JP2022525925A - Ａ２／ｎｙ－ｅｓｏ－１特異的ｔ細胞受容体およびその使用 - Google Patents

Ａ２／ｎｙ－ｅｓｏ－１特異的ｔ細胞受容体およびその使用 Download PDF

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Abstract

本出願は、がん抗原ＮＹ－ＥＳＯ－１のエピトープに特異的な遺伝子改変Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を提供する。関連するポリペプチドおよびタンパク質、ならびに関連する核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞、遺伝子操作された細胞を含むがこれらに限定されない細胞の集団、および医薬組成物も提供される。本出願はさらに、がん免疫療法（例えば、養子細胞療法）のためのそのような改変Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）および関連する組成物の使用を提供する。

Description

関連出願の相互参照
この出願は、２０１９年３月１８日に出願された米国仮出願第６２／８１９，９８８号の優先権を主張し、その開示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本発明は、がん抗原ＮＹ－ＥＳＯ－１由来のエピトープに特異的な遺伝子改変Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）に関する。本発明は、関連するポリペプチドおよびタンパク質、ならびに関連する核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞、および遺伝子操作された細胞を含むがそれらに限定されない細胞の集団、および医薬組成物に関する。本発明はさらに、がん免疫療法のためのそのような改変ＴＣＲおよび関連する組成物の使用に関する。
がん免疫療法は、がん細胞に対する患者自身の免疫応答を利用および／または増強することにより、細胞障害性化学療法、放射線療法、および外科手術などの標準治療アプローチに対する実行可能な代替の強力な補完としての地位を確立している（非特許文献１）。その多くの側面の中で、養子Ｔ細胞療法は以前から臨床でその有効性を証明してきた（非特許文献２）。このタイプのがん治療では、腫瘍標的を自然に認識して殺すことができるｅｘ ｖｉｖｏで拡大された自己の腫瘍浸潤リンパ球を患者に移入する（非特許文献３）。あるいは、患者の末梢血Ｔ細胞を、拡大および養子移入の前に、腫瘍特異的Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の異所性発現を介して腫瘍細胞を認識するように遺伝子改変することができる。ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲベース（非特許文献４）およびＣＤ１９ ＣＡＲベース（非特許文献５）のＴ細胞療法は、それぞれ固形および血液の悪性腫瘍において臨床で大きな期待を示しているがん免疫療法の並外れた例である。
ＮＹ－ＥＳＯ－１またはニューヨーク食道扁平上皮がん１は、様々な腫瘍によって発現される腫瘍抗原である（非特許文献６）。これらのがん性細胞のクラスＩヒト白血球抗原（ＨＬＡ）分子は、１５７位～１６５位からの９アミノ酸断片（ＳＬＬＭＷＩＴＱＣ（配列番号８））を含む、この抗原からのペプチドを提示する。したがって、ＮＹ－ＥＳＯ－１１５７－１６５エピトープ－ＨＬＡ－Ａ２複合体は、例えば、ＮＹ－ＥＳＯ－１１５７－１６５エピトープ（ＳＬＬＭＷＩＴＱＣ（配列番号８））に特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする核酸を形質導入された自己細胞を患者に移入する養子細胞移入療法において、ＴＣＲが標的とすることができるがんマーカーを提供する。しかしながら、その目的のために、ＴＣＲが、ペプチド－ＨＬＡ複合体に対して、その複合体に特異的な天然のＴＣＲよりもより高い親和性を有することが望ましいであろう。
「自己」腫瘍抗原に対するＴＣＲは、例えば胸腺のネガティブセレクションのせいで、ウイルスエピトープ特異的ＴＣＲよりも親和性が低い可能性があるため、より高い活性を可能にしながら特異性を維持する（すなわち、健康な組織と交差反応しない）、より親和性の高いＴＣＲを開発する必要がある。
免疫療法として非常に強力な戦略であると思われるにもかかわらず、多くの患者は養子Ｔ細胞療法による臨床的恩恵を示さないか、または長期の応答を維持できず、その結果、その適用は限られたままである。治療関連の毒性は依然として主要な懸念事項であるが（非特許文献７）、養子移入されたＴ細胞が有効な腫瘍制御を達成できない主な理由は、腫瘍自体の免疫抑制的微小環境にある（非特許文献８）。腫瘍は、免疫系による検出を回避するために多くの戦略を展開する。それらの中には、Ｔ細胞の化学誘引を妨げるケモカイン発現プロファイルの変更；適切なＴ細胞の血管外漏出を妨げる、周囲組織のコラーゲン要塞化および異常な腫瘍内血管系の促進による物理的バリアの強化；低グルコースレベルを特徴とするＴ細胞機能に不利な代謝微小環境の確立；制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）や骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）などの免疫抑制細胞の腫瘍微小環境への化学誘引、またはＭ２マクロファージなどの免疫抑制表現型を獲得するための他のものの分極化；および最後に、免疫チェックポイント受容体および同様の特性を有する他の膜結合型因子または可溶性因子のアップレギュレーションを介したＴ細胞機能の直接阻害（非特許文献１０）がある。
これら障害は、免疫抑制性腫瘍微小環境の様々な態様に取り組むことにより養子移入されたＴ細胞の活性を増強する組み合わせ治療戦略によって克服することができる。現在、化学療法および放射線療法と組み合わせて、免疫チェックポイント阻害抗体、サイトカイン療法、代謝酵素阻害剤、腫瘍血管系を正常化する薬剤、および抑制性免疫細胞枯渇抗体などの、無数のアプローチが前臨床および臨床レベルで試験されている（非特許文献１０）。代替のより的確で標的化されたアプローチは、Ｔ細胞活性に直接影響を与えるまたは腫瘍微小環境を標的にする分子による遺伝子改変を介した、移入されたＴ細胞の微調整を含む。ケモカイン受容体を用いたＴ細胞の操作は、腫瘍部位へのＴ細胞のトラフィッキングを促進することが示されており、ＶＥＧＦ受容体を標的とするＣＡＲは血管系の正常化をもたらし、共刺激リガンドの過剰発現またはＣＡＲへの統合は移入されたＴ細胞に更なる強みを与える。さらに、Ｔ細胞関連チェックポイントリガンドのターゲティングは、腫瘍由来のチェックポイントを介したＴ細胞抑制を軽減し得る（非特許文献１１）。
ほとんどの工学ベースの戦略がＴ細胞活性を直接改善することを狙っていることは驚くべきことはない（非特許文献１２）が、他の腫瘍常在免疫細胞の潜在的に有益な活性を利用または増強し得る薬剤で養子移入Ｔ細胞を改変する取り組みは現在のところ記載されていない。腫瘍関連マクロファージおよび顆粒球は、成功した抗腫瘍応答の確立または妨害における主要なプレーヤーとして浮上しており、それらの抗腫瘍対腫瘍促進特性の刺激が非常に重要である可能性がある（非特許文献１３および１４）。同じ方向に向かって、異所的に発現された腫瘍由来可溶性因子による樹状細胞（ＤＣ）の免疫誘引および刺激は、活性化された内因性Ｔ細胞によって媒介される強力な抗腫瘍応答を誘起することが示されている（非特許文献１５）。これらの観察結果は、前述の腫瘍常在免疫細胞系統の抗腫瘍潜在力を効果的に生かせる適切なＴ細胞操作候補薬剤の必要性を浮き彫りにしている。
本明細書に開示される本発明は、この必要性および他の関連する必要性に対処する。
Mellman, I., G. Coukos, and G. Dranoff, Nature, 2011. 480: p. 480 Restifo, N.P., M.E. Dudley, and S.A. Rosenberg, Nature Reviews Immunology, 2012. 12: p. 269 Rosenberg, S.A., et al., Clin Cancer Res, 2011. 17(13): p. 4550-7 Robbins, P.F., et al., J Clin Oncol, 2011. 29(7): p. 917-24 Kochenderfer, J.N., et al., Blood, 2012. 119: p. 2709-2720 Chen, Y. T. et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 1997. 94(5): p. 1914-1918 Gust, J., et al. Cancer Discovery, 2017. 7: p. 1404-1419 Zou, W. Nature Reviews Cancer, 2005. 5: p. 263 Baruch, E.N., et al., Cancer, 2017. 123(S11): p. 2154-2162 Zhang, H. and J. Chen, Journal of Cancer, 2018. 9(10): p. 1773-1781 Kunert, A. and R. Debets, Current Opinion in Immunology, 2018. 51: p. 133-139 Yoon, D.H., et al., International journal of molecular sciences, 2018. 19(2): p. 340 Noy, R. and J.W. Pollard, Immunity, 2014. 41(1): p. 49-61 Fridlender, Z.G. and S.M. Albelda, Carcinogenesis, 2012. 33(5): p. 949-55 Mach, N., et al., Cancer Res, 2000. 60(12): p. 3239-46
当技術分野では、がん抗原に対してより親和性の高いＴＣＲを開発する必要性が大いにある。本発明は、がん抗原ＮＹ－ＥＳＯ－１１５７－１６５エピトープに特異的な改変ＴＣＲ、ならびにがん免疫療法（例えば、養子細胞療法）のためにそのようなＴＣＲを使用するための関連する組成物および方法を提供することによって、このようなおよび他の必要性に取り組む。
