EP0665756A1 - Verfahren und vorrichtung zur herstellung flüssiger, disperser systeme - Google Patents

Verfahren und vorrichtung zur herstellung flüssiger, disperser systeme

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EP0665756A1
EP0665756A1 EP93922883A EP93922883A EP0665756A1 EP 0665756 A1 EP0665756 A1 EP 0665756A1 EP 93922883 A EP93922883 A EP 93922883A EP 93922883 A EP93922883 A EP 93922883A EP 0665756 A1 EP0665756 A1 EP 0665756A1
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EP
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liquid
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disperse systems
disperse
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Andreas Sachse
Thomas Schneider
Georg Rössling
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Individual
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Definitions

  • the invention relates to a method and a device for producing liquid, disperse systems.
  • lipid vesicles Due to the hydrophobic interactions, spontaneously closed lipid vesicles, which are called liposomes, are formed after dispersion of phospholipids in water. These are spherical or elliptical hollow bodies with one or more lipid bilayers, which include an aqueous phase. According to their size, a distinction is made between small, unilamellar (small unilamellar vesicles [SUV] with radii from 25 to 50 nm) and large, unilamellar vesicles (large unilamellar vesicles [LUV] with radii greater than 50 nm up to 10 ⁇ m) (Weiner, N ., Martin, F., Riaz, M., Drug Dev. Ind. Pharm. 15_, 1523-1554 (1989)).
  • SUV small unilamellar vesicles
  • LUV large unilamellar vesicles
  • multilamellar liposomes multilamellar vesicles [MLV]
  • MLV multilamellar vesicles
  • MW multivesicular liposomes
  • the liposomes are suitable for the inclusion of both hydrophilic and lipophilic drugs, the extent and location of the inclusion depending on the physicochemical properties of the drug and the lipid composition of the liposomes.
  • lipid film is first formed by rotary evaporation of an organic solution of the lipid or lipid mixture (for example in chloroform, methanol or diethyl ether). To completely remove the residual solvent, a 12-24 hour lyophilization is then often carried out under high vacuum. Subsequent addition of an aqueous phase and simple shaking (the so-called hand-shake method according to Bangham, Bangham, AD, Standish, MM, Watkins, J.C, J. Mol. Biol. 12, 238-252 (1965)) gives an MLV suspension that is extremely heterogeneous in terms of liposome size and lamellarity.
  • the oldest and most widespread method of producing SUVs is the so-called "sonication method" (ultra-sonication method).
  • MLV are crushed by ultrasound (ultrasonic wand or ultrasonic bath).
  • the liposomes thus obtained have an average diameter of 20 to 60 nm and an inclusion capacity of less than 1%.
  • the disadvantages of this method lie above all in the high supply of heat, which can lead to decomposition of the lipid or the pharmaceutical substance, and in the difficulty in reproducibly processing even large amounts of samples.
  • the ultrasound rod there is also the disadvantage of contamination of the sample with titanium chips and the formation of an aerosol (see the already cited publication by R.R.C. New).
  • the main disadvantage is the occurrence of device wear (annular gap etc.) and the difficult control of the product temperature.
  • Microfluidizer TM Mayhew, E., Lazo, R., Vail, WJ, King, J., Green, AM, Biochim. Biophys. Acta 775, 169-174 (1984) ).
  • an MLV dispersion or a coarse, aqueous lipid dispersion is first introduced into a reservoir and pressed by means of a high-pressure pump via a pre-filter (5 ⁇ m) into a so-called interaction chamber, in which the liquid flow in micro-channels is split into two individual flows, which are then split up be reunited at high speed. After exiting the interaction chamber, the dispersion obtained can either be removed or recirculated.
  • the continuous process according to the invention for the production of liquid dispersions does not have the disadvantages of the previously known processes. It is characterized in that a predispersion under high pressure of 6.6 to 250 MPa is sequentially extruded over 1 to 8 filter stages of decreasing pore size between 0.01 and 35 ⁇ m, it being possible to use up to 20 passages per filtration stage.
  • the process according to the invention is preferably carried out at a working pressure of 7 to 80 MPa.
  • the extrusion can take place at each filtration stage using one or a combination of 2-4 filters of the same or different pore size.
  • membrane filters such as polycarbonate membranes (surface filters) from Nucleopore (Tübingen) are used.
  • filters are metal or polymer membranes or inorganic materials such as glass fiber or Anopore R membranes (Anotec, Banbury Oxon, England).
  • suitable polymer materials are filters made of polytetrafluoroethylene (PTFE), polypropylene (PP), polyvinylidene fluoride or cellulose esters such as cellulose acetate.
  • This device which can be referred to as a continuously operating high-pressure extrusion apparatus (see Fig. 1), is characterized by a storage vessel (1), the drain line of which leads to a high-pressure pump (2) which is designed to build up working pressures of a maximum of 250 MPa. On the output side, this pump is connected to a filter holder (6) intended for receiving the filters used according to the invention, from which the product is connected
  • the high-pressure pump is preferably designed to build up working pressures of up to 80 MPa. Between the high-pressure pump and the filter holder, a pre-filter holder can also be attached, which is designed to hold filters with an average pore size of 2 to 35 ⁇ m. Furthermore, the device according to the invention can also be equipped with ventilation devices and / or temperature and pressure measuring devices.
  • Suitable pumps for the device according to the invention are, for example, pneumatic or hydraulic piston pumps (for example Maximator®, Schmidt, Kranz & Co., Zorge, Germany). Suitable pumps are usually those that have a span factor of around 50 to 750 and can therefore generate working pressures between 5 and 300 MPa from 0.1 to 0.4 MPa inlet pressure (air or nitrogen).
  • the devices according to the invention are expediently provided with a control valve (3), by means of which the pressure to be used in the method according to the invention can be set in a targeted manner.
  • resulting product flows are usually between 0.1 and 10 liters per minute, preferably 0.15 to 3 liters per minute.
  • the high pressures which can be used in the method according to the invention also eliminate the problem of filter clogging which occurs in other methods, as a result of which interruptions in the process for changing the filter are eliminated.
  • the storage vessel used in the device according to the invention can be designed in such a way that it can be temperature-controlled; the lines can be metal tubes or hose lines.
  • the product can also be returned via a two-chamber storage container or a liquid spiral, optionally also with heat exchange.
  • the device is to be used for the production of pharmaceutical preparations, all parts of the product in contact with it must be sterilizable and resistant to the solvents used in it.
  • the device is preferably made of materials which permit heat sterilization.
  • the high-pressure extrusion apparatus enables liquid dispersions to be produced continuously and in large quantities, as a result of which the production outlay for the dispersions is significantly reduced and the economy of the process is thus significantly improved.
  • the apparatus used in the exemplary embodiments has filter holders which allow the use of membrane filters with a diameter of 47 mm.
  • the pressure holding capacity of the filter holder used here is 80 MPa.
  • This device allows the rapid production of dispersions in the range of 100 to 1000 ml (dead volume of the system about 10 ml).
  • flows can be achieved with this device that are well above 150 ml per minute.
  • the dispersion is initially collected in a two-chamber system, in order to then return it to the system by simply opening a corresponding valve.
  • This two-chamber system offers the advantage over direct recirculation, since the total amount of dispersion is always subjected to the shear process and there is no mixing of the undispersed and dispersed phase.
  • the same effect can also take place via the recirculation of the dispersion via a liquid spiral, which comprises the total volume of the batch to be processed.
  • the dispersion can be tempered via the outer walls of the corresponding spiral.
  • the device according to the invention is not only suitable for carrying out the method according to the invention, but can also be useful when using lower pressures in the range from 1 to 6.6 MPa.
  • the method according to the invention allows the production of uni- or multilamellar liposomes over a wide limit range (average diameter usually 25 nm to 5 ⁇ m).
  • the size and homogeneity of the size distribution and the lamellarity of the liposomes obtained here are, among other things, a function of the type of filter used and pore size, the filtration pressure (working pressure), the number of passages through the device, the type and concentration of lipid and the type and amount of used drug.
  • lipid constituents can be used as in the other methods of this type.
  • lipids are generally phospholipids such as, for example, phosphatidylcholine, phosphatidylethanolamine, phosphatidylglycerol, phosphatidylserine, phosphatidic acid, phosphatidylinositol or sphingolipids.
  • sterols such as choesterol or other components such as fatty acids (e.g. stearic acid, palmitic acid), dicetyl phosphate or cholesterol hemisuccinate can be used as further constituents.
  • amphiphilic substances such as hexadecylpoly (3) glycerol, dialkylpoly (7) glycerol ether and alkyl glucosides, so-called niosomes, ie liposomes from non-ionic vesicle formers, are obtained.
  • Suitable active ingredients are, for example, vitamins, hormones, antimycotics, antiallergics, antphlogistics, antihypertensives, antiarrhythmics, antibiotics, antivirals, anxiolytics, cytostatics, immunomodulators, contraceptives, peptides, proteins and sedatives.
  • hydrophilic drugs these are generally dissolved in the aqueous phase used to prepare the predispersion and, after the predispersion has been prepared, are subjected to the process according to the invention. Surprisingly, liposomes with particularly high inclusions can be obtained here.
  • the method according to the invention thus proves to be particularly suitable, inter alia, for the encapsulation of contrast media for X-rays (or computed tomography) and NMR diagnostics, which have been inadequately encapsulated using the mechanical dispersion methods known to date.
  • contrast media for X-rays or computed tomography
  • NMR diagnostics which have been inadequately encapsulated using the mechanical dispersion methods known to date.
  • RKM iodine-containing X-ray contrast media
  • high inclusion capacities can be achieved even with small liposome diameters and relatively low lipid concentrations.
  • Combining it with one or more freeze-thaw cycles (freezing and thawing) can further increase inclusion.
  • RKM of the triiodobenzoic acid type are lopromide, lohexol, lopamidol, loversol, lopentol, loxaglate, 3-carbamoyl-5- [N- (2-hydroxyethyl) -acetamido] -2,4,6-triiodobenzoic acid - [(1 RS, 2SR) - 2,3-dihydroxy-1-hydroxymethylpropyl] amide and lotrolan.
  • NMR contrast agents which are particularly suitable for encapsulation are Gd-DTPA, Gd-EOB-DTPA, Gd-BOPTA, Gd-DOTA, Gadobutrol and Mn-DPDP (US Pat. Nos. 4,957,939, 5,021,236 and Schuhmann-Giampieri, G., Inv. Radiol. 28, (1993) in press).
  • suitable water-soluble substances can also be encapsulated using so-called active ioading techniques (remote loading).
  • active ioading techniques for example, drug-free liposomes are first produced using the high-pressure extrusion technology, which then, e.g. via a pH gradient, with which the substance to be encapsulated is loaded (Cullis, PR, Mayer, L D., Bally, MB, Madden, TD, Hope, MJ, Adv. Drug Delivery Rev. 3, 267-282 (1989) ).
  • the corresponding active ingredient can be encapsulated in the process according to the invention by dissolving or dispersing it in the lipid predispersion or by subsequent stirring into a finished liposome suspension.
  • Such drugs can also be modified
  • the method according to the invention is distinguished from the previously described production methods by a very good reproducibility of the liposome properties produced.
  • the liposomes produced show only slight fluctuations in their properties (especially inclusion, size and size distribution). This reproducibility of the process is not adversely affected by the enlargement of the manufacturing scale.
  • the method according to the invention is also particularly suitable for being carried out under aseptic conditions. This is particularly important in cases where the desired liposomes cannot be subjected to terminal sterile filtration (0.2 ⁇ m) due to their size.
  • sterile filtration 0.2 ⁇ m
  • the end product can usually be sterile filtered (e.g. 0.2 ⁇ m).
