie gehörende Verfahren ist die die sogenannte extrusion method. Bei diesem Verfahren wird eine MLV-Dispersion von Hand sequentiell über Filterhalter (Durchmesser 25 mm) mit Polycarbonatfiltern (Porenmembran) absteigender Porengröße (3.0,1.0, 0.8, 0.6, 0.4 und 0.2 µm) bei Drücken bis zu 0,35 MPa filtriert [9]. Die so hergestellten Liposomen wiesen mittlere Durchmesser zwischen 170 und 370 nm sowie Einschlußkapazitäten bis zu 23% auf. Eine Variation der Methode stellt die Extrusion von mittels der REV-Methode hergestellten Liposomen dar [10]. In Abhängigkeit von der Porengröße des verwendeten Endfilters (0.2, 0.1 oder 0.08 µm) ließen sich so bei Drücken von bis zu 0,7 MPa hauptsächlich unilamellare Liposomen mit Durchmessern zwischen 0,1 und 0,2 µm und Einschlußkapazitäten zwischen 12 und 25% herstellen.

Eine Weiterentwicklung dieser Extrusionsmethoden stellt die sogenannte LUVET- Methode (Large unilamellar vesicles by extrusion) dar [11, 12]. Bei diesem diskontinuierlichen Verfahren wird eine grobe Lipid- oder Liposomendispersion bei Drücken unterhalb 3,5 MPa mehrfach über zwei übereinandergelegte Polycarbonatfilter mit Porengrößen kleiner/gleich 100 nm extrudiert. Hierbei erhält man unilamellare Liposomen mit Durchmessern zwischen 60 und 100 nm und Einschlußvolumina zwischen 1 und 3 l wäßrige Phase/mol Lipid. Bei Verwendung hoher Lipidkonzentrationen (ca. 300 µmol/ml) lassen sich Einschlußkapazitäten von bis zu 30% erzielen. Wird unterhalb einer Lipidkonzentration von ca. 200 µmol/ml die Liposomensuspensionen zusätzlich einigen freeze-thaw Zyklen (Einfrieren der Suspension und anschließendes Auftauen) unterzogen, so läßt sich eine Steigerung der Einschlußeffizienz feststellen [11].

In späteren Untersuchungen konnte gezeigt werden, daß in Abhängigkeit von der Porengröße der verwendeten Filter (0,03-0,4 µm) Liposomen unterschiedlicher Größen und Lamellaritäten hergestellt werden können [13]. Bei Verwendung von Drücken von bis zu 5,5 MPa konnten sehr hohe Lipidkonzentrationen (400 mg/ml) verarbeitet werden. Ein kombiniertes freeze-thaw (5×) Extrusionsverfahren resultierte so in Einschlußkapazitäten von 56% (100 nm Filter) bzw. 80% (400 nm Filter).

Die bisher bei dieser Technik verwendeten Druckfiltergeräte sind analog der unten gezeigten schematischen Darstellung (Abb. I) aufgebaut. Hierbei werden die entsprechenden Vordispersionen in den direkt über den Membranen (i.d.R. 2 Polycarbonatmembranen) liegenden Aufgußraum gegeben und das Druckgefäß (bzw. Zulaufventil) verschlossen. Anschließend wird mittels Druckluft (oder N₂) der zur Filtration notwendige Druck aufgebaut. Das Filtrat wird über den Auslaß entnommen und anschließend erneut (i.d.R. bis zu 20 mal) in den Aufgußraum eingebracht.

Dieses Verfahren bietet gegenüber der Hochdruckhomogenisation (s. o.) den Vorteil, daß der Zerkleinerungsgrad der Liposomen (geeigneter Lipidzusammensetzung) durch Einsatz von Membranen mit entsprechender Porengröße über einen weiten Bereich einstellbar ist, ohne daß Veränderungen der Geräteeinstellung (Ringspaltgröße) oder -konfiguration notwendig ist. Ferner ist bei diesem Verfahren im Gegensatz zur Hochdruckhomogenisation auch nicht mit Geräteabrieb, welcher die Präparation verunreinigt, zu rechnen, wie dies beispielsweise für den Ringspalthomogenisator beschrieben ist (s. o.). Ein Nachteil der Extrusionsmethoden liegt in der diskontinuierlichen Betriebsweise, den geringen Arbeitsvolumina sowie den niedrigen Filtrationsdrücken bei den bisher kommerziell verfügbaren Geräten (z. B. The Extruder^TM, Fa. Lipex Biomembranes, Vancouver, B.C., Canada oder LiposoFast^TM Large, Fa. Avestin Inc., Ottawa, Canada s.a. Abb. I)). Bei letztgenanntem Gerät liegt das maximale Aufnahmevolumen beispielsweise bei 50 ml und der maximale Arbeitsdruck bei 2,7 MPa. Der Extruder der Fa. Lipex weist sogar nur ein Fassungsvolumen von maximal 10 ml bei einem maximalen Arbeitsdruck von 5,5 MPa auf.

Ein relativ neues Verfahren zur Herstellung von sogenannten microemulsified liposomes (MEL) stellt die Hochdruckhomogenisation mit einem Microfluidizer^TM dar [14]. Die Verwendung dieser Apparatur zur Herstellung von Emulsionen ist ebenfalls beschrieben [15].

Bei der Liposomenherstellung mit dem in Abb. II schematisch dargestellten Hochdruckhomogenisator wird eine MLV-Dispersion (z. B. hand shaken method) oder eine grobe, wäßrige Lipiddispersion (Direktmethode) zunächst in das Reservoir eingebracht. Im wesentlichen besteht die Wirkungsweise dieses Gerätes darin, daß diese Dispersion mittels einer Hochdruckpumpe (bis zu 100 MPa) über einen Metall- Vorfilter (5 µm) in eine sogenannte Interaktionskammer gepreßt wird. In dieser wird der Flüssigkeitsstrom in Mikrokanälen in zwei Einzelströme aufgespalten, die anschließend mit hoher Geschwindigkeit wieder vereinigt werden, wobei Scherkräfte wirken [2]. Nach Austritt aus der Interaktionskammer kann die erhaltene Dispersion entweder entnommen oder rezirkuliert werden. Die Größe der bei diesem Verfahren erhaltenen Liposomen ist eine Funktion der Lipidzusammensetzung und -konzentration sowie des Druckes und der Passagenanzahl durch das Gerät. Nach einer Passage liegen die erhaltenen Durchmesser unabhängig von der Lipidzusammensetzung immer unter 100 nm [16].

Die Vorteile dieses Verfahrens liegen in der Schnelligkeit und Einfachheit sowie der Möglichkeit auch höhere Lipidkonzentrationen (um 200 mg/ml) zu verarbeiten. Hierdurch lassen sich teilweise hohe Einschlüsse wasserlöslicher Substanzen (bis zu 75%) erzielen. Ferner ist die Methode potentiell geeignet auch größere Liposomenmengen reproduzierbar herzustellen.

Nachteilig ist vor allem das Auftreten von Metallabrieb in fertigen Präparationen sowie die Tatsache, daß teilweise ein Verlust bzw. eine Zersetzung des Lipids bei Homogenisation mit dem Microfluidizer^TM festgestellt wurde [17]. Darüberhinaus läßt sich die Größe und Lamellarität der Liposomen nur über einen begrenzten Bereich reproduzierbar einstellen, so daß in der Regel Liposomen unterhalb 100 nm erhalten werden.

Im Hinblick auf die Herstellung von Emulsionen finden einfache, schnellaufende Rührer, Mixbecher, Rührer mit Rotor und Stator (z. B. Ultra Turrax) sowie Kolloidmühlen Verwendung. Aufgrund verschiedener gerätetechnischer Nachteile sowie der schlechten Reproduzierbarkeit und den geringen Dispersitätgraden, die mit diesen Geräten erzielt werden, haben sich neben der Ultrabeschallung (Labormaßstab) vor allem die Hochdruckhomogenisationsverfahren bei der Emulsionsherstellung durchgesetzt [18]. Hierbei sind vor allem der Ringspalthomogenisator der Firma APV Gaulin bzw. der Microfluidizer^TM(MF) zu nennen, deren Anwendung z. B. zur Herstellung von Emulsionen für die parenterale Ernährung bereits beschrieben ist [19, 15].