一態様では、本明細書で提供されるのは、改変Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）またはその機能的断片をコードするポリヌクレオチドであり、改変ＴＣＲは、非置換野生型（ＷＴ）ＴＣＲのβ鎖のＣＤＲ２と比較して、改変ＴＣＲのβ鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）２内に単一アミノ酸置換を含む。
いくつかの実施形態では、改変ＴＣＲのβ鎖配列は、改変ＴＣＲのβ鎖またはその機能的断片のＣＤＲ２領域の外側で、非置換ＷＴ ＴＣＲのβ鎖またはその機能的断片と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、改変ＴＣＲのβ鎖またはその機能的断片は、ＣＤＲ２領域に単一アミノ酸置換を有する非置換ＷＴ ＴＣＲのβ鎖またはその機能的断片のアミノ酸配列を含む（すなわち、非置換ＷＴ ＴＣＲのβ鎖またはその機能的断片のアミノ酸配列においてＣＤＲ２領域に単一アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む）。
いくつかの実施形態において、非置換ＷＴ ＴＣＲのβ鎖は、配列番号１のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、単一アミノ酸置換は、ＷＴ ＴＣＲに対して残基５０、５１、５３、または５５に存在する。いくつかの実施形態において、単一アミノ酸置換は、ＷＴ ＴＣＲに対して残基５３または５５に存在する。いくつかの実施形態において、単一アミノ酸置換は、Ｉ５３Ｅ、Ｉ５３Ｆ、Ｉ５３Ｗ、またはＤ５５Ｅである。
いくつかの実施形態において、改変ＴＣＲは、ＷＴ ＴＣＲよりも高い結合親和性でがん抗原に結合する。いくつかの実施形態において、がん抗原は、ＮＹ－ＥＳＯ－１１５７－１６５エピトープ（配列番号８）である。
いくつかの実施形態において、がん抗原に対する改変ＴＣＲの結合親和性は、がん抗原に対するＷＴ ＴＣＲの結合親和性と比較して、約５～約７５倍高い。いくつかの実施形態において、がん抗原に対する改変ＴＣＲの結合親和性は、がん抗原に対するＷＴ ＴＣＲの結合親和性と比較して、約１０～約７５倍高い。いくつかの実施形態において、がん抗原に対する改変ＴＣＲの結合親和性は、がん抗原に対するＷＴ ＴＣＲの結合親和性と比較して、約２５～約７５倍高い。いくつかの実施形態において、がん抗原に対する改変ＴＣＲの結合親和性は、がん抗原に対するＷＴ ＴＣＲの結合親和性と比較して、約４０～約７５倍高い。いくつかの実施形態において、がん抗原に対する改変ＴＣＲの結合親和性は、がん抗原に対するＷＴ ＴＣＲの結合親和性と比較して、約４０～約６０倍高い。いくつかの実施形態において、がん抗原に対する改変ＴＣＲの結合親和性は、がん抗原に対するＷＴ ＴＣＲの結合親和性と比較して、約４０～約５０倍高い。いくつかの実施形態において、がん抗原に対する改変ＴＣＲの結合親和性は、がん抗原に対するＷＴ ＴＣＲの結合親和性と比較して、約５０倍高い。
いくつかの実施形態において、がん抗原に対する改変ＴＣＲの解離定数（ＫＤ）は、約０．３０～約４．５μＭの間である。いくつかの実施形態において、がん抗原に対する改変ＴＣＲの解離定数（ＫＤ）は、約０．３０～約２μＭの間である。いくつかの実施形態において、がん抗原に対する改変ＴＣＲの解離定数（ＫＤ）は、約２μＭ～約３μＭの間である。いくつかの実施形態において、がん抗原に対する改変ＴＣＲの解離定数（ＫＤ）は、約３μＭ～約４μＭの間である。いくつかの実施形態において、がん抗原に対する改変ＴＣＲの解離定数（ＫＤ）は、約０．４１μＭである。いくつかの実施形態において、がん抗原に対する改変ＴＣＲの解離定数（ＫＤ）は、約３．８９μＭである。
いくつかの実施形態において、改変ＴＣＲは、配列番号２～５のいずれか１つのアミノ酸配列またはその機能的断片、あるいは配列番号２～５のいずれか１つに対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、改変ＴＣＲは、配列番号１１～１４のいずれか１つのヌクレオチド配列、または配列番号１１～１４のいずれか１つに対して少なくとも８０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる。
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、改変ＴＣＲの発現のための少なくとも１つの調節エレメントに作動可能に連結される。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの調節エレメントはプロモーターである。
様々な実施形態において、ポリヌクレオチドはＤＮＡ分子である。
様々な実施形態において、ポリヌクレオチドは、ＲＮＡ分子またはその誘導体である。
別の態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書に記載のポリヌクレオチドを含む組換えベクターであり、ポリヌクレオチドは、改変Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の発現のための少なくとも１つの調節エレメントに作動可能に連結される。
いくつかの実施形態において、ベクターはウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、ウイルスベクターは、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、アルファウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、またはワクシニアウイルスベクターである。
いくつかの実施形態では、ベクターは非ウイルスベクターである。
別の態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載のポリヌクレオチドによってコードされる改変ＴＣＲのβ鎖またはその機能的断片を含む、改変Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）である。
別の態様では、本明細書で提供されるのは、ａ）本明細書に記載のポリヌクレオチドによってコードされる改変ＴＣＲのβ鎖またはその機能的断片、およびｂ）α鎖またはその機能的断片を含む、改変Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）である。
別の態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載のポリヌクレオチドによってコードされる改変ＴＣＲのβ鎖のＣＤＲを含む、改変Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）である。
別の態様では、本明細書で提供されるのは、ａ）改変ＴＣＲのβ鎖の機能的断片であって、本明細書に記載のポリヌクレオチドによってコードされるβ鎖のＣＤＲを含む機能的断片、およびｂ）α鎖の機能的断片であって、α鎖のＣＤＲを含む機能的断片；を含む改変Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）である。
いくつかの実施形態において、ａ）の機能的断片は、ＴＣＲβ鎖の定常領域をさらに含み、および／またはｂ）の機能的断片は、ＴＣＲα鎖の定常領域をさらに含む。一実施形態では、定常領域のいずれかがヒト起源である。一実施形態では、定常領域のいずれかがマウス起源である。
いくつかの実施形態では、α鎖は、ＷＴ ＴＣＲのα鎖またはその機能的断片を含む。一実施形態では、ＷＴ ＴＣＲのα鎖は、配列番号７のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、改変ＴＣＲは、配列番号２～５のいずれか１つのアミノ酸配列、またはその断片、あるいは配列番号２～５のいずれか１つに対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
別の態様では、本明細書で提供されるのは、配列番号７のアミノ酸配列を含むα鎖および配列番号２～５のいずれか１つのアミノ酸配列を含むβ鎖を含む改変Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）である。
別の態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載の改変Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む単離された宿主細胞（単離宿主細胞）である。
別の態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載のポリヌクレオチドを含む単離宿主細胞である。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、宿主細胞における改変Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の発現を媒介することができる少なくとも１つの調節エレメントに作動可能に連結される。
別の態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載のベクターを含む単離宿主細胞である。
いくつかの実施形態では、宿主細胞は哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態において、宿主細胞はリンパ球系細胞（lymphoid cell）である。いくつかの実施形態では、リンパ球系細胞はＴ細胞である。いくつかの実施形態では、リンパ球系細胞はナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である。
様々な実施形態において、宿主細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、腫瘍流入領域リンパ節（tumor draining lymph node）または腫瘍浸潤物（tumor infiltrate）から得られる。
様々な実施形態において、宿主細胞は、ｅｘ ｖｉｖｏで活性化および／または拡大されている。
様々な実施形態において、宿主細胞は同種異系細胞である。
様々な実施形態において、宿主細胞は自己細胞である。
様々な実施形態において、宿主細胞は、疾患を有する対象から単離される。いくつかの実施形態では、疾患はがんである。いくつかの実施形態において、がんは、その細胞の表面上にがん抗原ＮＹ－ＥＳＯ－１１５７－１６５エピトープ（配列番号８）を提示する。いくつかの実施形態では、がんは、骨髄腫、メラノーマ（黒色腫）、肉腫、膀胱がん（bladder cancer）、食道がん、肝細胞がん、頭頸部がん、乳がん、前立腺がん、膀胱がん（urinary bladder cancer）、皮膚がん、肺がん、卵巣がん、または脳腫瘍である。
