CN109884320A - 抑瘤素m作为生物标志物在制备脓毒症诊断试剂中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供抑瘤素M作为生物标志物在制备脓毒症诊断试剂中的应用。本发明提供了抑瘤素M可作为脓毒症的一个诊断指标；抑瘤素M可以作为评估脓毒症严重程度的一个指标，可根据抑瘤素M表达水平预测脓毒症的治疗和/或预后。

Description

抑瘤素M作为生物标志物在制备脓毒症诊断试剂中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及抑瘤素M作为生物标志物在制备脓毒症诊断试剂中的应用。

背景技术

2017年脓毒症最新指南将其定义为机体抗感染免疫失调所导致的危及生命的多器官功能障碍。脓毒症是一种全球性的公共卫生事件，是世界上最高的死亡原因之一。每年约有3150万的人群罹患脓毒症，其中约超过530万的患者最终死亡。

脓毒症发病机制非常复杂，M.J.Delano等学者认为，当宿主最初控制感染失败或者过度时，炎症因子级联“瀑布式”释放，促炎因子大量释放的同时伴有抑炎因子的合成与释放，与之后发展成免疫失衡密切相关，最终引发一系列的反应，包括全身性的炎症反应、呼吸窘迫综合症、脓毒症感染性休克，导致多器官功能障碍综合征。

脓毒症复杂的发病机制影响了脓毒症的诊断和治疗。在过去的几十年中，脓毒症的治疗虽然得到稳步改善，然而这种改善来自于重症监护管理的逐步优化，以及更好和更快速地治疗潜在感染，而不是早诊断、早治疗。目前临床上主要根据常规感染指标(PCT、WBC等)以及患者临床症状进行诊断，尚无公认的诊断脓毒症特异性指标以及治疗药物。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供抑瘤素M作为生物标志物在制备或筛选脓毒症诊断试剂中的应用，用于解决现有技术中缺乏对脓毒症进行早期诊断的标志物等问题。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供检测抑瘤素-M的试剂盒或诊断装置在制备或筛选用于诊断和/或预防和/或治疗脓毒症的药剂中的应用，所述试剂盒或诊断装置用于脓毒症的体外诊断和/或危险分层。