  • the method according to the invention offers the possibility of causing germs to be removed from the outset by extrusion using filters of suitable pore size (less than or equal to 0.6 ⁇ m), as a result of which subsequent sterile filtration could be dispensed with.
  • the inventive method is also particularly suitable for the production of storage-stable liposomes.
  • storage-stable liposomes in which the unencapsulated lopromide portion is not separated off, for example after three months of storage in the refrigerator, no decrease in pH and inclusion and no change in the mean diameters can be determined.
  • the process according to the invention for the first time offers the possibility of continuously producing large quantities of emulsions with reproducible properties.
  • the advantages listed above (liposome production) of the high-pressure extrusion process according to the invention also come into play when producing emulsions.
  • the previously not described use of filter extrusion in this area which was only opened by the high-pressure extrusion process according to the invention, enables the flexible production of emulsions over a wide range of sizes (100 nm-20 ⁇ m average diameter of the dispersed phase) without major expenditure on equipment.
  • the process is characterized by the fact that large amounts of the inner phase can be processed, and mostly direct production (without predispersion) is also possible.
  • this process can be used to produce two or multi-phase emulsions (e.g. W / O, O / W, W / O / W or O / W / O).
  • Vegetable oils such as soybean oil, castor oil, safflower oil or olive oil can be used as the oil phase.
  • Suitable emulsifiers are, for example, egg and soy lecithins or pure phospholipids from such fractions.
  • nonionic surfactants such as e.g. higher fatty alcohols, sorbitan fatty acid esters or polyethylene glycol ethers or esters are used.
  • the water phase can consist of pure water (p.i.
  • emulsions for parenteral nutrition can additionally contain sugars such as glucose and xylitol as well as other salts such as sodium dihydrogen phosphate, magnesium chloride or zinc acetate.
  • fats such as medium chain triglycerides may be present in the emulsion.
  • drugs can be dissolved or suspended in one or both phases before the emulsion is prepared or incorporated after the emulsion has been produced, analogously to the processes described in the literature.
  • the corresponding hydrophilic or lipophilic active ingredients can, for example, belong to the substance classes listed above (liposome production).
  • EPS egg phosphatidylserine, Lipoid EPS, Lipoid KG
  • PCS Pnotonic correlation spectroscopy method for measuring
  • the device is a continuously operating high-pressure extrusion apparatus, shown schematically in Figure 1.
  • a temperature-controlled storage vessel (1) which is connected via a pipe connection to a pneumatic piston air pump (2) which has a transformation factor of approximately 250.
  • the piston air pump is operated with nitrogen, with the inlet pressure being set via an inlet valve (3).
  • a pipe connection leads from the high-pressure pump via a vent valve (4) and a pressure gauge (5) to a high-pressure filter holder (6), which is suitable for holding membrane filter disks with a diameter of 47 mm.
  • the dispersion emerging from the filter holder is discharged via a hose connection (7), which is used either for product removal or for product return to the storage vessel (1).
  • This device shown schematically in Figure 2, is also a continuously operating high-pressure extrusion apparatus.
  • a metal cup pre-filter (6) with a pore diameter of, for example, 35 ⁇ m is installed behind the manometer (5).
  • REPLACEMENT LEAF Two-chamber storage vessel (1) leads.
  • the outlet of the upper of the two vessels (1a) is provided with a three-way valve (1c), which allows the dispersion contained therein to be removed in whole or in part or to be fed through the lower vessel (1b) again to the high-pressure extrusion process.
  • the mean vesicle diameter is determined by means of PCS (Submicron particle sizer autodilute model 370, Nicomp Instr. Corp., Goleta, CA).
  • Example B 1 Preparation of a liposome suspension with 50 mg SPC / ml
  • the predispersion obtained in this way is filtered sequentially with the apparatus according to the invention at a working pressure between 3 and 10 MPa, each 5 times over 2 polycarbonate membranes of decreasing pore size (5.0, 1.0, 0.4, 0.2, 0.1, 0.05 and 0.03 ⁇ m).
  • the liposome suspension obtained is slightly opalescent and the liposomes have an average diameter of 64 nm.
  • Example B 2 Preparation of a liposome suspension with 200 mg SPC / ml
  • the liposome suspension obtained is slightly opalescent and the liposomes have an average diameter of 73 nm.
  • Example B 3 Preparation of a liposome suspension with 400 mg SPC / ml
  • the liposome suspension obtained has a gel-like consistency and the liposomes have an average diameter of 74 nm.
  • Example B 5 Preparation of a liposome suspension with a reduced number of extrusion steps
  • the liposome suspension obtained is highly transparent to slightly opalescent and the liposomes have an average diameter of 68 nm.
  • Example B 6-B 18 Use of Different Lipids and Lipid Mixtures
  • Placebo liposomes with different lipid compositions are produced as described below:
  • lipid film is carried out by rotary evaporation of an organic lipid solution (ethanol, methanol or chloroform / ethanol - depending on
  • Solubility at elevated temperature (e.g. 50 ° C).
  • the lipid film is dispersed with buffer solution above the phase transition temperature of the lipid mixture used (swelling time at least 15 min, shaking by hand - at least 2 min)
  • Pore size (5.0, 1.0, 0.4, 0.2, 0.1, 0.05 and possibly 0.03 ⁇ m - each 5
  • Example B 19 - B 22 batches with different lipid concentrations
  • Example B 30 - B 33 Influence of the number of passages on the mean vesicle diameter
  • Example B 6-B 18 Four batches are described as described under Example B 6-B 18, but with different numbers of passages (1, 3, 5 and 10) at each extrusion stage.
  • a mixture of SPC, Chol and SPG (6: 3: 1) in Tris buffer serves as lipid. All batches are subjected to a 3-stage extrusion process through membranes with pore sizes of 0.4, 0.1 and 0.03 ⁇ m. The results are shown in Table 4.
  • a 100 ml batch is prepared from SPC: Chol: SPG (6: 3: 1) in Tris buffer with a lipid concentration of 50 mg / ml. Without prior film formation, the lipids are weighed directly into a 100 ml measuring cylinder and mixed with 70 ° C hot Tris buffer. After swelling (30 min), they are dispersed with an Ultraturrax 30 ml at 13500 rpm at the same temperature and then extruded as described in Example B 6-B 18. The end product has an average diameter of 60 nm with a coefficient of variation of 25%.
  • Example B 35 Extrusion using a filter pore size (0.1 ⁇ m)
  • a 100 ml batch is prepared from EPC in Tris buffer with a lipid concentration of 100 mg / ml. Without prior film formation, the lipid is weighed directly into a 100 ml measuring cylinder and Tris buffer is added at room temperature. After swelling (15 min), the mixture is dispersed with an Ultraturrax at 1350 rpm for 10 min at the same temperature and then 10 times each extruded over two superimposed 0.1 ⁇ m polycarbonate filters. The end product has an average diameter of approx. 120 nm with a variation coefficient of 32%.
  • Example B 36 Preparation of a large batch (1 l liposome suspension) with high flow rates
  • a 1000 ml batch is prepared from SPC in Tris buffer with a lipid concentration of 100 mg / ml. Without prior film formation, the lipid is directly in one
  • the flow rate is independent of the pore size
  • Liposomes have an average diameter of approx. 110 nm at one
  • a 100 ml batch is prepared from SPC in Tris buffer with a lipid concentration of 500 mg / ml. Without prior film formation, the lipid is weighed directly into a 100 ml measuring cylinder and Tris buffer is added at room temperature. After swelling (30 min), the mixture is dispersed with an Ultraturrax for 10 min at 13,500 rpm at the same temperature, a gel-like consistency being obtained. This gel is then extruded twice sequentially over two superimposed polycarbonate filters (1, 0 - 0.2 and 0.1 ⁇ m) without the membranes becoming blocked.
  • the liposomes (gel) obtained after 2 passages through the last filter combination (0.1 ⁇ m) have an average diameter of approx. 180 nm with a variation coefficient of 41%.
  • Example B 38 Preparation of a batch using polytetrafluoroethylene (PTFE) filters
  • a 100 ml batch is prepared from SPC in Tris buffer with a lipid concentration of 100 mg / ml. Without prior film formation, the lipid is weighed directly into a 100 ml measuring cylinder and Tris buffer is added at room temperature. After swelling (15 min), the mixture is dispersed with an Ultraturrax for 10 min at 13,500 rpm at the same temperature. This predispersion is then extruded 10 times sequentially over two superimposed PTFE filters (5.0 - 1.2 and 0.2 ⁇ m).
  • the liposomes obtained after 10 passages through the last filter combination (0.2 ⁇ m) have an average diameter of approx. 210 nm with a variation coefficient of approx. 30%.
  • Example B 39 Preparation of a batch using a metal (cup) filter (5 ⁇ m)
  • a 1000 ml batch is prepared from SPC in Tris buffer with a lipid concentration of 100 mg / ml. Without prior film formation, the lipid is weighed directly into a 1000 ml measuring cylinder and Tris buffer is added at room temperature. After swelling (15 min), the mixture is dispersed with an Ultraturrax for 10 min at 13500 rpm at the same temperature and then extruded 10 times through a metal (cup) filter with a nominal pore size of 5 ⁇ m. The liposomes obtained after 10 passages have an average diameter of approximately 1.4 ⁇ m with a coefficient of variation of approximately 80%.
  • a 100 ml batch is prepared with 4 g of VolpoN3 (polyoxyethylene glycol-lauryl alcohol) and 1 g of cholesterol in Tris buffer. Without prior film formation, the lipids are weighed directly into a 100 ml measuring cylinder and Tris buffer is added at RT. After swelling (15 min), they are dispersed with an Ultraturrax for 10 min at 13,500 rpm at the same temperature and then sequentially extruded 5 times each over two superimposed polycarbonate filters of decreasing pore size (5.0 - 0.2 and 0.05 ⁇ m) . The end product has an average diameter of 53 nm with a coefficient of variation of 33%.
  • VolpoN3 polyoxyethylene glycol-lauryl alcohol
  • Example B 41 - B 44 Inclusion of lopromide using various manufacturing methods
  • Example B 45-B 49 lopromide inclusion and vesicle size depending on the pore size of the last extrusion step
  • Example B 43 Batches are prepared and characterized as in Example B 43, but with the change that the pore size of the last extrusion step is varied with each batch.
  • the last pore sizes are 1.0, 0.4, 0.2, 0.1 and 0.05 ⁇ m.
  • the Freeze-Thaw cycles are carried out after extrusion through 5.0 ⁇ m.
  • the lipid concentration is 150 mg / ml.
  • Table 6 The mean values and coefficients of variation of the results from three approaches are summarized in Table 6.
  • Example B 50-B 53 lopromide inclusion and vesicle size as a function of the lipid concentration
  • Example B 43 Batches are prepared and characterized as in Example B 43, but with the change that different lipid concentrations (50, 100, 150 and 160 mg / ml) are used.
  • the mean values and coefficients of variation of the results from three approaches are summarized in Table 7.
  • Example B 54 Three-month stability of lopromide liposomes
  • Table 8 shows the properties of the corresponding liposomes at the respective times.
  • Example B 55- B 57 Inclusion of Gd-DTPA using various manufacturing methods
  • Example B 6-B 18 100 ml of liposome suspensions are prepared as described under Example B 6-B 18, which contain the water-soluble, ionic MRI contrast agent gadopentetic acid dimeglumine salt (hereinafter only called Gd-DTPA).
  • Gd-DTPA water-soluble, ionic MRI contrast agent gadopentetic acid dimeglumine salt
  • the Gd concentration in the end product is 180 ⁇ mol / g
  • SPC and Chol in a molar ratio (7: 3) are used as lipids.