様々な実施形態において、宿主細胞は、１つまたは複数の外因性分子を発現するようにさらに操作される。いくつかの実施形態において、１つまたは複数の外因性分子は、免疫シグナル伝達分子である。
いくつかの実施形態において、免疫シグナル伝達分子はサイトカインである。
いくつかの実施形態では、免疫シグナル伝達分子はケモカインである。
いくつかの実施形態では、免疫シグナル伝達分子は成長因子である。一実施形態では、成長因子は、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）である。
がん抗原に結合するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）またはその機能的断片を含む単離宿主細胞であって、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）を発現するようにさらに操作された宿主細胞も本明細書で提供される。いくつかの実施形態において、がん抗原は、ＮＹ－ＥＳＯ－１１５７－１６５エピトープ（配列番号８）である。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）はＷＴ ＴＣＲである。一実施形態では、ＷＴ ＴＣＲのβ鎖は、配列番号１のアミノ酸配列、または配列番号１に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ＷＴ ＴＣＲのα鎖は、配列番号７のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、ＧＭ－ＣＳＦのアミノ酸配列は、配列番号２１、３４または１５、あるいは配列番号２１、３４または１５に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＧＭ－ＣＳＦをコードするヌクレオチド配列は、配列番号２２、３５または１６、あるいは配列番号２２、３５または１６に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態において、１つまたは複数の外因性分子は可溶性受容体である。
いくつかの実施形態では、１つまたは複数の外因性分子はリガンドである。
いくつかの実施形態において、１つまたは複数の外因性分子は、抗原結合タンパク質である。いくつかの実施形態において、抗原結合タンパク質は、抗体または抗体フラグメントである。
いくつかの実施形態において、１つまたは複数の外因性分子は、ホスホジエステラーゼである。いくつかの実施形態において、ホスホジエステラーゼはＰＤＥ４Ｂ２である。
がん抗原に結合するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）またはその機能的断片を含む単離宿主細胞であって、ＰＤＥ４Ｂ２を発現するようにさらに操作された宿主細胞も本明細書で提供される。いくつかの実施形態において、がん抗原は、ＮＹ－ＥＳＯ－１１５７－１６５エピトープ（配列番号８）である。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）は、ＷＴ ＴＣＲである。一実施形態では、ＷＴ ＴＣＲのβ鎖は、配列番号１のアミノ酸配列、または配列番号１に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ＷＴ ＴＣＲのα鎖は、配列番号７のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、ＰＤＥ４Ｂ２のアミノ酸配列は、配列番号２７または２９、あるいは配列番号２７または２９に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＰＤＥ４Ｂ２をコードするヌクレオチド配列は、配列番号２８または３０、あるいは配列番号２８または３０に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態において、１つまたは複数の外因性分子は、細胞表面受容体である。いくつかの実施形態において、細胞表面受容体は、キメラ抗原受容体である。いくつかの実施形態において、細胞表面受容体は、がん抗原ＮＹ－ＥＳＯ－１１５７－１６５エピトープ（配列番号８）に結合しないＴ細胞受容体である。
別の態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載の改変Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）またはその機能的断片と、Ｔ細胞上の細胞表面タンパク質に特異的に結合する免疫エフェクターポリペプチドとを含む二機能性分子である。いくつかの実施形態において、免疫エフェクターポリペプチドは、抗体または抗体フラグメントを含む。いくつかの実施形態において、免疫エフェクターポリペプチドは、単鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦｖ）を含む。
いくつかの実施形態において、免疫エフェクターポリペプチドは、ＣＤ３に特異的に結合する。いくつかの実施形態において、免疫エフェクターポリペプチドは、ＯＫＴ３、ＵＣＨＴ－１、ＢＭＡ０３１、または１２Ｆ６に由来する抗体または抗体フラグメントを含む。いくつかの実施形態において、免疫エフェクターポリペプチドは、ＯＫＴ３に由来する抗体または抗体フラグメント（例えば、ｓｃＦＶ）を含む。いくつかの実施形態において、免疫エフェクターポリペプチドは、ＵＣＨＴ－１に由来する抗体または抗体フラグメント（例えば、ｓｃＦＶ）を含む。いくつかの実施形態において、免疫エフェクターポリペプチドは、ＢＭＡ０３１に由来する抗体または抗体フラグメント（例えば、ｓｃＦＶ）を含む。いくつかの実施形態において、免疫エフェクターポリペプチドは、１２Ｆ６に由来する抗体または抗体フラグメント（例えば、ｓｃＦＶ）を含む。
別の態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載の宿主細胞、または本明細書に記載の二機能性分子、ならびに薬学的に許容される担体および／または賦形剤を含む医薬組成物である。いくつかの実施形態では、組成物は養子細胞移入療法で使用される。
別の態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載のポリヌクレオチドまたは本明細書に記載のベクターを用いて宿主細胞を遺伝子操作することを含む、本明細書に記載の宿主細胞を作製する方法である。
別の態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載の改変Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）またはその機能的断片を発現するように宿主細胞を遺伝子操作する方法である。いくつかの実施形態では、この方法は、本明細書に記載のポリヌクレオチドまたは本明細書に記載のベクターを用いて宿主細胞を遺伝子操作することを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作ステップは、ウイルス遺伝子送達を介して実施される。いくつかの実施形態において、遺伝子操作ステップは、非ウイルス性遺伝子送達を介して実施される。いくつかの実施形態では、この方法はｅｘ ｖｉｖｏで実施される。いくつかの実施形態において、この方法は、ｅｘ ｖｉｖｏでの宿主細胞の活性化および／または拡大をさらに含む。
細胞工学的方法のいくつかの実施形態において、改変ＴＣＲは、配列番号２～５のいずれか１つのアミノ酸配列、またはその断片、あるいは配列番号２～５のいずれか１つに対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
細胞工学的方法のいくつかの実施形態において、この方法は、１つまたは複数の外因性分子をさらに発現するように宿主細胞を遺伝子操作することをさらに含む。いくつかの実施形態において、１つまたは複数の外因性分子は、免疫シグナル伝達分子である。いくつかの実施形態において、外因性分子は、サイトカイン、ケモカイン、成長因子、可溶性受容体、リガンド、ホスホジエステラーゼ、抗原結合タンパク質、または細胞表面受容体である。
細胞工学的方法のいくつかの実施形態において、成長因子は、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）である。一実施形態では、ＧＭ－ＣＳＦのアミノ酸配列は、配列番号２１、３４または１５、あるいは配列番号２１、３４または１５に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ＧＭ－ＣＳＦをコードするヌクレオチド配列は、配列番号２２、３５または１６、あるいは配列番号２２、３５または１６に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
細胞工学的方法のいくつかの実施形態において、ホスホジエステラーゼはＰＤＥ４Ｂ２である。一実施形態では、ＰＤＥ４Ｂ２のアミノ酸配列は、配列番号２７または２９、あるいは配列番号２７または２９に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ＰＤＥ４Ｂ２をコードするヌクレオチド配列は、配列番号２８または３０、あるいは配列番号２８または３０に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
細胞工学的方法のいくつかの実施形態において、抗原結合タンパク質は、抗体または抗体フラグメントである。
細胞工学的方法のいくつかの実施形態において、細胞表面受容体は、キメラ抗原受容体、またはがん抗原ＮＹ－ＥＳＯ－１１５７－１６５エピトープ（配列番号８）に結合しないＴ細胞受容体である。
細胞工学的方法の様々な実施形態において、宿主細胞は哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態において、宿主細胞はリンパ球系細胞である。いくつかの実施形態では、リンパ球系細胞はＴ細胞である。いくつかの実施形態では、リンパ球系細胞はナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である。
細胞工学的方法の様々な実施形態において、宿主細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、腫瘍流入領域リンパ節または腫瘍浸潤物から得られる。
様々な実施形態において、宿主細胞は、ｅｘ ｖｉｖｏで活性化および／または拡大されている。
様々な実施形態において、宿主細胞は同種異系細胞である。
