JP6698854B2 - 遺伝子改変細胞及びその作製方法 - Google Patents

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Description

本発明は、養子免疫療法の分野において有用な、キメラ抗原受容体を発現する遺伝子改変細胞及びその作製方法に関する。
さらに詳しく述べれば、本発明は、優れた標的細胞傷害性を有する、ヒト顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）受容体特異的キメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドが導入された遺伝子改変細胞、該ポリヌクレオチドと共にヒトGM-CSFに対するRNAiを誘導するポリヌクレオチドが導入された遺伝子改変細胞、及びこれらの作製方法及び医薬用途に関する。
腫瘍関連抗原を標的とするキメラ抗原受容体（chimeric antigen receptor : CAR）を発現させたT細胞（CAR-T）を使用した養子免疫療法は抗腫瘍効果が強力であることが報告され、近年開発が急速に進んでいる。特にCD19を標的とするCARの開発が進んでおり、臨床試験においても著効を示し、高い注目を集めている。CARは、一般的に、抗原との結合能力を保持した抗体由来の一本鎖ポリペプチドである単鎖抗体（scFv）を標的結合ドメインとして有し、細胞内シグナル伝達ドメインが連結されたタンパク質であり、代表的には免疫グロブリン重鎖（H鎖）及び軽鎖（L鎖）フラグメントのFv領域を連結した抗体ポリペプチドが標的結合ドメインとして使用されている（非特許文献１）。
CAR-T療法は効果が高い反面、副作用も頻発することが臨床試験で明らかになっている。特に、抗原結合ドメインとして、多くの場合、マウス由来の単鎖抗体（scFv）を用いていることから、望まない免疫応答に伴う重篤なアナフィラキシーショックを生じる危険性を有している。そのため、優れた効果と安全性を両立したCARの提供が求められており、かかる観点から、従来の抗体型CARに替わる手法としてリガンド型CARの利用が提案されている（非特許文献２）。
中沢洋三、「信州医誌」、2013年、第61巻、第4号、p.197-203 Donald R. Shafferら、「Medical Sciences」、2014年、第2巻、p22-36
リガンド型CARは、標的結合ドメインが標的細胞上に発現する受容体タンパク質に特異的に結合するリガンド、例えばサイトカイン、アフィボディ、天然型受容体由来のリガンド結合ドメイン、（例えば、腫瘍細胞上の）受容体の溶解性タンパク質/ペプチドリガンド、ペプチド、及び免疫応答を促すためのワクチン等である。そのため、標的細胞表面に受容体が発現していれば、従来のCARと同様の標的細胞傷害活性を示すことが期待されている。さらに、内因性のタンパク質をリガンドとして使用することで、上述の望まない免疫応答の低減を期待することができる。
しかしながら、リガンド型CARの開発は途上であり、臨床的に有効なものは未だ見出されていない。
本発明者らのグループは、若年性骨髄単球性白血病（JMML）の腫瘍細胞表面にGM-CSF受容体が高発現していることに着目し、野生型GM-CSFのオープンリーディングフレームを標的結合ドメインとして用いたリガンド型CARであるGM-CSF受容体特異的キメラ抗原受容体（以下、「GMR.CAR」と記載する）が当該疾患の養子免疫療法に適用できる可能性を考え、検討を行った。その結果、GMR.CARを遺伝子導入したT細胞（以下、「GMR.CAR-T細胞」と記載する）がJMML患者由来のCD34+腫瘍細胞への細胞傷害活性を示すことを見出した。
本発明者らは更に、GMR.CAR-T細胞が腫瘍細胞殺傷時に経時的にGM-CSFを自己分泌することを見出し、該GM-CSFの分泌上昇がGMR.CAR-T細胞の細胞傷害活性の向上を妨げる要因となり得るため、GMR.CARの治療への展開には、本課題を克服する必要があることも見出した。したがって、GMR.CAR-T細胞におけるGM-CSF遺伝子の発現を抑制し、且つ、細胞傷害活性を向上させたGMR.CARを提供することを更に検討した。
その結果、本発明者らは、宿主細胞にGMR.CARをコードするポリヌクレオチドとGM-CSFに対するRNAi効果を誘導することのできるポリヌクレオチドを宿主細胞において同時に発現させることで、GMR.CAR-T細胞からのGM-CSFの分泌を抑制し、GMR.CAR-T細胞の標的細胞傷害活性も向上させることができることを見出し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は以下の通りである。
［１］ ヒト顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）受容体に特異的に結合する標的結合ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内シグナル伝達ドメインとを有するキメラ抗原受容体（CAR）タンパク質をコードするポリヌクレオチドが導入された遺伝子改変細胞。
［２］ (i)ヒト顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）受容体に特異的に結合する標的結合ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内シグナル伝達ドメインとを有するキメラ抗原受容体（CAR）タンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び
(ii)ヒトGM-CSFに対するRNAiを誘導するポリヌクレオチド
が導入された遺伝子改変細胞。
［３］ GM-CSF受容体に結合するCARを細胞膜上に発現する、上記［１］又は［２］記載の細胞。
［４］ CARタンパク質が、更に共刺激ドメイン及び／又は細胞外スペーサードメインを含む、上記［１］〜［３］のいずれか記載の細胞。
［５］ 細胞内シグナル伝達ドメインがヒトCD3ζである、上記［１］〜［４］のいずれか記載の細胞。
［６］ 共刺激ドメインがヒトCD28又はヒト4-1BBである、上記［４］又は［５］記載の細胞。
［７］ 細胞外スペーサードメインがヒトIgG1のヒンジ、CH2、及び／又はCH3領域若しくはその一部、及び／又は人工スペーサー配列を含む、上記［４］〜［６］のいずれか記載の細胞。
［８］ 標的結合ドメインが配列番号２に示すアミノ酸配列、又は配列番号２のアミノ酸配列に対して90％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドである、上記［１］〜［７］のいずれか記載の細胞。
［９］ RNAiを誘導するポリヌクレオチドがsiRNA又はshRNAである、上記［２］〜［８］のいずれか記載の細胞。
［１０］ ヒトGM-CSF受容体に特異的に結合するキメラ抗原受容体（CAR）タンパク質をコードするポリヌクレオチドをベクターを用いて細胞に導入することを含む、CARタンパク質発現細胞の作製方法。
［１１］ ヒトGM-CSF受容体に特異的に結合するキメラ抗原受容体（CAR）タンパク質をコードするポリヌクレオチド、及びヒトGM-CSFに対するRNAiを誘導するポリヌクレオチドを同一又は異なるベクターを用いてそれぞれ細胞に導入することを含む、CARタンパク質発現細胞の作製方法。
［１２］ ヒトGM-CSF受容体に特異的に結合するキメラ抗原受容体（CAR）タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクター。
［１３］ ヒトGM-CSF受容体に特異的に結合するキメラ抗原受容体（CAR）タンパク質をコードするポリヌクレオチド、及びヒトGM-CSFに対するRNAiを誘導するポリヌクレオチドを含むベクター。
［１４］ ヒトGM-CSF受容体に特異的に結合するキメラ抗原受容体（CAR）タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターと、ヒトGM-CSFに対するRNAiを誘導するポリヌクレオチドを含むベクターとを含む、CARタンパク質発現細胞の作製のためのキット。
［１５］ 上記［１］〜［９］のいずれか記載の細胞を含む、GM-CSF受容体発現細胞が関与する疾患に対する治療剤。
［１６］ 上記［１５］記載の治療剤と、医薬上許容される担体とを含む、医薬組成物。
本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2016-182293号の開示内容を包含する。
本発明のGMR.CAR-T細胞は、若年性骨髄単球性白血病（JMML）及び急性骨髄性白血病（AML）を始めとするGM-CSF受容体を細胞表面に発現している種々の細胞を標的とした養子免疫療法への効果が期待される。また、本発明のGMR.CARをコードするポリヌクレオチド及びGM-CSFに対するRNAiを誘導するポリヌクレオチドを同時に発現させた遺伝子改変細胞は、遺伝子改変細胞からの経時的なGM-CSFの分泌を抑制し、且つ、標的細胞に対し、優れた細胞傷害活性を示す。
CD19.CARのベクターマップの例を示す。 本発明のGMR.CARのベクターマップの例を示す。 RNAiを誘導するポリヌクレオチドを含む合成配列（配列番号１９）の構成例を示す。 RNAiを誘導するポリヌクレオチド（配列番号２２）を含む合成配列（配列番号２９）の構成例を示す。 RNAiを誘導するポリヌクレオチド（配列番号２５）を含む合成配列（配列番号３０）の構成例を示す。 RNAiを誘導するポリヌクレオチド（配列番号２８）を含む合成配列（配列番号３１）の構成例を示す。 RNAiを誘導するポリヌクレオチド（SNC1-C（タカラバイオ株式会社））を含む合成配列（配列番号３２）の構成例を示す。 本発明のGMR.CAR+shRNAのベクターマップの例を示す。 GMR.CARをコードするポリヌクレオチドとRNAiを誘導するポリヌクレオチドとを導入したHEK293T細胞におけるGMR.CAR発現率％を示す。 GMR.CARをコードするポリヌクレオチドを導入したGMR.CAR-T細胞（CAR-T 001）のday 14におけるGMR.CAR発現率％を示す。 GMR.CAR-T細胞（CAR-T 001）のTHP-1、Kasumi-1又はK562細胞に対する抗腫瘍細胞活性％を示す。 GMR.CAR-T細胞（CAR-T 001）とTHP-1又はKasumi-1との共培養上清中のGM-CSF分泌量の経時的変化を示す。 GM-CSF（0、5、又は10 ng/ml）共存下におけるGMR.CAR-T細胞（CAR-T 001）のTHP-1（Ａ）又はKasumi-1細胞（Ｂ）に対する抗腫瘍細胞活性％を示す。 GMR.CARをコードするポリヌクレオチドを導入したGMR.CAR-T細胞（CAR-T 001）、及びGMR.CARをコードするポリヌクレオチドとRNAiを誘導するポリヌクレオチドとを導入したGMR.CAR-T細胞（CAR-T 004〜007）のday 14におけるGM-CSF発現解析の結果を示す。 CAR-T 001及びCAR-T 004〜CAR-T 007及びポリヌクレオチドを導入していないMock-T細胞のTHP-1細胞に対する抗腫瘍細胞活性％（Ａ）と腫瘍細胞殺傷能（Ｂ）をそれぞれ示す。 CAR-T 001及びCAR-T 004〜CAR-T 007及びMock-T細胞のKasumi-1細胞に対する抗腫瘍細胞活性％（Ａ）と腫瘍細胞殺傷能（Ｂ）をそれぞれ示す。 CAR-T 001及びCAR-T 004〜CAR-T 007及びMock-T細胞のshinAML-1細胞に対する抗腫瘍細胞活性％（Ａ）と腫瘍細胞殺傷能（Ｂ）をそれぞれ示す。 CAR-T 001及びCAR-T 004〜CAR-T 007及びMock-T細胞のMV4-11細胞に対する抗腫瘍細胞活性％（Ａ）と腫瘍細胞殺傷能（Ｂ）をそれぞれ示す。 CAR-T 001及びCAR-T 004〜CAR-T 007及びMock-T細胞のいずれかと、THP-1（Ａ）又はKasumi-1細胞（Ｂ）との共培養上清におけるGM-CSF濃度の経時的変化を示す。 CAR-T 001及びCAR-T 004〜CAR-T 007及びMock-T細胞のいずれかと、shinAML-1（Ａ）又はMV4-11細胞（Ｂ）との共培養上清におけるGM-CSF濃度の経時的変化を示す。 スペーサードメインを改変した本発明のGMR.CAR（CH2CH3欠失体、GMR.CARｄCH2CH3）のベクターマップの例を示す。 スペーサードメインを改変した本発明のGMR.CAR（CH2欠失体、GMR.CARdCH2）のベクターマップの例を示す。 スペーサードメインを改変した本発明のGMR.CAR（CH2CH3欠失-(G4S)3挿入体、GMR.CARdCH2CH3＋(G4S)3）のベクターマップの例を示す。 スペーサードメインを改変した本発明のGMR.CAR（ヒンジCH2欠失体、GMR.CARdhingeCH2）のベクターマップの例を示す。 GMR.CARをコードするポリヌクレオチドを導入したGMR.CAR-T細胞（CAR-T 001、CAR-T 008〜011）のday 14におけるGM-CSF発現解析の結果を示す。 GMR.CARをコードするポリヌクレオチドを導入したGMR.CAR-T細胞（CAR-T 008、CAR-T 010、CAR-T 012及びCAR-T 014）のday 14におけるGM-CSF発現解析の結果を示す。 CAR-T001及びCAR-T 008〜CAR-T 011及びMock-T細胞のMV4-11細胞に対する抗腫瘍細胞活性％を示す。 CAR-T 012、CAR-T 014及びMock-T細胞のMV4-11細胞に対する抗腫瘍細胞活性％を示す。 CAR-T 012、CAR-T 014及びMock-T細胞のMV4-11細胞に対する腫瘍細胞殺傷能を示す。 CAR-T 001及びCAR-T 008〜CAR-T 011及びMock-T細胞のTHP-1細胞に対する抗腫瘍細胞活性の持続性評価におけるウェル内の腫瘍細胞数、E:T比の組み合わせを示す。 CAR-T 001及びCAR-T 008〜CAR-T 011及びMock-T細胞のMV4-11細胞に対する抗腫瘍細胞活性の持続性評価におけるウェル内の腫瘍細胞数、E:T比の組み合わせを示す。 CAR-T 001及びCAR-T 008〜CAR-T 011及びMock-T細胞のTHP-1細胞に対するE：T比＝１：１における持続的腫瘍細胞殺傷能を示す。 CAR-T 001及びCAR-T 008〜CAR-T 011及びMock-T細胞のTHP-1細胞に対するE：T比＝１：５における持続的腫瘍細胞殺傷能を示す。 CAR-T 001及びCAR-T 008〜CAR-T 011及びMock-T細胞のMV4-11細胞に対するE：T比＝１：１における持続的腫瘍細胞殺傷能を示す。 CAR-T 001及びCAR-T 008〜CAR-T 011及びMock-T細胞のMV4-11細胞に対するE：T比＝１：５における持続的腫瘍細胞殺傷能を示す。 CAR-T 008、010、012、014及びMock-T細胞のTHP-1細胞に対する抗腫瘍細胞活性の持続性評価におけるウェル内の腫瘍細胞数、E:T比の組み合わせを示す。 CAR-T 008、010、012、014及びMock-T細胞のMV4-11細胞に対する抗腫瘍細胞活性の持続性評価におけるウェル内の腫瘍細胞数、E:T比の組み合わせを示す。 CAR-T 008、010、012、014及びMock-T細胞のTHP-1細胞に対するE：T比＝１：１における持続的腫瘍細胞殺傷能を示す。 CAR-T 008、010、012、014及びMock-T細胞のTHP-1細胞に対するE：T比＝１：５における持続的腫瘍細胞殺傷能を示す。 CAR-T 008、010、012、014及びMock-T細胞のMV4-11細胞に対するE：T比＝１：１における持続的腫瘍細胞殺傷能を示す。 CAR-T 008、010、012、014及びMock-T細胞のMV4-11細胞に対するE：T比＝１：５における持続的腫瘍細胞殺傷能を示す。