  • the starting solution is with
  • REPLACEMENT LEAF Water 1 1 diluted Magnevist ® used.
  • the pore size of the last extrusion stage is 0.1 ⁇ m.
  • the manufacturing processes differ as follows:
  • Example B 57 Method as described in Example B 6, but after extrusion through a 0.4 ⁇ m pore size, the batch is subjected to 3 freeze-thaw cycles (Freeze-Thaw). Is frozen in glass vials in methanol / dry ice at -70 to -80 ° C, thawed in a water bath at + 70 ° C. Extrusion is carried out at room temperature.
  • Example B 58-B 60 Gd-DTPA inclusion and vesicle size as a function of the pore size of the last extrusion step
  • Example B 57 Batches are prepared and characterized as in Example B 57, but with the change that the pore size of the last extrusion step is varied with each batch.
  • the last pore sizes are 0.2, 0.1 and 0.05 ⁇ m.
  • the mean values and variation coefficients of the results from three approaches are summarized in Table 10.
  • Example B 61 - B 63 Gd-DTPA inclusion and vesicle size depending on the lipid concentration
  • Example B 57 Batches are prepared and characterized as in Example B 57, but with the change that different lipid concentrations (100, 150 and 200 mg / ml) are used.
  • the mean values and variation coefficients of the results from three approaches are summarized in Table 11.
  • Example B 64 Preparation of liposomes with a lipophilic drug (methyiprednisolone aconate - MPA)
  • the liposomes thus obtained have an average diameter of 189 nm with a coefficient of variation of 30%.
  • the MPA is completely encapsulated in the liposomes.
  • Lipoid E 80 1.5 g of Lipoid E 80 are suspended in about 50 ml of double-distilled water and then 5 ml of filtered soybean oil (both Lipoid KG, Ludwigshafen) are added. After adding double-distilled water to 100 ml, the mixture is predispersed for 10 minutes with an Ultra-Turrax (13500 rpm). This predispersion is then extruded 10 times over two superimposed polycarbonate filters (0.1 ⁇ m). The droplet size of the homogeneous, yellowish-cloudy O / W emulsion thus obtained is approximately 430 nm.
  • Example B 66 Preparation of a 5% O / W emulsion using a PTFE filter
  • Lipoid E 80 1.5 g of Lipoid E 80 are suspended in about 50 ml of bidistilled water and then 5 ml of filtered soybean oil (both Lipoid KG, Ludwigshafen) are added. After adding double-distilled water to 100 ml, the mixture is predispersed for 10 min with an Ultra-Turrax (13500 rpm). This predispersion is then extruded 10 times each over two superimposed PTFE filters (0.2 ⁇ m). The droplet size of the homogeneous, yellowish-cloudy O / W emulsion thus obtained is approximately 230 nm.
  • Example B 67 Preparation of a 20% O / W emulsion
  • Cremophor S9 1 g of Cremophor S9 (BASF) is suspended in about 50 ml of double-distilled water and then 20 ml of filtered soybean oil (Lipoid KG, Ludwigshafen) are added. After adding distilled water to 100 ml, the mixture is predispersed for 1 min with an Ultra-Turrax (8000 rpm). This predispersion is then extruded 10 times over two superimposed polycarbonate filters (0.1 ⁇ m). The droplet size of the homogeneous, milky, cloudy O / W emulsion thus obtained is approximately 880 nm.

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Abstract

Es wird ein kontinuierliches Verfahren zur Herstellung flüssiger, disperser Systeme beschrieben, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß man eine Vordispersion unter hohem Druck von 6,6 bis 250 MPa sequentiell über 1 bis 8 Filterstufen absteigender Porengröße zwischen 0,01 und 35 νm extrudiert, wobei bis zu 20 Passagen pro Filtrationsstufe angewendet werden können. Ferner wird eine Vorrichtung beschrieben, die zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens dienen kann.

Description

Verfahren und Vorrichtung zur Herstellung flüssiger, disperser Systeme
Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Herstellung flüssiger, disperser Systeme.
Neben der kosmetischen Industrie besteht vor allem in der pharmazeutischen Industrie ein großer Bedarf an Verfahren und Vorrichtungen zur Herstellung disperser Systeme. Dies gilt insbesondere aus dem Grunde, weil man bei der Suche nach neuen Möglichkeiten des Arzneistofftransports sogenannte Arzneistoffträgersysteme (drug- delivery Systems) entwickelte, die disperse Systeme (insbesonders fest/flüssig oder flüssig/flüssig) darstellen. Hierunter zu nennen sind beispielsweise Emulsionen (flüssig/flüssig) für die parenterale Ernährung oder Darreichung schlecht wasserlöslicher Arzneistoffe und insbesondere Liposomensuspensionen, welche als zielgerichtete Arzneistoffträger Anwendung finden können.
Aufgrund der hydrophoben Wechselwirkungen entstehen nach Dispersion von Phospholipiden in Wasser spontan geschlossene Lipidvesikel, welche Liposomen genannt werden. Bei diesen handelt es sich um sphärische oder elliptische Hohlkörper mit einer oder mehreren Lipiddoppelschichten ("bilayer"), welche eine wäßrige Phase einschließen. Gemäß ihrer Größe unterscheidet man hierbei kleine, unilamellare (small unilamellar vesicles [SUV] mit Radien von 25 bis 50 nm) und große, unilamellare Vesikel (large unilamellar vesicles [LUV] mit Radien größer 50 nm bis zu 10 μm) (Weiner, N., Martin, F., Riaz, M., Drug Dev. Ind. Pharm. 15_, 1523- 1554 (1989)).
Ferner kennt man multilamellare Liposomen (multilamellar vesicles [MLV]), bei denen mehrere konzentrisch angeordnete bilayer vorliegen sowie multivesikuläre Liposomen (multivesicular vesicles [MW]), welche in ihrem Lumen wiederum vesikuläre Strukturen aufweisen.
Die Liposomen eignen sich sowohl zum Einschluß hydrophiler als auch lipophiler Arzneistoffe, wobei Umfang und Ort des Einschlusses von den physikochemischen Eigenschaften des Arzneistoffs und der Lipidzusammensetzung der Liposomen abhängig ist.
Alle Verfahren zur Herstellung von Liposomen beinhalten als wichtigsten Schritt die Dispersion des Lipids bzw. Lipidgemisches in einer wäßrigen Phase. Ausgehend hiervon, kann man sämtliche Herstellungsverfahren gemäß der drei Hauptdispersionsprinzipien einteilen. Hierbei unterscheidet man "mechanische
1 ERSATΣBLATT Dispersion" (mechanical dispersion) , "Zwei-Phasen Dispersion" (two-phase dispersion) und "Detergenz-Solubilisation" (detergent solubilization) (New, R. R. C. (Hrsgb.), Liposomes: a practical approach, Oxford University Press, New York, 1990, S. 33).
Bei den Methoden, die eine "Zwei-Phasen Dispersion" beinhalten, sind vor allem die begrenzte Löslichkeit einiger Lipide in organischen Lösungsmitteln sowie der hohe Aufwand bei der Entfernung der verwendeten Lösungsmittel (wie Chloroform, Methanol, Dieethylether), zur Absenkung der Restlösemittelkonzentration auf tolerierbare Konzentrationen (Toxizität), nachteilig. Die "Detergenz- Solubilisationsmethoden" weisen den Nachteil des nur schwierig aus der Präparation zu entfernenden Restdetergenzgehalts auf.
Bei den sogenannten "mechanischen Dispersionsverfahren" wird demgegenüber auf die Verwendung organischer Lösungsmittel oder Detergenzien während der Dispersion des Lipids in der Wasserphase verzichtet. In der Regel wird hierbei zunächst ein Lipidfilm durch Rotationsverdampfung einer organischen Lösung des Lipids bzw. Lipidgemischs (zum Beispiel in Chloroform, Methanol oder Diethylether) gebildet. Zur vollständigen Entfernung des Restlösemittels erfolgt danach oftmals eine 12-24 stündige Lyophilisation bei hohem Vakuum. Durch anschließende Zugabe einer wäßrigen Phase und bloßes Schütteln (die sogenannte hand-shaken method nach Bangham, Bangham, A. D., Standish, M. M., Watkins, J. C, J. Mol. Biol. 12, 238-252 (1965)) erhält man eine MLV-Suspension die hinsichtlich der Liposomengröße und Lamellarität äußerst heterogen ist.
Zur Weiterverarbeitung entsprechender MLV-Suspensionen existieren mehrere Verfahren, bei denen in der Regel SUV oder LUV erhalten werden.
Die älteste und am weitesten verbreitete Methode zur Herstellung von SUV ist die sogenannte "sonication method" (Ultrabeschallungsmethode). Hierbei werden MLV durch Ultrabeschallung (Ultraschallstab oder Ultraschallbad) zerkleinert. Die so erhaltenen Liposomen haben einen mittleren Durchmesser von 20 bis 60 nm und eine Einschlußkapazität unter 1%. Die Nachteile dieser Methode liegen vor allem in der hohen Wärmezufuhr, die zu einer Zersetzung des Lipids bzw. des Arzneistoffs führen kann sowie in der Schwierigkeit auch größere Probenmengen reproduzierbar zu verarbeiten. Bei der Verwendung des Ultraschallstabs besteht darüberhinaus der Nachteil der Verunreinigung der Probe mit Titansplittern sowie der Bildung eines Aerosols (siehe die bereits zitierte Publikation von R.R.C. New).
2 ERSATΣBLATT Eine weitere Methode zur Herstellung von kleinen uni- oder oligolamellaren Liposome ist die "french press method", deren Name auf die dabei verwendet Hochruckapparatur (french press) zurückgeht. Diese Anlage besteht aus eine elektrischen, hydraulischen Presse und einer Hochdruckzelle, die je nach Ausführun ein maximales Fassungsvolumen von 4 oder 40 ml aufweist (New R.R.C.; siehe oben). Nachteilig an dieser Methode ist neben dem begrenzten Volumen der z verarbeitenden Dispersionen vor allem die Tatsache, daß die fertige Liposomensuspensionen in der Regel mit Abriebrückständen der Druckkammer ode einem Anteil nicht zerkleinerter MLV kontaminiert sind sowie die Schwierigkeit den Temperaturanstieg in der Kammer zu kontrollieren.
In jüngster Zeit fanden auch sogenannte Hochdruckhomogenisatoren Eingang in di
Liposomentechnologie. So wurde die Herstellung von SUV mit einem
Kleinstmengenringspalthomogenisator aus MLV- oder Lipiddispersionen (ohn vorherige Filmbildung) beschrieben (Brandl, M., Bachmann, D., Drechsler, M., Bauer,
K. H., Drug Dev. Ind. Pharm. Iß, 2167-2191 (1990)).
Dieses Verfahren erlaubt die reproduzierbare Herstellung kleiner Mengen homogene
SUV-Dispersionen mit sehr kleinen mittleren Durchmessern (< 50 nm).
Nachteilig ist aber vor allem das Auftreten von Geräteabrieb (Ringspalt etc.) sowie die schwierige Kontrolle der Produkttemperatur.
Neben den vorher beschriebenen Verfahren zur Herstellung von SUV gibt es auch mehre mechanische Verfahren zur Herstellung von LUV, die ebenfalls unte Verwendung von Vordispersionen (Liposomen oder Lipid) arbeiten. Das älteste dieser Verfahren ist die die sogenannte "extrusion method". Bei diesem Verfahren wird eine MLV-Dispersion von Hand sequentiell über Filterhalter mit Polycarbonatfiltern absteigender Porengröße (3.0, 1.0, 0.8, 0.6, 0.4 und 0.2 μm) bei Drücken bis zu 0,35 MPa filtriert (Olson, F., Hunt, C. A., Szoka, F. C, Vail, W. J., Papahadjopoulos, D., Biochim. Biophys. Acta SSZ, 9-23 (1979)).