Bei der Herstellung von beispielsweise O/W-Emulsionen mit diesen Geräten wird i.d.R. eine grobe Vordispersion der entsprechenden Bestandteile hergestellt. So kann z. B. zunächst der verwendete Emulgator (z. B. Ei-Phosphatidylcholin) in der wäßrigen Phase aufgelöst werden. Anschließend kann die entsprechende Ölphase (z. B. Sojaöl - 10 oder 20% m/m) mittels eines schnellaufenden Rührers in der Wasserphase vordispergiert werden. Diese Vordispersion kann dann beispielsweise ein- oder mehrfach, ggf. bei erhöhter Temperatur, durch den MF gegeben werden. Die Größe der erhaltenen Emulsionströpfchen sowie der Polydispersitätsgrad der Zubereitung ist hierbei unter anderem eine Funktion der Art und Menge der verwendeten Öl- bzw. Emulgatorkomponente sowie des Arbeitsdrucks, der Passagenanzahl und der Prozeßtemperatur [15].

Darüberhinaus können natürlich auch arzneistoffhaltige Emulsionen (z. B. O/W oder W/O/W) für die unterschiedlichsten Anwendungszwecke hergestellt werden. Im Falle von lipophilen Arzneistoffen besteht so beispielsweise die Möglichkeit diese vor der Vordispersion in der Ölphase zu lösen oder entsprechende Stammlösungen des jeweiligen Arzneistoffs (z. B. in Ethanol) in bereits fertige Emulsionen einzuarbeiten [20].

Beschreibung des Erfindungsgegenstands:

Vor dem Hintergrund der bisher existierenden Herstellungsmethoden für Liposomen und Emulsionen wird klar, daß die bisher bekannten und vorbeschriebenen Verfahren vor allem Limitationen im Hinblick auf die reproduzierbare Herstellung großer Dispersionsmengen geeigneter Qualität aufweisen. Insbesonders bei den Liposomen besteht jedoch ein großer Bedarf an einer möglichst einfachen Methode zur reproduzierbaren und wirtschaftlichen Herstellung solcher Zubereitungen unter pharmazeutisch akzeptablen Bedingungen.

Der Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein neues, kontinuierliches Hochdruckextrusionsverfahren zur Herstellung von Liposomen und Emulsionen, welches die vorgenannten Anforderungen erfüllt.

Bei diesem Verfahren wird i.d.R. eine Vordispersion unter hohem Druck (< 6,5 MPa) sequentiell, ein- oder mehrfach über einen oder mehrere (ggf. übereinandergelegte) Filter absteigender Porengröße extrudiert. Hierbei finden zumeist Oberflächenfilter (z. B. Polycarbonatmembranen, Fa. Nucleopore) Verwendung. Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt im Gegensatz zu den vorbekannten Verfahren darüberhinaus auch die Verwendung anderer Filtertypen geeigneter Differenzdruckfestigkeit in den unterschiedlichsten Geometrien (z. B. Filterscheiben, -tassen, -kerzen). Nicht limitierende Bespiele für solche Filtermaterialien sind Metall- bzw. Polymermembranen oder anorganische Materialien wie beispielsweise Glasfaser- oder Anopore®-Membranen Beispiele für geeignete Polymermaterialien sind bei geeigneter Porengröße (10 nm-35 µm) Filter aus Polytetrafluorethylen (PTFE), Polypropylen (PP), Polyvinylidenfluorid oder Zelluloseestern wie beispielsweise Celluloseacetat.

Die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendbaren Apparaturen (s. z. B. Abb. 1 - Ausführungsbeispiele) erlauben die Herstellung von Dispersionen bei Drücken deutlich oberhalb 6,5 MPa. Der höchste anwendbare Druck ist dabei lediglich abhängig von der Auslegung des Gerätes sowie der verwendeten Filter. Die bei den Ausführungsbeispielen verwendete Apparatur erlaubte Arbeitsdrücke von etwa 10,1 MPa. Hierbei war jedoch lediglich die Differenzdruckfestigkeit der in dem Filterhalter verwendeten Siebplatte ausschlaggebend. Die Verwendung einer Siebplatte mit kleineren Bohrungen würde Drücke bis zu mindestens 80 MPa ermöglichen. Alternativ hierzu sind auch völlig andere Filtergehäusetypen verwendbar, die weitaus höhere Drücke erlauben. So kann beispielsweise die Hochdruckextrusion über Metallfiltertassen geeigneter Porengrößen (< 35 µm) unter Verwendung entsprechender Filtergehäuse erfolgen.

Durch die Höhe der bei dem erfindungsgemäßen Verfahren anwendbaren Drücke, lassen sich im Gegensatz zu den bisher bekannten Verfahren auch große Mengen an Dispersion mit hohen Konzentrationen disperser Phase (z. B. 500 mg Lipid/ml wäßriger Phase) und dementsprechend hoher Viskosität (gelartig) in kurzer Zeit extrudieren.

Die bei diesem Verfahren erzielbaren Flüsse liegen auch bei Verwendung von zwei übereinandergelegten Filtern mit Porengrößen kleiner/gleich 100 nm (Durchmesser 47 mm) deutlich oberhalb 150 ml/min. Die Flußrate kann hierbei durch geeignete Auslegung einer entsprechenden Anlage (z. B. Pumpenleistung, Filtergeometrie, Rohrverbindungen) drastisch erhöht werden (<< 2 l/min).

Durch die hohen bei diesem Verfahren anwendbaren Drücke wird ferner das bei anderen Methoden auftretende Problem der Verstopfung der Filter beseitigt, wodurch Unterbrechungen des Prozesses zum Wechseln der Filter entfallen. Darüberhinaus lassen sich auch komplexe Lipidmischungen, die bei anderen Liposomenherstellungsverfahren nicht direkt (ohne vorherige MLV-Herstellung) extrudierbar sind, ohne vorherige Filmbildung dispergieren. Hierzu zählen beispielsweise geladene Lipidgemische mit Cholesterolanteilen < 30 mol-% (z. B. SPC/CH/SPG 5 : 4 : 1).

Die in den Ausführungsbeispielen verwendete Apparatur erlaubt die rasche Herstellung von Dispersionen im Bereich von 100-1000 ml (Totvolumen der Anlage etwa 10 ml). Bei entsprechender Auslegung einer solchen Anlage (z. B. Durchmesser des Filters < 47 mm, Größe des Aufnahmegefäßes, Kolbenhub der Hochdruckpumpe) ist jedoch auch die Herstellung von Mengen deutlich oberhalb 10 l, ohne eine negative Beeinträchtigung der Produkteigenschaften möglich. Insofern bietet dieses neue Verfahren die Möglichkeit einer direkten Übertragung des Herstellungsprozesses von dem Labor- in den Technikums- und schließlich Produktionsbereich. Alternativ zu dem vorgesagten ist natürlich auch eine Auslegung solcher Anlagen für sehr kleine Mengen möglich, wo dies z. B. aus Gründen der Kosten der eingesetzten Substanzen gewünscht ist.

Im Gegensatz zu den bisher beschriebenen Hochdruckextrusionsverfahren erlaubt das erfindungsgemäße Verfahren die kontinuierliche Herstellung von Dispersionen, wodurch der Herstellungsaufwand und damit die Wirtschaftlichkeit der Methode deutlich verbessert wird. So können auch große Dispersionsmengen nach einer ersten Passage durch die Anlage zunächst in einem Zweikammervorratsgefäß aufgefangen werden, um dann durch bloßes Öffnen eines entsprechenden Ventils erneut die Anlage zu passieren. Diese Zweikammerkonstruktion bietet gegenüber der direkten Rezirkulation (d. h. Mehrfachextrusion) den Vorteil, daß immer zunächst die Gesamtmenge der Dispersion dem Scherprozeß unterzogen wird, so daß keine Vermischung von undispergierter und dispergierter Phase auftritt.