本発明の実施の形態について、以下に詳細に説明する。
本明細書において「キメラ抗原受容体（CAR）」とは、標的特異性をT細胞（例えば、ナイーブT細胞、セントラルメモリーT細胞、エフェクターメモリーT細胞、又はそれらの組み合わせ等のT細胞）等の細胞に移植することができる改変受容体を指す。CARはまた、人工T細胞受容体、キメラT細胞受容体、又はキメラ免疫受容体としても知られる。
本明細書において「ドメイン」とは、ポリペプチド内の領域であって、他の領域とは独立して特定の構造に折りたたまれる領域を示す。
「RNAi」（RNA interference；RNA干渉）とは、一般的に、標的遺伝子のmRNAと相同である配列を持つ鎖とこれと相補的な配列を持つ鎖で構成される二本鎖RNA（dsRNA）を細胞等に導入して、標的遺伝子mRNAの分解を誘導することで標的遺伝子の発現を抑制するメカニズムを意味する。RNAiは、配列特異的な転写後遺伝子抑制のプロセスである。哺乳動物細胞に対するRNAiでは、標的mRNAの配列に対応する配列の短い二本鎖RNA（siRNA）が使用される。
本明細書において「RNAiを誘導するポリヌクレオチド」とは、それを細胞に導入すると細胞内のプロセシングによって所望のsiRNA（標的遺伝子に対するRNAiを引き起こすsiRNA）が生ずるポリヌクレオチドをいい、例えば、shRNA（short hairpin RNA）を用いることができる。shRNAは、センスRNAとアンチセンスRNAがループ構造部を介して連結された構造（ヘアピン構造）を有し、細胞内でループ構造部が切断されて二本鎖siRNAとなり、RNAi効果をもたらす。あるいは、本明細書において、「RNAiを誘導するポリヌクレオチド」として、アンチセンスRNA、リボザイムも含めることができる。
本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド」には、天然又は合成のDNA及びRNA、例えばゲノムDNA、cDNA（相補DNA）、mRNA（メッセンジャーRNA）、rRNA（リボソームRNA）、shRNA（小ヘアピンRNA）、snRNA（核内低分子RNA）、snoRNA（核小体低分子RNA）、miRNA（マイクロRNA）、及び／又はtRNAが含まれるが、これらに限定されない。
本明細書において「翻訳領域」とは、mRNAの領域のうち、タンパク質に翻訳される領域（コーディング領域）のことをいい、「非翻訳領域」とは、コーディング領域の両側に位置し、タンパク質に翻訳されない領域を意味する。非翻訳領域としては、5'末端側の5'-非翻訳領域（5'-UTR）、及び3'末端側の3'-非翻訳領域（3'-UTR）が存在する。より具体的には、配列番号１にヒトGM-CSFの5'及び3'-非翻訳領域及び翻訳領域のヌクレオチド配列を含む配列を開示するが、この配列中、1〜32番目のポリヌクレオチドが5'-UTR、33〜467番目のポリヌクレオチドが翻訳領域、468から800番目のポリヌクレオチドが3'-UTRに相当する。
本明細書において「コードする」とは、当分野において通常使用されているように、所定のヌクレオチド配列が所定のタンパク質又は（ポリ）ペプチドのアミノ酸配列情報を暗号化していることをいい、本明細書において、センス鎖及びアンチセンス鎖の両方を「コードする」との文脈において使用する。
上記の通り、本発明は、ヒト顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）受容体に特異的に結合する標的結合ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内シグナル伝達ドメインとを有するキメラ抗原受容体（CAR）タンパク質をコードするポリヌクレオチドが導入された遺伝子改変細胞を提供する。
本発明のCARタンパク質はヒトGM-CSF受容体に特異的に結合する「標的結合ドメイン」を含む。標的（GM-CSF受容体）結合ドメインは、GM-CSF受容体に特異的な結合性を示し、GM-CSF受容体を細胞表面上に発現している標的細胞に対し、特異的な免疫応答を可能にする。
したがって、GM-CSF受容体結合ドメインとして、GM-CSF受容体に結合するサイトカインであるGM-CSFのアミノ酸配列を有するポリペプチドを用いることができる。好ましい態様として、GM-CSF受容体結合ドメインとして、ヒトGM-CSFのオープンリーディングフレームがコードするアミノ酸配列からなるポリペプチドを用いることができる。具体的には、配列番号２のアミノ酸配列を含むGM-CSFタンパク質を使用することができる。あるいは、配列番号２のアミノ酸配列に対して90％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、ヒトGM-CSF受容体に対する結合能を有するポリペプチドを使用することができる。例えば、配列番号４のアミノ酸配列からなるポリペプチドも同様に使用することができる。更に、GM-CSF受容体に対する結合能を保持している限り、これらのポリペプチドの断片、すなわち結合性断片を使用しても良い。
ここで、「ヒトGM-CSF受容体に対する結合能」を有するとは、ヒトGM-CSF受容体に対する結合定数が例えば1 − 1000 nM以下であることを意図する。この結合能は、抗原と抗体との結合能と比較して相対的に弱い結合であって良い。
本明細書のCARタンパク質は、場合によって「細胞外スペーサードメイン」を含むことができる。細胞外スペーサードメインは、CARと抗原の結合を促進し、細胞内へのシグナル伝達を亢進する配列であることが望ましい。例えば、抗体のFcフラグメント、又はそのフラグメントもしくは誘導体、抗体のヒンジ領域、又はそのフラグメントもしくは誘導体、抗体のCH2領域、抗体のCH3領域、人工スペーサー配列、又はそれらの組み合わせを用いることができる。
本発明の一態様として、細胞外スペーサードメインとして、（i）IgG4のヒンジ、CH2、及びCH3領域、（ii）IgG4のヒンジ領域、(iii)IgG4のヒンジ及びCH2、(iv)CD8aのヒンジ領域、（v）IgG1のヒンジ、CH2、及びCH3領域、（vi）IgG1のヒンジ領域、もしくは(vii)IgG1のヒンジ及びCH2、又はそれらの組み合わせを使用することができる。例えば、IgG1のヒンジ領域として、配列番号５に示すヌクレオチド配列によってコードされる以下のアミノ酸配列（配列番号６）を有するものを好適に使用することができるが、これに限定されるものではない。
Figure 0006698854
また、IgG1のCH2領域として、配列番号７に示すヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列（配列番号８）を有するもの、CH3領域として、配列番号９に示すヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列（配列番号１０）を有するものをそれぞれ好適に使用することができるが、これらに限定されるものではない。
好ましい態様として、細胞外スペーサードメインはヒトIgG1のヒンジ、CH2、及びCH3領域又はその一部を使用することができる。
また、好ましい態様として、細胞外スペーサードメインは、（i）ヒトIgG1のヒンジ領域単独（配列番号６）、（ii）ヒトIgG1のヒンジ領域（配列番号６）及びCH3領域（配列番号１０）の組み合わせ、（iii）CH3領域単独（配列番号１０）、で使用することができる。
本発明の一態様として、細胞外スペーサードメインに用いる人工スペーサー配列として、式(G4S)nで表されるスペーサー配列を使用することができる。式中、ｎは、１〜１０であり、好ましくはｎ＝３である。例えば、配列番号４２を有するものを好適に使用することができる。このようなスペーサー配列を有するスペーサーは、ペプチドリンカーと呼ばれることもある。当分野において好適に使用されるペプチドリンカーを、本発明において適宜使用することができる。この場合、ペプチドリンカーの構成及び鎖長は、得られるCARタンパク質の機能を損なわない範囲で適切なものを選択することができる。
更に好ましい態様として、細胞外スペーサードメインは、ヒトIgG1のヒンジ領域（配列番号６）及び(G4S)3のスペーサー配列（配列番号４２）の組み合わせを使用することができる。
細胞外スペーサードメインは、上記に例示したものから適宜選択して、又は当分野における技術常識に基づいて更に改変して、本発明のために使用することができる。
細胞外スペーサードメインは、標的結合ドメインと、膜貫通ドメインとの間に存在し得るように、それぞれのドメインのアミノ酸配列をコードする塩基配列を連結してベクターに挿入し、宿主細胞において発現させることができる。あるいはまた、細胞外スペーサードメインは、予め作製したプラスミドCARタンパク質をコードするポリヌクレオチドを鋳型として改変することもできる。
細胞外スペーサードメインの改変は、例えば、CARをコードするポリヌクレオチドを導入したCAR-T細胞の宿主細胞におけるCAR遺伝子発現率の向上、シグナル伝達、細胞の老化、腫瘍への分布、抗原認識又はin vivo活性への影響を考慮した場合に有用である。
本発明のCARタンパク質は、細胞膜上に存在し、標的結合ドメイン及び任意に細胞外スペーサードメインを含む細胞外ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内シグナル伝達ドメイン及び任意に共刺激ドメインを含む細胞内ドメインとを含む。当分野において周知であるように、「膜貫通ドメイン」は、細胞外ドメイン及び細胞内ドメインがいずれも親水性ドメインであるのに対して、細胞膜を構成する脂質二重層に対する親和性を有するドメインである。本発明のGMR.CARにおける膜貫通ドメインは、CARタンパク質が細胞膜上に存在でき、標的結合ドメインと細胞内シグナル伝達ドメインの機能を損なわない限り、特に限定するものではないが、後述する共刺激ドメインと同じタンパク質由来のポリペプチドが膜貫通ドメインとしての機能を果たす場合もあり得る。
本発明の一態様として、膜貫通ドメインは、例えば、CD28、CD3ε、CD8α、CD3、CD4又は4-1BBなどの膜貫通ドメインを用いることができる。
好ましい態様として、膜貫通ドメインは、ヒトCD28（Uniprot No. ：P10747（153‐179））を使用することができる。具体的には、配列番号１１に示すヌクレオチド配列（NCBI Accession No.: NM_006139.3 (679-759)）によってコードされるアミノ酸配列（配列番号１２）を有するものを膜貫通ドメインとして好適に使用することができる。
本発明のCARタンパク質は、場合によって「共刺激ドメイン」を含むことができる。共刺激ドメインは共刺激リガンドと特異的に結合し、それによって、これらに限定されないが、CAR-T細胞の増殖、サイトカイン産生、機能分化、標的細胞の細胞死のような、細胞による共刺激応答が媒介される。
本発明の一態様として、共刺激ドメインは、例えば、CD27、CD28、4-1BB (CD137)、CD134 (OX40)、Dap10、CD2、CD5、CD30、CD40、PD-1、ICAM-1、LFA-1 (CD11a/CD18)、TNFR-1、TNFR-II、Fas、Lckを用いることができる。
好ましい態様として、共刺激ドメインは、ヒトCD28（Uniprot No. ：P10747（180‐220））又は4-1BB（GenBank：U03397.1）等を使用することができる。具体的には、配列番号１３に示すヌクレオチド配列（NCBI Accession No.: NM_006139.3 (760-882)）によってコードされるアミノ酸配列（配列番号１４）を有するものを共刺激ドメインとして好適に使用することができる。
本発明のCARタンパク質は「細胞内シグナル伝達ドメイン」を含む。細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫細胞のエフェクター機能の発揮に必要なシグナルを伝達する。
本発明の一態様として、細胞内シグナル伝達ドメインとしては、例えば、ヒトCD3ζ鎖、FcγRIII、FcεRI、Fc受容体の細胞質末端、免疫受容体チロシン活性化モチーフ(ITAM)を有する細胞質受容体又はそれらの組み合わせを用いることができる。
好ましい態様として、細胞内シグナル伝達ドメインは、ヒトCD3ζ鎖（例えばNCBI Accession No. NM＿000734.3のヌクレオチド299-637）を使用することができる。具体的には配列番号１５に示すヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列（配列番号１６）を有するものを細胞内シグナル伝達ドメインとして好適に使用することができる。
目的とするポリヌクレオチドは常法に従い、容易に作製することができる。各ドメインのアミノ酸配列を示すNCBI RefSeq IDやGenBankのAccession番号からアミノ酸配列をコードする塩基配列を取得することが可能であり、標準的な分子生物学的及び/又は化学的手順を用いて本発明のポリヌクレオチドを作製することができる。例えば、これらの塩基配列をもとに、核酸を合成することができ、また、cDNAライブラリーよりポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を使用して得られるDNA断片を組み合わせて本発明のポリヌクレオチドを作製することができる。
従って、本発明のGMR.CARをコードするポリヌクレオチドは、上記のそれぞれのドメインをコードするポリヌクレオチドを連結して作製することができ、このポリヌクレオチドを適切な細胞に導入することによってGMR.CAR-T細胞を作製することができる。また、GMR.CARは、標的結合ドメイン以外の構成成分が同一である既存のCARタンパク質をコードするポリヌクレオチドを鋳型として、常法に従い、標的結合ドメインを組み替えることによっても作製することができる。
更に、目的に応じて、既存のCARタンパク質をコードするポリヌクレオチドを鋳型として、1以上のドメイン、例えば細胞外スペーサードメインを、inverse-PCR（iPCR）法等を使用して、改変することができる。細胞外スペーサードメインの改変技術については、例えばOncoimmunology, 2016, Vol.5, No.12, e1253656等に記載されている。
本発明はまた、
(i)ヒト顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）受容体に特異的に結合する標的結合ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内シグナル伝達ドメインとを有するキメラ抗原受容体（CAR）タンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び
(ii)ヒトGM-CSFに対するRNAiを誘導するポリヌクレオチド
が導入された遺伝子改変細胞を提供する。
本発明におけるヒトGM-CSFに対するRNAiを誘導するポリヌクレオチドは、GM-CSF遺伝子の発現過程（転写、転写後調節、翻訳、翻訳後調節を含む）を抑制する核酸分子である。本発明における「発現の抑制」は一過的抑制及び恒常的抑制のいずれでもよい。