Eine Weiterentwicklung dieser Extrusionsmethoden stellt die sogenannte "LUVET- Methode" (Large unilamellar vesicles by extrusion) dar (WO86/00238, 1986 und Hope, M. J„ Bally, M. B., Webb, G., Cullis, P. R., Biochim. Biophys. Acta fi12, 55-65 (1985)). Bei diesem diskontinuierlichen Verfahren wird eine grobe Lipid- ode Liposomendispersion bei Drücken unterhalb 3,5 MPa mehrfach über zwei übereinandergelegte Polycarbonatfilter mit Porengrößen kleiner/gleich 100 nm extrudiert. Hierbei erhält man unilamellare Liposomen mit einem Durchmesser von 6 bis 100 nm und einem Einschlußvolumen von 1 bis 3 I wäßrige Phase pro mol Lipid. Wird die Liposomensuspension unterhalb einer Lipidkonzentration von ca. 200 μmo
3 ERSATZBLATT pro ml zusätzlich einigen freeze-thaw Zyklen (Einfrieren der Suspension und anschließendes Auftauen - Cullis, P. R., Mayer, L. D., Baliy, M. B., Madden, T. D., Hope, M. J., Adv. Drug Delivery Rev. 3, 267-282 (1989)) unterzogen, so läßt sich eine Steigerung der Einschlußeffizienz feststellen. Bei Verwendung von Drücken von bis zu 5,5 MPa konnten sehr hohe Lipidkonzentrationen verarbeitet werden. Bei den bei dieser Technik verwendeten Druckfiltergeräten, wird die Vordispersion in einen direkt über den Membranen liegenden Aufgußraum gegeben, das Druckgefäß verschlossen und anschließend mittels Druckluft oder Stickstoff der zur Filtration notwendige Druck aufgebaut. Das Filtrat wird über einen Auslaß entnommen und anschließend erneut bis zu 20 mal in den Aufgußraum zurückgeführt. Ein Nachteil der Extrusionsmethoden liegt in der diskontinuierlichen Betriebsweise, den geringen Arbeitsvolumina sowie den niedrigen Filtrationsdrücken der kommerziell verfügbaren Geräte.
Ein relativ neues Verfahren stellt die Hochdruckhomogenisation mit dem sogenannten Microfluidizer™ dar (Mayhew, E., Lazo, R., Vail, W.J., King, J., Green, A.M., Biochim. Biophys. Acta 775, 169-174 (1984)).
Bei dieser Methode wird eine MLV-Dispersion oder eine grobe, wäßrige Lipiddispersion zunächst in ein Reservoir eingebracht und mittels einer Hochdruckpumpe über einen Vorfilter (5 μm) in eine sogenannte Interaktionskammer gepreßt, in der der Flüssigkeitsstrom in Mikrokanälen in zwei Einzelströme aufgespalten wird, die anschließend mit hoher Geschwindigkeit wieder vereinigt werden. Nach Austritt aus der Interaktionskammer kann die erhaltene Dispersion entweder entnommen oder rezirkuliert werden.
Nachteilig bei diesem Verfahren ist vor allem das Auftreten von Metallabrieb in den fertigen Präparationen sowie die Tatsache, daß teilweise ein Verlust bzw. eine Zersetzung des Lipids beobachtet wird (Talsma, H., Özer, A.Y., van Bloois, L., Crommelin, D.J.A., Drug. Dev. Ind. Pharm. 15, 197-207 (1989)). Darüberhinaus läßt sich die Größe und Lamellarität der Liposomen nur über einen begrenzten Bereich reproduzierbar einstellen.
Bei der Herstellung von Emulsionen finden einfache, schnellaufende Rührer, Mixbecher, Rührer mit Rotor und Stator (z.B. Ultra Turrax) sowie Kolloidmühlen Verwendung. Aufgrund verschiedener gerätetechnischer Nachteile sowie der schlechten Reproduzierbarkeit und den geringen Dispersitätgraden, die mit diesen Geräten erzielt werden, haben sich neben der Ultrabeschallung (im Labormaßstab) vor allem die Hochdruckhomogenisationsverfahren, trotz der damit verbundenen Nachteile, bei der Emulsionsherstellung durchgesetzt (Praveen, T. (Hrsgb.): Specialized drug delivery Systems, Drugs and the pharmaceutical sciences, Bd. 41 ,
4 ERSATZBLATT Marcel Dekker, Inc., New York, Basel 1990, S. 317 ff.). Hierbei sind vor allem der Ringspalthomogenisator der Firma APV Gaulin (Lübeck, Deutschland) bzw. der Microfluidizer™ zu nennen, deren Anwendung z.B. zur Herstellung von Emulsionen für die parenterale Ernährung bereits beschrieben ist (Washington, C, Davis, S.S., Int. J. Pharm. 44, 169-176 (1988) und Muchtar, S., Jacobs, G.P., Benita, S., Tenside Surf. Det. 20, 347-351 (1989)).
Das erfindungsgemäße kontinuierliche Verfahren zur Herstellung flüssiger Dispersionen hat die aufgezeigten Nachteile der vorbekannten Verfahren nicht. Es ist dadurch gekennzeichnet, daß man eine Vordispersion unter hohem Druck von 6,6 bis 250 MPa sequentiell über 1 bis 8 Filterstufen absteigender Porengröße zwischen 0,01 und 35 μm extrudiert, wobei bis zu 20 Passagen pro Filtrationsstufe angewendet werden können.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird vorzugsweise bei einem Arbeitsdruck von 7 bis 80 MPa durchgeführt. Die Extrusion kann dabei auf jeder Filtrationsstufe über jeweils einen oder eine Kombination aus 2 - 4 Filtern gleicher oder unterschiedlicher Porengröße erfolgen. Hierbei werden zumeist Membranfilter wie zum Beispiel Polycarbonatmembranen (Oberflächenfilter) etwa der Firma Nucleopore (Tübingen) verwendet.
Im Gegensatz zu den vorbekannten Verfahren sind aber auch andere Filter ent¬ sprechender Differenzdruckfestigkeit aus unterschiedlichsten Materialien und in den unterschiedlichsten Geometrien (wie zum Beispiel Filterscheiben, -tassen oder - kerzen) zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens geeignet. Geeignete Filter sind Metall- bzw. Polymermembranen oder anorganische Materialien wie beispielsweise Glasfaser- oder AnoporeR-Membranen (Fa. Anotec, Banbury Oxon, England). Beispiele für geeignete Polymermaterialien sind Filter aus Polytetrafluorethylen (PTFE), Polypropylen (PP), Polyvinylidenfluorid oder Celluloseestern wie beispielsweise Celluloseacetat.
Es wurde bereits erwähnt, daß die Erfindung nicht nur ein Verfahren zur Herstellung von flüssigen Dispersionen betrifft, sondern auch eine Vorrichtung zur Durchführung dieses Verfahrens. Diese Vorrichtung, welche als kontinuierlich arbeitende Hochdruckextrusionsapparatur bezeichnet werden kann (s. Abb. 1), ist gekennzeichnet durch ein Vorratsgefäß (1), dessen Abflußleitung zu einer Hochdruckpumpe (2) führt, die zum Aufbau von Arbeitsdrücken von maximal 250 MPa ausgelegt ist. Ausgangsseitig ist diese Pumpe mit einem zur Aufnahme der erfindungsgemäß verwendeten Filter bestimmten Filterhalter (6) verbunden von dem das Produkt über
5 ERSATZBLATT eine Abflußleitung (7) entweder in das Vorratsgefäß rezirkuliert und/oder entnommen wird.
Vorzugsweise ist die Hochdruckpumpe zum Aufbau von Arbeitsdrücken bis maximal 80 MPa ausgelegt. Zwischen Hochdruckpumpe und Filterhalter kann gegebenenfalls noch ein Vorfilterhalter angebracht sein, der zur Aufnahme von Filtern mit einer mittleren Porengröße von 2 bis 35 μm bestimmt ist. Ferner kann die erfindungsgemäße Vorrichtung noch mit Entlüftungsvorrichtungen und/oder Temperatur- und Druckmeßgeräten ausgestattet sein.
Geeignete Pumpen für die erfindungsgemäße Vorrichtung sind beispielsweise pneumatische oder hydraulische Kolbenpumpen (zum Beispiel Maximator®, Fa. Schmidt, Kranz & Co., Zorge, Deutschland). Geeignete Pumpen sind üblicherweise solche, die einen Umspannfaktor von etwa 50 bis 750 aufweisen und somit aus 0,1 bis 0,4 MPa Eingangsdruck (Luft oder Stickstoff) Arbeitsdrücke zwischen 5 und 300 MPa erzeugen können. Zweckmäßigerweise werden die erfindungsgemäßen Vorrichtungen mit einem Regelventil (3) versehen, mittels dessen Hilfe der bei dem erfindungsgemäßen Verfahren anzuwendende Druck gezielt eingestellt werden kann. Bei hohem Druck können dann auch große Mengen an Dispersion mit hohen Konzentrationen an disperser Phase (beispielsweise 500 mg Lipid pro ml wässriger Phase) und dementsprechend hoher Viskosität (gelartig) extrudiert werden, was bei den vorbekannten Verfahren in der Regel nicht möglich ist. Die hierbei resultierenden Produktflüsse liegen in der Regel zwischen 0,1 und 10 Litern pro Minute, vorzugsweise bei 0,15 bis 3 Litern pro Minute.
Durch die hohen bei dem erfindungsgemäßen Verfahren anwendbaren Drücke wird ferner das bei anderen Methoden auftretende Problem der Verstopfung der Filter beseitigt, wodurch Unterbrechungen des Prozesses zum Wechseln der Filter entfallen.
Das in der erfindungsgemäßen Vorrichtung verwendete Vorratsgefäß kann so gestaltet sein, daß es temperierbar ist, die Leitungen können Metallröhren oder Schlauchleitungen sein. Alternativ hierzu kann die Produktrückführung auch über ein Zweikammervorratsbehältnis oder eine Flüssigkeitsspirale gegebenenfalls auch mit Wärmetausch erfolgen.
Wenn die Vorrichtung zur Herstellung pharmazeutischer Präparate verwendet werden soll, müssen alle produktberührenden Teile derselben sterilisierbar und beständig gegen die in ihr verwendeten Lösungsmittel sein. Vorzugsweise ist die Vorrichtung aus solchen Materialien gefertigt, die eine Hitzesterilisation zulassen.
6 ERSATZBLATT Im Gegensatz zu den meisten vorbekannten Vorrichtungen ermöglicht es di erfindungsgemäße Hochdruckextrusionsapparatur, flüssige Dispersionen kontinuierlic und in größeren Mengen herzustellen, wodurch der Herstellungsaufwand für di Dispersionen signifikant gesenkt und somit die Wirtschaftlichkeit des Verfahren deutlich verbessert wird.
So hat die in den Ausführungsbeispielen verwendete Apparatur beispielweis Filterhalter, die die Verwendung von Membranfiltern von 47 mm Durchmesse gestatten. Das Druckhaltevermögen des hierbei verwendeten Filterhalters beträ 80 MPa. Diese Vorrichtung erlaubt die rasche Herstellung von Dispersionen im Bereic von 100 bis 1000 ml (Totvolumen der Anlage etwa 10 ml). Bei der Verwendung vo zwei Filtern mit 47 mm Durchmesser mit einer Porengröße von kleiner/gleich 100 n lassen sich mit dieser Vorrichtung Flüsse erzielen, die deutlich oberhalb 150 ml pr Minute liegen.