Die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren einsetzbaren Anlagen können im Prinzip analog zu der in Abb. 1 (s. Ausführungsbeispiele) gezeigten Apparatur aufgebaut sein. Besondere Merkmale der hier gezeigten Apparatur sind die leichte Bauweise sowie die Tatsache, daß durch geringe Modifikationen der Gerätekonfiguration (z. B. Dimension des Filterhalters, Größe und Art der Pumpe und des Vorratsgefäßes) eine Anpassung an größere Herstellungsmaßstäbe erreicht werden kann. Die benötigten Einzelteile sind leicht verfügbar und darüberhinaus kostengünstig. Sämtliche produktberührende Teile sind aus Materialien, die eine Hitzesterilisation ermöglichen. Dies ist vor allem im Hinblick auf die aseptische Fertigung von pharmazeutischen Produkten wichtig.

Vor allem in der Liposomentechnologie (z. B. Pharmazie und Kosmetik) besteht großes Interesse an kontinuierlich arbeitenden Herstellungsmethoden, welche die wirtschaftliche Produktion großer Liposomenmengen mit reproduzierbaren Eigenschaften (z. B. Einschluß, Größe und Größenverteilung, Lamellarität) in pharmazeutische Qualität (Sterilität, Pyrogenfreiheit) erlauben. Darüberhinaus sollte ein besonders geeignetes Verfahren möglichst flexibel im Hinblick auf die Art und Menge der zur Liposomenherstellung einsetzbaren Ausgangsstoffe (Liposomenbausteine und ggf. Arzneistoffe) sein.

Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt die Herstellung uni- oder multilamellarer Liposomen über einen weiten Größenbereich (mittlere Durchmesser i.d.R. zwischen 25 nm und 5 µm). Die Größe und Homogenität der Größenverteilung sowie die Lamellarität der hier erhaltenen Liposomen ist unter anderem eine Funktion der verwendeten Filterart und Porengröße, Filtrationsdrücke, Passagenanzahl durch das Gerät, Lipidart und -konzentration sowie Art und Menge des eingesetzten Arzneistoffs.

Bei geeigneter Wahl dieser Parameter lassen sich Formulierungen mit sehr enger Größen- und Lamellaritätsverteilung erhalten.

Die hierbei zur Liposomenherstellung einsetzbaren Lipidbestandteile sind in der Literatur allgemein beschrieben. In der Regel handelt es sich hierbei um Phospholipide wie beispielsweise Phosphatidylcholin, Phosphatidylethanolamin, Phosphatidylglycerol, Phosphatidylserin, Phosphatidsäure, Phosphatidylinositol oder Sphingolipide. Darüberhinaus können als weitere Bestandteile Sterole wie beispielsweise Cholesterol oder auch andere Komponenten wie Fettsäuren (z. B. Stearinsäure, Palmitinsäure), Dicetylphosphat oder Cholesterolhemisuccinat eingesetzt werden. Bei Verwendung von amphiphilen Substanzen wie beispielsweise Hexadecylpoly(3)glycerol, Dialkylpoly(7)glycerol-ether und Alkylglucosiden werden sogenannte Niosomen, d. h. Liposomen aus nicht-ionogenen Vesikelbildnern erhalten.

Im Hinblick auf den Einschluß von Arzneistoffen eignet sich dieses Verfahren sowohl zur Herstellung von Liposomen mit hydrophilen als auch lipophilen Arzneistoffen.

Entsprechende Wirksubstanzen können beispielsweise Vitamine, Hormone, Antimykotika, Antiallergika, Antiphlogistika, Antihypertensiva, Antiarrhythmika, Antibiotika, Antiviralia, Anxiolytika, Cytostatika, Immunmodulatoren, Kontrazeptiva, Peptide, Proteine und Sedativa umfassen.

Im Falle von hydrophilen Arzneistoffen werden diese i.d.R. in der zur Herstellung der Vordispersion verwendeten wäßrigen Phase gelöst und der Hochdruckextrusionsprozeß durchgeführt. Überraschenderweise konnte dabei festgestellt werden, daß das erfindungsgemäße Verfahren Liposomen mit besonders hohen Einschlüssen liefert. So erwies sich das Verfahren besonders geeignet zur Verkapselung von Kontrastmitteln für die Röntgen (bzw. CT) und NMR Diagnostik, die mit den bisher bekannten mechanischen Dispersionsmethoden nur unzureichend verkapselt wurden. Bei Einschluß von iodhaltigen Röntgenkontrastmitteln (RKM) konnten so auch bei kleinen Liposomendurchmessern und relativ geringen Lipidkonzentrationen hohe Einschlußkapazitäten erzielt werden. Durch Kombination mit einem oder mehreren freeze-thaw Zyklen (Einfrieren und Auftauen) läßt sich eine weitere Einschlußerhöhung erzielen. Besonders geeignete Beispiele für entsprechende RKM vom Typ der Triiodbenzoesäure sind Iopromid, Iohexol, Iopamidol, Ioversol, Iopentol, Ioxaglat, ZK 139129 und Iotrolan.

Im Falle des Einschlusses von Kontrastmitteln für die NMR Diagnostik erwies sich das erfindungsgemäße Verfahren im Hinblick auf die erzielbaren Einschlußkapazitäten gegenüber allen vorbeschriebenen mechanischen Verfahren überlegen. Durch bloße Hochdruckextrusion lassen sich extrem hohe Einschlüsse erhalten, die überraschenderweise durch zusätzliche freeze-thaw Zyklen nicht wesentlich weiter gesteigert werden können. Besonders für die Verkapselung geeignete NMR Kontrastmittel sind hierbei Gd-DTPA, Gd-EOB-DTPA, Gd-BOPTA, Gd-DOTA, Gadobutrol und Mn-DPDP.

Alternativ hierzu können geeignete, wasserlösliche Substanzen auch mit sogenannten active loading techniques (remote loading) verkapselt werden. Hierzu werden beispielsweise zunächst arzneistofffreie Liposomen mittels der Hochdruckextrusionstechnik hergestellt, die anschließend, z. B. über einen pH- Gradienten, mit der zu verkapselnden Substanz beladen werden.

Zur Verkapselung lipophiler Substanzen kann bei dem erfindungsgemäßen Verfahren der entsprechende Wirkstoff durch Losen bzw. Dispergieren in der Lipid-Vordispersion bzw. durch nachträgliches Einrühren in eine fertige Liposomensuspension verkapselt werden. Bei solchen Arzneistoffen kann es sich auch um modifizierte Arzneistoffmoleküle (amphiphile Substanzen) handeln, welche durch entsprechende chemische Modifikation direkt als Liposomenmembranbestandteile fungieren können.

Übereinstimmend mit den bisher existierenden Liposomenpräparationsverfahren kann bei lipophilen Arzneistoffen von einer quantitativen Verkapselung der jeweiligen Komponente ausgegangen werden, solange ein kritisches Arzneistoff/Lipidverhältnis nicht überschritten wird. Insofern erweist sich das erfindungsgemäße Verfahren auch hier als besonders geeignet, da durch die Verarbeitbarkeit extrem hoher Lipidkonzentrationen (< 400 mg/ml) auch extrem hohe Konzentrationen lipophiler Arzneistoffe dispergiert werden können.