様々な実施形態において、宿主細胞は自己細胞である。
様々な実施形態において、宿主細胞は、疾患を有する対象から単離される。いくつかの実施形態では、疾患はがんである。いくつかの実施形態において、がんは、その細胞の表面上にがん抗原ＮＹ－ＥＳＯ－１１５７－１６５エピトープ（配列番号８）を提示する。いくつかの実施形態では、がんは、骨髄腫、メラノーマ、肉腫、膀胱がん（bladder cancer）、食道がん、肝細胞がん、頭頸部がん、乳がん、前立腺がん、膀胱がん（urinary bladder cancer）、皮膚がん、肺がん、卵巣がん、または脳腫瘍である。
別の態様では、本明細書に提供されるのは、それを必要とする哺乳動物における免疫応答を刺激または増強する方法であって、本明細書に記載の改変Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を含むリンパ球系細胞、本明細書に記載の宿主細胞、本明細書に記載の二機能性分子、本明細書に記載の組成物、または本明細書に記載の方法によって作製される宿主細胞の有効量を、前記哺乳動物に投与することを含む方法である。
別の態様において、本明細書に提供されるのは、それを必要とする対象におけるがんの治療方法であって、本明細書に記載の改変Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を含むリンパ球系細胞、本明細書に記載の宿主細胞、本明細書に記載の二機能性分子、本明細書に記載の組成物、または本明細書に記載の方法によって作製される宿主細胞の有効量を、対象に投与することを含む方法である。いくつかの実施形態において、がんの細胞は、その表面上にがん抗原ＮＹ－ＥＳＯ－１１５７－１６５エピトープ（配列番号８）を提示する。
治療方法のいくつかの実施形態では、がんは、骨髄腫、メラノーマ、肉腫、膀胱がん（bladder cancer）、食道がん、肝細胞がん、頭頸部がん、乳がん、前立腺がん、膀胱がん（urinary bladder cancer）、皮膚がん、肺がん、卵巣がん、または脳腫瘍である。
いくつかの実施形態では、治療方法は：
ａ）対象または哺乳動物のＴ細胞を分離すること；
ｂ）本明細書に記載のポリヌクレオチドまたは本明細書に記載のベクターを用いてｅｘ ｖｉｖｏで前記Ｔ細胞を遺伝子改変すること；
ｃ）任意選択で、ステップｂ）の前、後、または最中に、前記Ｔ細胞を拡大および／または活性化すること；および
ｄ）遺伝子改変されたＴ細胞を対象または哺乳動物に導入すること；
を含む。
様々な実施形態において、対象または哺乳動物はヒトである。
本発明のこれらおよび他の態様は、以下の説明、特許請求の範囲、および図面において当業者に明らかであろう。
図１Ａ～１Ｅは、ＮＹ－ＥＳＯ ＴＣＲ変異体のα鎖およびβ鎖のアミノ酸配列を示す。図１Ａは、ＴＣＲ ＢＣ１α鎖およびβ鎖のアミノ酸配列を示す。 図１Ｂは、ＴＣＲ Ｉ５３Ｅのα鎖およびβ鎖のアミノ酸配列を示す。 図１Ｃは、ＴＣＲ Ｉ５３Ｆのα鎖およびβ鎖のアミノ酸配列を示す。 図１Ｄは、ＴＣＲ Ｉ５３Ｗのα鎖およびβ鎖のアミノ酸配列を示す。 図１Ｅは、ＴＣＲ Ｄ５５Ｅのα鎖およびβ鎖のアミノ酸配列を示す。 図２Ａおよび２Ｂは、様々なＮＹ－ＥＳＯ ＴＣＲ変異体で形質導入されたＣＤ４＋Ｔ細胞のフローサイトメトリー分析を示す。図２Ａは、様々なＮＹ－ＥＳＯ ＴＣＲ変異体で形質導入されたＣＤ４＋Ｔ細胞のフローサイトメトリーＴＣＲＶｂ１３．１分析を示す。 図２Ｂは、様々なＮＹ－ＥＳＯ ＴＣＲ変異体で形質導入されたＣＤ４＋Ｔ細胞のフローサイトメトリーＨＬＡ－Ａ２．１ ＮＹ－ＥＳＯテトラマー分析を示す。 図３Ａおよび３Ｂは、様々なＮＹ－ＥＳＯ ＴＣＲ変異体で形質導入されたＣＤ８＋Ｔ細胞のフローサイトメトリー分析を示す。図３Ａは様々なＮＹ－ＥＳＯ ＴＣＲ変異体で形質導入されたＣＤ８＋Ｔ細胞のフローサイトメトリーＴＣＲＶｂ１３．１ 分析を示す。 図３Ｂは、様々なＮＹ－ＥＳＯ ＴＣＲ変異体で形質導入されたＣＤ８＋Ｔ細胞のフローサイトメトリーＨＬＡ－Ａ２．１ ＮＹ－ＥＳＯテトラマー分析を示す。 図４Ａおよび４Ｂは、ＮＹ－ＥＳＯ特異的ＴＣＲトランスジェニックＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の機能的アビディティ分析（functional avidity analysis）を示す。図４Ａは、様々なＮＹ－ＥＳＯ ＴＣＲ変異体で形質導入されたＣＤ４＋Ｔ細胞によるインターロイキン２の産生を示す。使用した標的細胞は、ＮＹ－ＥＳＯ１５７－１６５ペプチドの連続１０倍希釈液をロードしたＨＬＡ－Ａ２．１陽性細胞株Ｔ２であった。「ＮＴ」は、形質導入されていない細胞（非形質導入細胞）を指す。 図４Ｂは様々なＮＹ－ＥＳＯ ＴＣＲ変異体で形質導入されたＣＤ８＋Ｔ細胞によるインターフェロンγ（ＩＦＮ－γ）の産生を示す。使用した標的細胞は、ＮＹ－ＥＳＯ１５７－１６５ペプチドの連続１０倍希釈液をロードしたＨＬＡ－Ａ２．１陽性細胞株Ｔ２であった。「ＮＴ」は非形質導入細胞を指す。 図５は、ＮＹ－ＥＳＯ ＴＣＲトランスジェニックＣＤ４＋細胞のＩＬ－２産生を示す。使用した標的細胞は、Ｍｅ２７５（ＨＬＡ／Ａ２－ＮＹ－ＥＳＯ－１を自然に発現する腫瘍細胞株）、Ａ２００８－Ａ２ ＮＬＭおよびＯＶＣＡＲ５ ＮＬＭ（ＨＬＡ－Ａ２－ＮＹ－ＥＳＯ－１を発現するように遺伝子操作された細胞）、ならびにＮＡ８、Ａ２００８－Ａ２およびＯＶＣＡＲ５（ＨＬＡ／Ａ２－ＮＹ－ＥＳＯ－１を発現していない腫瘍細胞株）であった。 図６は、ＮＹ－ＥＳＯ ＴＣＲトランスジェニックＣＤ４＋細胞のＩＬ－２産生を示す。使用した標的細胞は、ＨＬＡ．Ａ２．１陽性、ＮＹ－ＥＳＯ陰性細胞株ＮＡ８、ならびにＨＬＡ－Ａ２．１陽性、ＮＹ－ＥＳＯ陽性細胞株Ｍｅ２７５、Ａ３７５、Ｓａｏｓ－２およびＵ２６６であった。 図７は、ＮＹ－ＥＳＯ ＴＣＲトランスジェニックＣＤ８＋細胞のＩＦＮ－γ産生を示す。使用した標的細胞は、Ｍｅ２７５（ＨＬＡ／Ａ２－ＮＹ－ＥＳＯ－１を自然に発現する腫瘍細胞株）、Ａ２００８－Ａ２ ＮＬＭおよびＯＶＣＡＲ５ ＮＬＭ（ＨＬＡ－Ａ２－ＮＹ－ＥＳＯ－１を発現するように遺伝子操作された細胞）、ならびにＮＡ８、Ａ２００８－Ａ２およびＯＶＣＡＲ５（ＨＬＡ／Ａ２－ＮＹ－ＥＳＯ－１を発現していない腫瘍細胞株）であった。 図８は、ＮＹ－ＥＳＯ ＴＣＲトランスジェニックＣＤ８＋細胞のＩＦＮ－γ産生を示す。使用した標的細胞は、ＨＬＡ．Ａ２．１陽性、ＮＹ－ＥＳＯ陰性細胞株ＮＡ８、ならびにＨＬＡ－Ａ２．１陽性、ＮＹ－ＥＳＯ陽性細胞株Ｍｅ２７５、Ａ３７５、Ｓａｏｓ－２およびＵ２６６であった。 図９は、ペプチドパルス標的細胞との関連でのＮＹ－ＥＳＯ ＴＣＲトランスジェニックＣＤ４＋細胞（野生型ＢＣ１ ＴＣＲ、Ｉ５３Ｅ、およびＩ５３Ｆを発現するＣＤ４＋細胞）のＩＬ－２産生を示す。ＣＤ４＋Ｔ細胞とペプチドをロードしたＴ２標的細胞との２４時間共培養。 図１０は、ペプチドパルス標的細胞との関連でのＮＹ－ＥＳＯ ＴＣＲトランスジェニックＣＤ８＋細胞（野生型ＢＣ１ ＴＣＲ、Ｉ５３Ｅ、およびＩ５３Ｆを発現するＣＤ８＋細胞）のＩＦＮ－γ産生を示す。ＣＤ４＋Ｔ細胞とペプチドをロードした標的細胞との２４時間共培養。 図１１は、様々な腫瘍細胞株に対する、Ｉ５３Ｆ、１５３Ｗ、および１Ｇ４ＬＹ ＴＣＲで形質導入されたＣＤ８＋Ｔ細胞のＩＦＮ－γ産生を示す。使用した標的細胞は、ＮＹ－ＥＳＯ陰性細胞株Ｕ８７ＭＧ、ＯＶＣＡＲ３、Ａ４３１、Ａ６７３、ＳＫＯＶ３、ＲＤ－ＥＳ、ＳＫ－Ｎ－ＡＳおよびＨＴ－２９、ならびにＮＹ－ＥＳＯ陽性細胞株Ａ３７５であった。 図１２は、様々な時点における、野生型ＢＣ１ ＴＣＲ、Ｉ５３Ｅ ＴＣＲ、およびＩ５３Ｆ ＴＣＲを発現するＣＤ８＋細胞による殺細胞活性（ＩｎｃｕＣｙｔｅにより測定）を示す。「ＮＴ」は非形質導入細胞を指す。 図１３Ａおよび１３Ｂは、ＷＩＮＮアッセイを使用したＮＹ－ＥＳＯ ＴＣＲトランスジェニック細胞のｉｎ ｖｉｖｏ評価を示す。図１３Ａは、アッセイの概略図を示す。ＨＬＡ－Ａ２＋／ＮＹ－ＥＳＯ＋腫瘍細胞株Ｍｅ２７５をＮＹ－ＥＳＯ形質導入Ｔ細胞と混合し、ＮＳＧマウスの右側腹部に皮下注射（ｓ．ｃ）した。ＣＤ４＋とＣＤ８＋のパーセンテージはそれぞれ３０％と７０％であった。腫瘍サイズを週に２回測定した。 図１３Ｂはアッセイの結果を示す。 図１４Ａおよび１４Ｂは、ＮＳＧマウスを使用したＮＹ－ＥＳＯ ＴＣＲトランスジェニック細胞のｉｎ ｖｉｖｏ評価を示す。図１４Ａは、アッセイの概略図を示す。０日目（ｄ０）に、０．５ｘ１０６のＭｅ２７５細胞をＮＳＧマウスの脇腹に皮下注射（ｓ．ｃ）した。腫瘍サイズが約５０～１００ｍｍ３になったときに、１０ｘ１０６のＮＹ－ＥＳＯ特異的Ｔ細胞を１０日目（ｄ１０）と１３日目（ｄ１３）に腫瘍周囲に注射した。ＣＤ４＋Ｔ細胞とＣＤ８＋Ｔ細胞の割合はそれぞれ３０％と７０％であった。 図１４Ｂはアッセイの結果を示す。 図１５Ａおよび１５Ｂは、ＮＳＧマウスを使用したＮＹ－ＥＳＯ ＴＣＲトランスジェニック細胞のｉｎ ｖｉｖｏ評価を示す。図１５Ａはアッセイの概略図を示す。０日目（ｄ０）に、５ｘ１０６のＭｅ２７５細胞をＮＳＧマウスの脇腹に皮下注射（ｓ．ｃ）した。腫瘍のサイズが約５０～１００ｍｍ３になったときに、１０ｘ１０６のＮＹ－ＥＳＯ特異的Ｔ細胞を１０日目（ｄ１０）と１３日目（ｄ１３）に静脈内注射（ｉ．ｖ．）した。ＣＤ４＋Ｔ細胞とＣＤ８＋Ｔ細胞の割合はそれぞれ３０％と７０％であった。 図１５Ｂはアッセイの結果を示す。 図１６Ａおよび１６Ｂは、ＮＳＧマウスを使用したＮＹ－ＥＳＯ ＴＣＲトランスジェニック細胞のｉｎ ｖｉｖｏ評価を示す。図１６Ａはアッセイの概略図を示す。０日目（ｄ０）に、５ｘ１０６のＭｅ２７５細胞をＮＳＧマウスの脇腹に皮下注射（ｓ．ｃ）した。腫瘍のサイズが約５０～１００ｍｍ３になったときに、１０日目（ｄ１０）と１３日目（ｄ１３）に様々な数のＮＹ－ＥＳＯ特異的Ｔ細胞を静脈内注射（ｉ．ｖ．）した。ＣＤ４＋Ｔ細胞とＣＤ８＋Ｔ細胞の割合はそれぞれ３０％と７０％であった。 図１６Ｂはアッセイの結果を示す。 図１７Ａ～１７Ｃは、ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲを安定発現しかつマウスＧＭ－ＣＳＦを分泌するように、ヒトＴ細胞を効率的に共操作（co-engineered）できることを示す。図１７Ａは、レトロウイルスマウスＧＭ－ＣＳＦ構築物およびレンチウイルスＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲ構築物の概略図を示す。 図１７Ｂは、ウイルス形質導入後７日目のヒトＣＤ８＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋Ｔ細胞の代表的な等高線プロットを示す。ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲの発現は、ＨＬＡ－Ａ２拘束性ＮＹ－ＥＳＯ－１１５７－１６５テトラマーを使用して確認し、一方、マウスＧＭ－ＣＳＦの発現は、表面のＴｈｙ１．１レポータータンパク質の検出によって追跡した。「ＮＴ」は非形質導入Ｔ細胞を指す。 図１７Ｃは、分泌されたマウスＧＭ－ＣＳＦが、形質導入されたＣＤ８＋Ｔ細胞培養物の上清においてＥＬＩＳＡによって検出され得ることを示す。「ＮＴ」は非形質導入Ｔ細胞を指す。 図１８Ａおよび１８Ｂは、分泌されたマウスＧＭ－ＣＳＦがヒトＴ細胞の活性に影響を及ぼさないことを示す。ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲで操作されたＴ細胞によって分泌されたＩＦＮγの検出が、ＨＬＡ－Ａ２＋ＮＹ－ＥＳＯ－１＋腫瘍細胞の認識に基づくことを示す。ＩＦＮγレベルに対するマウスＧＭ－ＣＳＦの影響はない。図１８Ａと図１８Ｂは同じ実験を示す。「ＮＴ」は形質転換されていないことを指す。統計的有意性は、一元配置分散分析（ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）によって決定した。****ｐ＜０．０００１。 図１８Ｂは、ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲで操作されたＴ細胞がＨＬＡ－Ａ２＋ＮＹ－ＥＳＯ－１＋腫瘍細胞を容易に殺すことができ、それらの細胞傷害活性がマウスＧＭ－ＣＳＦによる影響を受けないことを示す。「ＮＴ」は形質転換されていないことを指す。統計的有意性は、一元配置分散分析（ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）によって決定した。****ｐ＜０．０００１。 図１９Ａ～１９Ｃは、腫瘍微小環境で分泌されたＴ細胞由来マウスＧＭ－ＣＳＦが、ＮＳＧヒトメラノーマ異種移植マウスモデルにおいて、ＮＹ－ＥＳＯ－１特異的Ｔ細胞による腫瘍増殖の制御を有意に増強できることを実証する。図１９Ａは、Ｗｉｎｎアッセイによるマウスにおける腫瘍増殖を示す。マウスＧＭ－ＣＳＦを分泌するように共操作されたヒトＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲ発現Ｔ細胞は、ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲのみを発現する対照Ｔ細胞と比較して、Ｍｅ２７５メラノーマ細胞の生着および確立を効果的に遅らせることができる。「ＮＴ」は非形質導入Ｔ細胞を指す。ｉｎ ｖｉｖｏ応答の統計的有意性は、一元配置分散分析または個々の時点の対応のないｔ検定によって決定した。***ｐ＜０．００１。 図１９Ｂは、Ｗｉｎｎアッセイによるマウスの生存率を示す。ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲ発現マウスＧＭ－ＣＳＦ分泌Ｔ細胞で処置されたマウスの４０％は腫瘍がなかった。生存曲線の統計的有意性は、Ｍａｎｔｅｌ－Ｃｏｘログランク検定によって決定した。**ｐ＜０．０１。 図１９Ｃは、２ｘ１０７のＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲ発現マウスＧＭ－ＣＳＦ分泌Ｔ細胞の養子移入が、ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲ単独と比較して、確立されたＭｅ２７５腫瘍のより良好な腫瘍制御を示したことを示す。「ＮＴ」は非形質導入Ｔ細胞を指す。ｉｎ ｖｉｖｏ応答の統計的有意性は、一元配置分散分析または個々の時点の対応のないｔ検定によって決定した。***ｐ＜０．００１。 図２０Ａは、マウスＧＭ－ＣＳＦの例示的なタンパク質およびヌクレオチド配列を提供する。 図２０Ｂは、ヒトＧＭ－ＣＳＦの例示的なタンパク質およびヌクレオチド配列を提供する。 図２１は、初代ヒトＴ細胞に効果的に形質導入して外因性ホスホジエステラーゼ４Ｂ２（ＰＤＥ４Ｂ２）を発現させることができ、また同時形質導入して外因性ＰＤＥ４Ｂ２とＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲバリアントβ－Ｉ５３Ｆを発現させることができることを示す。形質導入されていない（非形質導入）、ＰＤＥ４Ｂ２を導入された、ならびにＰＤＥ４Ｂ２＆ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲを導入されたＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞について、７日目に外因性ＰＤＥ４Ｂ２またはＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲバリアントβ－Ｉ５３Ｆの発現をフローサイトメトリーで調べた結果が示されている。 図２２は、ＰＤＥ４Ｂ２の過剰発現が細胞内ｃＡＭＰの蓄積を防ぐことを示す。フォルスコリン（Ｆｓｋ）またはＰＧＥ２に１時間曝露したときの、ｅＧＦＰ（灰色の線）またはＰＤＥ４Ｂ２（黒色の線）で形質導入された休止ＣＤ４ Ｔ細胞の細胞内ｃＡＭＰレベルが示されている。処理後、Ｔ細胞を溶解させ、ｃＡＭＰレベルをＥＬＩＳＡで定量化した。示されている結果は、すべてのｃＡＭＰ測定が三重で実行された単一の実験からのものである。エラーバーは標準偏差（ＳＤ）を表す。 図２３Ａおよび２３Ｂは、ＰＤＥ４Ｂ２で形質導入されたＴ細胞によるＴｈ－１サイトカイン産生を示す。図２３Ａは、フォルスコリン（Ｆｓｋ）またはＰＧＥ２の存在下での、プレート結合αＣＤ３および可溶性αＣＤ２８有り（実線：刺激）または無し（点線：非刺激）での刺激の７時間後の細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）によって決定された、ｅＧＦＰまたはＰＤＥ４Ｂ２を形質導入された休止ＣＤ４ Ｔ細胞によるＩＦＮγまたはＴＮＦ－αの産生を示す。生きているＣＤ４５＋ｅＧＦＰ＋リンパ球（灰色線）または生きているＣＤ４５＋外因性ＰＤＥ４Ｂ２＋リンパ球（黒線）の内のＩＦＮγ＋またはＴＮＦ－α＋細胞のパーセンテージ、ならびに代表的なプロットが示されている。示されている結果は、すべての条件について二重で実施された単一の実験からのものである。エラーバーはＳＤを表す。 図２３Ｂは、ＥＬＩＳＡによって測定された、ＰＧＥ２またはフォルスコリンの存在下でのＮＹ－ＥＳＯ－１提示メラノーマ細胞Ａ３７５との４８時間の共培養に応答した、ｅＧＦＰ、ＰＤＥ４Ｂ２、ｅＧＦＰ＆ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲ、またはＰＤＥ４Ｂ２－＆ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲを形質導入された休止ＣＤ８ Ｔ細胞によるＩＦＮγの分泌を示す。共培養上清のＩＦＮγ濃度が示されている。エラーバーはＳＤを表す。 図２４は、ＰＤＥ４Ｂ２の過剰発現が、細胞内ｃＡＭＰ蓄積を誘導する条件下で増殖を促進することを示す。ｅＧＦＰ（灰色）またはＰＤＥ４Ｂ２（黒色）を形質導入されたＣＤ４ Ｔ細胞の増殖能力は、ＢｒＤＵ取り込みアッセイによって決定した。Ｔ細胞を、プレート結合αＣＤ３有り（実線：刺激）または無し（点線：非刺激）で、ＰＧＥ２またはフォルスコリン（Ｆｓｋ）の存在下で４８時間再刺激した。生きているＣＤ４５＋リンパ球の内のＢｒＤＵ＋細胞のパーセンテージ（左側のグラフ）、これらの集団のＢｒＤＵ ＭＦＩ（中央のグラフ）、ならびに代表的なプロットが示されている。示されている結果は、すべての条件について二重で実施された単一の実験からのものである。エラーバーはＳＤを表す。 図２５は、ＰＤＥ４Ｂ２の過剰発現が、ＰＧＥ２の存在下で細胞傷害性を促進することを示す。ｅＧＦＰ（白三角）、ＰＤＥ４Ｂ２（白丸）、ｅＧＦＰ＆ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲ（黒三角）、またはＰＤＥ４Ｂ２＆ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲ（黒丸）を形質導入された休止ＣＤ４（左グラフ）またはＣＤ８（左グラフ）Ｔ細胞が、ＰＧＥ２の存在下（黒線）または不在下（灰色線）でＮＹ－ＥＳＯ－１提示メラノーマ細胞Ａ３７５の拡大を抑制する能力をＩｎｃｕＣｙｔｅによって評価した。ウェルあたりのＡ３７５細胞の核が占めるｍｍ２に対応する赤色オブジェクト面積（red object area）の値が表されている。示されている結果は、すべての条件が３重で実施された単一の実験からのものである。ウェルごとに４つの異なる平面が分析に組み込まれた。エラーバーはＳＤを表す。 図２６は、ヒトおよびマウスのＰＤＥ４Ｂ２の例示的なタンパク質配列を提供する。
本発明は、一般に、がん抗原ＮＹ－ＥＳＯ－１１５７－１６５エピトープへの結合親和性が改善された改変Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を提供する。
本発明はまた、関連するポリペプチドおよびタンパク質、ならびに関連する核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞、および遺伝子操作された細胞を含むがこれらに限定されない細胞集団を提供する。さらに、本発明は、改変ＴＣＲを含む遺伝子操作された細胞を提供する。本発明によってさらに提供されるのは、本発明の改変ＴＣＲおよび細胞に関連する医薬組成物である。
さらに、本発明は、改変ＴＣＲを発現するリンパ球系細胞の遺伝子操作の方法を提供する。本発明によってさらに提供されるのは、改変ＴＣＲ、ならびに追加の受容体（キメラ抗原受容体、またはがん抗原ＮＹ－ＥＳＯ－１１５７－１６５エピトープに対してではない受容体が含まれるが、これらに限定されない）または可溶性タンパク質（サイトカイン、ケモカイン、成長因子、可溶性受容体、リガンド、抗体フラグメント、および抗原結合ドメインが含まれるがこれらに限定されない）を発現する遺伝子操作されたリンパ球系細胞である。養子細胞移入療法においてそのような遺伝子操作されたリンパ球系細胞を使用する方法も本明細書に提供される。
また、本発明によって提供されるのは、対象におけるがんを治療する方法である。この方法は、そのようながんを患っている対象に、本発明の改変ＴＣＲを提示するリンパ球系細胞の有効量を投与することを含む。また、本発明によって提供されるのは、哺乳動物における免疫応答を刺激または増強する方法であって、本発明の遺伝子操作されたリンパ球系細胞の有効量を哺乳動物に投与することを含む。