Bei entsprechender Auslegung der Apparatur ist jedoch auch die Herstellung i Technikums- und Produktionsmaßstab ohne eine negative Beeinträchtigung de Produkteigenschaften möglich. Bei einer entsprechenden Auslegung der Vorrichtun (Pumpenleistung, Filtergeometrie, Rohrverbindungen etc.) kann man mit de entsprechenden Anlagen die erzielbare Flußrate auf weit über 3 I pro Minute erhöhen Alternativ ist aber auch eine Auslegung solcher Anlagen für sehr klein Produktmengen möglich, wo dies zum Beispiel aus ökonomischen Gründen erwünsch ist.
Bei Vorrichtungen, bei denen nach erfolgter erster Dispersion eine Rückführung de Produktes erfolgen soll, ist es oft zweckmäßig, daß die Dispersion zunächst in einem Zweikammersystem aufgefangen wird, um diese dann durch bloßes Öffnen eines ent sprechenden Ventils erneut in die Anlage zurückzuführen. Diese Zweikammernsystem bietet gegenüber der direkten Rezirkulation den Vorteil, da immer zunächst die Gesamtmenge der Dispersion dem Scherprozeß unterworfen wird und keine Vermischung von undispergierter und dispergierter Phase auftritt. De gleiche Effekt kann auch über die Rezirkulation der Disperison über eine Flüssigkeitsspirale erfolgen, welche das Gesamtvolumen des zu verarbeitenden Ansatzes faßt. Hierbei kann gleichzeitig eine Temperierung der Dispersion über die Außenwände der entsprechenden Spirale erfolgen.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung ist nicht nur zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens geeignet, sondern sie kann auch bei Anwendung niedrigerer Drücke im Bereich von 1 bis 6,6 MPa von Nutzen sein.
7 ERSATZBLATT Die mittels der erfindungsgemäßen Vorrichtung durchführbaren erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung flüssiger Dispersionen sind von besonderer Bedeutung in der pharmazeutischen und kosmetischen Liposomentechnologie, da sie eine wirtschaftliche Produktion großer Liposomenmengen mit reproduzierbaren Eigenschaften (wie zum Beispiel Einschlußmenge, Liposomengröße und -lamellarität) in pharmazeutischer Qualität (zum Beispiel Sterilität und Pyrogenfreiheit) erlauben.
Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt die Herstellung uni- oder multilamellarer Liposomen über einen weiten Grenzbereich (mittlerer Durchmesser in der Regel 25 nm bis 5 μm). Die Größe und Homogenität der Größenverteilung sowie die Lamellarität der hier erhaltenen Liposomen ist unter anderem eine Funktion der verwendeten Filterart, und Porengröße, des Filtrationsdrucks (Arbeitsdruck), der Anzahl der Passagen durch das Gerät, der Lipidart und -konzentration sowie der Art und Menge des eingesetzten Arzneistoffes. Mittels der üblichen Vorversuche, wie sie dem Fachmann geläufig sind, lassen sich durch eine geeignete Wahl dieser Parameter Formulierungen mit sehr enger Größen- und Lamellaritätsverteilung erhalten.
Bei der Liposomenbildung mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens können die gleichen Lipidbestandteile eingesetzt werden, wie bei den übrigen Verfahren dieser Art. Derartige Lipide sind in der Regel Phosphoiipide wie beispielsweise Phosphatidylcholin, Phosphatidylethanolamin, Phosphatidylglycerol, Phosphatidylserin, Phosphatidsäure, Phosphatidylinositol oder Sphingolipide. Darüberhinaus können als weitere Bestandteile Sterole wie beispielsweise Choiesterol oder auch andere Komponenten wie Fettsäuren (z.B. Stearinsäure, Palmitinsäure), Dicetylphosphat oder Cholesterolhemisuccinat eingesetzt werden. Bei Verwendung von amphiphilen Substanzen wie beispielsweise Hexadecylpoly(3)glycerol, Dialkylpoly(7)glycerol-ether und Alkylglucosiden werden sogenannte Niosomen, dies sind Liposomen aus nicht- ionogenen Vesikelbildnern, erhalten.
Mittels der erfindungsgemäßen Vorrichtung und des erfindungsgemäßen Verfahren ist es möglich sowohl hydrophile als auch iipophile Arzneistoffe liposomal zu verkapseln. Geeignete Wirkstoffe sind beispielsweise Vitamine, Hormone, Antimycotica, Antiallergica, Antphlogistica, Antihypertensiva, Antiarrhytmica, Antibiotika, Antiviralia, Anxiolytika, Cytostatika, Immunmodulatoren, Kontrazeptiva, Peptide, Proteine und Sedativa.
8 ERSATZBLATT Im Falle von hydrophilen Arzneistoffen werden diese in der Regel in der zur Herstellung der Vordispersion verwendeten wässrigen Phase gelöst und nach Herstellung der Vordispersion dem erfindungsgemäßen Verfahren unterworfen. Hierbei können überraschenderweise Liposomen mit besonders hohen Einschlüssen erhalten werden.
So erweist sich das erfindungsgemäße Verfahren unter anderem als besonders geeignet zur Verkapselung von Kontrastmitteln für die Röntgen (beziehungsweise Computertomographie) und NMR Diagnostik, die mit den bisher bekannten mechanischen Dispersionsmethoden nur unzureichend verkapselt wurden. Bei Einschluß von jodhaltigen Röntgenkontrastmitteln (RKM) können so auch bei kleinen Liposomendurchmessern und relativ geringen Lipidkonzentrationen hohe Einschlußkapazitäten erzielt werden. Durch Kombination mit einem oder mehreren freeze-thaw Zyklen (Einfrieren und Auftauen) läßt sich eine weitere Einschlußerhöhung erzielen. Besonders geeignete Beispiele für entsprechende RKM vom Typ der Triiodbenzoesäure sind lopromid, lohexol, lopamidol, loversol, lopentol, loxaglat, 3- Carbamoyl-5-[N-(2-hydroxyethyl)-acetamido]-2,4,6-triiod-benzoesäure-[(1 RS, 2SR)- 2,3-dihydroxy-1-hydroxymethylpropyl]-amid und lotrolan.
Im Falle des Einschlusses von Kontrastmitteln für die NMR Diagnostik erweist sich das erfindungsgemäße Verfahren im Hinblick auf die erzielbaren Einschlußkapazitäten gegenüber allen vorbeschriebenen mechanischen Verfahren überlegen. Durch bloße Hochdruckextrusion lassen sich extrem hohe Einschlüsse erhalten, die überraschenderweise durch zusätzliche freeze-thaw Zyklen nicht wesentlich weiter gesteigert werden können. Besonders für die Verkapselung geeignete NMR Kontrastmittel sind hierbei Gd-DTPA, Gd-EOB-DTPA, Gd-BOPTA, Gd-DOTA, Gadobutrol und Mn-DPDP (US-A 4,957,939, US-A 5,021,236 und Schuhmann- Giampieri, G., Inv. Radiol. 28, (1993) in press).
Alternativ hierzu können geeignete, wasserlösliche Substanzen auch mit sogenannten active ioading techniques (remote loading) verkapselt werden. Hierzu werden beispielsweise zunächst arzneistofffreie Liposomen mittels der Hochdruckextrusionstechnik hergestellt, die anschließend, z.B. über einen pH- Gradienten, mit der zu verkapselnden Substanz beladen werden (Cullis, P. R., Mayer, L D., Bally, M. B., Madden, T. D., Hope, M. J., Adv. Drug Delivery Rev. 3, 267-282 (1989)).
Zur Verkapselung lipophiler Substanzen kann bei dem erfindungsgemäßen Verfahren der entsprechende Wirkstoff durch Lösen bzw. Dispergieren in der Lipid-Vordispersion bzw. durch nachträgliches Einrühren in eine fertige Liposomensuspension verkapselt werden. Bei solchen Arzneistoffen kann es sich auch um modifizierte
9 ERSATZBLATT Arzneistoffmoleküle (amphiphile Substanzen) handeln, welche durch entsprechende chemische Modifikation direkt als Liposomenmembranbestandteile fungieren können. Übereinstimmend mit den bisher existierenden Liposomenpräparationsverfahren kann bei lipophilen Arzneistoffen von einer quantitativen Verkapselung der jeweiligen Komponente ausgegangen werden, solange ein kritisches Arzneistoff/Lipidverhältnis nicht überschritten wird. Insofern erweist sich das erfindungsgemäße Verfahren auch hier als besonders geeignet, da durch die Verarbeitbarkeit extrem hoher Lipidkonzentrationen (> 400 mg/ml) auch extrem hohe Konzentrationen lipophiler Arzneistoffe dispergiert werden können.
Das erfindungsgemäße Verfahren zeichnet sich gegenüber den bisher beschriebenen Herstellungsmethoden durch eine sehr gute Reproduzierbarkeit der produzierten Liposomeneingenschaften aus. So kann beispielsweise bei der mehrfachen Herstellung von kontrastmittelhaltigen Liposomen unter identischen Bedingungen nachgewiesen werden, daß die produzierten Liposomen nur geringe Schwankungen hinsichtlich ihrer Eigenschaften (vor allem Einschluß, Größe und Größenverteilung) aufweisen. Diese Reproduzierbarkeit des Verfahrens wird durch die Vergrößerung des Herstellungsmaßstabs nicht negativ beeinträchtigt.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist ferner besonders zur Durchführung unter aseptischen Bedingungen geeignet. Dies ist vor allem in solchen Fällen bedeutsam bei denen die gewünschten Liposomen aufgrund ihrer Größe keiner terminalen Sterilfiltration (0,2 μm) unterzogen werden können. Zur aseptischen Herstellung sind sterilisierte, entpyrogenisierte Geräte sowie sterile und pyrogenfreie Ausgangsstoffe einzusetzen und es ist in Reinräumen der entsprechenden Reinraumklassen zu arbeiten. In allen übrigen Fällen (d.h. letzte Extrusion kleiner/gleich 0,6 μm) kann das Endprodukt zumeist sterilfiltriert (z.B. 0,2 μm) werden. Darüberhinaus bietet das erfindungsgemäße Verfahren die Möglichkeit, durch Extrusion unter Verwendung von Filtern geeigneter Porengröße (kleiner/gleich 0.6 μm) von vornherein eine Entfernung von Keimen zu bewirken, wodurch eine nachträgliche Sterilfiltration entfallen könnte.
Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich darüber hinaus besonders zur Herstellung von lagerstabilen Liposomen. Im Falle der Lagerung von lopromid-haltigen Liposomen, bei denen der unverkapselte lopromidanteil nicht abgetrennt wird, kann so beispielsweise nach dreimonatiger Lagerung im Kühlschrank keine Abnahme des pH- Wertes und des Einschlusses sowie keine Veränderung der mittleren Durchmesser festgestellt werden.
10 ERSATZBLATT im Hinblick auf die Herstellung von Emulsionen bietet das erfindungsgemäße Verfahren erstmals die Möglichkeit der kontinuierlichen Herstellung großer Emulsionsmengen mit reproduzierbaren Eigenschaften. Im wesentlichen kommen auch bei der Emulsionsherstellung die weiter oben aufgeführten Vorteile (Liposomenherstellung) des erfindungsgemäßen Hochdruckextrusionsverfahrens zum Tragen. Der vorher nicht beschriebene Einsatz der Filterextrusion in diesem Bereich, der erst durch das erfindungsgemäße Hochdruckextrusionsverfahren eröffnet wurde, ermöglicht die flexible Herstellung von Emulsionen über einen weiten Größenbereich (100 nm - 20 μm mittlerer Durchmesser der dispergierten Phase) ohne größeren apparativen Aufwand. Das Verfahren zeichnet sich auch in dieser Anwendung durch die Verarbeitbarkeit großer Mengen an innerer Phase aus, wobei zumeist auch eine Direktherstellung (ohne Vordispersion) möglich ist.