標的特異的なRNAiを生じさせるためには、標的遺伝子のmRNA配列の一部と相補性を有するセンス鎖及びこれに相補的なアンチセンス鎖からなるsiRNAを細胞内に導入するか、又は細胞内で発現させればよい。本発明の実施態様の一つとしては、RNAiを誘導するポリヌクレオチドとして、siRNA又はshRNAを用いることができる。siRNAは、短鎖二本鎖RNA分子であり、通常、15〜30塩基対である。shRNAは、生体内でダイサーによってプロセシングされてsiRNAを生成することができるヘアピン型RNAである。siRNA及びshRNAは、例えばリポフェクタミン等のトランスフェクション試薬と共に、in vitro又はin vivoで細胞内に導入することができる。あるいはまた、siRNA及びshRNAは、細胞内でこれらを生成することができるようにDNAの形態でベクターに組み込んで細胞内に導入することができる。
GM-CSF遺伝子を標的とするsiRNAは、通常、当該遺伝子のmRNAの配列における連続する領域と相同な配列からなるセンス鎖とその相補配列からなるアンチセンス鎖がハイブリダイズした二本鎖RNAである。ここでの「連続する領域」の長さは通常15〜30塩基である。「連続する領域」は、GM-CSF遺伝子の翻訳領域、非翻訳領域、及び翻訳領域と非翻訳領域との境界を含んでいても良い。特に限定するものではないが、本発明において好適に使用できるsiRNA及びshRNAは、ヒトGM-CSF遺伝子のmRNAの非翻訳領域に対するものである。
当業者であれば、siRNA及びshRNAの設計及び調製は、標的配列の情報等に基づいて容易に得ることができる。siRNAの設計には通常、標的配列に固有の配列（連続配列）が利用される。適当な標的配列を選択するためのプログラム及びアルゴリズムが開発されている。あるいはまた、特定の標的タンパク質の発現を抑制又は阻害するsiRNA及びshRNAは、例えばタカラバイオ株式会社、サーモフィッシャーサイエンティフィック、キアゲン等の供給業者から市販品を入手することもできる。
従って、特に限定するものではないが、例えば本発明者等が実施例において使用したヒトGM-CSFに対するRNAiを誘導するポリヌクレオチドとして、配列番号２０及び２１、２３及び２４、２６及び２７に示す配列を有するsiRNA、並びに配列番号２２、２５、２８に示すヌクレオチド配列を有するshRNA等を挙げることができる。
RNAiを誘導するポリヌクレオチドのさらなる態様としては、所望のsiRNAを発現し得るベクターである。このようなベクターとしては、後のプロセスによってsiRNAに変換されるshRNAを発現するベクター（ステムループタイプ又はショートヘアピンタイプと呼ばれる）、センスRNAとアンチセンスRNAを別々に発現するベクター（タンデムタイプと呼ばれる）が挙げられる。これらのベクターは当業者であれば常法に従い作製することができる。
宿主細胞におけるGM-CSFの恒常的抑制の実現という観点からは、RNAiを誘導するポリヌクレオチドとしてはshRNAを細胞内で発現するベクターを用いることが好ましい。
本発明のRNAiを誘導するポリヌクレオチドは、また、宿主細胞においてヒトGM-CSFを標的結合ドメインとして有するGMR.CARと同時に発現される。したがって、本発明のRNAiを誘導するポリヌクレオチドは、宿主細胞においてGMR.CARの発現には影響を与えず、且つ、宿主細胞におけるGM-CSFの発現を抑制することが望ましい。
前記特徴に鑑みて、本発明の実施態様の一つとしては、GM-CSFの非翻訳領域のmRNAの配列における任意の連続する15個乃至30個の領域と相補性を有する15個乃至30個の塩基配列をセンス鎖として有し、アンチセンス鎖としてセンス鎖と相補的な塩基配列を含む15個乃至30個の塩基配列をsiRNAとして使用することができる。GM-CSFの非翻訳領域としては、5'-末端側の非翻訳領域及び3'-末端側の非翻訳領域が存在するが、いずれの領域を使用してもよい。具体的には、5'-末端側の非翻訳領域としては、配列番号１で示されるヒトGM-CSFの全長ヌクレオチド配列の1から32番目の配列のうち任意の連続する15個乃至30個の領域を選ぶことができる。また、3'-末端側の非翻訳領域としては、配列番号１で示されるヒトGM-CSFの全長ヌクレオチド配列の468から800番目の配列のうち任意の連続する15個乃至30個の領域を選ぶことができる。より好ましくは、5'-末端側の非翻訳領域を用いることができる。
本発明のさらなる実施態様の一つとしては、RNAiを誘導するポリヌクレオチドとして、例えば配列番号２０及び２１で示される配列を有するsiRNAを用いることができる。
本発明のさらなる実施態様としては、配列番号２２で示される配列を有するshRNAを使用することができる。
本発明において、ヒトGM-CSF受容体に特異的に結合するキメラ抗原受容体タンパク質をコードするポリヌクレオチドと、ヒトGM-CSFに対するRNAiを誘導するポリヌクレオチドとは、ヒト細胞における発現に適するプロモータの制御下で同一ベクター中に存在し得るが、別々のベクター中に存在していても良い。適切なプロモータは、構成プロモータ（constitutive promoter）及び誘導プロモータ（inducible promoter）の両方でありうる。好ましいプロモータは、CMV及びSV-40に由来する。別々のベクターによってポリヌクレオチドが導入される場合、これらのベクターは、同時に、又は連続して宿主細胞へトランスフェクトされ得る。
本発明の一実施形態としては、
配列番号１のアミノ酸配列を含むヒト顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）受容体に特異的に結合する標的結合ドメインと、配列番号１２のアミノ酸配列を含む膜貫通ドメインと、配列番号１６のアミノ酸配列を含む細胞内シグナル伝達ドメインとを有するキメラ抗原受容体（CAR）タンパク質をコードするポリヌクレオチド
が導入された遺伝子改変細胞を使用することができる。
本発明の一実施形態としては、
配列番号１のアミノ酸配列を含むヒト顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）受容体に特異的に結合する標的結合ドメインと、配列番号６、配列番号８、配列番号１０及び／又は配列番号４２のアミノ酸配列を含む細胞外スペーサードメインと、配列番号１２のアミノ酸配列を含む膜貫通ドメインと、配列番号１６のアミノ酸配列を含む細胞内シグナル伝達ドメインとを有するキメラ抗原受容体（CAR）タンパク質をコードするポリヌクレオチド
が導入された遺伝子改変細胞を使用することができる。
尚、前記、「配列番号６、配列番号８、配列番号１０及び／又は配列番号４２のアミノ酸配列を含む」とは、配列番号６、配列番号８、配列番号１０及び配列番号４２のアミノ酸配列のうち、任意の1又は２以上の組み合わせのいずれかを含むことを意味する。以下、本明細書において同様である。
本発明の一実施形態としては、
(i)ヒト顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）受容体に特異的に結合する標的結合ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内シグナル伝達ドメインとを有するキメラ抗原受容体（CAR）タンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び
(ii)ヒトGM-CSFに対するRNAiを誘導するポリヌクレオチドとして、ヒトGM-CSFの非翻訳領域の配列に相補性を有するsiRNA又はshRNA
が導入された遺伝子改変細胞を使用することができる。
本発明の一実施形態としては、
(i)ヒト顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）受容体に特異的に結合する標的結合ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内シグナル伝達ドメインとを有するキメラ抗原受容体（CAR）タンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び
(ii) 配列番号２２、配列番号２５又は配列番号２８のヒトGM-CSFに対するRNAiを誘導するポリヌクレオチド
が導入された遺伝子改変細胞を使用することができる。
本発明の一実施形態としては、
(i)ヒト顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）受容体に特異的に結合する標的結合ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内シグナル伝達ドメインとを有するキメラ抗原受容体（CAR）タンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び
(ii) ヒトGM-CSFに対するRNAiを誘導するポリヌクレオチドとして、ヒトGM-CSFの5'-側非翻訳領域の配列に相補性を有するsiRNA又はshRNA
が導入された遺伝子改変細胞を使用することができる。
本発明の一実施形態としては、
(i)ヒト顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）受容体に特異的に結合する標的結合ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内シグナル伝達ドメインとを有するキメラ抗原受容体（CAR）タンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び
(ii) 配列番号２２又は配列番号２５のヒトGM-CSFに対するRNAiを誘導するポリヌクレオチド
が導入された遺伝子改変細胞を使用することができる。
本発明の一実施形態としては、
（i）ヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）受容体に特異的に結合する標的結合ドメインと、膜貫通ドメインと、配列番号６、配列番号８、配列番号１０及び／又は配列番号４２のアミノ酸配列を含む細胞外スペーサードメインと、配列番号１４のアミノ酸配列を含む共刺激ドメインと、配列番号１６のアミノ酸配列を含む細胞内シグナル伝達ドメインとを有するキメラ抗原受容体（CAR）タンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び
（ii）ヒトGM-CSFに対するRNAiを誘導するポリヌクレオチドとして、ヒトGM-CSFの非翻訳領域の配列に相補性を有するsiRNA又はshRNA
が導入された遺伝子改変細胞を使用することができる。
本発明の一実施形態としては、
(i)ヒト顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）受容体に特異的に結合する標的結合ドメインと、膜貫通ドメインと、配列番号６のアミノ酸配列を含む細胞外スペーサードメインと、配列番号１４のアミノ酸配列を含む共刺激ドメインと、配列番号１６のアミノ酸配列を含む細胞内シグナル伝達ドメインとを有するキメラ抗原受容体（CAR）タンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び
(ii)ヒトGM-CSFに対するRNAiを誘導するポリヌクレオチドとして、ヒトGM-CSFの非翻訳領域の配列に相補性を有するsiRNA又はshRNA
が導入された遺伝子改変細胞を使用することができる。
本発明の一実施形態としては、
（i）ヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）受容体に特異的に結合する標的結合ドメインと、膜貫通ドメインと、配列番号６、配列番号８、配列番号１０及び／又は配列番号４２のアミノ酸配列を含む細胞外スペーサードメインと、配列番号１４のアミノ酸配列を含む共刺激ドメインと、配列番号１６のアミノ酸配列を含む細胞内シグナル伝達ドメインとを有するキメラ抗原受容体（CAR）タンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び
（ii）配列番号２２、配列番号２５又は配列番号２８のヒトGM-CSFに対するRNAiを誘導するポリヌクレオチド
が導入された遺伝子改変細胞を使用することができる。
本発明の一実施形態としては、
(i)ヒト顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）受容体に特異的に結合する標的結合ドメインと、膜貫通ドメインと、配列番号６のアミノ酸配列を含む細胞外スペーサードメインと、配列番号１４のアミノ酸配列を含む共刺激ドメインと、配列番号１６のアミノ酸配列を含む細胞内シグナル伝達ドメインとを有するキメラ抗原受容体（CAR）タンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び
(ii) 配列番号２２、配列番号２５又は配列番号２８のヒトGM-CSFに対するRNAiを誘導するポリヌクレオチド
が導入された遺伝子改変細胞を使用することができる。
本発明の一実施形態としては、
（i）ヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）受容体に特異的に結合する標的結合ドメインと、膜貫通ドメインと、配列番号６、配列番号８、配列番号１０及び／又は配列番号４２のアミノ酸配列を含む細胞外スペーサードメインと、配列番号１４のアミノ酸配列を含む共刺激ドメインと、配列番号１６のアミノ酸配列を含む細胞内シグナル伝達ドメインとを有するキメラ抗原受容体（CAR）タンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び
（ii）ヒトGM-CSFに対するRNAiを誘導するポリヌクレオチドとして、ヒトGM-CSFの5'側非翻訳領域の配列に相補性を有するsiRNA又はshRNA
が導入された遺伝子改変細胞を使用することができる。
本発明の一実施形態としては、
(i)ヒト顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）受容体に特異的に結合する標的結合ドメインと、膜貫通ドメインと、配列番号６のアミノ酸配列を含む細胞外スペーサードメインと、配列番号１４のアミノ酸配列を含む共刺激ドメインと、配列番号１６のアミノ酸配列を含む細胞内シグナル伝達ドメインとを有するキメラ抗原受容体（CAR）タンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び
(ii) ヒトGM-CSFに対するRNAiを誘導するポリヌクレオチドとして、ヒトGM-CSFの5’側非翻訳領域の配列に相補性を有するsiRNA又はshRNA
が導入された遺伝子改変細胞を使用することができる。
本発明の一実施形態としては、
（i）ヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）受容体に特異的に結合する標的結合ドメインと、膜貫通ドメインと、配列番号６、配列番号８、配列番号１０及び／又は配列番号４２のアミノ酸配列を含む細胞外スペーサードメインと、配列番号１４のアミノ酸配列を含む共刺激ドメインと、配列番号１６のアミノ酸配列を含む細胞内シグナル伝達ドメインとを有するキメラ抗原受容体（CAR）タンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び
（ii）配列番号２２又は配列番号２５のヒトGM-CSFに対するRNAiを誘導するポリヌクレオチド
が導入された遺伝子改変細胞を使用することができる。
本発明の一実施形態としては、