Das erfindungsgemäße Verfahren zeichnet sich gegenüber den bisher beschriebenen Herstellungsmethoden durch eine sehr gute Reproduzierbarkeit der produzierten Liposomeneigenschaften aus. So konnte beispielsweise bei der mehrfachen Herstellung von kontrastmittelhaltigen Liposomen unter identischen Bedingungen nachgewiesen werden, daß die produzierten Liposomen nur geringe Schwankungen hinsichtlich ihrer Eigenschaften (vor allem Einschluß, Größe und Größenverteilung) aufweisen. Diese Reproduzierbarkeit des Verfahrens wird durch die Vergrößerung des Herstellungsmaßstabs nicht negativ beeinträchtigt.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist ferner besonders zur Durchführung unter aseptischen Bedingungen geeignet. Dies ist vor allem in solchen Fällen bedeutsam bei denen die gewünschten Liposomen aufgrund ihrer Größe keiner terminalen Sterilfiltration (0,2 µm) unterzogen werden können. Zur aseptischen Herstellung sind sterilisierte, entpyrogenisierte Geräte sowie sterile und pyrogenfreie Ausgangsstoffe einzusetzen und es ist in Reinräumen der entsprechenden Reinraumklassen zu arbeiten. In allen übrigen Fällen (d. h. letzte Extrusion kleiner/gleich 0,6 µm) kann das Endprodukt zumeist sterilfiltriert (z. B. 0,2 µm) werden. Darüberhinaus bietet das erfindungsgemäße Verfahren die Möglichkeit, durch Extrusion unter Verwendung von Filtern geeigneter Porengröße (kleiner/gleich 0.6 µm) von vornherein eine Entfernung von Keimen zu bewirken, wodurch eine nachträgliche Sterilfiltration entfallen könnte.

Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich darüber hinaus besonders zur Herstellung von lagerstabilen Liposomen. Im Falle der Lagerung von Iopromid-haltigen Liposomen, bei denen der unverkapselte Iopromidanteil nicht abgetrennt wurde, konnte so beispielsweise nach dreimonatiger Lagerung im Kühlschrank keine Abnahme des pH-Wertes und des Einschlusses sowie keine Veränderung der mittleren Durchmesser festgestellt werden.

Im Hinblick auf die Herstellung von Emulsionen bietet das erfindungsgemäße Verfahren erstmals die Möglichkeit der kontinuierlichen Herstellung großer Emulsionsmengen mit reproduzierbaren Eigenschaften. Im wesentlichen kommen auch bei der Emulsionsherstellung die weiter oben aufgeführten Vorteile (Liposomenherstellung) des erfindungsgemäßen Hochdruckextrusionsverfahrens zum Tragen. Der vorher nicht beschriebene Einsatz der Filterextrusion in diesem Bereich, der erst durch das erfindungsgemäße Hochdruckextrusionsverfahren eröffnet wurde, ermöglicht die flexible Herstellung von Emulsionen über einen weiten Größenbereich (100 nm-20 µm mittlerer Durchmesser der dispergierten Phase) ohne größeren apparativen Aufwand. Das Verfahren zeichnet sich auch in dieser Anwendung durch die Verarbeitbarkeit großer Mengen an innerer Phase aus, wobei zumeist auch eine Direktherstellung (ohne Vordispersion) möglich ist.

Je nach dem gewünschten Anwendungszweck lassen sich mit diesem Verfahren Zwei bzw. Mehrphasenemulsionen (z. B. W/O, O/W, W/O/W oder O/W/O) herstellen.

Als Ölphase können dabei beispielsweise pflanzliche Öle wie Soja-, Rizinus-, Saflor- oder Olivenöl Verwendung finden. Geeignete Emulgatoren sind beispielsweise Ei- und Sojalecithine bzw. reine Phospholipe aus solchen Fraktionen. Ferner können beispielsweise auch nichtionische Tenside wie z. B. höhere Fettalkohole Sorbitanfettsäureester oder Polyethylenglykolether bzw. -ester eingesetzt werden.

Die Wasserphase kann aus reinem Wasser (p.i. oder pur.) bzw. wäßrigen Lösungen verschiedener Puffer- oder Salze (z. B. NaCl, KCl) bestehen und auch Zusätze wie beispielsweise Glycerol enthalten. Darüberhinaus können Emulsionen für die parenterale Ernährung zusätzlich Zucker wie Glucose und Xylitol sowie weitere Salze wie Natriumdihydrogenphosphat, Magnesiumchlorid oder Zinkacetat enthalten. Darüberhinaus können auch Fette wie z. B. mittelkettige Triglyceride in der Emulsion vorhanden sein.

Ferner können in einer oder beiden Phasen Arzneistoffe bereits vor der Emulsionsherstellung gelöst oder suspendiert werden bzw. nach vollendeter Emulsionsherstellung, analog zu den in der Literatur beschriebenen Verfahren, eingearbeitet werden. Die entsprechenden hydrophilen oder lipophilen Wirkstoffe können dabei beispielsweise den weiter oben (Liposomenherstellung) aufgeführten Substanzklassen zugehören.

Literaturverzeichnis:

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7. Brandl, M., Bachmann, D., Drechsler, M., Bauer, K. H., Liposome preparation by a new high pressure homogenizer Gaulin Micron LAB 40, Drug Dev. Ind. Pharm. 16, 2167-2191 (1990).
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11. Cullis, P. R., Hope, M. J., Bally, M. B. (The Liposome Company), WO 86/00238 (1986).
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20. Prankerd, R.J., Frank, S.G., Stella, V.J., Preliminary development and evaluation of a parenteral emulsion formulation of penclomedine (NSC-338720; 3,5-dichloro-2,4-dimethoxy-6-trichloromethyl pyridine): a novel, practically water insoluble cytotoxic agent, J. Parenter. Sci. Technol 42, 76-81 (1988).

Ausführungsbeispiele:

Die nachfolgenden Ausführungsbeispiele dienen zur näheren Erläuterung der Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens.

Die hierbei verwendeten Abkürzungen sind wie folgt
Chol: Cholesterol, Cholesterol gepulvert, Fa. E. Merck, Darmstadt
DCP: Dicetylphosphat, Sigma,
EPC: Eiphosphatidylcholin, Lipoid E 100, Fa. Lipoid KG, Ludwigshafen
EPS: Eiphosphatidylserin, Lipoid EPS, Fa. Lipoid KG
PCS: Photonenkorrelationsspektroskopie- Verfahren zur Messung von Teilchengrößen unter 1 µm
SPA: Sojaphosphatidsäure, Lipoid SPA, Fa. Lipoid KG
SPC: Sojaphosphatidylcholin, Lipoid S 100, Fa. Lipoid KG
SPE: Sojaphosphatidylethanolamin, Lipoid SPE
SPG: Sojaphosphatidylglycerol, Lipoid SPG, Fa. Lipoid KG
SS: Stearinsäure, Fluka, CH-Buchs

Nähere Erläuterungen zur Apparatur aus Abbildung 1:

1. Vorratsbehältnis ggf. temperierbar
2. Hochdruckpumpe (z. B. hydraulische Kolbendruckluftpumpe). Die für die Beispielversuche verwendete Pumpe hatte einen Umspannfaktor von ca. 100, d. h. aus 0,1 MPa Eingangsdruck werden 10 MPa Arbeitsdruck
3. Regelungsventil für Eingangsdruck
4. Entlüftungsventil (optional)
5. Manometer - bei Bedarf können zusätzlich auch andere Meßwerte (z. B. Temperatur) analog oder digital aufgenommen werden. Evtl. sind auch an anderen Stellen der Apparatur entsprechende Meßsysteme vorzusehen.
6. Hochdruckfilterhalter mit Druckhaltevermögen bis 80 MPa. In der Standardausführung nimmt der Halter Filterscheiben mit einem Durchmesser von 47 mm auf. Je nach Dimensionierung der Anlage können auch kleinere (z. B. 25 mm) oder größere (z. B. 76 mm) vorgesehen werden. Alternativ hierzu sind auch völlig andere Filtergehäuse und -typen einsetzbar.
7. Produktauslaß - bestehend z. B. aus einem flexiblen Schlauch. Hierüber kann das Filtrat entweder direkt entnommen oder für weitere Extrusionsschritte durch Rückführung in das Vorratsgefäß rezirkuliert werden. Alternativ hierzu kann die Rückführung beispielsweise über ein Zweikammervorratsbehältnis oder eine Flüssigkeitsspirale (auch Wärmetausch) erfolgen.