可选地，所述试剂盒用于检测体液样品中抑瘤素-M的表达量。

可选地，所述试剂盒通过酶联免疫吸附测定法来检测抑瘤素-M的表达量。

可选地，所述体液样品中抑瘤素-M的表达量与脓毒症的严重程度正相关。

可选地，所述药剂用于诊断或监测脓毒症的存在和/或过程和/或严重程度和/或预后。

可选地，所述体液样品选自血清。

本发明还提供抑瘤素-M或其与PCT、WBC中的至少一种联合作为生物标志物在制备或筛选脓毒症诊断试剂中的应用，所述诊断试剂用于脓毒症的体外诊断和/或危险分层。

本发明还提供用于表达抑瘤素-M的DNA或其mRNA或保有其功能的同源物作为生物标志物在制备或筛选脓毒症的诊断试剂中的应用。

如上所述，本发明的抑瘤素M作为生物标志物在制备或筛选脓毒症诊断试剂中的用途，具有以下有益效果：

1、本发明提供了抑瘤素M可作为脓毒症的一个诊断指标；

2、本发明提供抑瘤素M可以作为评估脓毒症严重程度的一个指标，可根据抑瘤素M表达水平预测脓毒症的治疗和/或预后。

附图说明

图1a显示为实施例1中健康对照组和临床脓毒症患者血清中OSM蛋白检测浓度结果图

图1b显示为实施例1中临床脓毒症存活以及死亡患者患者血清中OSM蛋白检测浓度结果图。

图2a显示为实施例2中OSM与常规炎症因子PCT相关性分析图，图2b显示为OSM与常规炎症因子WBC相关性分析图。

图3显示为实施例3中ROC曲线比较分析OSM和PCT以及WBC在脓毒症中的诊断效果分析图。

图4显示为实施例4中小鼠脓毒症模型中OSM在肺组织的mRNA表达量统计图。

图5显示为实施例5中小鼠脓毒症模型中OSM蛋白在血清、脾脏、肺、腹腔灌洗液(Peritoneal lavage fluid,PLF)中的浓度统计图。

图6a显示为实施例6中OSM蛋白处理处理小鼠及对照组小鼠生存率统计图。

图6b显示为实施例6中OSM抗体处理小鼠及对照组小鼠生存率统计图。

图7显示为实施例7中小鼠的肝肾功能损害检测结果对比图。

图8a显示为实施例7中小鼠的器官病理切片图。

图8b显示为实施例7中小鼠的病理损伤评分图。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

探索脓毒症相关的免疫因子，了解其作用机制，有望为尽早诊断脓毒症，寻找治疗靶点提供新思路。

抑瘤素M(GenBank:AH001516.2，oncostatin-M，OSM)是白介素-6(IL-6)家族细胞因子成员之一，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，最初被认为是由活化的T细胞分泌出来的能抑制人黑色素瘤细胞生长的因子，是一种独特的细胞生长调节剂。OSM主要由巨噬细胞、T淋巴细胞以及中性粒细胞分泌，用OSM给小鼠滴鼻会引起小鼠肺部炎性细胞的浸润以及剂量依赖性的胶原沉积，参与肺纤维的病理进程；在类风湿性关节炎中，OSM与软骨破坏，胶原蛋白的丧失以及随后对组织的不可逆损伤有关，目前已经被用于类风湿疾病的一期和二期临床试验；OSM还是一个促炎因子，可以通过促进P选择素的释放以及E-选择素的延迟合成与释放增加中性粒细胞迁移和黏附作用，参与炎症反应。

目前关于OSM在脓毒症中的生物学功能和可能的作用尚未阐明，本发明通过一系列研究，认为OSM在脓毒症病理生理过程中可能扮演重要角色，尤其作为脓毒症疾病相关指标有重要价值。本发明的目的在于提供OSM作为生物标志物在诊断或监测脓毒症预后中的应用，用于解决临床上脓毒症诊断以及治疗的不足。

本研究旨在说明OSM作为免疫分子在脓毒症中的诊断价值以及预后的评估作用。前期通过ELISA检测了49例脓毒症患者血清中OSM蛋白的含量，发现与32例健康体检者相比，OSM浓度明显升高，且在脓毒症致死亡患者体内高于存活患者，这提示OSM可能参与脓毒症的免疫病理进程且在患病严重的患者体内含量更高。之后我们将OSM含量收集到的病人WBC、PCT等炎症指标进行相关性分析，发现OSM蛋白含量与WBC、PCT显著相关，说明OSM在提示感染方面具有一定的价值，对脓毒症的诊断具有一定的参考意义。我们接着对这三类数据通过ROC曲线建立分析，结果显示，OSM在诊断脓毒症中，其效益高于PCT和WBC，尤其将OSM与PCT联合诊断脓毒症时，其诊断效率显著优于PCT以及OSM单独诊断，体现了OSM的诊断价值。

进一步的，我们建立脓毒症小鼠模型对OSM的含量进行检测，发现脓毒症模型小鼠肺内OSM mRNA水平升高，且OSM蛋白在脓毒症小鼠模型血清、腹腔灌洗液(PLF)、肺、脾匀浆中含量显著增加，即与人相同，OSM蛋白在脓毒症小鼠模型中也发挥作用。为了进一步探索这种作用，我们通过盲肠结扎穿刺术(CLP)建立脓毒症小鼠模型，发现给予重组OSM蛋白的脓毒症模型小鼠生存率降低，而给予OSM抗体的小鼠生存时间显著延长。且给予重组蛋白后，脓毒症小鼠的肝肾功受损情况更为严重，HE染色显示组织器官充血水肿，炎性细胞浸润，蛋白渗出更为明显，组织病理评分升高。说明OSM蛋白在脓毒症中与器官损伤状态息息相关，可以作为评估该疾病严重程度的指标。

对以下实施例涉及的实验，说明如下：

研究人群：收集2017年3月到2018年3月重庆医科大学附属第一医院诊治的脓毒症患者血液为试验组，同期健康查体者为健康对照组，男女分别为17(53.1％)例、l5(46.9％)例。试验组男女分别为28(57.1％)，21(42.8％)例。样本置于4℃1 400×g离心7min，之后冻存在-80℃，通过ELISA检测血清中的OSM蛋白表达水平。患者均符合国际脓毒症会议中对该病的诊断标准Sepsis 3.0，排除患有恶性肿瘤、HIV感染、血红蛋白低于7g/mL或者存在活动性出血、需要两个单位以上的红细胞等情况，受试者所有研究均经重庆医科大学第一附属医院科学与伦理委员会批准。