一態様では、本明細書で提供されるのは、改変ＴＣＲとコロニー刺激因子サイトカイン／ケモカインファミリーからのサイトカインおよび／またはケモカインとを発現する、遺伝子操作されたリンパ球系細胞である。コロニー刺激因子サイトカイン／ケモカインファミリーのメンバーは、これらの骨髄細胞のほとんどに作用し、それらの活性を調節することが知られている（Ushach, I. and A. Zlotnik, Journal of Leukocyte Biology, 2016. 100: p. 481-489）。具体的には、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）は、単球、マクロファージ、顆粒球、および樹状細胞（ＤＣ）の生物学において免疫刺激の役割を果たすことが知られている。ＧＭ－ＣＳＦは、当初造血成長因子として説明されてたが、自己免疫疾患やがんなど、多くの病的状態における重要な免疫調節因子として浮上している。ＧＭ－ＣＳＦは、造血系（すなわち、マクロファージ、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、活性化Ｔ細胞）、および非造血系（内皮細胞や線維芽細胞など）起源の両方の細胞により分泌される。健康な個体の血清では検出できないが、ＧＭ－ＣＳＦレベルは炎症中に急速に増加する（Becher, B., S. Tugues, and M. Greter, Immunity, 2016. 45: p. 963-973）。ＧＭ－ＣＳＦは、そのコグネイト受容体（cognate receptor）、すなわちＧＭ－ＣＳＦ受容体（ＧＭ－ＣＳＦ－Ｒ）を介してその多面的効果を発揮し、主に単球／マクロファージおよび顆粒球系統の細胞、ならびにＤＣに見られる。リガンドが結合すると、ＧＭ－ＣＳＦ受容体は、細胞の生存、増殖、分化、および活性化に関連するシグナルを伝達する（Hercus, T.R., et al., Blood. 2009. 114: p. 1289-1298）。そのような専門の抗原提示細胞（ＡＰＣ）の運命を制御することによって、ＧＭ－ＣＳＦは、Ｔ細胞の活性を間接的に調節でき、したがって適応免疫と自然免疫の間の架け橋として機能する（Shi, Y., et al., Cell Res. 2006. 16(2):126-33）。
がん治療において、ＧＭ－ＣＳＦは、化学療法および／または幹細胞移植レジメン後の免疫系の骨髄コンパートメントの回復を加速および強化するだけでなく、がん患者の支持療法において中心的な役割を果たしてきた（Arellano, M. and S. Lonial, Biologics. 2008. 2(1):13-27）。さらに、ＤＣの発生および分化におけるその極めて重要な役割により、ＧＭ－ＣＳＦは、ＤＣを活性化するＧＭ－ＣＳＦ分泌がんワクチン（Gupta, R. and L.A. Emens. Discovery medicine, 2010. 10(50): p. 52-60）または一次免疫療法としてのＧＭ－ＣＳＦにより活性化された／偏向されたＤＣ（GM-CSF-activated/skewed DC）の養子移入（Mookerjee, A., M. Graciotti, and L. Kandalaft, BioImpacts: BI, 2018. 8(3): p. 211-221）のいずれかの形態で、ＤＣベースの免疫療法の中核を担っている。ＤＣは、ＧＭ－ＣＳＦを強制的に過剰発現する腫瘍を使用した前臨床試験（Shi, F.S., et al., Cancer Gene Ther, 1999. 6(1): p. 81-8）における、またはがん患者での可溶性ＧＭ－ＣＳＦの投与後（Nasi, M.L., et al., Cytokines Cell Mol Ther, 1999. 5(3): p. 139-44）における、堅牢な抗腫瘍応答の主要なメディエーターとしても浮上している。有望な結果にもかかわらず、臨床での単一補助療法（single adjuvant therapy）としてのＧＭ－ＣＳＦの使用は、かなり不十分であることが証明されており（Lawson, D.H., et al., J Clin Oncol, 2015. 33(34): p. 4066-76）、また用量関連毒性の出現により制限されている（Antman, K.S., et al., N Engl J Med, 1988. 319(10): p. 593-8）。興味深いことに、別の一連の研究は、腫瘍由来のＧＭ－ＣＳＦが、腫瘍微小環境においてＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ－１＋骨髄由来免疫抑制細胞（ＭＤＳＣ）の免疫誘引を担い、それが次に腫瘍の免疫回避（tumor evasion）を促進するという、抗腫瘍応答のＧＭ－ＣＳＦ駆動免疫抑制メカニズムを明らかにしている（Pylayeva-Gupta, Y., et al., Cancer Cell, 2012. 21: p. 836-847）。
養子Ｔ細胞移入戦略の恩恵を最大化し、ＧＭ－ＣＳＦの免疫調節性抗がん特性を活用するとともに、望ましくない副作用や標的外毒性を回避するために、高親和性ＮＹ－ＥＳＯ－１特異的ＴＣＲおよびＧＭ－ＣＳＦを異所的に発現させるようにＴ細胞を遺伝子的に共操作（genetically co-engineered）する組み合わせアプローチが開発された。ＮＹ－ＥＳＯ－１特異的ＴＣＲおよびＧＭ－ＣＳＦを発現するＴ細胞の一実施形態は、以下の実施例６に例示されている。ヒトＴ細胞は、増殖能や抗腫瘍活性に影響を与えることなく、完全に機能的な可溶性ＧＭ－ＣＳＦを効率的に分泌し、ｉｎ ｖｉｖｏでヒトＮＹ－ＥＳＯ－１＋メラノーマ腫瘍に対して強力な抗腫瘍応答を誘発することが示された。
別の態様では、本明細書で提供されるのは、改変ＴＣＲおよびホスホジエステラーゼを発現する遺伝子操作されたリンパ球系細胞である。いくつかの実施形態では、ホスホジエステラーゼは、ホスホジエステラーゼ４Ｂ２（ＰＤＥ４Ｂ２）である。細胞内セカンドメッセンジャーであるサイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）は、Ｔ細胞において強力な免疫抑制シグナル伝達分子として機能し、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）、アデノシン、および制御性Ｔ細胞の機能などの多様な腫瘍関連抑制因子によってアップレギュレートされる。ホスホジエステラーゼの過剰発現は、ｃＡＭＰシグナル伝達を低下させ、ＰＧＥ２などの抑制因子の阻害に対する抗腫瘍Ｔ細胞の耐性を高めることができる。米国特許第９，９７６，１２１号およびSchmetterer, KG., Front. Immunol., 30 July 2019を参照されたい（これらはすべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
定義
別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。
本明細書で使用される場合、「抗原」という用語は、抗体に特異的に結合することができるまたはＴ細胞受容体によって認識されるペプチド断片を生成することができる、および／または免疫応答を誘導することができる分子および／または物質である。抗原は、１つまたは複数の「エピトープ」を含み得る。特定の実施形態では、抗原はいくつかのエピトープを有する。エピトープは、ＭＨＣ分子との関連で抗体またはリンパ球によって認識される。様々な実施形態において、抗原はＮＹ－ＥＳＯ－１である。様々な実施形態において、エピトープは、ＮＹ－ＥＳＯ－１１５７－１６５である。
本明細書で使用される場合、交換可能に使用される「腫瘍抗原」または「がん抗原」という用語は、腫瘍もしくはがん細胞によって特異的に発現されるまたは腫瘍に関連する抗原として広く定義され、例えば、過剰発現または異常発現された抗原、発がん性ウイルス（oncogenic virus）によって産生される抗原、がん胎児性抗原、改変細胞表面糖脂質および糖タンパク質抗原、細胞型特異的分化抗原などである。がん細胞の表面に存在する腫瘍抗原は、個体の正常な体細胞の表面に存在しない抗原であり、すなわち、その抗原は、がん細胞において免疫系に曝露されるが、正常な体細胞では曝露されない。抗原は、腫瘍細胞の細胞表面に発現される場合があり、そこで抗原はＢリンパ球（Ｂ細胞）などの体液性免疫系の構成要素によって認識される。細胞内腫瘍抗原は、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子と複合体を形成する短いペプチド断片にプロセッシングされ、がん細胞の細胞表面に提示され、そこでＴリンパ球（Ｔ細胞）またはナチュラルキラー細胞のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）によって認識される。好ましくは、腫瘍抗原は、正常細胞によって発現されないか、または少なくとも腫瘍細胞と同レベルまでは発現されないものである。
本明細書で使用される「機能的断片」という用語は、全長ポリペプチドまたはタンパク質の少なくとも１つの機能を保持するポリペプチドもしくはタンパク質の断片、またはポリペプチドもしくはタンパク質をコードするポリヌクレオチドを指す。機能的断片は、全長ポリペプチドまたはタンパク質のアミノ酸配列の、少なくとも５個の連続アミノ酸残基、少なくとも６個の連続アミノ酸残基、少なくとも７個の連続アミノ酸残基、少なくとも８個の連続アミノ酸残基、少なくとも９個の連続アミノ酸残基、少なくとも１０個の連続アミノ酸残基、少なくとも１１個の連続アミノ酸残基、少なくとも１２個の連続アミノ酸残基、少なくとも１３個の連続アミノ酸残基、少なくとも１４個の連続アミノ酸残基、少なくとも１５個の連続アミノ酸残基、少なくとも２０個の連続アミノ酸残基、少なくとも２５個の連続アミノ酸残基、少なくとも４０個の連続アミノ酸残基、少なくとも５０個の連続アミノ酸残基、少なくとも６０個の連続アミノ酸残基、少なくとも７０個の連続アミノ酸残基、少なくとも８０個の連続アミノ酸残基、少なくとも９０個の連続アミノ酸残基、少なくとも１００個の連続アミノ酸残基、少なくとも１２５個の連続アミノ酸残基、少なくとも１５０個の連続アミノ酸残基、少なくとも１７５個の連続アミノ酸残基、少なくとも２００個の連続アミノ酸残基、または少なくとも２５０個の連続アミノ酸残基のアミノ酸配列を含み得る。ポリペプチドまたはタンパク質の機能的断片は、全長タンパク質またはポリペプチドの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれ以上の機能を保持し得る。例えば、特定の抗原（またはエピトープ）に免疫特異的に結合するＴＣＲの機能的断片は、その抗原（またはエピトープ）に免疫特異的に結合する能力を保持し得る。いくつかの実施形態において、ＴＣＲの機能的断片は、ＴＣＲのα鎖および／またはβ鎖の１つまたは複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。いくつかの実施形態において、ＴＣＲの機能的断片は、ＴＣＲのα鎖および／またはβ鎖を含む。