Beispiel 1 Verwendung unterschiedlicher Lipide und Lipidgemische

Plazeboliposomen mit unterschiedlichen Lipidzusammensetzungen werden wie nachfolgend beschrieben produziert:

- Herstellung eines Lipidfilms durch Rotationsverdampfung einer organischen Lipidlösung (Ethanol, Methanol oder Chloroform/Ethanol - je nach Löslichkeit) bei erhöhter Temperatur (z. B. 50°C).
- Dispersion des Lipidfilms mit Puffer- oder Arzneistofflösung oberhalb der Phasenübergangstemperatur des verwendeten Lipidgemischs (Quellzeit mind. 15 min, Schütteln von Hand - mind. 2 min)
- Sequentielle Extrusion der Vordispersion (MLV) über Filter absteigender Porengröße (5,0; 1,0; 0,4; 0,2; 0,1; 0,05 und 0,03 µm - je 5 Filterpassagen - ggf. bei erhöhter Temperatur).

In diesem Beispiel wurden jeweils zwei übereinandergelegte Polycarbonatfilter pro Filtergröße verwendet, wobei die letzte Extrusion über 0,05 µm Filter erfolgte. Nach Abschluß der Extrusion wurden die Liposomensuspensionen sterilfiltriert (Celluloseacetat-membran, 0,2 µm). Die eingesetzte Lipidkonzentration betrug jeweils 50 mg/ml. Es wurden 100 ml Ansätze in Puffer (20 mM Tris(hydroxymethyl) aminomethan, pH 7,5, im folgenden Tris-Puffer genannt) hergestellt.

Folgende Lipide wurden in den angegebenen molaren Verhältnissen eingesetzt:

SPC
EPC @	SPC:Chol	9 : 1
SPC:Chol	7 : 3
SPC:Chol	5 : 5
SPC:SPE	9 : 1
SPC:EPS	9 : 1
SPC:SPG	9 : 1
SPC:SPA	9 : 1
SPC:SS	9 : 1
SPC:DCP	9 : 1
SPC:Chol:SPG	6 : 3 : 1
SPC(hydriert):Chol:SPG	6 : 3 : 1

Nach Herstellung wurden die mittleren Vesikeldurchmesser mittels PCS (Submicron particle sizer autodilute model 370, Fa. Nicomp Instruments Corp.) bestimmt. Die erhaltenen Werte sind in Abb. 2 dargestellt.

Beispiel 2 Ansätze mit unterschiedlichen Lipidkonzentrationen

Es wurden Ansätze aus reinem SPC und Tris-Puffer mit den Lipidkonzentrationen 50, 100, 200 und 400 mg/ml wie unter Beispiel 1 beschrieben hergestellt. Die letzte Stufe der Extrusion erfolgte bei einer Porengröße von 0,03 µm. Die Größenbestimmung erfolgt ebenfalls gemäß Beispiel 1. Die erhaltenen Werte sind in Abb. 3 aufgelistet.

Beispiel 3 Beeinflussung der resultierenden Vesikeldurchmesser durch die Porengröße der verwendeten Filter

Es wurden Ansätze wie unter Beispiel 1 hergestellt und charakterisiert, jedoch mit der Änderung, daß die Porengröße des letzten Extrusionschrittes bei jedem Ansatz variiert wurde. Die jeweils letzten Porengrößen waren 5,0,1,0, 0,4, 0,2, 0,1, 0,05 und 0,03 µm. Als Lipid wurde ein Gemisch aus SPC, Chol und SPG (6 : 3 : 1) in Tris-Puffer eingesetzt. Die Ergebnisse sind in Abb. 4 zusammengefaßt.

Beispiel 4 Einfluß der Passagenanzahl auf mittlere Vesikeldurchmesser

Es wurden vier Ansätze wie unter Beispiel 1 beschrieben, jedoch mit jeweils unterschiedlicher Passagenanzahl (1, 3, 5 und 10) auf jeder Extrusionsstufe hergestellt und charakterisiert. Als Lipid diente ein Gemisch aus SPC, Chol und SPG (6 : 3 : 1) in Tris-Puffer. Alle Ansätze wurden einem 3-stufigen Extrusionsprozeß durch Membranen mit 0,4, 0,1 und 0,03 µm Porengröße unterworfen. Die Ergebnisse sind in Abb. 5 dargestellt.

Beispiel 5 Herstellung einer Liposomensuspension ohne vorherige Filmbildung (Direktdispersion):

Es wurde ein 100 ml großer Ansatz aus SPC:Chol: SPG (6 : 3 : 1) in Tris-Puffer mit einer Lipidkonzentration von 50 mg/ml hergestellt. Ohne vorherige Filmbildung wurden die Lipide direkt in einen 100 ml Meßzylinder eingewogen und mit 70°C heißem Tris-Puffer versetzt. Nach dem Quellen (30 min) wurden sie mit einem Ultraturrax 30 min mit 13500 U/min bei gleicher Temperatur dispergiert und anschließend wie unter Beispiel 1 beschrieben extrudiert. Das Endprodukt wies einen mittleren Durchmesser von 60 nm bei einem Variationskoeffizienten von 25% auf (PCS).

Beispiel 6 Extrusion unter Verwendung einer Filterporengröße (0,1 µm):

Es wurde ein 100 ml großer Ansatz aus EPC in Tris-Puffer mit einer Lipidkonzentration von 100 mg/ml hergestellt. Ohne vorherige Filmbildung wurde das Lipid direkt in einen 100 ml Meßzylinder eingewogen und bei RT mit Tris-Puffer versetzt. Nach dem Quellen (15 min) wurde die Mischung mit einem Ultraturrax 10 min mit 13500 U/min bei gleicher Temperatur dispergiert und anschließend je 10 mal über zwei übereinandergelegte 0,1 µm Polycarbonatfilter extrudiert. Das Endprodukt wies einen mittleren Durchmesser von ca. 120 nm bei einem Variationskoeffizienten von 32% auf (PCS).

Beispiel 7 Herstellung eines Großansatzes (1 l Liposomensuspension) mit hohen Durchflußraten:

Es wurde ein 1000 ml großer Ansatz aus SPC in Tris-Puffer mit einer Lipidkonzentration von 100 mg/ml hergestellt. Ohne vorherige Filmbildung wurde das Lipid direkt in einen 1000 ml Meßzylinder eingewogen und bei RT mit Tris-Puffer versetzt. Nach dem Quellen (15 min) wurde die Mischung mit einem Ultraturrax 10 min mit 13500 U/min bei gleicher Temperatur dispergiert und anschließend je 10 mal sequentiell über zwei übereinandergelegte Polycarbonatfilter (1,0-0,2 und 0,1 µm) extrudiert.

Die Durchflußrate betrug hierbei unabhängig von der Porengröße der verwendeten Membranen ca. 500 ml/min.

Die nach 10 Passagen über die letzte Filterkombination (0,1 µm) erhaltenen Liposomen wiesen einen mittleren Durchmesser von ca. 110 nm bei einem Variationskoeffizienten von 30% auf (PCS).