(i)ヒト顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）受容体に特異的に結合する標的結合ドメインと、膜貫通ドメインと、配列番号６のアミノ酸配列を含む細胞外スペーサードメインと、配列番号１４のアミノ酸配列を含む共刺激ドメインと、配列番号１６のアミノ酸配列を含む細胞内シグナル伝達ドメインとを有するキメラ抗原受容体（CAR）タンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び
(ii) 配列番号２２又は配列番号２５のヒトGM-CSFに対するRNAiを誘導するポリヌクレオチド
が導入された遺伝子改変細胞を使用することができる。
上記のポリヌクレオチドが導入される細胞としては、哺乳動物、例えばヒト由来の細胞又はサル、マウス、ラット、ブタ、ウシ、イヌ等の非ヒト哺乳動物由来のT細胞又はT細胞を含む細胞集団が使用できる。例えば、血液（末梢血、臍帯血など）、骨髄などの体液、組織又は器官により採取、単離、精製、誘導された細胞を使用することができる。末梢血単核細胞（PBMC）、免疫細胞[樹状細胞、Ｂ細胞、造血幹細胞、マクロファージ、単球、NK細胞又は血球系細胞（好中球、好塩基球）]、臍帯血単核球、繊維芽細胞、前駆脂肪細胞、幹細胞、皮膚角化細胞、間葉系細胞、脂肪肝細胞、各種がん細胞株又は神経幹細胞を使用することができる。
本発明の好ましい実施態様の一つとしては、例えば、細胞傷害性タンパク質（パーフォリン、グランザイム等）を放出する細胞を用いることができる。具体的には、例えばT細胞、T細胞の前駆細胞（造血幹細胞、リンパ球前駆細胞等）、NK細胞、NK-T細胞又はこれらを含有する細胞集団を使用することができる。さらに、これらの細胞に分化し得る細胞としてES細胞、iPS細胞等の各種幹細胞が含まれる。T細胞には、CD8陽性T細胞、CD4陽性T細胞、制御性T細胞、細胞傷害性T細胞、又は腫瘍浸潤リンパ球が含まれる。T細胞及びT細胞の前駆細胞を含有する細胞集団には、PBMCが含まれる。前記の細胞は生体より採取されたもの、それを拡大培養したもの又は細胞株として樹立されたもののいずれでもよい。製造されたCARを発現する細胞又は当該細胞より分化させた細胞を生体に移植する場合には、その生体自身又は同種の生体から採取された細胞に核酸を導入することが望ましい。
遺伝子改変細胞を作製するためのポリヌクレオチドの導入方法は、通常使用されているものであればいずれでも良く、特に限定されるものではない。ベクターを用いて導入する場合、使用され得るベクターとしては、特に限定するものではないが、例えばレンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、泡沫状ウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター等が挙げられる。また、非ウイルス性の態様として、プラスミドトランスポゾンを使用することができ、sleeping beautyトランスポゾンシステム（例えばHuang X, Guo H, et al. Mol Ther. 2008; 16: 580-9；Singh H, Manuri PR, et al. Cancer Res. 2008; 68: 2961-71；Deniger DC, Yu J, et al. PLoS One. 2015; 10: e0128151；Singh H, Moyes JS, et al. Cancer Gene Ther. 2015; 22: 95-100；Hou X, Du Y, et al. Cancer Biol Ther. 2015; 16: 8-16；Singh H, Huls H, et al. Immunol Rev. 2014; 257: 181-90；及びMaiti SN, Huls H, et al. J Immunother. 2013; 36: 112-23に記載）又はpiggybacトランスポゾンシステム（Nakazawa Y, Huye LE, et al. J Immunother. 2009; 32: 826-36；Galvan DL, Nakazawa Y, et al. J Immunother. 2009; 32: 837-44；Nakazawa Y, Huye LE, et al. Mol Ther. 2011; 19: 2133-43；Huye LE, Nakazawa Y, et al. Mol Ther. 2011; 19: 2239-48；Saha S, Nakazawa Y, et al. J Vis Exp. 2012; (69): e4235；Nakazawa Y, Saha S, et al. J Immunother. 2013; 36: 3-10；及びSaito S, Nakazawa Y, et al. Cytotherapy. 2014; 16: 1257-69に記載）が好適に使用できる。
本発明の好ましい態様の一つとしては、非ウイルス性の態様、特にpiggybacトランスポゾンシステムを使用することができる。具体例は実施例に示す。
本発明はまた、上記の通り、ヒトGM-CSF受容体に特異的に結合するキメラ抗原受容体（CAR）タンパク質をコードするポリヌクレオチドをベクターを用いて細胞に導入することを含む、CARタンパク質発現細胞の作製方法を提供する。
本発明はまた、上記の通り、ヒトGM-CSF受容体に特異的に結合するキメラ抗原受容体（CAR）タンパク質をコードするポリヌクレオチド、及びヒトGM-CSFに対するRNAiを誘導するポリヌクレオチドを同一又は異なるベクターを用いてそれぞれ細胞に導入することを含む、CARタンパク質発現細胞の作製方法を提供する。
本発明の好ましい実施態様の一つとしては、宿主細胞におけるGMR.CARをコードするポリヌクレオチドとRNAiを誘導するポリヌクレオチドは、宿主細胞において該二つのポリヌクレオチドが同時に発現する割合を高めるために、同一のベクターに組み込まれていることが望ましい。即ち、RNAiを誘導するポリヌクレオチドによって、宿主細胞においてGM-CSFの発現が抑制されている細胞にGMR.CARが発現することが望ましい。例えば、配列番号１の33〜467番目のポリヌクレオチドと、配列番号２９〜３１で示すヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドとを用いて、遺伝子改変細胞を作製することができる。
本発明のGMR.CARをコードするポリヌクレオチド、及び場合によってRNAiを誘導するポリヌクレオチドを含むベクターは、特に限定するものではないが、例えば大腸菌等の適切な宿主細胞において作製・維持することができる。
また、本発明の遺伝子改変細胞の作製及び培養は、本願明細書の記載並びに当分野における技術常識に基づいて、T細胞又はT細胞若しくはT細胞の前駆細胞を含む細胞集団の培養に適した培地及び培養条件に従って行うことができる。培養に際しては、適切なサイトカイン、例えばIL-15、IL-7等を添加することができる。
更に、実施例にも記載するように、本発明の遺伝子改変細胞の培養において、例えば国際公開WO 2017/061615号に開示されるような、抗体で刺激した活性化T細胞、又は抗体刺激後にウイルスペプチド抗原で処理したウイルスペプチド添加活性化T細胞をフィーダー細胞として添加することもできる。しかしながら、本願発明の遺伝子改変細胞の培養方法は、特に限定されるものではない。
本発明の細胞は、GM-CSF受容体を表面に発現している標的細胞に対して、受容体特異的免疫応答を引き起こすことによって、細胞内にシグナルが伝達され、活性化される。CARを発現する細胞の活性化は、宿主細胞の種類やCARの細胞内ドメインによって異なるが、例えば、サイトカインの放出、細胞増殖率の向上、細胞表面分子の変化等を指標として確認することができる。細胞傷害性タンパク質の放出（パーフォリン、グランザイムなど）は、受容体を発現している細胞の破壊をもたらす。
本発明は更に、ヒトGM-CSF受容体に特異的に結合するキメラ抗原受容体（CAR）タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。
本発明は更に、ヒトGM-CSF受容体に特異的に結合するキメラ抗原受容体（CAR）タンパク質をコードするポリヌクレオチド、及びヒトGM-CSFに対するRNAiを誘導するポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。本発明は更に、ヒトGM-CSF受容体に特異的に結合するキメラ抗原受容体（CAR）タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターと、ヒトGM-CSFに対するRNAiを誘導するポリヌクレオチドを含むベクターとを含む、CARタンパク質発現細胞の作製のためのキットを提供する。
本発明のベクター及びキットは、上記の本発明の遺伝子改変細胞を作製するために好適に使用することができる。
本発明のGMR.CARを発現する細胞は、疾患の治療剤として使用することができる。従って、本発明は、上記の本発明の細胞を含む、GM-CSF受容体発現細胞が関与する疾患に対する治療剤を提供する。該治療剤は、CARタンパク質を発現する細胞を活性成分として含み、さらに、適当な賦形剤を含んでいても良い。本発明の治療剤による治療が期待される疾患としては、当該細胞に感受性を示す疾患であれば良く、限定されないが、例えば、GM-CSF受容体を発現する、特に高発現する細胞が関連する疾患、例えば血液がん（白血病）が挙げられ、具体的には、例えば若年性骨髄単球性白血病（JMML）、急性骨髄性白血病（AML）が挙げられる。さらには、固形がんが挙げられ、具体的には、例えば、神経膠腫（グリオーマ）、神経芽細胞腫、膠芽腫、脳腫瘍、直腸結腸腺がん、前立腺がん、腎臓がん、メラノーマ及び肺小細胞がん等が挙げられる。
固形がんに上記治療剤が適用される場合、GM-CSF受容体が標的細胞の微小環境を形成している細胞、例えば骨髄由来免疫抑制細胞（MDSCs）等に発現している疾患が含まれる。該疾患にあっては、標的細胞にGM-CSF受容体が発現していない場合であっても、例えば、腫瘍細胞傷害活性を高める目的で、他の治療剤と併用して用いることができる。
ここで、「GM-CSF受容体を発現する、特に高発現する」とは、発現強度が高い（例えば、フローサイトメトリーにおける平均蛍光強度（MFI）が高い）ことを意図する場合と、発現率（陽性率）が高いことを意図する場合があり得る。発現率が高い細胞を意図する場合、例えば、CD33/CD116発現率（陽性率）が少なくとも40％以上である細胞を意味する。好適には該発現率が80％以上の細胞を意味する。
本発明の治療剤の一態様は、GM-CSF受容体を発現する腫瘍細胞に対する抗癌剤である。本発明の治療剤又は抗癌剤は、単独で使用することもできるが、異なるメカニズムの薬剤及び／又は治療と組み合わせて使用することができる。
従って、本発明の治療剤は、単独又は他の有効成分と組み合わせて、医薬組成物の形態とすることができる。本発明の治療剤又は医薬組成物は、局所投与又は全身投与することができ、投与形態を限定するものではないが、例えば白血病の治療の場合には、静脈内投与とすることが好ましい。医薬組成物には、本発明の治療剤及び他の有効成分の他に、投与形態に応じて、当分野で通常使用される担体、賦形剤、緩衝剤、安定化剤等を含めることができる。本発明の治療剤の投与量は、患者の体重、年齢、疾患の重篤度等に応じて変動するものであり、特に限定するものではないが、例えば、104〜1010 CAR陽性細胞数/kg体重の範囲で１日１回〜数回、２日毎、３日毎、１週間毎、２週間毎、毎月、２カ月毎、３カ月毎に投与することが可能である。
以下に実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、本発明は以下の実施例のみに限定されるものではない。
［実施例１ GMR.CAR発現プラスミド（CAR 001）の作製］
ヒトGM-CSF（NCBI Accession No.: NM_000758の翻訳領域（配列番号１、33〜464塩基：終止コドン前）の両端にEcoRIとBclIサイトをつけたPCR産物をpTA2クローニングベクター（TOYOBO）にサブクローニングした。ヒトGM-CSF配列をサブクローニングしたpTA2クローニングベクターをEcoRIとBclIダブルダイジェストしヒトGM-CSF配列を切り出した。一方、pSL1190ベクター（Amersham社）をEcoRIとBamHIでダブルダイジェストした後、前述の切り出したヒトGM-CSF配列をcompatible siteを使用してpSL1190ベクターにライゲーションした（pSL1190-GMR.CAR）。pSL1190-GMR.CARをNotIとEcoRIでダブルダイジェストし、GMR.CAR配列部分を切り出した。
一方、pIRES2-eGFP (Clontech)をトランスポゾンプラスミドとするため、5’側逆向き反復配列と3’側逆向き反復配列を挿入し、トランスポゾンプラスミドであるpIR-eGFPベクターとした。さらにpIR-eGFPベクターからピューロマイシン耐性遺伝子を除去し、pIRII-eGFPベクターとした。ベイラー医科大学において作製されたSFG-CD19 CAR retroviral vectorをEcoRIとNotIでダブルダイジェストし、anti-CD19 scFv (FMC63; Zola H. et al. Immunol Cell Biol. 1991 Dec;69 (Pt 6):411-22)-CD28-CD3ζの断片を得た。pIRII-eGFPベクターもEcoRIとNotIでダブルダイジェストし、anti-CD19 scFv (FMC63)-CD28-CD3ζとライゲーションし，pIRII-CD19.CARを作製した。得られたpIRII-CD19.CAR（Mol Ther. 2011; 19: 2239-48及びCytotherapy. 2014; 16: 1257-69）をNotIとEcoRIでダブルダイジェストした後に、切り出したGMR.CAR配列をライゲーションして、GMR.CAR発現プラスミドを取得した（CAR 001）。
図１にCAR 001作製のもととなったpIRII-CD19.CARのベクターマップ、図２に作製されたCAR 001のベクターマップをそれぞれ示す。
［実施例２ siRNAのデザイン及びshRNAの合成］
ヒトGM-CSF（NCBI Accession No.: NM_000758.3、配列番号１）の配列をもとに，タカラバイオ株式会社に委託し，１対の翻訳領域内のmRNAに特異的なsiRNAをデザインした（配列番号１７及び１８）。
一方、ヒトGM-CSFの5'-非翻訳領域（5'-UTR）又は3'-非翻訳領域（3'-UTR）のmRNA配列に特異的なsiRNAをBLOCK-iT（商標登録）RNAi Designer（サーモフィッシャーサイエンティフィック）を使用してデザインし、任意の3対のsiRNAを選択した（配列番号２０及び２１、２３及び２４、２６及び２７）。
ヒトU6プロモーター配列直後に、上記のsiRNAセンス鎖とアンチセンス鎖をそれぞれヘアピンループで繋ぎ合わせたDNA配列を人工合成した（タカラバイオ株式会社又はユーロフィンジェノミクス株式会社に委託）。人工合成遺伝子の5’側に制限酵素MunI（MfeI）によって切断される配列と3’側に制限酵素ClaIによって切断される配列を付加した。合成された配列を配列番号１９及び２９〜３１に示した(図３〜６）。陰性対照配列として、同様にMunI（MfeI）及びClaIの切断配列を付加したSNC1-C（タカラバイオ株式会社）を用いた（図７、配列番号３２）。
［実施例３ GMR.CAR+siRNAのコンストラクト作製］