实验动物：健康6-8w雄性C57BL/6小鼠(SPF级)，体质量(20±2)g，由北京华阜康生物科技股份有限公司提供，饲养于重庆医科大学实验动物中心SPF级实验室，实验前适应性喂养7d。动物实验均严格遵循中华人民共和国科技部颁布的实验室动物照料及使用指南，符合重庆医科大学实验动物伦理会管理规定。实验动物许可证号：SCKK(渝)2012-0001。

实施例1

脓毒症患者血清中OSM蛋白浓度检测

收集健康体检者及脓毒症患者血清标本(参见表1)，采用ELISA试剂盒(购自Abcam公司，产品名称Human Oncostatin M ELISA Kit，货号ab215543)，检测抑瘤素M的表达量，操作方法严格按照试剂盒所附说明书进行。用SPSS 19.0软件做统计学分析，GraphPadPrism 5.0软件作图。

表1成人脓毒症患者及健康体检者数据统计结果

图1a显示为临床脓毒症患者血清中OSM蛋白检测浓度结果图，图1b显示为脓毒症存活患者、脓毒症死亡患者血清中OSM蛋白检测浓度结果图。结果显示：与32例健康捐献者相比，脓毒症患者血清中OSM浓度明显升高，差异具有统计学意义(P＜0.001)。且在脓毒症最终导致死亡的患者(19例)体内，OSM浓度高于脓毒症存活患者(30例)(P＜0.05)，显示感染严重的患者血清中OSM含量更高。

实施例2

OSM与PCT和WBC的相关性分析

根据实施例1中OSM蛋白检测值，分别与临床上收集对应的PCT和WBC值做相关分析。用SPSS 19.0软件做统计学分析，GraphPad Prism 5.0软件作图。

图2a显示为OSM与常规炎症因子PCT相关性分析图，图2b显示为OSM与常规炎症因子WBC相关性分析图。结果显示：脓毒症患者血清中OSM的浓度与PCT值显著正相关，与WBC值显著正相关，二者是临床上常用的显示感染的指标，对脓毒症诊断的诊断有一定的指导意义，说明OSM在脓毒症诊断过程中具备作为炎症参考指标的价值。

实施例3

ROC曲线比较分析血清OSM和PCT以及WBC对脓毒症的诊断效能

根据实施例1和2中收集到的脓毒症患者OSM、PCT以及OSM值，使用SPSS19.0软件绘制ROC曲线，并用MedCalc15.8软件比较ROC曲线下面积的统计学差异，分析结果如表2所示。

图3显示为ROC曲线比较分析OSM和PCT以及WBC在脓毒症中的诊断效果分析图。结果显示：血清中OSM浓度的曲线下面积(Area under the Curve，AUC)为0.94，cutoff值为10.52pg/ml，灵敏度为85.71％，特异度为100％，优于WBC(P＜0.05)，而当OSM与PCT，以及OSM、PCT与WBC进行联合诊断时，诊断效益优于PCT(P分别为0.025、0.023)、WBC(P分别为0.0015、0.0018)单独诊断，因此我们认为，OSM+PCT联合、OSM+WBC联合、OSM+PCT+WBC联合诊断的效率优于OSM、WBC、PCT单独诊断。

表2 ROC曲线分析表

实施例4

盲肠结扎穿刺术(Cecal ligation and puncture，CLP)模型制备以及mRNA的检测

将实验动物经腹腔注射100μL 1.5％戊巴比妥钠，麻醉后于腹正中线处做1cm纵向切口，游离盲肠，于盲肠末端处结扎，以22号针头贯穿盲肠穿孔，挤出少许粪便，将盲肠还纳至腹腔，将腹部肌肉和皮肤分层缝合，伤口处消毒。术毕于小鼠背部皮下注射0.8mL的生理盐水做液体复苏。6h后取小鼠肺，进行下一步检测。

Q-PCR检测小鼠组织mRNA的转录水平：取小鼠肺研磨后提取总RNA，逆转录为cDNA(采用TaKaRa公司逆转录试剂盒，Lot#AK6501)，然后进行Q-PCR(采用TaKaRa公司T BGreen试剂盒，Lot#AI21783A)。