Beispiel 8 Herstellung eines Ansatzes mit hoher Lipidkonzentration (500 mg/ml):

Es wurde ein 100 ml großer Ansatz aus SPC in Tris-Puffer mit einer Lipidkonzentration von 500 mg/ml hergestellt. Ohne vorherige Filmbildung wurde das Lipid direkt in einen 100 ml Meßzylinder eingewogen und bei RT mit Tris-Puffer versetzt. Nach dem Quellen (30 min) wurde die Mischung mit einem Ultraturrax 10 min mit 13500 U/min bei gleicher Temperatur dispergiert wobei eine gelartige Konsistenz erhalten wurde. Dieses Gel wurde anschließend je 2 mal sequentiell über zwei übereinandergelegte Polycarbonatfilter (1,0-0,2 und 0,1 µm) extrudiert, ohne das die Membranen verstopften.

Die nach 2 Passagen über die letzte Filterkombination (0,1 µm) erhaltenen Liposomen (Gel) wiesen einen mittleren Durchmesser von ca. 180 nm bei einem Variationskoeffizienten von 41% auf (PCS).

Beispiel 9 Herstellung eines Ansatzes unter Verwendung von Polytetrafluorethylen (PTFE) Filtern:

Es wurde ein 100 ml großer Ansatz aus SPC in Tris-Puffer mit einer Lipidkonzentration von 100 mg/ml hergestellt. Ohne vorherige Filmbildung wurde das Lipid direkt in einen 100 ml Meßzylinder eingewogen und bei RT mit Tris-Puffer versetzt. Nach dem Quellen (15 min) wurde die Mischung mit einem Ultraturrax 10 min mit 13500 U/min bei gleicher Temperatur dispergiert. Anschließend wurde diese Vordispersion je 10 mal sequentiell über zwei übereinandergelegte PTFE-Filter (5,0-1,2 und 0,2 µm) extrudiert.

Die nach 10 Passagen über die letzte Filterkombination (0,2 µm) erhaltenen Liposomen wiesen einen mittleren Durchmesser von ca. 210 nm bei einem Variationskoeffizienten von ca. 30% auf (PCS).

Beispiel 10 Herstellung eines Ansatzes unter Verwendung eines Metall(tassen) filters (5 µm):

Es wurde ein 1000 ml großer Ansatz aus SPC in Tris-Puffer mit einer Lipidkonzentration von 100 mg/ml hergestellt. Ohne vorherige Filmbildung wurde das Lipid direkt in einen 1000 ml Meßzylinder eingewogen und bei RT mit Tris-Puffer versetzt. Nach dem Quellen (15 min) wurde die Mischung mit einem Ultraturrax 10 min mit 13500 U/min bei gleicher Temperatur dispergiert und anschließend je 10 mal über einen Metall(tassen)-filter mit einer nominalen Porengröße von 5 µm extrudiert.

Die nach 10 Passagen erhaltenen Liposomen wiesen einen mittleren Durchmesser von ca. 1,4 µm bei einem Variationskoeffizienten von ca. 80% auf (PCS).

Beispiel 11 Herstellung von Niosomen:

Es wurde ein 100 ml großer Ansatz mit 4 g VolpoN3 (Polyoxyethylenglykol laurylalkohol) und 1 g Cholesterol in Tris-Puffer hergestellt. Ohne vorherige Filmbildung wurden die Lipide direkt in einen 100 ml Meßzylinder eingewogen und bei RT mit Tris- Puffer versetzt. Nach dem Quellen (15 min) wurden sie mit einem Ultraturrax 10 min mit 13500 U/min bei gleicher Temperatur dispergiert und anschließend sequentiell je 5 mal über zwei übereinandergelegte Polycarbonatfilter absteigender Porengröße (5,0- 0,2 und 0,05 µm) extrudiert. Das Endprodukt wies einen mittleren Durchmesser von 53 nm bei einem Variationskoeffizienten von 33% auf (PCS).

Beispiel 12 Einschluß von Iopromid unter Verwendung verschiedener Herstel lungsmethoden

Es wurden wie in Beispiel 1 beschrieben 100 ml Liposomensuspensionen hergestellt, die das wasserlösliche, nicht-ionische Röntgenkontrastmittel Iopromid enthielten. Die Iodkonzentration im Endprodukt betrug 100 mg/g, die Lipidkonzentration 160 mg/g. Als Lipide wurden SPC, Chol und SPG im molaren Verhältnis (6 : 3 : 1) verwendet. Als Ausgangslösung wurde mit Tris-Puffer verdünntes Ultravist® 370 eingesetzt. Die Porengröße der letzten Extrusionsstufe betrug 0,1 µm. Die Herstellungsverfahren unterschieden sich wie folgt:

1. Verfahren wie unter Beispiel 1 beschrieben, bei Raumtemperatur (RT) extrudiert.
2. Verfahren wie unter Beispiel 1 beschrieben, bei 70°C extrudiert.
3. Verfahren wie unter Beispiel 1 beschrieben, nach der Extrusion durch 0,4 µm Porengröße wird der Ansatz jedoch 3 Gefrier-Tau-Zyklen (Freeze-Thaw) unterworfen. Eingefroren wird in Glasvials in Methanol/Trockeneis bei -70 bis -80°C, aufgetaut im Wasserbad bei +70°C. Extrudiert wird bei Raumtemperatur.
4. Verfahren wie unter 3. beschrieben, jedoch Extrusion bei 70°C.

Zur Charakterisierung der hergestellten Liposomen wurde der Einschluß mittels Gleichgewichtsdialyse mit photometrischer Auswertung sowie der mittlere Vesikeldurchmesser mit PCS bestimmt. Die Mittelwerte und Variationskoeffizienten der Ergebnisse aus je drei Ansätzen sind in Abb. 6 zusammengefaßt.

Beispiel 13 Iopromideinschluß und Vesikelgröße in Abhängigkeit von der Porengröße des letzten Extrusionsschrittes:

Es wurden Ansätze wie unter Beispiel 12, Punkt 3. hergestellt und charakterisiert, jedoch mit der Änderung, daß die Porengröße des letzten Extrusionschrittes bei jedem Ansatz variiert wurde. Die jeweils letzten Porengrößen waren 1,0, 0,4, 0,2, 0,1 und 0,05 µm. Die Freeze-Thaw-Zyklen wurden nach Extrusion durch 5,0 µm durchgeführt. Die Lipidkonzentration betrug 150 mg/ml. Die Mittelwerte und Variationskoeffizienten der Ergebnisse aus je drei Ansätzen sind in Abbildung 7 zusammengefaßt.

Beispiel 14 Iopromideinschluß und Vesikelgröße in Abhängigkeit von der Lipidkonzentration:

Es wurden Ansätze wie unter Beispiel 12, Punkt 3. hergestellt und charakterisiert, jedoch mit der Änderung, daß verschiedene Lipidkonzentrationen (50, 100, 150 und 160 mg/ml) eingesetzt wurden. Die Mittelwerte und Variationskoeffizienten der Ergebnisse aus je drei Ansätzen sind in Abbildung 8 zusammengefaßt.

Beispiel 15 Drei-Monats-Stabilität von Iopromidliposomen:

Zur Beurteilung der Stabilität von Iopromidliposomen wurde ein 3-Fachansatz nach 3- monatiger Lagerung im Kühlschrank hinsichtlich des pH, des Einschlusses und der Vesikelgröße untersucht. Bei den eingelagerten Proben wurde der unverkapselte Iopromidanteil vor der Einlagerung nicht entfernt, d. h. die extrudierten Liposomen wurden direkt eingelagert.

Die nachfolgende Tabelle zeigt die Eigenschaften der entsprechenden Liposomen zu den jeweiligen Zeitpunkten.