実施例２で人工合成したDNA（配列番号２９〜３１）及びMunI（MfeI）及びClaIの切断配列を付加したSNC1-C（タカラバイオ株式会社、配列番号３２）をpTAKN-2ベクター（株式会社バイオダイナミクス研究所）又はpBAsiベクター（タカラバイオ株式会社）に組み込み、得られたベクターを100 ng/μLとなるよう溶解し、その1μL（100 ng相当）を用いて大腸菌HST04株（タカラバイオ株式会社）を形質転換した後、50μg/mLカナマイシン含有のLB寒天培地上で約16時間培養した。別に実施例１で作製したGMR.CAR発現プラスミド（CAR 001）でも同様にHST04株を形質転換し、50μg/mLアンピシリン含有のLB寒天培地上で約16時間培養した。
出現したコロニーをさらに50μg/mLカナマイシン又はアンピシリン含有LB液体培地中で約16時間培養した。大腸菌培養液からQIAprep Spin Miniprep Kit（キアゲン）を用いて各プラスミドを精製した。精製したプラスミド（0.5〜1μg相当）を制限酵素MfeI及びClaI（New England Biolabs）により約3時間消化した。酵素処理済み反応液を1％アガロースゲル電気泳動にて分離し、pTAKN-2ベクターから切り出されたインサート断片とCAR 001の酵素処理済み断片をゲルから切り出し、NucleoSpin Gel and PCR Clean-up（登録商標、マッハライ・ナーゲル、タカラバイオ株式会社）を用いて精製した。精製したインサート断片とベクター断片をDNA Ligation Kit<Mighty Mix>（タカラバイオ株式会社）を用いて連結した。連結された環状ベクターにより大腸菌DH5α（東洋紡績株式会社）、TOP10（サーモフィッシャーサイエンティフィック）又はHST04株を形質転換し、50μg/mLアンピシリン含有LB寒天培地上で約16時間培養した。
出現したコロニーをさらに50μg/mLアンピシリン含有LB液体培地中で約16時間培養した。培養した大腸菌培養液からQIAprep Spin Miniprep Kit（キアゲン）を用いて各プラスミドを精製した。精製したプラスミド（0.5〜1μg相当）を制限酵素BamHI（New England Biolabs）により約3時間消化し、インサート断片の挿入を1％アガロースゲル電気泳動で確認し、挿入が確認されたサンプルにつき塩基配列確認を行い、塩基配列が配列番号２９〜３２と完全一致したサンプルをGMR.CAR+shRNA挿入体発現プラスミド［それぞれCAR 004 (GMR.CAR+5'-UTR_1)、CAR 005 (GMR.CAR+5'-UTR_6)、CAR 006 (GMR.CAR+3'-UTR_500)又はCAR 007 (GMR.CAR+ SNC1-C)］（図８）とした。
以下の検討にはGMR.CAR+shRNA挿入体発現プラスミド又は変異体GMR.CAR+shRNA挿入体発現プラスミドを含む大腸菌を培養し、Endofree Plasmid Maxi Kit（キアゲン）を用いて精製したプラスミド溶液を使用した。
［比較例１ GM-CSF変異体GMR.CAR発現プラスミド］
翻訳領域のsiRNAはGMR.CARの標的結合ドメインであるGM-CSFの発現にも影響する可能性があるため、GM-CSF mRNA配列（NCBI Accession No.: NM_000758.3(配列番号１)の159-179塩基に相当）部分にアミノ酸置換の起こらないような変異を導入した（配列番号３及び４）。具体的には、配列番号１の塩基配列中159〜179番目の塩基配列を、配列番号３の塩基配列中127〜147番目の塩基配列に変異させた。この変異体はsiRNAが結合するmRNA配列部分の塩基に変異を導入した人工合成遺伝子とCAR 001の野生型GM-CSF配列を入れ替えることで作製した。すなわち、5’側に制限酵素XhoIで切断される配列と3’側に制限酵素DraIIIによって切断される配列を付加したXhoI - 分泌シグナル配列 - GM-CSF変異体 - ヒンジ配列 - DraIIIの断片を人工合成した（ユーロフィンジェノミクス株式会社に委託）。この断片とCAR 001をXhoIとDraIIIで処理した断片とを結合させ、GM-CSF変異体GMR.CAR発現プラスミドを作製した。
［比較例２ GM-CSF変異体GMR.CAR+siRNAのコンストラクト作製］
実施例２で人工合成したDNA（配列番号１９）及びMunI（MfeI）及びClaIの切断配列を付加したSNC1-C（タカラバイオ株式会社、配列番号３２）をそれぞれpBAsiベクター（タカラバイオ株式会社）に組み込み、実施例３と同様にして大腸菌HST04株（タカラバイオ株式会社）を形質転換した後、50μg/mLカナマイシン含有のLB寒天培地上で約16時間培養した。別に比較例１で作製したGM-CSF変異体GMR.CAR発現プラスミド（CAR 002）でも同様にHST04株を形質転換し、50μg/mLアンピシリン含有のLB寒天培地上で約16時間培養した。
出現したコロニーをさらに50μg/mLカナマイシン又はアンピシリン含有LB液体培地中で約16時間培養し、実施例３と同様の操作によって、塩基配列が配列番号１９及び３２と完全一致したサンプルをGM-CSF変異体GMR.CAR+shRNA挿入体発現プラスミド［それぞれCAR 002 (変異体GMR.CAR+shRNA)、CAR 003 (変異体GMR.CAR+ SNC1-C)］とした。
［実施例４ GM-CSF変異体GMR.CAR+shRNA挿入体発現プラスミド（CAR 002及びCAR 003）又はGMR.CAR+shRNA挿入体発現プラスミド（CAR 004〜CAR 007）の発現確認］
継代維持したHEK293T細胞（ヒト胎児腎細胞HEK293細胞にSV40 Large T 抗原を発現する派生株、理化学研究所）を10% FBS含有のD-MEM（和光純薬工業株式会社）を用いて希釈し、4 x 105個/well、500μLで24ウェルトリートメント培養プレートに播種し、一晩培養した。一晩培養した細胞に、50μL Opti-MEM（サーモフィッシャーサイエンティフィック）中に0.8μgのCAR 001〜007を含有するプラスミド希釈液と50μL Opti-MEM中に2μLのリポフェクタミン2000試薬（サーモフィッシャーサイエンティフィック）を等量ずつ混和した溶液を20分間室温に放置し、播種した細胞に100μL/wellを加えた。そのまま約48時間CO2インキュベータ内で培養した。コントロールとして、Opti-MEMを100μL添加した群と、プラスミドを含まないリポフェクタミン試薬のみを添加した群を設定した。
48時間後に各細胞を回収し遠心分離後、PE Rat Anti-Human GM-CSF抗体（BD Pharmingen）2.5μL及びAPC Anti-Human CD116抗体（ミルテニーバイオテック） 5μLを加えて懸濁し、4℃、遮光にて20分間抗体標識反応を行った。20分後、D-PBS適量で細胞を洗浄し、遠心分離により細胞を沈殿させ上清を除去した後、D-PBS適量に再懸濁したサンプルについてFACSCalibur（BD）を用いて解析し、GM-CSF/CD3陽性のGMR.CARの発現率を測定した。
図９にCAR 001〜007をHEK293T細胞に遺伝子導入してから48時間後のGM-CSF陽性のGMR.CAR発現率％の結果を示した。その結果、GM-CSF遺伝子の翻訳領域に対するRNAiを誘導し得るCAR 002を導入した場合のGMR.CARの発現率が他と比較して最も低かった。一方、陰性対照shRNA挿入体（CAR 003及びCAR 007）、非翻訳領域shRNA挿入体（CAR 004〜006）の導入によるGMR.CARの発現率はほとんど低下しなかった。CAR 002はGM-CSF mRNAの翻訳領域内に特異的なshRNAが挿入され、かつGM-CSF遺伝子配列中のsiRNA認識部分に塩基変異を導入した変異体であるが、塩基変異を導入してもsiRNAがある程度のノックダウン効果を示し、GMR.CARの発現自体を抑制している可能性が考えられた。
［実施例５ GMR.CAR-T細胞の培養・増幅１］
＜Day 0: ヒト末梢血単核細胞（PBMC）の分離とGMR.CAR発現ベクターの電気的導入＞
健康成人ドナーから末梢血を採取し、D-PBS（和光純薬工業株式会社）で2倍に希釈した後、Ficoll-Paque PLUS（GEヘルスケア）に希釈末梢血を重層し、400 x g、30分の遠心分離を行い、PBMCを分取した。分取したPBMCをD-PBSで2回洗浄し、遠心分離により単離した。GMR.CAR発現プラスミド（CAR 001）のPBMCへの導入は10 x 106 個の細胞を用いた。具体的には、それぞれCAR 001 5μg、pCMV-piggyBacプラスミド5μg、P3 Primary Cell 4D-NucleofectorTMX Kit（ロンザジャパン株式会社）に付属するP3 Primary Cell solution 100 μLを混和し、10 x 106個のPBMCを懸濁した。懸濁した細胞全量をNucleocuvetteに移し、4D-Nucleofection（Program No: FI-115）により電気的遺伝子導入を行った。電気的遺伝子導入を行った細胞を10分間室温に放置し、全量を予め加温しておいた10 ng/mL IL-7及び5 ng/mL IL-15含有TexMACS medium（ミルテニーバイオテック）2 mL/wellで24ウェルトリートメント培養プレートにて培養を開始した。遺伝子導入操作を施さないMock-T細胞として、1 x 106個の細胞を同様に培養した。培養中の培地の半量を廃棄し、2倍量すなわち20 ng/mL IL-7及び10 ng/mL IL-15含有のTexMACS mediumを半量添加する培地交換作業を適宜行った。
＜Day 1-4: 遺伝子導入細胞の非特異的抗体刺激＞
抗CD3抗体及び抗CD28抗体（ミルテニーバイオテック）を含有するD-PBSで24ウェルノントリートメント培養プレートを37℃、2時間で抗体コーティングしたプレートを用意し、day 0の培養液全量を抗体コーティングプレートに移し、T細胞の非特異的抗体刺激をday 4まで行った。
＜Day 4: T細胞の増幅＞
Day 1から非特異的抗体刺激を施したT細胞を24ウェルトリートメント培養プレートに戻し、引き続き培養して増幅を行った。
＜Day 7: CAR-T細胞の増幅＞
細胞懸濁液全量を10 ng/mL IL-7及び5 ng/mL IL-15含有のTexMACS medium 30 mLを充填したG-Rex 10（Wilson Wolf）に移し、Day 14までCAR-T細胞の増幅を行った。Day 14まで増幅したGMR.CAR細胞の発現率を以下の方法にて測定した。Mock-T細胞は24ウェルトリートメント培養プレート上で培養を続け、細胞の増殖度合いにより培地交換と増幅を行った。
＜Day 14: GMR.CAR発現率の評価＞
細胞数をカウントし、1〜2 x 105個の細胞をフローサイトメトリー解析により、GMR.CAR-Tの発現率を評価した。1〜2 x 105個の細胞を採取し、FITC Goat Anti-Human IgG (H+L) 抗体（Jackson ImmunoResearch Inc）2μL又はPE Rat Anti-Human GM-CSF抗体（BD Pharmingen）2.5μL及びAPC Anti-Human CD3抗体（ミルテニーバイオテック） 5μLを加え懸濁し、4℃、遮光にて20分間抗体標識反応を行った。20分後、D-PBS適量で細胞を洗浄し、遠心分離により細胞を沈殿させ上清を除去した後、D-PBS適量に再懸濁したサンプルについてFACSCalibur（BD）を用いて解析し、IgG1/CD3陽性又はGM-CSF/CD3陽性のGMR.CARの発現率を測定した。GMR.CAR発現プラスミド（CAR 001）を用いてPBMCへの電気的導入操作及びT細胞の培養・増幅操作によって得られるGMR.CAR-T細胞をCAR-T 001と定義した。
図１０に健康成人3ドナーから作製されたCAR-T 001のday 14における発現解析結果を示す。CAR-T 001のGMR.CAR発現率はそれぞれ、ドナー 1: 10.12％ (IgG/CD3陽性率)、ドナー 2: 15.38％及びドナー 3: 10.98％ (それぞれGM-CSF/CD3陽性率) であり、それぞれのドナーに対応するMock-T細胞における発現率（ドナー 1: 0.87％、 ドナー 2: 4.62％及びドナー 3: 4.37％）に比較していずれも高く、GMR.CAR発現T細胞（CAR-T 001）の作製に成功した。
［実施例６ CAR-T 001の抗腫瘍細胞活性とGM-CSF分泌量の評価］
＜抗腫瘍細胞活性評価：＞
CAR-T 001の腫瘍細胞傷害活性を評価するため、腫瘍細胞との共培養試験を行った。具体的には、THP-1、Kasumi-1又はK562細胞（American Type Culture Collection(ATCC)）を使用し、それぞれの腫瘍細胞［ターゲット（Ｔ）］を10 x 105個/mLとなるように10％ FBS含有RPMI 1640培地（サーモフィッシャーサイエンティフィック）で調製し、48ウェルトリートメント培養プレートに500μL/wellで播種した（ウェル内の細胞数は5 x 105個となる）。CAR-T 001［エフェクター（Ｅ）］は、Ｅ：Ｔ比1 : 5〜1 : 50となるように10％ FBS含有RPMI 1640培地で希釈した。すなわち、E : T比＝１：５の場合、CAR-T 001は2 x 105個/mLとなるように調製し、腫瘍細胞が播かれた48ウェルトリートメント培養プレートに500μL/wellで添加した（ウェル内の細胞数は1 x 105個）。同様に、E : T比＝１：５０の場合は、0.2 x 105個/mLとなるように調製し、腫瘍細胞が播かれた48ウェルトリートメント培養プレートに500μL/wellで添加した（ウェル内の細胞数は0.1 x 105個となる）。
共培養試験は5日間行った。Mock-T細胞についても同様な共培養試験を行い、コントロール群として、腫瘍細胞のみを同細胞数で培養した群も設定した（CAR-T非添加群）。共培養試験5日目に各ウェルの細胞を回収し、トリパンブルーによる染色下、生細胞数をカウントした。遠心分離した細胞にAPC Anti-Human CD3抗体（ミルテニーバイオテック）5μL及びPE Anti-Human CD33抗体 5μLを加え懸濁し、4℃、遮光にて20分間抗体標識反応を行った。20分後、D-PBS適量で細胞を洗浄し、遠心分離により細胞を沈殿させ上清を除去した後、D-PBS適量に再懸濁したサンプルについてFACSCaliburを用いて解析し、CD33の陽性率を測定し、以下の計算式によりCAR-T 001又はMock-T細胞の抗腫瘍細胞活性％を算出した。
＜抗腫瘍細胞活性の算出＞
計算式：
・CD33陽性細胞数＝（トリパンブルー染色下生細胞数 ｘ FACSにおけるCD33陽性率％）／１００
・抗腫瘍細胞活性％＝１００−（CAR-T添加群のCD33陽性細胞数）／（CAR-T非添加群のCD33陽性細胞数）ｘ１００
図１１に健康成人3ドナー由来の細胞を用いて作製したCAR-T 001のTHP-1、Kasumi-1又はK562細胞に対する抗腫瘍細胞活性％の結果を示した。データは3ドナーCAR-T 001の抗腫瘍細胞活性％の平均値を示した。CAR-T 001は、THP-1及びKasumi-1細胞をE : T比1 : 5で完全に殺傷し、E : T比1 : 50でも強い抗腫瘍細胞活性が認められた。一方、GM-CSFレセプターα鎖であるCD116を発現しないK562細胞をCAR-T 001は全く殺傷しなかった。
＜GM-CSF分泌量の評価：＞
上記抗腫瘍細胞活性と同様の共培養試験のE : T比1 : 5の1日目から5日目の培養上清を採取し、測定まで-30℃に冷凍保存した。冷凍保存した培養上清を解凍してD-PBSで10倍に希釈した後、Human GM-CSF Quantikine ELISA Kit（R&D Systems）を用いて培養上清中のGM-CSF分泌量を測定した。