Je nach dem gewünschten Anwendungszweck lassen sich mit diesem Verfahren Zwei¬ bzw. Mehrphasenemulsionen (z.B. W/O, O/W, W/O/W oder O/W/O) herstellen. Als Ölphase können dabei beispielsweise pflanzliche Öle wie Soja-, Rizinus-, Saflor- oder Olivenöl Verwendung finden. Geeignete Emulgatoren sind beispielsweise Ei- und Sojalecithine bzw. reine Phospholipe aus solchen Fraktionen. Ferner können beispielsweise auch nichtionische Tenside wie z.B. höhere Fettalkohole, Sorbitanfettsäureester oder Polyethylenglykolether bzw. -ester eingesetzt werden. Die Wasserphase kann aus reinem Wasser (p.i. oder pur.) bzw. wäßrigen Lösungen verschiedener Puffer- oder Salze (z.B. NaCI, KCI) bestehen und auch Zusätze wie beispielsweise Glycerol enthalten. Darüberhinaus können Emulsionen für die parenterale Ernährung zusätzlich Zucker wie Glucose und Xylitol sowie weitere Salze wie Natriumdihydrogenphospnat, Magnesiumchlorid oder Zinkacetat enthalten. Darüberhinaus können auch Fette wie z.B. mittelkettige Triglyceride in der Emulsion vorhanden sein.
Ferner können in einer oder beiden Phasen Arzneistoffe bereits vor der Emulsionsherstellung gelöst oder suspendiert werden bzw. nach vollendeter Emulsionsherstellung, analog zu den in der Literatur beschriebenen Verfahren, eingearbeitet werden. Die entsprechenden hydrophilen oder lipophilen Wirkstoffe können dabei beispielsweise den weiter oben (Liposomenherstellung) aufgeführten Substanzklassen zugehören.
11 ERSATΣB Die nachfolgenden Ausführungsbeispiele dienen zur näheren Erläuterung der erfindungsgemäßen Vorrichtung und des erfindungsgemäßen Verfahrens.
Die hierbei verwendeten Abkürzungen sind folgende:
Chol: Cholesterol, Cholesterol gepulvert, E. Merck, Darmstadt
DCP: Dicetylphosphat, Sigma, St.Louis, MO, USA
EPC: Eiphosphatidylcholin, Lipoid E 100, Lipoid KG, Ludwigshafen
EPS: Eiphosphatidylserin, Lipoid EPS, Lipoid KG
PCS: Pnotonenkorrelationsspektroskopie- Verfahren zur Messung von
Teilchengrößen unter 1 μm
SPA: Sojaphosphatidsäure, Lipoid SPA, Lipoid KG
SPC: Sojaphosphatidylcholin, Lipoid S 100, Lipoid KG
SPE: Sojaphosphatidylethanolamin, Lipoid SPE, Lipoid KG
SPG: Sojaphosphatidylglycerol, Lipoid SPG, Lipoid KG
SS: Stearinsäure, Fluka, CH-Buchs
A.) Ausführungsbeispiele betreffend die erfindungsgemäße Vorrichtung
Beispiel A 1 :
Die Vorrichtung ist eine in Abbildung 1 schematisch dargestellte kontinuierlich arbeitende Hochdruckextrusionsapparatur.
Sie besteht aus einem temperierbaren Vorratsgefäß (1), welches über eine Rohrverbindung mit einer pneumatischen Kolbendruckluftpumpe (2) verbunden ist, die einen Umspannfaktor von etwa 250 aufweist. Die Kolbendruckluftpumpe wird mittels Stickstoff betrieben, wobei der Eingangsdruck über ein Einlaßventil (3) eingestellt wird. Von der Hochdruckpumpe führt eine Rohrverbindung über ein Entlüftungsventil (4) und ein Manometer (5) zu einem Hochdruckfilterhalter (6), welcher zur Aufnahme von Membranfilterscheiben mit einem Durchmesser von 47 mm geeignet ist. Die aus dem Filterterhalter austretende Dispersion wird über eine Schlauchverbindung (7) abgeführt, die wahlweise zur Produktentnahme oder zur Produktrückführung in das Vorratsgefäß (1) dient.
Beispiel A 2:
Diese in Abbildung 2 schematisch dargestellte Vorrichtung ist ebenfalls eine kontinuierlich arbeitende Hochdruckextrusionsapparatur.
Sie unterscheidet sich von der in Abbildung 1 dargestellten Apparatur dadurch, daß hinter dem Manometer (5) noch ein Metalltassenvorfilter (6) mit einem Porendurchmesser von beispielsweise 35 μm eingebaut ist.
Ein weiterer Unterschied zu der in Abbildung 1 beschriebenen Apparatur besteht darin, daß die aus dem Filterhalter (7) austretende Schlauchverbindung zu einem
12
ERSATZBLATT Zweikammervorratsgefäß (1) führt. Der Auslauf des oberen der zwei Gefäße (1a) is mit einem Dreiwegeventil (1c) versehen, welches es erlaubt die darin befindlich Dispersion ganz oder teilweise zu entnehmen oder über das untere Gefäß (1b) erneu dem Hochdruckextrusionsprozeß zuzuführen.
B.) Ausführungsbeispiele betreffend das erfindungsgemäße Verfahren
Vorbemerkung: In den nachfolgenden Ausführungsbeispielen wird der mittler Vesikeldurchmesser mittels PCS (Submicron particle sizer autodilute model 370, Fa Nicomp Instr. Corp., Goleta, CA) bestimmt.
Beispiel B 1 : Herstellung einer Liposomensuspension mit 50 mg SPC/ml
5 g SPC werden bei 50°C am Rotationsverdampfer in Ethanol gelöst und anschließen zum Film eingedampft.
Der erhaltene Film wird mit 100 ml 20 mM Tris-HCI-Puffer (pH = 7,5) versetzt und nac 15-minütigem Quellen durch mindestens 2-minütiges Schütteln von Hand abgelöst. Di so erhaltene Vordispersion wird mit der erfindungsgemäßen Apparatur bei eine Arbeitsdruck zwischen 3 und 10 MPa jeweils 5 mal über 2 Polycarbonatmembrane absteigender Porengröße (5.0, 1.0, 0.4, 0.2, 0,1 , 0.05 und 0.03 μm) sequentiell filtriert. Die erhaltene Liposomensuspension ist leicht opaleszierend und die Liposome weisen einen mittleren Durchmesser von 64 nm auf.
Beispiel B 2: Herstellung einer Liposomensuspension mit 200 mg SPC/ml
Herstellung wie Beispiel B 1 jedoch Einsatz von 20 g SPC bei der Filmbildung.
Die erhaltene Liposomensuspension ist leicht opaleszierend und die Liposome weisen einen mittleren Durchmesser von 73 nm auf.
Beispiel B 3: Herstellung einer Liposomensuspension mit 400 mg SPC/ml
Herstellung wie Beispiel B 1 jedoch Einsatz von 40 g SPC bei der Filmbildung.
Die erhaltene Liposomensuspension ist von gelartiger Konsistenz und die Liposome weisen einen mittleren Durchmesser von 74 nm auf.
13 ERSATΣBLATT Beispiel B 4: Herstellung einer Liposomensuspension mit 50 mg SPC/Chol/SPG (molares Verhältnis 6:3:1) pro ml
Herstellung wie Beispiel B 1 jedoch Einsatz von 5 g des Lipidgemisches zur Filmbildung. Die erhaltene Liposomensuspension ist stark transparent bis leicht opaleszierend und die Liposomen weisen einen mittleren Durchmesser von 72 nm auf.
Beispiel B 5: Herstellung einer Liposomensuspension mit verringerter Anzahl an Extrusionsschritten
Herstellung und Zusammensetzung wie Beispiel B 4 jedoch Reduktion der Extrusionsstufen auf 0.4, 0.1 und 0.03 μm. Die erhaltene Liposomensuspension ist stark transparent bis leicht opaleszierend und die Liposomen weisen einen mittleren Durchmesser von 68 nm auf.
Beispiel B 6 - B 18: Verwendung unterschiedlicher Lipide und Lipidgemische
Plazeboliposomen mit unterschiedlichen Lipidzusammensetzungen werden wie nachfolgend beschrieben produziert:
-Die Herstellung eines Lipidfilms erfolgt durch Rotationsverdampfung einer organischen Lipidlösung (Ethanol, Methanol oder Chloroform/Ethanol - je nach
Löslichkeit) bei erhöhter Temperatur (z.B. 50° C).
-Der Lipidfilm wird mit Pufferlösung oberhalb der Phasenübergangstemperatur des verwendeten Lipidgemischs dispergiert (Quellzeit mind. 15 min, Schütteln von Hand - mind. 2 min)
-Die sequentielle Extrusion der Vordispersion (MLV) erfolgt über Filter absteigender
Porengröße (5,0; 1 ,0; 0,4; 0,2; 0,1 ; 0,05 und gegebenenfalls 0,03 μm - je 5
Filterpassagen - gegebenenfalls bei erhöhter Temperatur).
In diesen Beispielen (B 6 - B 18) werden jeweils zwei übereinandergelegte Polycarbonatfilter pro Filtergröße verwendet, wobei die letzte Extrusion über 0,05 μm Filter erfolgt. Nach Abschluß der Extrusion werden die Liposomen¬ suspensionen sterilfiltriert (Celluloseacetatmembran, 0,2 μm). Die eingesetzte Lipidkonzentration beträgt jeweils 50 mg/ml. Es werden 100 ml Ansätze in Puffer (20 mM Tris(hydroxymethyl)-aminomethan, pH 7,5, im folgenden Tris-Puffer genannt) hergestellt.
14 ERSATZBLATT Tabelle 1 : Mittlere Durchmesser hochdruckextrudierter Liposomen unterschiedlicher Lipidzusammensetzung (Beispiele B 6 - B 18)
Beispiel B 19 - B 22: Ansätze mit unterschiedlichen Lipidkonzentrationen
Es werden Ansätze aus reinem SPC und Tris-Puffer mit den Lipidkonzentrationen 50, 100, 200 und 400 mg/ml wie unter Beispiel B 6- B 18 beschrieben hergestellt. Die letzte Stufe der Extrusion erfolgte bei einer Porengröße von 0,03 μm. Die erhaltenen Werte sind in Tabelle 2 aufgelistet.
Tabelle 2: Liposomengröße in Abhängigkeit von der eingesetzten Lipidkonzentration (Beispiele B 19 - B 22)
15 ERSATZBLATT Beispiel B 23 - B 29: Beeinflussung der resultierenden Vesikeldurchmesse durch die Porengröße der verwendeten Filter
Es werden Ansätze wie unter Beispiel B 6- B 18 hergestellt und charakterisiert, jedoch mit der Änderung, daß die Porengröße des letzten Extrusionschrittes bei jedem Ansatz variiert wird. Die jeweils letzten Porengrößen sind 5,0, 1 ,0, 0,4, 0,2, 0,1 , 0,05 und 0,03 μm. Als Lipid wird ein Gemisch aus SPC, Chol und SPG (6:3:1) in Tris-Puffe eingesetzt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 zusammengefaßt.