Beispiel 16 Einschluß von Gd-DTPA unter Verwendung verschiedener Herstel lungsmethoden

Es wurden wie unter Beispiel 1 beschrieben 100 ml Liposomensuspensionen hergestellt, die das wasserlösliche, ionische MRT-Kontrastmittel Gadopentetsäure, Dimegluminsalz (im folgenden nur Gd-DTPA genannt) enthielten. Die Gd-Konzentration im Endprodukt betrug 180 µmol/g, die Lipidkonzentration 150 mg/g. Als Lipide wurden SPC und Chol im molaren Verhältnis (7 : 3) verwendet. Als Ausgangslösung wurde mit Wasser 1 : 1 verdünntes Magnevist® eingesetzt. Die Porengröße der letzten Extrusionsstufe betrug 0,1 µm. Die Herstellungsverfahren unterschieden sich wie folgt:

1. Verfahren wie unter Beispiel 1 beschrieben, bei Raumtemperatur extrudiert.
2. Verfahren wie unter Beispiel 1 beschrieben, bei 70°C extrudiert.
3. Verfahren wie unter Beispiel 1 beschrieben, nach der Extrusion durch 0,4 µm Porengröße wird der Ansatz jedoch 3 Gefrier-Tau-Zyklen (Freeze-Thaw) unterworfen. Eingefroren wird in Glasvials in Methanol/Trockeneis bei -70 bis -80°C, aufgetaut im Wasserbad bei +70°C. Extrudiert wird bei Raumtemperatur.

Zur Charakterisierung der hergestellten Liposomen wurde der Einschluß mittels Gleichgewichtsdialyse und Inductively-coupled-plasma-atomic-emission-spectrome-try (ICP-AES) sowie der mittlere Vesikeldurchmesser mit PCS bestimmt. Die Mittelwerte und Variationskoeffizienten der Ergebnisse aus je drei Ansätzen sind in Abb. 9 zusammengefaßt.

Beispiel 17 Gd-DTPA-Einschluß und Vesikelgröße in Abhängigkeit von der Porengröße des letzten Extrusionsschrittes:

Es wurden Ansätze wie unter Beispiel 16, Punkt 3. hergestellt und charakterisiert jedoch mit der Änderung, daß die Porengröße des letzten Extrusionschrittes bei jedem Ansatz variiert wurde. Die jeweils letzten Porengrößen waren 0,2, 0,1 und 0,05 µm. Die Mittelwerte und Variationskoeffizienten der Ergebnisse aus je drei Ansätzen sind in Abb. 10 zusammengefaßt.

Beispiel 18 Gd-DTPA-Einschluß und Vesikelgröße in Abhängigkeit von der Lipidkonzentration:

Es wurden Ansätze wie unter Beispiel 10, Punkt 3. hergestellt und charakterisiert jedoch mit der Änderung, daß verschiedene Lipidkonzentrationen (100, 150 und 200 mg/ml) eingesetzt wurden. Die Mittelwerte und Variationskoeffizienten der Ergebnisse aus je drei Ansätzen sind in Abb. 11 zusammengefaßt.

Beispiel 19 Herstellung von Liposomen mit einem lipophilen Arzneistoff (Methylprednisolonaceponat-MPA):

20 ml Plazeboliposomen bestehend aus 50 mg SPC/ml, welche gemäß Beispiel 1, jedoch mit 0.2 µm als letzter Extrusionsstufe, hergestellt wurden, werden mit 50 mg MPA versetzt und anschließend bei RT 24 h mit einem Magnetrührer gerührt.

Die so erhaltenen Liposomen weisen einen mittleren Durchmesser von 189 nm bei einem Variationskoeffizienten von 30% auf. Das MPA ist vollständig in den Liposomen verkapselt.

Beispiel 20 Herstellung einer 5%-igen O/W-Emulsion:

1,5 g Lipoid E 80 wurde in etwa 50 ml bidestilliertem Wasser suspendiert und anschließend 5 ml filtriertes Sojaöl (beides Lipoid KG, Ludwigshafen) hinzugefügt. Nach Zusatz von bidestilliertem Wasser ad 100 ml wurde die Mischung 10 min mit einem Ultra-Turrax (13 500 U/min) vordispergiert. Anschließend wurde diese Vordispersion je 10 mal über zwei übereinandergelegte Polycarbonatfilter (0,1 µm) extrudiert. Die Tröpfchengröße der so erhaltenen homogenen, gelblich-trüben O/W- Emulsion betrug ca. 430 nm.

Beispiel 21 Herstellung einer 5%-igen O/W-Emulsion unter Verwendung eines PTFE-Filters:

1,5 g Lipoid E 80 wurde in etwa 50 ml bidestilliertem Wasser suspendiert und anschließend 5 ml filtriertes Sojaöl (beides Lipoid KG, Ludwigshafen) hinzugefügt. Nach Zusatz von bidestilliertem Wasser ad 100 ml wurde die Mischung 10 min mit einem Ultra-Turrax (13 500 U/min) vordispergiert. Anschließend wurde diese Vordispersion je 10 mal über zwei übereinandergelegte PTFE-Filter (0,2 µm) extrudiert. Die Tröpfchengröße der so erhaltenen homogenen, gelblich-trüben O/W-Emulsion betrug ca. 230 nm.

Beispiel 22 Herstellung einer 20%-igen O/W-Emulsion:

1 g Cremophor S9 (BASF) wurde in etwa 50 ml bidestilliertem Wasser suspendiert und anschließend 20 ml filtriertes Sojaöl (Lipoid KG, Ludwigshafen) dazugefügt. Nach Zusatz von bidestilliertem Wasser ad 100 ml wurde die Mischung 1 min mit einem Ultra-Turrax (8000 U/min) vordispergiert. Anschließend wurde diese Vordispersion je 10 mal über zwei übereinandergelegte Polycarbonatfilter (0,1 µm) extrudiert. Die Tröpfchengröße der so erhaltenen homogenen, milchig-trüben O/W-Emulsion betrug ca. 880 nm.

Claims

1. Eine Hochdruckextrusionsmethode zur Herstellung von Liposomen.

2. Eine Methode gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Drücke über 6,5 MPa verwendet werden.

3. Eine Methode gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß Lipid gemische mit Cholesterolanteilen oberhalb 30 mol-% verarbeitet werden können.

4. Eine Methode gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß Produkt flüsse < 150 ml/min erreicht werden können.

5. Eine Methode gemäß Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, daß die Liposomenherstellung kontinuierlich erfolgen kann.

6. Eine Methode gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die in einem Gang herzustellenden Mengen oberhalb 100 ml liegen.

7. Eine Methode gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß Lipidkonzentrationen < 400 mg/ml verarbeitet werden können.

8. Eine Methode gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß uni- oder multilamellare Liposomen zwischen 25 nm und 5 µm herstellbar sind.

9. Eine Methode gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Hochdruckextrusion über Filter aus geeigneten Materialien erfolgt.

10. Eine Methode gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß Metallfilter verwendet werden.

11. Eine Methode gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß Polymer membranen verwendet werden.

12. Eine Methode gemäß Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß das verwendete Material Polycarbonat ist.

13. Eine Methode gemäß Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß das verwendete Material Polytetrafluorethylen (PTFE) ist.

14. Eine Methode gemäß Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß das verwendete Material Polypropylen (PP) ist.

15. Eine Methode gemäß Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß Celluloseester verwendet werden.

16. Eine Methode gemäß Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß das verwendete Material Celluloseacetat ist.

17. Eine Methode gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß das verwendete Material ein anorganischen Material ist.

18. Eine Methode gemäß Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß das verwendete Material Glasfaser ist.

19. Eine Methode gemäß Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß das verwendete Material Anopore^TM ist.

20. Eine Methode gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Porengröße der verwendeten Membranen im Bereich zwischen 0,01 und 35 µm liegt.

21. Eine Methode gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Hochdruckextrusion über einen oder mehrere übereinandergelegte Filter erfolgt.

22. Eine Methode gemäß Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß die über einandergelegten Filter dieselbe Porengröße aufweisen.

23. Eine Methode gemäß Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß die übereinandergelegten Filter unterschiedliche Porengrößen aufweisen.

24. Eine Methode gemäß Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß die Lipo somendispersion mehr als dreimal durch entsprechende Filter extrudiert wird.

25. Eine Methode gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Hochdruckextrusion sequentiell über einen oder mehrere übereinandergelegte Filter absteigender Porengröße erfolgt.