図１２にCAR-T 001とTHP-1又はKasumi-1との共培養上清中のGM-CSF分泌量の結果を示した。CAR-T 001はTHP-1又はKasumi-1との共培養1日目からGM-CSF分泌を認め、THP-1細胞との共培養においては3日目をピークに、Kasumi-1との共培養においては5日目までGM-CSFの著しい上昇が確認された。一方、遺伝子導入操作を施さないMock-Tとの共培養では、いずれも培養上清中のGM-CSFの上昇は確認されなかった。
［実施例７ CAR-T 001の抗腫瘍細胞活性に対するGM-CSF共存の影響］
CAR-T 001とTHP-1又はKasumi-1との5日間の共培養試験において、GM-CSF 0〜10 ng/mLを人為的に添加し、GM-CSF共存によるCAR-T 001の抗腫瘍細胞活性に及ぼす影響を評価した。
図１３にGM-CSF共存下におけるCAR-T 001のTHP-1又はKasumi-1に対する抗腫瘍細胞活性をグラフに示した。CAR-T 001のTHP-1細胞に対する抗腫瘍細胞活性に対し、E : T比 1 : 5においてはGM-CSF共存の影響は認められなかったが、E : T比1 : 50においてGM-CSFの添加濃度依存的に抗腫瘍細胞活性が減弱することが確認された。またCAR-T 001のKasumi-1に対する抗腫瘍細胞活性に対してはE : T比 1 : 5及び 1 : 50においてGM-CSFの添加濃度依存的に抗腫瘍細胞活性が減弱することが確認された。
［実施例８ GMR.CAR-T細胞の培養・増幅２］
＜Day -3: PBMCの分離とT細胞の非特異的刺激OKT 3 blast（抗CD3抗体で非特異的に刺激を受けた芽球）の作製＞
遺伝子導入操作3日前に健康成人ドナーから末梢血を採取し、D-PBS（和光純薬工業株式会社）で2倍に希釈した後、Ficoll-Paque PLUSに希釈末梢血を重層し、400 x g、30分の遠心分離を行い、PBMCを分取した。分取したPBMCをD-PBSで2回洗浄し、遠心分離により単離した。単離したPBMC 2〜4 x 106個/well/2 mLとなるように5 ng/mL IL-15含有TexMACS mediumに懸濁した。抗CD3抗体及び抗CD28抗体を含有するD-PBSで24ウェルノントリートメント培養プレートを37℃、2時間で抗体コーティングしたプレートを用意し、細胞懸濁液を2 mL/wellで播きT細胞の特異的刺激を行いOKT3 blastの作製を行った。
＜Day 0: OKT3 blastのウイルスペプチドパルス＞
Day -3に非特異的抗体刺激を施したOKT3 blastを回収し、Peptivatorペプチドプール（登録商標、ミルテニーバイオテック）によるウイルスペプチド刺激を行った。具体的には、D-PBS 50μLにそれぞれ0.05μg/μLのAdV5 Hexon、CMV pp65、EBV BZLF1及びEBV EBNA-1を添加したペプチドプールにてOKT3 blastを懸濁し、37℃で30分間ウイルスペプチド刺激を施した。これらウイルスペプチドの頭文字を取ってACE法と定義した。30分後、OKT3 blastに適量のD-PBSを加え懸濁し、その後4分間のUV照射を行った。UV照射済みOKT3 blastを回収し、細胞数をカウントした後、0.5〜2 x 106個/well/2 mLとなるように10 ng/mL IL-7及び5 ng/mL IL-15含有TexMACS medium中に懸濁し、フィーダー細胞として24ウェルトリートメント培養プレートに移した。ウイルスペプチドパルスとUV照射を施さないOKT3 blastの残りは、5 ng/mL IL-15含有TexMACS medium中24ウェルトリートメント培養プレートでそのまま培養を続けた。
＜Day 0: PBMCの分離と遺伝子導入操作＞
健康成人ドナーから末梢血を採取し、D-PBS（和光純薬工業株式会社）で2倍に希釈した後、Ficoll-Paque PLUS（GEヘルスケア）に希釈末梢血を重層し、400 x g、30分の遠心分離を行い、PBMCを分取した。分取したPBMCをD-PBSで2回洗浄し、遠心分離により単離した。GMR.CAR発現プラスミドのPBMCへの導入は10 x 106 個の細胞を用いた。具体的には、それぞれCAR 001及びCAR 004〜CAR 007のいずれかを5μg、pCMV-piggyBacプラスミド5μg、P3 Primary Cell 4D-NucleofectorTMX Kit（ロンザジャパン株式会社）に付属するP3 Primary Cell solution 100μLを混和し、10 x 106個のPBMCを懸濁した。懸濁した細胞全量をNucleocuvetteに移し、4D-Nucleofection（Program No: FI-115）により電気的遺伝子導入を行った。電気的遺伝子導入を行った細胞を10分間室温に放置し、全量をフィーダー細胞の入った24ウェルトリートメント培養プレートに加え培養を開始した。遺伝子導入操作を施さないMock-T細胞として、各ドナーから1 x 106個の細胞を同様に培養した。培養中の培地の半量を廃棄し、2倍量すなわち20 ng/mL IL-7及び10 ng/mL IL-15含有のTexMACS mediumを半量添加する培地交換作業を適宜行った。Mock-T細胞は24ウェルトリートメント培養プレート上で培養を続け、細胞の増殖度合いにより培地交換と増幅を行った。
＜Day 7: CAR-T細胞の増幅:＞
細胞懸濁液全量を、10 ng/mL IL-7及び5 ng/mL IL-15含有のTexMACS medium 30 mL中にDay 0と同様に作製したフィーダー細胞2 x 106個を充填したG-Rex 10に移し、Day 14までGMR.CAR-T細胞の増幅を行った。Day 14まで増幅したGMR.CAR-T細胞の発現率を以下の方法にて測定した。
＜Day 14: GMR.CAR発現率の評価＞
細胞数をカウントし、1〜2 x 105個の細胞をフローサイトメトリー解析により、GMR.CAR-Tの発現率を評価した。1〜2 x 105個の細胞を採取し、PE Rat Anti-Human GM-CSF抗体2.5μL及びAPC Anti-Human CD3抗体5μLを加え懸濁し、4℃、遮光にて20分間抗体標識反応を行った。20分後、D-PBS適量で細胞を洗浄し、遠心分離により細胞を沈殿させ上清を除去した後、D-PBS適量に再懸濁したサンプルについてFACSCaliburを用いて解析し、GM-CSF/CD3陽性のGMR.CARの発現率を測定した。GMR.CAR発現プラスミド（CAR 001）及びGMR.CAR+shRNA挿入体発現プラスミド（それぞれCAR 004、CAR 005、CAR 006又はCAR 007）を用いてPBMCへの電気的導入操作及びT細胞の培養・増幅操作によって得られるGMR.CAR-T細胞をそれぞれ、CAR-T 001、CAR-T 004、CAR-T 005、CAR-T 006及びCAR-T 007と定義した。
＜ACE法によって作製されたCAR-T 001及び004〜007の結果：＞
図１４に、健康成人1ドナーのPBMCからACE法で作製されたCAR-T 001及び004〜007のday 14における発現解析結果を示した。ACE法で作製されたCAR-T 001及び004〜007のGMR.CAR発現率はそれぞれ、CAR-T 001: 24.41％、CAR-T 004: 13.17％、CAR-T 005: 16.47％、CAR-T 006: 11.21％及びCAR-T 007: 13.19％であり、対応するMock-T細胞における5.99％に比較していずれも高く、ACE法によるCAR-T 001及び004〜007の作製が確認された。
［実施例９ 腫瘍細胞表面におけるGMRα（CD116）の発現解析］
CAR-T 001及び004〜007の抗腫瘍細胞活性評価に使用した腫瘍細胞株の細胞表面におけるGMRα（CD116）の発現率をフローサイトメトリーにより解析した。急性骨髄性白血病（AML）の細胞株であるTHP-1、Kasumi-1、MV4-11株（American Type Culture Collection(ATCC)）、shinAML-1株（信州大学付属病院においてAML患者から樹立した細胞株）又は慢性骨髄性白血病（CML）の細胞株であるK562細胞の解析を行った。具体的には、1〜2 x 105個の細胞を採取し、APC Anti-Human CD116抗体（ミルテニーバイオテック）5μL及びPE Anti-Human CD33抗体（ミルテニーバイオテック）5μLを加え懸濁し、4℃、遮光にて20分間抗体標識反応を行った。20分後、D-PBS適量で細胞を洗浄し、遠心分離により細胞を沈殿させ上清を除去した後、D-PBS適量に再懸濁したサンプルについてFACSCaliburを用いて解析し、CD33/CD116の発現率を測定した。
表１に各腫瘍細胞表面のCD33/CD116発現率を示した。THP-1、Kasumi-1、shinAML-1及びMV4-11すべてにおいてCD33/CD116陽性率は90％以上であった。一方でK562におけるCD33/CD116陽性率は4.29％と低く、K562細胞表面におけるGM-CSFレセプターα鎖の発現が低いことが確認された。
Figure 0006698854
［実施例１０ ACE CAR-T 001及び004〜007の抗腫瘍細胞活性］
CAR-T 001及び004〜007の腫瘍細胞傷害活性を評価するため、腫瘍細胞との共培養試験を行った。具体的には、THP-1、Kasumi-1、shinAML-1又はMV4-11を使用し、それぞれの腫瘍細胞［ターゲット（Ｔ）］を5 x 105個/mLとなるように10％ FBS含有RPMI 1640培地（サーモフィッシャーサイエンティフィック）で調製し、48ウェルトリートメント培養プレートに500μL/wellで播種した。実施例８で取得したCAR-T 001及び004〜007［エフェクター（Ｅ）］は、Ｅ：Ｔ比1 : 5〜1 : 100となるように10% FBS含有RPMI 1640培地で希釈した。
すなわち、E : T比＝１：５の場合、GMR.CAR-T細胞は1 x 105個/mLとなるように調製し、腫瘍細胞が播かれた48ウェルトリートメント培養プレートに500μL/wellで添加した。同様に、E : T比＝１：５０、１：１００の場合は、それぞれGMR.CAR-T細胞は0.1 x 105個/mL又は0.05 x 105個/mLとなるように調製し、腫瘍細胞が播かれた48ウェルトリートメント培養プレートに500μL/wellで添加した。共培養試験は5日間行った。Mock-T細胞についても同様な共培養試験を行い、コントロール群として、腫瘍細胞のみを同細胞数で培養した群も設定した（CAR-T非添加群）。ウェル内のエフェクター及びターゲットの細胞数、E : T比の組み合わせを以下の表２にまとめた。
Figure 0006698854
共培養試験5日目に各ウェルの細胞を回収し、トリパンブルーによる染色下、生細胞数をカウントした。遠心分離した細胞にAPC Anti-Human CD3抗体5μL及びPE Anti-Human CD33抗体 5μLを加え懸濁し、4℃、遮光にて20分間抗体標識反応を行った。20分後、D-PBS適量で細胞を洗浄し、遠心分離により細胞を沈殿させ上清を除去した後、D-PBS適量に再懸濁したサンプルについてFACSCaliburを用いて解析し、CD33の陽性率を測定し、以下の計算式によりCAR-T 001及び004〜007又はMock-T細胞の抗腫瘍細胞活性％を算出した。
＜抗腫瘍細胞活性の算出＞
計算式：
・CD33陽性細胞数＝（トリパンブルー染色下生細胞数 ｘ FACSにおけるCD33陽性率％）／１００
・抗腫瘍細胞活性%＝１００−（CAR-T添加群のCD33陽性細胞数）／（CAR-T非添加群のCD33陽性細胞数）ｘ１００
＜CAR-T細胞の腫瘍細胞殺傷能（単一CAR-T細胞が殺傷した腫瘍細胞数）の算出＞
・CAR-T細胞数＝エフェクターの細胞数ｘGM-CSF陽性率％／１００
・死細胞数＝CAR-T非添加群のCD33陽性細胞数―CAR-T添加群のCD33陽性細胞数
・単一CAR-T細胞が殺傷した腫瘍細胞数＝死細胞数／CAR-T細胞数
図１５にCAR-T 001及び004〜007又はMock-T細胞のTHP-1に対する抗腫瘍細胞活性（Ａ）と腫瘍細胞殺傷能（Ｂ）を示した。CAR-T 004の抗腫瘍細胞活性はCAR-T 001、005、006、007よりも強く、E : T比1 : 100においても90％以上を維持した。腫瘍細胞殺傷能では、CAR-T 004が最も強く、shRNAが導入されていないCAR-T 001又は陰性対照のCAR-T 007のそれよりも2倍程度強い殺傷能だった。
図１６にCAR-T 001及び004〜007又はMock-T細胞のKasumi-1に対する抗腫瘍細胞活性（Ａ）と腫瘍細胞殺傷能（Ｂ）を示した。腫瘍細胞殺傷能では、CAR-T 004が最も強く、shRNAが導入されていないCAR-T 001又は陰性対照のCAR-T 007のそれよりも1.5倍程度強い殺傷能だった。
図１７にCAR-T 001及び004〜007又はMock-T細胞のshinAML-1に対する抗腫瘍細胞活性（Ａ）と腫瘍細胞殺傷能（Ｂ）を示した。CAR-T 004の抗腫瘍細胞活性はCAR-T 001、005、006、007よりも強く、E : T比1 : 100においても80％以上を維持した。腫瘍細胞殺傷能では、CAR-T 004が最も強く、shRNAが導入されていないCAR-T 001又は陰性対照のCAR-T 007のそれよりも2倍以上強い殺傷能だった。
図１８にCAR-T 001及び004〜007又はMock-T細胞のMV4-11細胞に対する抗腫瘍細胞活性（Ａ）と腫瘍細胞殺傷能（Ｂ）を示した。CAR-T 004の抗腫瘍細胞活性はCAR-T 001、005、006、007よりも強く、E : T比1 : 100においても70％以上を維持した。腫瘍細胞殺傷能では、CAR-T 004が最も強く、shRNAが導入されていないCAR-T 001又は陰性対照のCAR-T 007のそれよりも1.5倍程度強い殺傷能だった。
［実施例１１ GM-CSF分泌量の評価］
実施例１０で実施した共培養試験のE : T比1 : 5の1日目から5日目の培養上清を採取し、測定まで-30℃に冷凍保存した。冷凍保存した培養上清を解凍してD-PBSで10倍に希釈した後、Human GM-CSF Quantikine ELISA Kit（R&D Systems）を用いて培養上清中のGM-CSF分泌量を測定した。CAR-T 001及び004〜007のGM-CSF分泌量はCAR-T細胞のGM-CSF陽性率％により補正した。
図１９及び２０にCAR-T 001及び004〜007のいずれかと、THP-1、Kasumi-1、shinAML-1又はMV4-11細胞との共培養上清におけるGM-CSF濃度の測定結果を示した。shRNAが導入されていないCAR-T 001は、いずれの腫瘍細胞との共培養においてもGM-CSF分泌量の上昇が確認された。一方で、GM-CSFの非翻訳領域に対するshRNAが挿入されたCAR-T 004、005、及び006は、CAR-T 001と比較していずれの腫瘍細胞との共培養においてもGM-CSFの分泌量が低下しており、配列番号２９〜３１のいずれのshRNAを用いた場合においてもGM-CSFのノックダウン効果が認められた。陰性対照のshRNAが導入されたCAR-T 007ではノックダウン効果はほとんど認められなかった。
GM-CSFに対するノックダウン効果とCAR-T細胞の抗腫瘍細胞活性の向上が最も相関したCAR-T細胞はCAR-T 004であった。GM-CSFに対するノックダウン効果が最も高いと考えられるCAR-T 006に関しては、抗腫瘍細胞活性が他のCAR-Tよりも一様に劣ることから、siRNAによるノックダウン効果が高いというよりはむしろ、腫瘍細胞の殺傷に伴ったサイトカイン分泌自体が低下している可能性も考えられる。