Tabelle 3: Vesikeldurchmesser in Abhängigkeit von der Filterporengröße (Beispiele B 23 - B 29)
Beispiel B 30 - B 33: Einfluß der Passagenanzahl auf die mittleren Vesikeldurchmesser
Es werden vier Ansätze wie unter Beispiel B 6 - B 18 beschrieben, jedoch mit jeweils unterschiedlicher Passagenanzahl (1 , 3, 5 und 10) auf jeder Extrusionsstufe hergestellt und charakterisiert. Als Lipid dient ein Gemisch aus SPC, Chol und SPG (6:3:1) in Tris- Puffer. Alle Ansätze werden einem 3-stufigen Extrusionsprozess durch Membranen mit 0,4, 0,1 und 0,03 μm Porengröße unterworfen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 dargestellt.
Tabelle 4: Einfluß der Passagenanzahl (Beispiele B 30 - B 33)
16 ERSATΣBLÄTT Beispiel B 34: Herstellung einer Liposomensuspension ohne vorherig Filmbildung (Direktdispersion)
Es wird ein 100 ml großer Ansatz aus SPC:Chol: SPG (6:3:1) in Tris-Puffer mit eine Lipidkonzentration von 50 mg/ml hergestellt. Ohne vorherige Filmbildung werden di Lipide direkt in einen 100 ml Meßzylinder eingewogen und mit 70 °C heißem Tris Puffer versetzt. Nach dem Quellen (30 min) werden sie mit einem Ultraturrax 30 mi mit 13500 U/min bei gleicher Temperatur dispergiert und anschließend wie unte Beispiel B 6 - B 18 beschrieben extrudiert. Das Endprodukt weist einen mittlere Durchmesser von 60 nm bei einem Variationskoeffizienten von 25% auf.
Beispiel B 35: Extrusion unter Verwendung einer Filterporengröße (0,1 μm)
Es wird ein 100 ml großer Ansatz aus EPC in Tris-Puffer mit einer Lipidkonzentratio von 100 mg/ml hergestellt. Ohne vorherige Filmbildung wird das Lipid direkt in eine 100 ml Meßzylinder eingewogen und bei Raumtemperatur mit Tris-Puffer versetzt Nach dem Quellen (15 min) wird die Mischung mit einem Ultraturrax 10 min mit 1350 U/min bei gleicher Temperatur dispergiert und anschließend je 10 mal über zwe übereinandergelegte 0,1 μm Polycarbonatfilter extrudiert. Das Endprodukt weist eine mittleren Durchmesser von ca. 120 nm bei einem Variationskoeffizienten von 32% auf.
Beispiel B 36: Herstellung eines Großansatzes (1 I Liposomensuspension) mi hohen Durchflußraten
Es wird ein 1000 ml großer Ansatz aus SPC in Tris-Puffer mit einer Lipidkonzentratio von 100 mg/ml hergestellt. Ohne vorherige Filmbildung wird das Lipid direkt in eine
1000 ml Meßzylinder eingewogen und bei Raumtemperatur mit Tris-Puffer versetzt.
Nach dem Quellen (15 min) wird die Mischung mit einem Ultraturrax 10 min mit 1350
U/min bei gleicher Temperatur dispergiert und anschließend je 10 mal sequentiell übe zwei übereinandergelegte Polycarbonatfilter (1,0 - 0,2 und 0,1 μm) extrudiert.
Die Durchflußrate beträgt hierbei unabhängig von der Porengröße der verwendete
Membranen ca. 500 ml/min.
Die nach 10 Passagen über die letzte Filterkombination (0,1 μm) erhaltene
Liposomen weisen einen mittleren Durchmesser von ca. 110 nm bei eine
Variationskoeffizienten von 30% auf .
17 ERSATZBLÄTT Beispiel B 37: Herstellung eines Ansatzes mit hoher Lipidkonzentration (500 mg/ml)
Es wird ein 100 ml großer Ansatz aus SPC in Tris-Puffer mit einer Lipidkonzentration von 500 mg/ml hergestellt. Ohne vorherige Filmbildung wird das Lipid direkt in einen 100 ml Meßzylinder eingewogen und bei Raumtemperatur mit Tris-Puffer versetzt. Nach dem Quellen (30 min) wird die Mischung mit einem Ultraturrax 10 min mit 13500 U/min bei gleicher Temperatur dispergiert wobei eine gelartige Konsistenz erhalten wird. Dieses Gel wird anschließend je 2 mal sequentiell über zwei übereinandergelegte Polycarbonatfilter (1 ,0 - 0,2 und 0,1 μm) extrudiert, ohne daß die Membranen verstopften.
Die nach 2 Passagen über die letzte Filterkombination (0,1 μm) erhaltenen Liposomen (Gel) weisen einen mittleren Durchmesser von ca. 180 nm bei einem Variationskoeffizienten von 41% auf.
Beispiel B 38: Herstellung eines Ansatzes unter Verwendung von Polytetrafluorethylen (PTFE) Filtern
Es wird ein 100 ml großer Ansatz aus SPC in Tris-Puffer mit einer Lipidkonzentration von 100 mg/ml hergestellt. Ohne vorherige Filmbildung wird das Lipid direkt in einen 100 ml Meßzylinder eingewogen und bei Raumtemperatur mit Tris-Puffer versetzt. Nach dem Quellen (15 min) wird die Mischung mit einem Ultraturrax 10 min mit 13500 U/min bei gleicher Temperatur dispergiert. Anschließend wird diese Vordispersion je 10 mal sequentiell über zwei übereinandergelegte PTFE-filter (5,0 - 1,2 und 0,2 μm) extrudiert.
Die nach 10 Passagen über die letzte Filterkombination (0,2 μm) erhaltenen Liposomen weisen einen mittleren Durchmesser von ca. 210 nm bei einem Variationskoeffizienten von ca. 30% auf.
Beispiel B 39: Herstellung eines Ansatzes unter Verwendung eines Metall(tassen)-filters (5 μm)
Es wird ein 1000 ml großer Ansatz aus SPC in Tris-Puffer mit einer Lipidkonzentration von 100 mg/ml hergestellt. Ohne vorherige Filmbildung wird das Lipid direkt in einen 1000 ml Meßzylinder eingewogen und bei Raumtemperatur mit Tris-Puffer versetzt. Nach dem Quellen (15 min) wird die Mischung mit einem Ultraturrax 10 min mit 13500 U/min bei gleicher Temperatur dispergiert und anschließend je 10 mal über einen Metall(tassen)-filter mit einer nominalen Porengröße von 5 μm extrudiert. Die nach 10 Passagen erhaltenen Liposomen weisen einen mittleren Durchmesser von ca. 1 ,4 μm bei einem Variationskoeffizienten von ca. 80% auf.
18 ERSATZBLATT Beispiel B 40: Herstellung von Niosomen
Es wird ein 100 ml großer Ansatz mit 4 g VolpoN3 (Polyoxyethylenglykol-Iaurylalkohol) und 1 g Cholesterol in Tris-Puffer hergestellt. Ohne vorherige Filmbildung werden die Lipide direkt in einen 100 ml Meßzylinder eingewogen und bei RT mit Tris-Puffer versetzt. Nach dem Quellen (15 min) werden sie mit einem Ultraturrax 10 min mit 13500 U/min bei gleicher Temperatur dispergiert und anschließend sequentiell je 5 mal über zwei übereinandergelegte Polycarbonatfilter absteigender Porengröße (5,0 - 0,2 und 0,05 μm) extrudiert. Das Endprodukt weist einen mittleren Durchmesser von 53 nm bei einem Variationskoeffizienten von 33% auf.
Beispiel B 41 - B 44: Einschluß von lopromid unter Verwendung verschiedener Herstellungsmethoden
Es werden wie in Beispiel B 6 - B 18 beschrieben 100 ml Liposomensuspensionen hergestellt, die das wasserlösliche, nicht-ionische Röntgenkontrastmittel lopromid enthalten. Die lodkonzentration im Endprodukt beträgt 100 mg/g, die Lipidkonzentration 160 mg/g. Als Lipide werden SPC, Chol und SPG im molaren Verhältnis (6:3:1) verwendet. Als Ausgangslösung wird mit Tris-Puffer verdünntes Ultravist® 370 eingesetzt. Die Porengröße der letzten Extrusionsstufe beträgt 0,1 μm. Die Herstellungverfahren unterscheiden sich wie folgt:
B 41. Verfahren wie unter Beispiel B 6 beschrieben, bei Raumtemperatur (RT) extrudiert.
B 42. Verfahren wie unter Beispiel B 41 beschrieben, bei 70° C extrudiert.
B 43. Verfahren wie unter Beispiel B 6 beschrieben, nach der Extrusion durch
0,4 μm Porengröße wird der Ansatz jedoch 3 Gefrier-Tau-Zyklen (Freeze-Thaw) unterworfen. Eingefroren wird in Glasvials in Methanol Trockeneis bei -70 bis -80° C, aufgetaut im Wasserbad bei +70° C. Extrudiert wird bei Raumtemperatur.
B 44. Verfahren wie unter B 43 beschrieben, jedoch Extrusion bei 70° C.
Zur Charakterisierung der hergestellten Liposomen wird der Einschluß mittels Gleichgewichtsdialyse mit photometrischer Auswertung sowie der mittlere Vesikeldurchmesser mit PCS bestimmt. Die Mittelwerte und Variationskoeffizienten der Ergebnisse aus je drei Ansätzen sind in Tabelle 5 zusammengefaßt.
19 ERSATZBLATT Tabelle 5: Eigenschaften lopromid-haltiger Liposomen
Beispiel B 45 - B 49: lopromideinschluß und Vesikelgröße in Abhängigkeit vo der Porengröße des letzten Extrusionsschrittes
Es werden Ansätze wie unter Beispiel B 43 hergestellt und charakterisiert, jedoch mi der Änderung, daß die Porengröße des letzten Extrusionschrittes bei jedem Ansat variiert wird. Die jeweils letzten Porengrößen sind 1,0, 0,4, 0,2, 0,1 und 0,05 μm. Di Freeze-Thaw-Zyklen werden nach Extrusion durch 5,0 μm durchgeführt. Di Lipidkonzentration beträgt 150 mg/ml. Die Mittelwerte und Variationskoeffizienten de Ergebnisse aus je drei Ansätzen sind in Tabelle 6 zusammengefaßt.
Tabelle 6: Eigenschaften lopromid-haltiger Liposomen in Abhängigkeit von der Porengröße
Beispiel B 50 - B 53: lopromideinschluß und Vesikelgröße in Abhängigkeit von der Lipidkonzentration
Es werden Ansätze wie unter Beispiel B 43 hergestellt und charakterisiert, jedoch mit der Änderung, daß verschiedene Lipidkonzentrationen (50, 100, 150 und 160 mg/ml) eingesetzt werden. Die Mittelwerte und Variationskoeffizienten der Ergebnisse aus je drei Ansätzen sind in Tabelle 7 zusammengefaßt.
20
ERSATZBLAT Tabelle 7: Eigenschaften lopromid-haltiger Liposomen in Abhängigkeit von der Lipidkonzentration
Beispiel B 54: Drei-Monats-Stabilität von lopromidliposomen
Zur Beurteilung der Stabilität von lopromidliposomen wird ein 3-Fachansatz nach 3-monatiger Lagerung im Kühlschrank hinsichtlich des pH, des Einschlusses und der Vesikelgröße untersucht. Bei den eingelagerten Proben wird der unverkapselte lopromidanteil vor der Einlagerung nicht entfernt, d.h. die extrudierten Liposomen werden direkt eingelagert.
Die nachfolgende Tabelle 8 zeigt die Eigenschaften der entsprechenden Liposomen zu den jeweiligen Zeitpunkten.