本实验涉及的引物如下：

OSM引物：5′-TGATCCGGTGCTCTCTCTCA-3′(上游引物，SEQ ID NO.2)；5′-CGCCCAGATCAGTGTTCCTT-3′(下游引物，SEQ ID NO.3)；

GAPDH引物：5′-ATGTGTCCGTCGTGGATCTGA-3′(上游引物，SEQ ID NO.4)；5′-TTGAAGTCGCAGGAGACAACCT-3′(下游引物，SEQ ID NO.5)。

图4显示为小鼠脓毒症模型中OSM在肺组织的mRNA表达量统计图。结果显示：与正常对照组相比，脓毒症小鼠肺OSM mRNA水平在6h明显上调(P＜0.01)，提示在脓毒症小鼠模型内，OSM浓度同样出现升高的情况。

实施例5

脓毒症小鼠模型体内OSM蛋白含量的检测

为了一进步研究脓毒症小鼠体内OSM的含量，我们在建模后6h取小鼠心脏血、腹腔灌洗液(PLF)，肺、脾磨成匀浆，之后将标本离心取上清，进行ELISA检测(购自Abcam公司)，操作步骤严格按照试剂盒操作说明书进行，(采用的试剂盒购自R&D，Mouse Oncostatin M(OSM)Quantikine ELISA Kit，MSM00)。用GraphPad Prism 5.0软件做统计学分析及作图。

图5显示为小鼠脓毒症模型中OSM蛋白在血清、脾脏、肺、腹腔灌洗液(Peritoneallavage fluid,PLF)中的浓度统计图。结果显示：与正常对照组相比，浓度症小鼠血清中、肺、脾、PLF中OSM蛋白含量明显升高。此结果与脓毒症患者体内OSM升高趋势相符，说明OSM蛋白参与了脓毒症的病理进程。

实施例6

生存率实验

为了进一步研究OSM蛋白在脓毒症中的作用，我们在小鼠建立脓毒症模型后，将其随机分为2组(对照组和处理组)。其中给予对照组小鼠腹腔注射无菌PBS缓冲液100μL，给予处理组小鼠腹腔注射100μL重组OSM蛋白(含蛋白1μg)(购自R&D公司，Recombinant MouseOncostatin M(OSM)Protein，495-MO-025)，观察生存率，时间约2周。

图6a显示为OSM蛋白处理小鼠及对照组小鼠生存率统计图。结果显示：给予给予外源性重组蛋白OSM会使小鼠的生存率从40％下降到20％。

为了进一步探索OSM的功能，我们给予对照组小鼠腹腔注射Isotipical IgG 100μl，给予处理组腹腔注射100μl重组OSM蛋白抗体(含抗体5ug)(购自R&D公司，MouseOncostatin M/OSM Antibody，AF-495-NA)，观察生存率。

图6b显示为OSM抗体处理小鼠及对照组小鼠生存率统计图。结果显示，OSM抗体可以提高脓毒症小鼠的生存率，延长生存时间。

实施例7

OSM肝肾功评估

将建模后小鼠分为2组，对照组给予PBS缓冲液，处理组给予OSM蛋白(1μg/只)，48h之后取小鼠心脏血，离心后收取上清，检测肝肾功指标如丙氨酸转氨酶(ALT)、天门冬氨酸转氨酶(AST)、乳酸脱氢酶(LDH)以及肌酐(CREA)、尿素(UREA)等。摘取小鼠肝脾肺肾用于HE染色。

组织HE染色以及病理组织评分

取得小鼠组织后于4％多聚甲醛中固定24～48小时，分别进行脱水、浸蜡、包埋、切片，经HE染色后于显微镜下镜检。根据韩丙超等文献记录进行病理评分统计(韩丙超,解立新,赵晓巍,et al.全氟化碳汽化吸入对急性肺损伤兔多脏器病理组织学的影响[J].中国呼吸与危重监护杂志,2009,8(2).)，用GraphPad Prism 5.0软件做统计学分析，Excel软件制作表格。数据使用中位数(四分位间距)进行显示。

图7显示为小鼠的肝肾功能损害检测结果对比图。结果显示：OSM蛋白处理小鼠后其肝肾指标明显升高，而使用OSM中和抗体能够缓和脓毒症所致器官损伤。图8a显示为小鼠的器官病理切片图，图8b显示为小鼠的病理损伤评分图。组织切片显示，腹腔注射OSM蛋白组组织充血水肿明显，炎性细胞浸润增加，甚至出现细胞坏死等情况，且病理评分有统计学意义。