［実施例１２ GMR.CARスペーサー改変体発現プラスミド（CAR 008〜011）の作製］
CAR 001を鋳型として、細胞外スペーサードメイン部分を改変したGMR.CAR発現プラスミドをinverse-PCR法により作製した。具体的には、図２１〜２４にベクターマップをそれぞれ示す、CH2CH3部分欠失体（図２１）、CH2部分欠失体（図２２）、CH2CH3部分欠失と(G4S)3の挿入体（図２３）、及びヒンジCH2部分欠失体（図２４）を作製した。
Inverse-PCRに用いるPCRプライマーは、以下に示すように、CH2CH3部分欠失体用プライマー（配列番号３３及び３４）、CH2部分欠失体用プライマー（配列番号３５及び３６）、CH2CH3部分欠失と(G4S)3の挿入体用プライマー（配列番号３７及び３８）、ヒンジCH2部分欠失体用プライマー（配列番号３９及び４０）をそれぞれデザインし、合成した（ユーロフィンジェノミクス株式会社に委託）。
＜CH2CH3部分欠失体用プライマー＞
フォワードプライマー：5'- TTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTC -3'（配列番号３３）
リバースプライマー：5'- TGGGCATGTGTGAGTTTTGTCAGGAGAT -3'（配列番号３４）
＜CH2部分欠失体用プライマー＞
フォワードプライマー：5'- GGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTAC -3'（配列番号３５）
リバースプライマー：5'- TGGGCATGTGTGAGTTTTGTCAGGAGATTTGGGC -3'（配列番号３６）
＜CH2CH3部分欠失と(G4S)3の挿入体用プライマー＞
フォワードプライマー：5'- GGTGGTGGTGGATCCGGCGGCGGCGGCTCCGGTGGTGGTGGTTCTAAAGATCCCAAA
TTTTGGGTGCTGG -3'（配列番号３７）
リバースプライマー：5'- TGGGCATGTGTGAGTTTTGTCAGGAGATTTGGGC -3'（配列番号３８）
＜ヒンジCH2部分欠失体用プライマー＞
フォワードプライマー：5'- GGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTAC -3'（配列番号３９）
リバースプライマー：5'- CTCCTGGACTGGCTCCCAGCAGTC -3'（配列番号４０）
CAR 001を50 ng/μLに調製して鋳型として用い、各PCRプライマーは反応液中濃度が0.2又は0.3μMになるように調製した。Inverse-PCRはKOD -Plus- Mutagenesis Kit（東洋紡績株式会社）を用い、反応組成はキット添付のプロトコールに従った。反応条件は、(i)94℃ 2分、(ii)98℃ 10秒、(iii)68℃ 7分で、(ii)及び(iii)を10サイクル行った。
PCR反応後のサンプルの一部を1〜1.2%アガロースゲル電気泳動にて分離し、目的のサイズの直鎖状のプラスミドの生成を確認した。次いで、残りのPCR反応後のサンプルをキット添付のプロトコールに従ってDpn I処理により、メチル化された鋳型プラスミドCAR 001を切断して排除する反応を行った。その後、直鎖状プラスミドをキット添付のT4 Polynucleotide Kinaseによりセルフライゲーションさせて環状プラスミドとした。得られた各環状プラスミドにより大腸菌DH5α（東洋紡績株式会社）を形質転換し、50μg/mLアンピシリン含有LB寒天培地上で約16時間培養した。
出現したコロニーをさらに50μg/mLアンピシリン含有LB液体培地中で約16時間培養した。培養した大腸菌培養液からQIAprep Spin Miniprep Kit（キアゲン）を用いて各プラスミドを精製して塩基配列確認を行い、目的の塩基配列の改変が確認されたプラスミド：CAR 008 (GMR.CAR dCH2CH3)、CAR 009 (GMR.CAR dCH2)、CAR 010 (GMR.CAR dCH2CH3+(G4S)3)、及びCAR 011 (GMR.CAR dHingeCH2)を取得した。得られたプラスミドの細胞外スペーサードメインは、CAR 008は配列番号６のアミノ酸配列からなるヒンジ領域、CAR 009は配列番号６のアミノ酸配列からなるヒンジ領域及び配列番号１０のアミノ酸配列からなるCH3領域、CAR 010は配列番号６のアミノ酸配列からなるヒンジ領域及び配列番号４２からなる(G4S)3配列、CAR011は配列番号１０のアミノ酸配列からなるCH3領域をそれぞれ含んでいる。
［実施例１３ GMR.CAR+shRNA挿入体のスペーサー改変体発現プラスミド（CAR 012〜015）の作製］
CAR 004を鋳型として、実施例１２と同様に細胞外スペーサードメイン部分を改変したGMR.CAR発現プラスミドをinverse-PCR法により作製した。
使用したプライマー及び方法は実施例１２と同様に行い、塩基配列確認により目的の塩基配列の改変が確認されたプラスミド：CAR 012 (GMR.CAR+shRNA dCH2CH3)、CAR 013 (GMR.CAR+shRNA dCH2)、CAR 014 (GMR.CAR+shRNA dCH2CH3+(G4S)3)、及びCAR 015 (GMR.CAR+shRNA dHingeCH2)を取得した。得られたプラスミドCAR 012、CAR 013、CAR 014、及びCAR 015の細胞外スペーサードメインは、それぞれCAR 008、CAR 009、CAR 010、及びCAR 011と同じ構成となっており、これらのプラスミドは更に、CAR 004と同様、GM-CSFの5'側非翻訳領域の配列に相補性を有するshRNA（図４、配列番号２９）を含んでいる。
［実施例１４ GMR.CAR-T細胞(CAR-T 008〜011、CAR-T 012及びCAR-T 014)の培養・増幅３］
＜Day 0: PBMCの分離と非特異的刺激OKT 3 blastの作製＞
健康成人ドナーから末梢血を採取し、D-PBS（和光純薬工業株式会社）で2倍に希釈した後、Ficoll-Paque PLUSに希釈末梢血を重層し、400 x g、30分の遠心分離を行い、PBMCを分取した。分取したPBMCをD-PBSで2回洗浄し、遠心分離により単離した。単離したPBMC 2〜4 x 106個/well/2 mLとなるように5 ng/mL IL-15含有TexMACS mediumに懸濁した。抗CD3抗体及び抗CD28抗体を含有するD-PBSで24ウェルノントリート培養プレートを37℃、2時間で抗体コーティングしたプレートを用意し、細胞懸濁液を2 mL/wellで播きT細胞の特異的刺激を行い、OKT3 blastの作製を行った。
＜Day 0: PBMCのウイルスペプチドパルス＞
単離したPBMCにpeptivatorペプチドプール（登録商標、ミルテニーバイオテック）によるウイルスペプチド刺激を行った。具体的には、D-PBS 50μLにそれぞれ0.05μg/μLのAdV5 Hexon、CMV pp65、EBV BZLF1及びEBV EBNA-1を添加したペプチドプールにてPBMCを懸濁し、37℃で30分間ウイルスペプチド刺激を施した。本実施例の培養法を、実施例８に記載したACE法の変法としてPBMC-ACE法と定義した。30分後、PBMCに適量のD-PBSを加え懸濁し、その後4分間のUV照射を行った。UV照射済みPBMCを回収し、細胞数をカウントした後、0.5〜2 x 106個/well/2 mLとなるように10 ng/mL IL-7及び5 ng/mL IL-15含有TexMACS medium中に懸濁し、フィーダー細胞として24ウェルトリートメント培養プレートに移した。
＜Day 0: PBMCの分離と遺伝子導入操作＞
健康成人ドナーから末梢血を採取し、D-PBS（和光純薬工業株式会社）で2倍に希釈した後、Ficoll-Paque PLUS（GEヘルスケア）に希釈末梢血を重層し、400 x g、30分の遠心分離を行い、PBMCを分取した。分取したPBMCをD-PBSで2回洗浄し、遠心分離により単離した。GMR.CAR発現プラスミドのPBMCへの導入は10 x 106 個の細胞を用いた。具体的には、それぞれCAR 008〜011、CAR 012及びCAR 014のいずれかを5μg、pCMV-piggyBacプラスミド5μg、P3 Primary Cell 4D-NucleofectorTM X Kit（ロンザジャパン株式会社）に付属するP3 Primary Cell solution 100μLを混和し、10 x 106個のPBMCを懸濁した。懸濁した細胞全量をNucleocuvetteに移し、4D-Nucleofection（Program No: FI-115）により電気的遺伝子導入を行った。電気的遺伝子導入を行った細胞を10分間室温に放置し、全量をフィーダー細胞の入った24ウェルトリートメント培養プレートに加え培養を開始した。遺伝子導入操作を施さないMock-T細胞として、1 x 106個の細胞を同様に培養した。培養中の培地の半量を廃棄し、2倍量すなわち20 ng/mL IL-7及び10 ng/mL IL-15含有のTexMACS mediumを半量添加する培地交換作業を適宜行った。遺伝子導入を行っていないMock-T細胞は24ウェルトリートメント培養プレート上で培養を続け、細胞の増殖度合いにより培地交換と増幅を行った。
＜Day 7: CAR-T細胞の増幅:＞
細胞懸濁液全量を、10 ng/mL IL-7及び5 ng/mL IL-15含有のTexMACS medium 30 mL中にDay 0と同様に作製したフィーダー細胞2 x 106個を充填したG-Rex 10に移し、Day 14までGMR.CAR-T細胞の増幅を行った。Day 14まで増幅したGMR.CAR-T細胞の発現率を以下の方法にて測定した。
＜Day 14: GMR.CAR発現率の評価＞
細胞数をカウントし、1〜2 x 105個の細胞をフローサイトメトリー解析により、GMR.CAR-Tの発現率を評価した。1〜2 x 105個の細胞を採取し、遠心分離した細胞にPE Rat Anti-Human GM-CSF抗体（ミルテニーバイオテック）5μL及びAPC Anti-Human CD3抗体5μLを加え懸濁し、4℃、遮光にて20分間抗体標識反応を行った。20分後、D-PBS適量で細胞を洗浄し、遠心分離により細胞を沈殿させ上清を除去した後、D-PBS適量に再懸濁したサンプルについてFACSCantoII(BD)及びFLOWJO（トミーデジタルバイオロジー）を用いて解析し、GM-CSF/CD3陽性のGMR.CARの発現率を測定した。それぞれ作製された発現プラスミド(CAR 008〜011、CAR 012及びCAR 014)を用いてPBMCへの電気的導入操作及びT細胞の培養・増幅操作によって得られるGMR.CAR-T細胞をそれぞれ、CAR-T 008、CAR-T 009、CAR-T 010、CAR-T 011、CAR-T 012、及びCAR-T 014と定義した。
図２５にCAR-T 001及び008〜011のday 14における発現解析結果を示す。GMR.CAR発現率はそれぞれ、 CAR-T 001 : 29.8％、 CAR-T 008: 33.1％、 CAR-T 009:25.9％、CAR-T 010: 33.6％、CAR-T 011: 16.4％であり、Mock-T細胞における発現率（0.91％）と比較していずれも高く、スペーサー部位の異なるGMR.CAR発現T細胞の作製に成功した。以降の実験では、作製したGMR.CAR発現T細胞をMock-T細胞で希釈することで発現率を25.9%に揃えて（CAR-T 011は16.4%のまま）、抗腫瘍細胞活性を評価した。
図２６にCAR-T 008、CAR-T 010、CAR-T 012及びCAR-T 014のday 14における発現解析結果を示す。GMR.CAR発現率はそれぞれ、CAR-T008: 23.6%、CAR-T010 : 32.3％、CAR-T012:4.00％、CAR-T014: 7.18％であった。
[実施例１５ CAR-T 008〜011の抗腫瘍細胞活性評価]
実施例１４で得られたCAR-T 001及び008〜011の腫瘍細胞傷害活性を評価するため、腫瘍細胞との共培養試験を行った。具体的には、MV4-11細胞（American Type Culture Collection（ATCC））を使用し、MV4-11細胞［ターゲット（T）］を5 x 105個/mLとなるように10％FBS含有RPMI 1640培地（サーモフィッシャーサイエンティフィック）で調製した。それらを48ウェルトリートメント培養プレートに500 μL/wellで播種した（ウェル内の細胞数は2.5 x 105個となる）。 CAR-T 001及び008〜011［エフェクター（E）］は、E：T比1 : 25及び1 : 125となるように10％FBS含有RPMI 1640培地で希釈した。すなわち、E:T比1：25の場合、CAR-T は0.2 x 105個/mLとなるように調製し、腫瘍細胞が播かれた48ウェルトリートメント培養プレートに500 μL/wellで添加した（ウェル内の細胞数は0.1 x 105個となる）。同様に、E : T比1：125の場合、0.04 x 105個/mLとなるように調製し、腫瘍細胞が播かれた48ウェルトリートメント培養プレートに500 μL/wellで添加した（ウェル内の細胞数は0.02 x 105個となる）。
共培養試験は5日間行った。遺伝子導入を行っていないMock-T細胞についても同様な共培養試験を行い、また、コントロール群として、腫瘍細胞のみを同細胞数で培養した群も設定した（CAR-T非添加群）。共培養試験5日目に各ウェルの細胞を回収し、遠心分離した細胞にAPC Anti-Human CD3抗体（ミルテニーバイオテック）5μL及びPE Anti-Human CD33抗体（ミルテニーバイオテック） 5μLを加え懸濁し、4℃、遮光にて20分間抗体標識反応を行った。20分後、D-PBS適量で細胞を洗浄し、遠心分離により細胞を沈殿させ上清を完全に除去した後、450 μLのD-PBSで再懸濁し、さらにCountBright absolute counting beads （インビトロジェン）を50 μL添加したサンプルについて、FACS Canto II（BD）とFLOWJO（トミーデジタルバイオロジー）を用いて解析し、CD33の陽性細胞数をカウンティングビーズをもとに算出した。CAR-T 001 、008〜011及びMock-T細胞の抗腫瘍細胞活性％を実施例１０と同様にして算出した。
図２７に作製したCAR-T 001及び008〜011のMV4-11細胞に対する抗腫瘍細胞活性％の結果を示した。データは同一ドナーCAR-Tの抗腫瘍細胞活性％の3ウェル平均値を示した。CAR-T 001及び008〜011は、MV4-11細胞をE:T比1:25で強い抗腫瘍細胞活性が認められ、E:T比1:125ではスペーサーの種類の違いによって抗腫瘍細胞活性に違いが認められた。
[実施例１６ CAR-T 012及びCAR-T 014の抗腫瘍細胞活性評価]