本明細書で使用される「バリアント」という用語は、野生型ポリペプチド、タンパク質、またはポリヌクレオチドと実質的なまたは有意な配列同一性または類似性を有する改変ポリペプチド、タンパク質、またはポリヌクレオチドを指す。バリアントは、そのバリアントの野生型ポリペプチド、タンパク質、またはポリヌクレオチドと比較して、同じ生物学的活性を保持し得るか、あるいは変更された（例えば、改善された、低減された、または撤廃された）生物学的活性を有し得る。バリアントは、少なくとも１つのアミノ酸残基またはヌクレオチドの挿入、欠失、置換を含み得る。
「抗原結合タンパク質」という用語は、目的の抗原またはポリペプチドあるいはその断片に結合する任意のタンパク質を指す。タンパク質は、天然由来または合成のいずれかであり得る。抗原結合タンパク質の例には、抗体；抗体に由来するポリペプチドまたはフラグメント、例えば、単鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖフラグメント；例えば、ＴＣＲ可変ドメインなどのＴ細胞受容体に由来するポリペプチド；シグナル伝達ドメイン（例えば、「サイトカイン（zytokine）」）に人工的に融合され得る分泌因子（例えば、サイトカイン、成長因子）；および目的の抗原に結合する任意のリガンドまたは受容体断片（例えば、ＣＤ２７、ＮＫＧ２Ｄ）が含まれるが、これらに限定されない。コンビナトリアルライブラリーを使用して、治療標的に高い親和性で結合するペプチドを同定することもできる。
本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、多重特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、および抗体フラグメント（例えば、一本鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆｖフラグメント、単鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）、（Ｆａｂ）２’フラグメントなどの二価抗体フラグメント、Ｆ（ａｂ’）フラグメント、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、イントラボディ（intrabody）、ミニボディ（minibody）、ジアボディ（diabody）、トリアボディ（triabody）、デカボディ（decabody）、および他のドメイン抗体（例えば、Holt, L. J., et al., Trends Biotechnol. (2003), 21, 11, 484-490)）を指す。「抗体」という用語はまた、米国特許出願公開第２００７／０００４９０９号に開示されているような共有結合型ジアボディ、および米国特許出願公開第２００９／００６０９１０号に開示されているようなＩｇ－ＤＡＲＴＳも指す。本明細書に記載の方法において有用な抗体には、任意のタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）またはサブクラスの免疫グロブリン分子が含まれる。
「ベクター」、「クローニングベクター」および「発現ベクター」という用語は、宿主を遺伝子改変し、導入された配列の発現（例えば、転写および翻訳）を促進するように、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列（例えば、外来遺伝子）を宿主細胞に導入することができるビヒクルを意味する。ベクターには、プラスミド、合成されたＲＮＡおよびＤＮＡ分子、トランスポゾン、ファージ、ウイルスなどが含まれる。特定の実施形態において、ベクターは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、アルファウイルス、ヘルペスウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、またはワクシニアベクターなどであるが、これらに限定されないウイルスベクターである。
「調節エレメント」という用語は、核酸配列の発現のいくつかの側面を制御する任意のシス作用性遺伝子エレメントを指す。いくつかの実施形態において、「プロモーター」という用語は、本質的に、転写を開始するために必要とされる最小の配列を含む。いくつかの実施形態において、「プロモーター」という用語は、転写を開始する配列を含み、加えて、一般にそれぞれ「エンハンサーエレメント」および「リプレッサーエレメント」と呼ばれる、転写をアップレギュレートまたはダウンレギュレートすることができる配列も含む。いくつかの実施形態では、プロモーターはリンパ球特異的プロモーターである。
本明細書で使用される「作動可能に連結され」という用語は、ヌクレオチド配列が別のヌクレオチド配列と機能的関係に置かれることを意味する。例えば、コード配列がプロモーター配列に作動可能に連結されている場合、これは一般に、プロモーターがコード配列の転写を促進し得ることを意味する。作動可能に連結されているとは、連結されているＤＮＡ配列が通常は隣接しており、２つのタンパク質コード領域を結合するために必要な場合は、隣接しておりかつリーディングフレーム内にあることを意味する。しかしながら、エンハンサーはプロモーターから数キロベース離れているときに機能する場合があり、またイントロン配列は可変長であり得るため、一部のヌクレオチド配列は作動可能に連結されているが隣接していない場合もある。
「Ｔ細胞」および「Ｔリンパ球」という用語は交換可能であり、本明細書では同義語として使用される。本明細書で使用される場合、Ｔ細胞には、胸腺細胞（thymocyte）、ナイーブＴリンパ球、未成熟Ｔリンパ球、成熟Ｔリンパ球、休止Ｔリンパ球、または活性化Ｔリンパ球が含まれる。Ｔ細胞は、Ｔヘルパー（Ｔｈ）細胞、例えば、Ｔヘルパー１（Ｔｈｌ）またはＴヘルパー２（Ｔｈ２）細胞であり得る。Ｔ細胞はヘルパーＴ細胞（ＨＴＬ；ＣＤ４＋Ｔ細胞）ＣＤ４＋Ｔ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ；ＣＤ８＋Ｔ細胞）、腫瘍浸潤性細胞傷害性Ｔ細胞（ＴＩＬ；ＣＤ８＋Ｔ細胞）、ＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞、またはＴ細胞のその他のサブセットであってよい。特定の実施形態での使用に適したＴ細胞の他の例示的な集団には、ナイーブＴ細胞およびメモリーＴ細胞が含まれる。「ＮＫＴ細胞」も含まれ、それは、セミインバリアント（semi-invariant）αβＴ細胞受容体を発現するが、ＮＫ１．１などのＮＫ細胞に通常関連する様々な分子マーカーも発現する特殊なＴ細胞集団を指す。ＮＫＴ細胞には、ＮＫ１．１＋およびＮＫ１．１－、ならびにＣＤ４＋、ＣＤ４－、ＣＤ８＋、およびＣＤ８－細胞が含まれる。ＮＫＴ細胞上のＴＣＲは、ＭＨＣ Ｉ様分子ＣＤＩｄによって提示される糖脂質抗原を認識するという点で独特である。ＮＫＴ細胞は、炎症または免疫寛容のいずれかを促進するサイトカインを産生する能力により、保護効果または有害効果のいずれかを有することができる。また、「ガンマ－デルタＴ細胞（γδＴ細胞）」も含まれ、これは、その表面上に別のＴＣＲを有するＴ細胞の小さなサブセットである特殊な集団を指し、ＴＣＲがα－ＴＣＲ鎖およびβ－ＴＣＲ鎖と呼ばれる２つの糖タンパク質鎖で構成される大多数のＴ細胞とは異なり、γδＴ細胞のＴＣＲはγ鎖とδ鎖で構成される。γδＴ細胞は、免疫監視および免疫調節において役割を果たすことができ、ＩＬ－１７の重要な供給源であり、堅牢なＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞応答を誘導することがわかっている。また、「制御性Ｔ細胞」または「Ｔｒｅｇ」も含まれ、これは、異常または過剰な免疫応答を抑制し、免疫寛容において役割を果たすＴ細胞を指す。Ｔｒｅｇ細胞は典型的には転写因子Ｆｏｘｐ３陽性ＣＤ４＋Ｔ細胞であり、ＩＬ－１０産生ＣＤ４＋Ｔ細胞である転写因子Ｆｏｘｐ３陰性制御性Ｔ細胞も含むことができる。
「ナチュラルキラー細胞」および「ＮＫ細胞」という用語は、交換可能に使用され、本明細書では同義語として使用される。本明細書で使用される場合、ＮＫ細胞は、ＣＤ１６＋ＣＤ５６＋および／またはＣＤ５７＋ＴＣＲ－表現型を有する分化したリンパ球を指す。ＮＫは、特定の細胞溶解性酵素の活性化によって「自己」ＭＨＣ／ＨＬＡ抗原を発現しない細胞に結合して殺す能力、ＮＫ活性化受容体のリガンドを発現する腫瘍細胞または他の罹患細胞に結合して殺す能力、および免疫応答を刺激または阻害するサイトカインと呼ばれるタンパク質分子を放出する能力を特徴とする。
本明細書で使用される場合、「外因性」は、自然界に見られる特定の細胞に由来しない任意の分子を指す。外因性分子は、人工的または自然的手段によって宿主細胞に導入された核酸分子から発現され得る。
状況、障害または状態を「治療する（treat）」または「治療（treatment）」という用語には：１）その状況、障害または状態を患っているまたはその素因を有している可能性があるが、その状況、障害または状態の臨床的または無症候性症状をまだ経験または表示していない対象において、その状況、障害または状態の少なくとも１つの臨床症状または無症候性症状の出現の発生および／または可能性を予防、遅延または低減させること；または（２）その状況、障害または状態を阻害する、すなわち、疾患またはその再発、あるいはそれらの少なくとも１つの臨床症状または無症候性症状の発生を停止、軽減または遅延させること；または（３）疾患を軽減する、すなわち、状況、障害または状態あるいはそれらの臨床症状または無症候症状の少なくとも１つの後退を生じさせること；が含まれる。治療される対象に対する利益は、統計的に有意であるか、あるいは少なくとも患者または医師に知覚可能であるかのいずれかである。
用量または量に適用される「有効」という用語は、それを必要とする対象に投与した際に所望の活性をもたらすのに十分な化合物または医薬組成物の量を指す。有効成分の組み合わせを投与する場合、組み合わせの有効量は、個別に投与された場合に有効であったであろう各成分の量を含む場合も含まない場合もあることに留意されたい。必要とされる正確な量は、対象の種、年齢、および一般的な状態、治療される状態の重症度、使用される特定の薬物、投与方法などに応じて、対象ごとに異なる。
本明細書に記載の組成物に関連して使用される「薬学的に許容される」という句は、生理学的に許容可能であり、かつ哺乳動物（例えば、ヒト）に投与した場合に通常は望ましくない反応を生じない、そのような組成物の分子種および他の成分を指す。好ましくは、「薬学的に許容される」という用語は、米国連邦政府または州政府の規制当局によって承認されているか、または哺乳動物、より具体的にはヒトで使用するために米国薬局方または他の一般に認められた薬局方に掲載されていることを意味する。