综上所述，本发明发现OSM在临床脓毒症患者血清中的含量显著高于健康体检者，且重症患者表现出更高的含量，与炎症指标WBC、PCT显著相关，并通过ROC曲线分析发现OSM作为分子生物标志物在脓毒症的诊断上具有较高的效益。之后通过动物实验发现脓毒症模型小鼠体内同样出现OSM水平升高的情况，并且与疾病的严重性呈正相关。因此，本发明提供OSM作为诊断脓毒症和评估其预后的指标。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

SEQUENCE LISTING

<110> 重庆医科大学

<120> 抑瘤素M作为生物标志物在制备脓毒症诊断试剂中的应用

<130> PCQYK193056

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 231

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> OSM氨基酸序列

<400> 1

Met Ala Ser Met Ala Ala Ile Gly Ser Cys Ser Lys Glu Tyr Arg Val

1 5 10 15

Leu Leu Gly Gln Leu Gln Lys Gln Thr Asp Leu Met Gln Asp Thr Ser

20 25 30

Arg Leu Leu Asp Pro Tyr Ile Arg Ile Gln Gly Leu Asp Val Pro Lys

35 40 45

Leu Arg Glu His Cys Arg Glu Arg Pro Gly Ala Phe Pro Ser Glu Glu

50 55 60

Thr Leu Arg Gly Leu Gly Arg Arg Gly Phe Leu Gln Thr Leu Asn Ala

65 70 75 80

Thr Leu Gly Cys Val Leu His Arg Leu Ala Asp Leu Glu Gln Arg Leu

85 90 95

Pro Lys Ala Gln Asp Leu Glu Arg Ser Gly Leu Asn Ile Glu Asp Leu

100 105 110

Glu Lys Leu Gln Met Ala Arg Pro Asn Ile Leu Gly Leu Arg Asn Asn

115 120 125

Ile Tyr Cys Met Ala Gln Leu Leu Asp Asn Ser Asp Thr Ala Glu Pro

130 135 140

Thr Lys Ala Gly Arg Gly Ala Ser Gln Pro Pro Thr Pro Thr Pro Ala

145 150 155 160

Ser Asp Ala Phe Gln Arg Lys Leu Glu Gly Cys Arg Phe Leu His Gly

165 170 175

Tyr His Arg Phe Met His Ser Val Gly Arg Val Phe Ser Lys Trp Gly

180 185 190

Glu Ser Pro Asn Arg Ser Arg Arg His Ser Pro His Gln Ala Leu Arg

195 200 205

Lys Gly Val Arg Arg Thr Arg Pro Ser Arg Lys Gly Lys Arg Leu Met

210 215 220

Thr Arg Gly Gln Leu Pro Arg

225 230

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> OSM上游引物

<400> 2

tgatccggtg ctctctctca 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> OSM下游引物

<400> 3

cgcccagatc agtgttcctt 20

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> GAPDH上游引物

<400> 4

atgtgtccgt cgtggatctg a 21

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> GAPDH下游引物

<400> 5

ttgaagtcgc aggagacaac ct 22

Claims (8)

1.检测抑瘤素-M的试剂盒或诊断装置在制备或筛选用于诊断和/或预防和/或治疗脓毒症的药剂中的应用，所述试剂盒或诊断装置用于脓毒症的体外诊断和/或危险分层。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述试剂盒用于检测体液样品中抑瘤素-M的表达量。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述试剂盒通过酶联免疫吸附测定法来检测抑瘤素-M的表达量。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述体液样品中抑瘤素-M的表达量与脓毒症的严重程度正相关。

5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述体液样品选自血清。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述药剂用于诊断或监测脓毒症的存在和/或过程和/或严重程度和/或预后。

7.抑瘤素-M或其与PCT、WBC中的至少一种联合作为生物标志物在制备或筛选脓毒症诊断试剂中的应用，所述诊断试剂用于脓毒症的体外诊断和/或危险分层。

8.用于表达抑瘤素-M的DNA或其mRNA或保有其功能的同源物作为生物标志物在制备或筛选脓毒症的诊断试剂中的应用。