26. Eine Methode gemäß Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß die übereinandergelegten Filter dieselbe Porengröße aufweisen.

27. Eine Methode gemäß Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß die übereinandergelegten Filter unterschiedliche Porengrößen aufweisen.

28. Eine Methode gemäß Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß die Lipo somendispersion mehr als dreimal durch entsprechende Filter extrudiert wird.

29. Eine Hochdruckextrusionsmethode zur Herstellung von Liposomen ohne vorherige Filmbildung.

30. Eine Methode gemäß Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, daß Drücke über 6,5 MPa verwendet werden.

31. Eine Methode gemäß Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, daß Lipidkonzentrationen < 400 mg/ml verarbeitet werden können.

32. Eine Methode gemäß Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, daß Lipidge mische mit Cholesterolanteilen oberhalb 30 mol% verarbeitet werden können.

33. Eine Methode gemäß Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, daß Produktflüsse < 150 ml/min erreicht werden können.

34. Eine Methode zur Herstellung von Liposomen mit hohen Einschlüssen an Röntgenkontrastmitteln basierend auf einer ein- oder mehrfachen Hoch druckextrusion von Lipiddispersionen über einen oder mehrere geeignete Filter.

35. Eine Methode gemäß Anspruch 34, dadurch gekennzeichnet, daß das verwendete Kontrastmittel iodhaltig ist.

36. Eine Methode gemäß Anspruch 35, dadurch gekennzeichnet, daß das verwendete Kontrastmittel vom Typ der Triiodbenzoesäure ist.

37. Eine Methode gemäß Anspruch 36, dadurch gekennzeichnet, daß das verwendete Kontrastmittel Iopromid ist.

38. Eine Methode gemäß Anspruch 36, dadurch gekennzeichnet, daß das verwendete Kontrastmittel Iotrolan ist.

39. Eine Methode gemäß Anspruch 36, dadurch gekennzeichnet, daß das verwendete Kontrastmittel ZK 139129 ist.

40. Eine Methode gemäß Anspruch 34, dadurch gekennzeichnet, daß durch einen oder mehrere Einfrier/Auftau-Zyklen eine weitere Einschlußerhöhung erzielt werden kann.

41. Eine Methode zur Herstellung von Liposomen mit hohen Einschlüssen an NMR-Kontrastmitteln, basierend auf einer ein- oder mehrfachen Hoch druckextrusion von Lipiddispersionen über einen oder mehrere geeignete Filter.

42. Eine Methode gemäß Anspruch 41, dadurch gekennzeichnet, daß das verwendete NMR-Kontrastmittel paramagnetische Metallionen enthält.

43. Eine Methode gemäß Anspruch 42, dadurch gekennzeichnet, daß das verwendete Kontrastmittel Gd-DTPA ist.

44. Eine Methode gemäß Anspruch 42, dadurch gekennzeichnet, daß das verwendete Kontrastmittel Gd-EOB ist.

45. Eine Methode gemäß Anspruch 42, dadurch gekennzeichnet, daß das verwendete Kontrastmittel Gadobutrol ist.

46. Eine Hochdruckextrusionsmethode zur Herstellung von Liposomen mit hohen Einschlüssen an hydrophilen Arzneistoffen.

47. Eine Methode gemäß Anspruch 46, dadurch gekennzeichnet, daß die Hochdruckextrusion sequentiell über einen oder mehrere übereinandergelegte Filter absteigender Porengröße erfolgt.

48. Eine Methode gemäß Anspruch 47, dadurch gekennzeichnet, daß Drücke über 6,5 MPa verwendet werden.

49. Eine Methode gemäß Anspruch 46, dadurch gekennzeichnet, daß Einschlüsse über 40% erzielt werden.

50. Eine Methode gemäß Anspruch 49, dadurch gekennzeichnet, daß hohe Einschlüsse bereits bei Lipidkonzentrationen zwischen 100 und 150 mg/ml erreicht werden.

51. Eine Hochdruckextrusionsmethode zur Herstellung von Liposomen mit lipophilen Arzneistoffen.

52. Eine Methode gemäß Anspruch 51, dadurch gekennzeichnet, daß die Hochdruckextrusion sequentiell über einen oder mehrere übereinandergelegte Filter absteigender Porengröße erfolgt.

53. Eine Methode gemäß Anspruch 52, dadurch gekennzeichnet, daß Drücke über 6,5 MPa verwendet werden.

54. Eine Methode gemäß Anspruch 51, dadurch gekennzeichnet, daß der lipophile Arzneistoff durch Dispergieren in der fertig extrudierten Liposomensuspension verkapselt wird.

55. Eine Methode gemäß Anspruch 54, dadurch gekennzeichnet, daß der lipophile Arzneistoff quantitativ verkapselt ist.

56. Eine Hochdruckextrusionsmethode zur Herstellung lagerstabiler Liposomen suspensionen.

57. Eine Methode gemäß Anspruch 56, dadurch gekennzeichnet, daß die Hochdruckextrusion sequentiell über einen oder mehrere übereinandergelegte Filter absteigender Porengröße erfolgt.

58. Eine Methode gemäß Anspruch 57, dadurch gekennzeichnet, daß Drücke über 6,5 MPa verwendet werden.

59. Eine Methode gemäß Anspruch 58, dadurch gekennzeichnet, daß hydrophile Arzneistoffe in den Liposomen verkapselt werden.

60. Eine Methode gemäß Anspruch 59, dadurch gekennzeichnet, daß bei Nichtabtrennung des Arzneistoffs stabile Liposomensuspensionen erhalten werden.

61. Eine Methode gemäß Anspruch 58, dadurch gekennzeichnet, daß lipophile Arzneistoffe in den Liposomen verkapselt werden.

62. Eine Hochdruckextrusionsmethode zur Herstellung steriler Liposomen suspensionen.

63. Eine Methode gemäß Anspruch 62, dadurch gekennzeichnet, daß die Hoch druckextrusion sequentiell über einen oder mehrere übereinandergelegte Filter absteigender Porengröße erfolgt.

64. Eine Methode gemäß Anspruch 63, dadurch gekennzeichnet, daß Drücke über 6,5 MPa verwendet werden.

65. Eine Methode gemäß Anspruch 63, dadurch gekennzeichnet, daß Porengrößen unterhalb 0,45 µm verwendet werden.

66. Eine Methode gemäß Anspruch 65, dadurch gekennzeichnet, daß Polymer membranen verwendet werden.

67. Eine Methode gemäß Anspruch 65, dadurch gekennzeichnet, daß anorganische Membranmaterialien verwendet werden.

68. Eine Hochdruckextrusionsmethode zur Herstellung von Emulsionen.

69. Eine Methode gemäß Anspruch 68, dadurch gekennzeichnet, daß eine Vordispersion der Emulsionsbestandteile bei Drücken über 6,5 MPa ein oder mehrfach über einen oder mehrere Filter extrudiert wird.

70. Eine Methode gemäß Anspruch 68, dadurch gekennzeichnet, daß Produktflüsse < 150 ml/min erreicht werden können.

71. Eine Methode gemäß Anspruch 68, dadurch gekennzeichnet, daß die Emulsionsherstellung kontinuierlich erfolgen kann.

72. Eine Methode gemäß Anspruch 68, dadurch gekennzeichnet, daß die in einem Gang herzustellenden Mengen oberhalb 100 ml liegen.

73. Eine Methode gemäß Anspruch 68, dadurch gekennzeichnet, daß die Tröpfchengröße der inneren Phase zwischen 0,1 und 20 µm eingestellt werden kann.

74. Eine Methode gemäß Anspruch 69, dadurch gekennzeichnet, daß die erhaltenen Emulsionen lagerungsstabil sind.

75. Eine Methode gemäß Anspruch 69, dadurch gekennzeichnet, daß sterile Emulsionen erhalten werden.