実施例１４で得られたCAR-T 012及び014の腫瘍細胞傷害活性を評価するため、腫瘍細胞との共培養試験を行った。具体的には、MV4-11細胞（American Type Culture Collection（ATCC））を使用し、MV4-11細胞［ターゲット（T）］を5 x 105個/mLとなるように10％FBS含有RPMI 1640培地（サーモフィッシャーサイエンティフィック）で調製した。それらを48ウェルトリートメント培養プレートに500 μL/wellで播種した（ウェル内の細胞数は2.5 x 105個となる）。 CAR-T 012及び014 ［エフェクター（E）］は、E：T比1:5、1 : 25及び1 : 125となるように10％FBS含有RPMI 1640培地で希釈した。すなわち、E:T比1：5の場合、CAR-T は1 x 105個/mLとなるように調製し、腫瘍細胞が播かれた48ウェルトリートメント培養プレートに500 μL/wellで添加した（ウェル内の細胞数は0.5 x 105個となる）。また、E : T比1：25の場合、0.2 x 105個/mLとなるように調製し、腫瘍細胞が播かれた48ウェルトリートメント培養プレートに500 μL/wellで添加した（ウェル内の細胞数は0.1 x 105個となる）。同様に、E : T比1：125の場合、0.04 x 105個/mLとなるように調製し、腫瘍細胞が播かれた48ウェルトリートメント培養プレートに500 μL/wellで添加した（ウェル内の細胞数は0.02 x 105個となる）。
共培養試験は4日間行った。遺伝子導入を行っていないMock-T細胞についても同様な共培養試験を行い、コントロール群として、腫瘍細胞のみを同細胞数で培養した群も設定した（CAR-T非添加群）。共培養試験4日目に各ウェルの細胞を回収し、遠心分離した細胞にAPC Anti-Human CD3抗体（ミルテニーバイオテック）5 μL及びPE Anti-Human CD33抗体（ミルテニーバイオテック） 5 μLを加え懸濁し、4℃、遮光にて20分間抗体標識反応を行った。20分後、D-PBS適量で細胞を洗浄し、遠心分離により細胞を沈殿させ上清を完全に除去した後、450 μLのD-PBSで再懸濁し、さらにCountBright absolute counting beads （インビトロジェン）を50 μL添加したサンプルについて、FACS Canto II（BD）とFLOWJO（トミーデジタルバイオロジー）を用いて解析し、CD33の陽性細胞数をカウンティングビーズをもとに算出した。 算出したCD33の陽性細胞数をもとにCAR-T 00X〜00Y及びMock-T細胞の抗腫瘍細胞活性％を実施例１０と同様にして算出した。
図２８に作製したCAR-T 012及び014のMV4-11細胞に対する抗腫瘍細胞活性％の結果をCAR-T 008及び010の結果と共に示した。CAR-T 012及び014は、MV4-11細胞をE:T比1:5で強い抗腫瘍細胞活性が認められ、E:T比1:25及び1:125でもMock-T細胞と比較して抗腫瘍細胞活性が認められた。
図２９にCAR-T012、CAR-T014及びMock-T細胞のMV4-11細胞に対する腫瘍細胞殺傷能を示した。腫瘍細胞殺傷能では、CAR-T012、014が強く、shRNAが導入されていないCAR-T008又はCAR-T010よりも3倍程度強い殺傷能だった。
［実施例１７ 抗腫瘍細胞活性持続性評価］
CAR-T 001、008〜012及び014の腫瘍細胞傷害活性の持続性を評価するため、長期間の腫瘍細胞との共培養試験を行った。具体的には、THP-1又はMV4-11細胞（American Type Culture Collection（ATCC））を使用し、それぞれの腫瘍細胞［ターゲット（T）］を5 x 105個/mLとなるように10％FBS含有RPMI 1640培地（サーモフィッシャーサイエンティフィック）で調製し、48ウェルトリートメント培養プレートに500 μL/wellで播種した（ウェル内の細胞数は2.5 x 105個となる）。 CAR-T 001、008〜012、及び014 ［エフェクター（E）］は、E：T比1 : 1及び1 : 5となるように10％FBS含有RPMI 1640培地で希釈した。すなわち、E:T比＝1：1の場合、CAR-T は5 x 105個/mLとなるように調製し、腫瘍細胞が播かれた48ウェルトリートメント培養プレートに500μL/wellで添加した（ウェル内の細胞数は2.5 x 105個となる）。同様に、E : T比＝1：5の場合、 1 x 105個/mLとなるように調製し、腫瘍細胞が播かれた48ウェルトリートメント培養プレートに500 μL/wellで添加した（ウェル内の細胞数は0.5 x 105個となる）。なお、各群2ウェルずつ用意し、1ウェルはFACS Canto II（BD）での「解析用」、もう1ウェルは次のタームで新しい腫瘍細胞へ添加するための「継続用」として用いた。
ターム1としての共培養試験は4日間行った。遺伝子導入を行っていないMock-T細胞についても同様の共培養試験を行い、また、コントロール群として、腫瘍細胞のみを同細胞数で培養した群も設定した（CAR-T非添加群）。共培養試験4日目に「解析用」のウェルの細胞を回収し、遠心分離した細胞にAPC Anti-Human CD3抗体（ミルテニーバイオテック）5μL及びPE Anti-Human CD33抗体（ミルテニーバイオテック） 5μLを加え懸濁し、4℃、遮光にて20分間抗体標識反応を行った。20分後、D-PBS適量で細胞を洗浄し、遠心分離により細胞を沈殿させ上清を完全に除去した後、450 μLのD-PBSで再懸濁し、さらにCountBright absolute counting beads （インビトロジェン）を50 μL添加したサンプルについてFACS Canto II、FLOWJO（トミーデジタルバイオロジー）を用いて解析し、CD33の陽性細胞数をカウンティングビーズをもとに算出した。ここまでをターム1とする。
共培養開始時と比較して腫瘍細胞が殺傷された（腫瘍細胞数が減少した）群に関しては、次のターム2へ進めた。具体的には、予め2.5 x 105個/500 μL/wellで播種された腫瘍細胞を2ウェル用意し、そこへターム1で「継続用」として共培養しておいた培養液を500 μL/wellずつ等分に添加し、さらに4日間共培養した。この作業を培養期間4日または3日で繰り返した。なお、共培養開始時と比較して腫瘍細胞数が増加した群に関しては、次のタームへは進めないこととした。
図３０〜図４１に各腫瘍細胞をターゲットとしたときの持続的な抗腫瘍細胞活性評価の結果を示した。CAR-T 001、008〜012、及び014は持続的に腫瘍細胞を殺傷することが確認された。また、MV4-11に対しては、スペーサーの違いで殺傷回数に違いが認められた。具体的にはCAR−T 001及びCAR−T 010において、より長期的な腫瘍殺傷効果が期待できる。
本発明により、ヒト顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）受容体を細胞表面に発現している標的細胞に特異的に結合し、優れた細胞傷害活性を付与するCAR-T細胞が提供される。本発明の細胞は、JMML等の疾患に対する養子免疫治療に使用することができる。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。

Claims (21)

  1. 配列番号２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド、配列番号２のアミノ酸配列に対して90％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、ヒト顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）受容体に対する結合能を保持するポリペプチド、又はヒト顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）受容体に対する結合能を保持するこれらのポリペプチドの断片である標的結合ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内シグナル伝達ドメインとを有するキメラ抗原受容体（chimeric antigen receptor：CAR）タンパク質をコードするポリヌクレオチドが導入された遺伝子改変細胞を含む、CD33/CD116発現率（陽性率）が少なくとも40％以上である細胞が関連する疾患の治療剤。
  2. 遺伝子改変細胞がGM-CSF受容体に結合するCARを細胞膜上に発現する、請求項１記載の治療剤。
  3. CARタンパク質が、更に共刺激ドメイン及び／又は細胞外スペーサードメインを含む、請求項１又は２記載の治療剤。
  4. 細胞内シグナル伝達ドメインがヒトCD3ζである、請求項１〜３のいずれか１項記載の治療剤。
  5. 共刺激ドメインがヒトCD28又はヒト4-1BBである、請求項３又は４記載の治療剤。
  6. 細胞外スペーサードメインがヒトIgG1のヒンジ、CH2、及び／又はCH3領域若しくはその一部、及び／又は人工スペーサー配列を含む、請求項３〜５のいずれか１項記載の治療剤。
  7. 疾患が若年性骨髄単球性白血病（JMML）又は急性骨髄性白血病（AML）である、請求項１〜６のいずれか１項記載の治療剤。
  8. 配列番号２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド、配列番号２のアミノ酸配列に対して90％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、ヒト顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）受容体に対する結合能を保持するポリペプチド、又はヒト顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）受容体に対する結合能を保持するこれらのポリペプチドの断片である標的結合ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内シグナル伝達ドメインとを有するキメラ抗原受容体（CAR）タンパク質をコードするポリヌクレオチドをベクターを用いて細胞に導入してCARタンパク質発現細胞を作製することを含む、請求項１〜７のいずれか１項記載の治療剤の作製方法。
  9. 請求項１〜７のいずれか１項記載の治療剤と、医薬上許容される担体とを含む、医薬組成物。
  10. (i) 配列番号２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド、配列番号２のアミノ酸配列に対して90％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、ヒト顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）受容体に対する結合能を保持するポリペプチド、又はヒト顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）受容体に対する結合能を保持するこれらのポリペプチドの断片である標的結合ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内シグナル伝達ドメインとを有するキメラ抗原受容体（CAR）タンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び
    (ii)ヒトGM-CSFに対するRNAiを誘導するポリヌクレオチド
    が導入された遺伝子改変細胞。
  11. GM-CSF受容体に結合するCARを細胞膜上に発現する、請求項１０記載の細胞。
  12. CARタンパク質が、更に共刺激ドメイン及び／又は細胞外スペーサードメインを含む、請求項１０又は１１記載の細胞。
  13. 細胞内シグナル伝達ドメインがヒトCD3ζである、請求項１０〜１２のいずれか１項記載の細胞。
  14. 共刺激ドメインがヒトCD28又はヒト4-1BBである、請求項１２記載の細胞。
  15. 細胞外スペーサードメインがヒトIgG1のヒンジ、CH2、及び／又はCH3領域若しくはその一部、及び／又は人工スペーサー配列を含む、請求項１２〜１４のいずれか１項記載の細胞。
  16. RNAiを誘導するポリヌクレオチドがsiRNA又はshRNAである、請求項１０〜１５のいずれか１項記載の細胞。
  17. 配列番号２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド、配列番号２のアミノ酸配列に対して90％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、ヒト顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）受容体に対する結合能を保持するポリペプチド、又はヒト顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）受容体に対する結合能を保持するこれらのポリペプチドの断片である標的結合ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内シグナル伝達ドメインとを有するキメラ抗原受容体（CAR）タンパク質をコードするポリヌクレオチド、及びヒトGM-CSFに対するRNAiを誘導するポリヌクレオチドを同一又は異なるベクターを用いてそれぞれ細胞に導入することを含む、CARタンパク質発現細胞の作製方法。
  18. 配列番号２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド、配列番号２のアミノ酸配列に対して90％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、ヒト顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）受容体に対する結合能を保持するポリペプチド、又はヒト顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）受容体に対する結合能を保持するこれらのポリペプチドの断片である標的結合ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内シグナル伝達ドメインとを有するキメラ抗原受容体（CAR）タンパク質をコードするポリヌクレオチド、及びヒトGM-CSFに対するRNAiを誘導するポリヌクレオチドを含むベクター。
  19. 配列番号２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド、配列番号２のアミノ酸配列に対して90％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、ヒト顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）受容体に対する結合能を保持するポリペプチド、又はヒト顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）受容体に対する結合能を保持するこれらのポリペプチドの断片である標的結合ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内シグナル伝達ドメインとを有するキメラ抗原受容体（CAR）タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターと、ヒトGM-CSFに対するRNAiを誘導するポリヌクレオチドを含むベクターとを含む、CARタンパク質発現細胞の作製のためのキット。
  20. 請求項１０〜１６のいずれか１項記載の細胞を含む、GM-CSF受容体発現細胞が関与する疾患に対する治療剤。
  21. 請求項２０記載の治療剤と、医薬上許容される担体とを含む、医薬組成物。
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