Tabelle 8: Stabilität von lopromidliposomen
Beispiel B 55- B 57: Einschluß von Gd-DTPA unter Verwendung verschiedener Herstellungsmethoden
Es werden wie unter Beispiel B 6 - B 18 beschrieben 100 ml Liposomensuspensionen hergestellt, die das wasserlösliche, ionische MRT-Kontrastmittel Gadopentetsäure- Dimegluminsalz (im folgenden nur Gd-DTPA genannt) enthalten. Die Gd-Konzentration im Endprodukt beträgt 180 μmol/g, die Lipidkonzentration 150 mg/g. Als Lipide werden SPC und Chol im molaren Verhältnis (7:3) verwendet. Als Ausgangslösung wird mit
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ERSATZBLATT Wasser 1 :1 verdünntes Magnevist® eingesetzt. Die Porengröße der letzten Extrusionsstufe beträgt 0,1 μm. Die Herstellungverfahren unterscheiden sich wie folgt:
B 55. Verfahren wie unter Beispiel B 6 beschrieben, bei Raumtemperatur extrudiert.
B 56. Verfahren wie unter Beispiel B 6 beschrieben, bei 70° C extrudiert.
B 57. Verfahren wie unter Beispiel B 6 beschrieben, nach der Extrusion durch 0,4 μm Porengröße wird der Ansatz jedoch 3 Gefrier-Tau-Zyklen (Freeze-Thaw) unterworfen. Eingefroren wird in Glasvials in Methanol/Trockeneis bei -70 bis -80° C, aufgetaut im Wasserbad bei +70° C. Extrudiert wird bei Raumtemperatur.
Zur Charakterisierung der hergestellten Liposomen wird der Einschluß mittels Gleichgewichtsdialyse und Inductively-coupled-plasma-atomic-emission-spectrometry (ICP-AES) sowie der mittlere Vesikeldurchmesser mit PCS bestimmt. Die Mittelwerte und Variationskoeffizienten der Ergebnisse aus je drei Ansätzen sind in Tabelle 9 zusammengefaßt.
Tabelle 9: Eigenschaften Gd-DTPA-haltiger Liposomen
Beispiel B 58 - B 60: Gd-DTPA-Einschluß und Vesikelgröße in Abhängigkeit von der Porengröße des letzten Extrusionsschrittes
Es werden Ansätze wie unter Beispiel B 57 hergestellt und charakterisiert, jedoch mit der Änderung, daß die Porengröße des letzten Extrusionschrittes bei jedem Ansatz variiert wird. Die jeweils letzten Porengrößen sind 0,2, 0,1 und 0,05 μm. Die Mittelwerte und Variationskoeffizienten der Ergebnisse aus je drei Ansätzen sind in Tabelle 10 zusammengefaßt.
22 ERSATZBLATT Tabelle 10: Eigenschaften Gd-DTPA-haltiger Liposomen in Abhängigkeit von der Porengröße
Beispiel B 61 - B 63: Gd-DTPA-Einschluß und Vesikelgröße in Abhängigkeit von der Lipidkonzentration
Es werden Ansätze wie unter Beispiel B 57 hergestellt und charakterisiert, jedoch mit der Änderung, daß verschiedene Lipidkonzentrationen (100, 150 und 200 mg/ml) eingesetzt werden. Die Mittelwerte und Variationskoeffizienten der Ergebnisse aus je drei Ansätzen sind in Tabelle 11 zusammengefaßt.
Tabelle 11: Eigenschaften Gd-DTPA-haltiger Liposomen in Abhängigkeit von der Lipidkonzentration
Beispiel B 64: Herstellung von Liposomen mit einem lipophilen Arzneistoff (Methyiprednisolonaceponat - MPA)
20 ml Plazeboliposomen bestehend aus 50 mg SPC/ml, welche gemäß Beispiel 1, jedoch mit 0.2 μm als letzter Extrusionsstufe, hergestellt wurden, werden mit 50 mg
MPA versetzt und anschließend bei Raumtemperatur 24 h mit einem Magnetrührer gerührt.
Die so erhaltenen Liposomen weisen einen mittleren Durchmesser von 189 nm bei einem Variationskoeffizienten von 30% auf. Das MPA ist vollständig in den Liposomen verkapselt.
23 ERSATZBLATT Beispiel B 65: Herstellung einer 5%-igen O/W-Emulsion
1 ,5 g Lipoid E 80 werden in etwa 50 ml bidestiliiertem Wasser suspendiert und anschließend 5 ml filtriertes Sojaöl (beides Lipoid KG, Ludwigshafen) hinzugefügt. Nach Zusatz von bidestiliiertem Wasser ad 100 ml wird die Mischung 10 min mit einem Ultra-Turrax (13500U/min) vordispergiert. Anschließend wird diese Vordispersion je 10 mal über zwei übereinandergelegte Polycarbonatfilter (0,1 μm) extrudiert. Die Tröpfchengröße der so erhaltenen homogenen, gelblich-trüben O/W-Emulsion beträgt ca. 430 nm.
Beispiel B 66: Herstellung einer 5%-igen O/W-Emulsion unter Verwendung eines PTFE-Filters
1 ,5 g Lipoid E 80 werden in etwa 50 ml bidestiliiertem Wasser suspendiert und anschließend 5 ml filtriertes Sojaöl (beides Lipoid KG, Ludwigshafen) hinzugefügt. Nach Zusatz von bidestiliiertem Wasser ad 100 ml wird die Mischung 10 min mit einem Ultra-Turrax (13500U/min) vordispergiert. Anschließend wird diese Vordispersion je 10 mal über zwei übereinandergelegte PTFE-filter (0,2 μm) extrudiert. Die Tröpfchengröße der so erhaltenen homogenen, gelblich-trüben O/W-Emulsion beträgt ca. 230 nm.
Beispiel B 67: Herstellung einer 20%-igen O/W-Emulsion
1 g Cremophor S9 (BASF) wird in etwa 50 ml bidestiliiertem Wasser suspendiert und anschließend 20 ml filtriertes Sojaöl (Lipoid KG, Ludwigshafen) dazugefügt. Nach Zusatz von bidestiliiertem Wasser ad 100 ml wird die Mischung 1 min mit einem Ultra- Turrax (8000U/min) vordispergiert. Anschließend wird diese Vordispersion je 10 mal über zwei übereinandergelegte Polycarbonatfilter (0,1 μm) extrudiert. Die Tröpfchengröße der so erhaltenen homogenen, milchig-trüben O/W-Emulsion beträgt ca. 880 nm.
24 ERSATZBLATT

Claims

Patentansprüche:
1. Verfahren zur Herstellung flüssiger, disperser Systeme, dadurch gekennzeich¬ net, daß man eine Vordispersion unter hohem Druck von 6,6 bis 250 MPa sequentiell über 1 bis 8 Filterstufen zwischen 0,01 und 35 μm extrudiert.
2. Verfahren zur Herstellung flüssiger, disperser Systeme gemäß Patentanspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß man die Vordisperison über Filter aus anorganischen Materialien extrudiert
3. Verfahren zur Herstellung flüssiger, disperser Systeme gemäß Patentanspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß man die Vordisperison über Membranfilter extrudiert.
4. Verfahren zur Herstellung flüssiger, disperser Systeme gemäß Patentan¬ spruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man die Dispersionen über 2 bis 4 übereinandergelegte Membranfilter pro Filtrationsstufe extrudiert.
5. Verfahren zur Herstellung flüssiger, disperser Systeme gemäß Patentan¬ spruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die übereinandergelegten Filter unterschiedliche Porengrößen aufweisen.
6. Verfahren zur Herstellung flüssiger, disperser Systeme gemäß Patentan¬ spruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Extrusion kontinuierlich erfolgt.
7. Verfahren zur Herstellung flüssiger, disperser Systeme gemäß Patentan¬ spruch 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß man die Dispersion sequentiell über Filter absteigender Porengröße extrudiert.
8. Verfahren zur Herstellung flüssiger, disperser Systeme gemäß Patentan¬ spruch 1 bis 7, dadurch gekennzeichent, daß 1 bis 20 Filterpassagen pro Filtrationsstufe angewendet werden.
9. Verfahren zur Herstellung flüssiger, disperser Systeme gemäß Patentan¬ spruch 1 bis 8 dadurch gekennzeichnet, daß die in einem Gang herzustellen¬ den Produktmengen oberhalb 100 ml liegen.
25 ERSATZBL
10. Verfahren zur Herstellung flüssiger, disperser Systeme gemäß Patentanspruch 1 bis.9 dadurch gekennzeichnet, daß die Produktflüsse oberhalb 150 ml pro Minute liegen.
11. Verfahren zur Herstellung flüssiger, disperser Systeme gemäß Patentan¬ spruch 1 bis 10 dadurch gekennzeichnet, daß das disperse System eine Emulsion ist.
12. Verfahren zur Herstellung flüssiger, disperser Systeme gemäß Patentan¬ spruch 1 bis 10 dadurch gekennzeichnet, daß das disperse System eine Liposomensuspension ist.
13. Verfahren zur Herstellung flüssiger, disperser Systeme gemäß Patentan¬ spruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß diese Röntgenkontrastmittel enthalten.
14. Verfahren zur Herstellung flüssiger, disperser Systeme gemäß Patentan¬ spruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß diese als Röntgenkontrastmittel lotrolan, lopromid oder 3-Carbamoyl-5-[N-(2-hydroxyethyl)-acetamido]-2,4,6- triiod-benzoesäure-[(1 RS, 2SR)-2,3-dihydroxy-1 -hydroxymethylpropyl]-amid enthalten.
15. Verfahren zur Herstellung flüssiger, disperser Systeme gemäß Patentan¬ spruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß diese NMR-Kontrastmittel enthalten.
16. Verfahren zur Herstellung flüssiger, disperser Systeme gemäß Patentan¬ spruch 15, dadurch gekennzeichnet, das diese als NMR-Kontrastmittel Gd-DTPA, Gd-EOB oder Gadobutrol enthalten.
17. Verfahren zur Herstellung flüssiger, disperser Systeme gemäß Patentan¬ spruch 11 und 12, dadurch gekennzeichnet, daß die erhaltenen Dispersionen steril sind.
18. Vorrichtung zur Herstellung flüssiger, disperser Systeme gekennzeichnet durch ein Vorratsgefäß, dessen Abflußleitung zu einer Hochdruckpumpe führt, die zum Aufbau von Arbeitsdrücken bis maximal 250 MPa ausgelegt ist, welche ihrerseits mit einem zur Aufnahme der erfindungsgemäß verwendeten Filter
26 ERSAT bestimmten Filterhalter verbunden ist, von dem das Produkt über eine Abflußleitung entweder in das Vorratsgefäß rezirkuliert und/oder entnommen wird.
19. Vorrichtung zur Herstellung flüssiger, disperser Systeme gemäß Patentanspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß die Hochdruckpumpe zum Aufbau von Arbeitsdrücken bis maximal 80 MPa ausgelegt ist.
20. Vorrichtung zur Herstellung flüssiger, disperser Systeme gemäß Patentanspruch 18 und 19, dadurch gekennzeichnet, daß zwischen Hochdruckpumpe und Filterhalter zusätzlich noch ein Vorfilterhalter angebracht ist, der zur Aufnahme von Filtern mit einer mittleren Porengröße von 2 bis 35 μm bestimmt ist.
21. Vorrichtung zur Herstellung flüssiger, disperser Systeme gemäß Patentan¬ spruch 18 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß diese zusätzlich noch mit Entlüftungsvorrichtungen und/oder Temperatur- und Druckmeßgeräten aus¬ gestattet ist.
27 ERSA
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