「患者」、「個体」、「対象」、および「動物」という用語は、本明細書で交換可能に使用され、ヒトおよび獣医動物（例えば、ネコ、イヌ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタなど）、ならびに実験動物モデルを含むがそれらに限定されない哺乳動物を指す。好ましい実施形態では、対象はヒトである。
「担体」という用語は、化合物とともに投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルを指す。そのような医薬担体は、水および油などの無菌液体であってよく、それら油には、ピーナツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油などの、石油、動物、植物または合成起源のものが含まれる。水または水溶液、生理食塩水、ならびにデキストロースおよびグリセロール水溶液が、特に注射用溶液のための担体として好ましく使用される。あるいは、担体は、結合剤（圧縮錠剤用）、流動化剤（glidant）、封入剤、香味剤、および着色剤のうちの１つまたは複数を含むがこれらに限定されない固体剤形担体であってもよい。適切な医薬担体は、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」に記載されている。
単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」には、文脈で明確に指示されていない限り、複数への言及が含まれる。したがって、例えば、「方法」への言及は、本明細書に記載されたおよび／または本開示を読むと当業者に明らかになるタイプの１つまたは複数の方法、および／またはステップを含む。
「約」または「おおよそ」という用語は、統計的に意味のある値の範囲内にあることを含む。このような範囲は、所与の値または範囲の１桁以内、好ましくは５０％以内、より好ましくは２０％以内、さらにより好ましくは１０％以内、さらにより好ましくは５％以内であり得る。「約」または「おおよそ」という用語に含まれる許容可能な変動は、試験中の特定のシステムに依存し、当業者によって容易に理解され得る。
本明細書における値の範囲の列挙は、本明細書に別段の記載がない限り、その範囲内にある各個別の値および各終点を個別に参照する簡略化された方法として機能することを意図しており、各個別の値および終点は、本明細書に個別に記載されているかのように明細書に組み込まれる。
本発明の実施は、特に明記しない限り、当業者の内である、統計分析、分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、および生化学の従来の技術を使用する。そのようなツールおよび技術は、例えば、Sambrook et al. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3rd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, New York; Ausubel et al. eds. (2005) Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley and Sons, Inc.: Hoboken, NJ; Bonifacino et al. eds. (2005) Current Protocols in Cell Biology. John Wiley and Sons, Inc.: Hoboken, NJ; Coligan et al. eds. (2005) Current Protocols in Immunology, John Wiley and Sons, Inc.: Hoboken, NJ; Coico et al. eds. (2005) Current Protocols in Microbiology, John Wiley and Sons, Inc.: Hoboken, NJ; Coligan et al. eds. (2005) Current Protocols in Protein Science, John Wiley and Sons, Inc. : Hoboken, NJ；およびEnna et al. eds. (2005) Current Protocols in Pharmacology, John Wiley and Sons, Inc.: Hoboken, NJに詳細に記載されている。
改変Ｔ細胞受容体
一態様では、本発明は、改変Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）またはその機能的断片を提供し、改変ＴＣＲは、非置換野生型（ＷＴ）ＴＣＲのβ鎖のＣＤＲ２と比較して、改変ＴＣＲのβ鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）２内に単一アミノ酸置換を含む。
一実施形態では、本発明は、野生型（ＷＴ）ＴＣＲのアミノ酸配列においてＴＣＲのβ鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）２に位置する単一アミノ酸置換のみを有するアミノ酸配列を含む改変Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を提供し、改変ＴＣＲは、ＷＴ ＴＣＲと比較して、ＷＴ ＴＣＲの抗原特異性を保持し、がん抗原に対するより高い結合親和性を有し、配列番号１のＣＤＲ２に位置する単一アミノ酸置換を有することを除いて配列番号１のアミノ酸配列を含む。
特定の実施形態において、改変ＴＣＲのがん抗原への結合親和性は、ＷＴ ＴＣＲのがん抗原への結合親和性と比較して、約５倍、約１０倍、約１５倍、約２０倍、約２５倍、約３０倍、約３５倍、約４０倍、約４５、約５０倍、約５５倍、約６０倍、約６５倍、約７０倍、約７５倍、約８０倍、約８５倍、約９０倍、約９５倍、または１００倍以上高い。
解離定数（ＫＤ）を使用して、改変ＴＣＲのがん抗原への結合親和性を評価することができる。特定の実施形態において、がん抗原に対する改変ＴＣＲの解離定数（ＫＤ）は、約０．１～約１０μＭの間である。非限定的な例として、がん抗原に対する改変ＴＣＲの解離定数（ＫＤ）は、約０．１μＭ、約０．２μＭ、約０．３μＭ、約０．４μＭ、約０．５μＭ、約０．６μＭ、約０．７μＭ、約０．８μＭ、約０．９μＭ、約１μＭ、約１．２μＭ、約１．５μＭ、約１．７μＭ、約２μＭ、約２．２μＭ、約２．５μＭ、約２．７μＭ、約３μＭ、約３．２μＭ、約３．５μＭ、約３．７μＭ、約３．９μＭ、約４μＭ、約４．２μＭ、約４．５μＭ、約５μＭ、約５．５μＭ、約６μＭ、約６．５μＭ、約７μＭ、約７．５μＭ、約８μＭ、約８．５μＭ、約９μＭ、約９．５μＭ、または約１０μＭであり得る。
一実施形態では、本発明は、ＴＣＲのβ鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）２に位置する単一アミノ酸置換を有する以外は野生型（ＷＴ）ＴＣＲのアミノ酸配列を含む改変Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を提供し、改変ＴＣＲは、ＷＴ ＴＣＲと比較して、ＷＴ ＴＣＲの抗原特異性を保持し、がん抗原ＮＹ－ＥＳＯ－１１５７－１６５エピトープ（配列番号８）に対するより高い結合親和性を有し、配列番号１のＣＤＲ２に位置する単一アミノ酸置換を有する以外は配列番号１のアミノ酸配列を含む。
特定の実施形態において、改変ＴＣＲのがん抗原ＮＹ－ＥＳＯ－１への結合親和性は、ＷＴ ＴＣＲのがん抗原ＮＹ－ＥＳＯ－１への結合親和性と比較して、約２倍～約１００倍高い。非限定的な例として、改変ＴＣＲのがん抗原ＮＹ－ＥＳＯ－１への結合親和性は、ＷＴ ＴＣＲのがん抗原ＮＹ－ＥＳＯ－１への結合親和性と比較して、約５倍、約１０倍、約１５倍、約２０倍、約２５倍、約３０倍、約３５倍、約４０倍、約４５倍、約５０倍、約５５倍、約６０倍、約６５倍、約７０倍、約７５倍、約８０倍、約８５倍、約９０倍、約９５倍、または１００倍以上高い。様々な実施形態において、エピトープはＮＹ－ＥＳＯ－１１５７－１６５である。
一実施形態では、改変ＴＣＲのがん抗原ＮＹ－ＥＳＯ－１への結合親和性は、ＷＴ ＴＣＲのがん抗原ＮＹ－ＥＳＯ－１への結合親和性と比較して、約５～約７５倍高い。一実施形態では、改変ＴＣＲのがん抗原ＮＹ－ＥＳＯ－１への結合親和性は、ＷＴ ＴＣＲのがん抗原ＮＹ－ＥＳＯ－１への結合親和性と比較して、約１０～約７５倍高い。一実施形態では、改変ＴＣＲのがん抗原ＮＹ－ＥＳＯ－１への結合親和性は、ＷＴ ＴＣＲのがん抗原ＮＹ－ＥＳＯ－１への結合親和性と比較して、約２５～約７５倍高い。一実施形態では、改変ＴＣＲのがん抗原ＮＹ－ＥＳＯ－１への結合親和性は、ＷＴ ＴＣＲのがん抗原ＮＹ－ＥＳＯ－１への結合親和性と比較して、約４０～約７５倍高い。一実施形態では、改変ＴＣＲのがん抗原ＮＹ－ＥＳＯ－１への結合親和性は、ＷＴ ＴＣＲのがん抗原ＮＹ－ＥＳＯ－１への結合親和性と比較して、約４０～約６０倍高い。一実施形態では、改変ＴＣＲのがん抗原ＮＹ－ＥＳＯ－１への結合親和性は、ＷＴ ＴＣＲのがん抗原ＮＹ－ＥＳＯ－１への結合親和性と比較して、約４０～約５０倍高い。一実施形態では、改変ＴＣＲのがん抗原ＮＹ－ＥＳＯ－１への結合親和性は、ＷＴ ＴＣＲのがん抗原ＮＹ－ＥＳＯ－１への結合親和性と比較して約５０倍高い。様々な実施形態において、エピトープはＮＹ－ＥＳＯ－１１５７－１６５である。
解離定数（ＫＤ）を使用して、改変ＴＣＲのがん抗原ＮＹ－ＥＳＯ－１への結合親和性を評価することができる。特定の実施形態において、がん抗原ＮＹ－ＥＳＯ－１に対する改変ＴＣＲの解離定数（ＫＤ）は、約０．１～約１０μＭの間である。非限定的な例として、がん抗原ＮＹ－ＥＳＯ－１に対する改変ＴＣＲの解離定数（ＫＤ）は、約０．１μＭ、約０．２μＭ、約０．３μＭ、約０．４μＭ、約０．５μＭ、約０．６μＭ、約０．７μＭ、約０．８μＭ、約０．９μＭ、約１μＭ、約１．２μＭ、約１．５μＭ、約１．７μＭ、約２μＭ、約２．２μＭ、約２．５μＭ、約２．７μＭ、約３μＭ、約３．２μＭ、約３．５μＭ、約３．７μＭ、約３．９μＭ、約４μＭ、約４．２μＭ、約４．５μＭ、約５μＭ、約５．５μＭ、約６μＭ、約６．５μＭ、約７μＭ、約７．５μＭ、約８μＭ、約８．５μＭ、約９μＭ、約９．５μＭ、または約１０μＭであり得る。様々な実施形態において、エピトープはＮＹ－ＥＳＯ－１１５７－１６５である。
一実施形態では、がん抗原ＮＹ－ＥＳＯ－１に対する改変ＴＣＲの解離定数（ＫＤ）は、約０．３～約４．５μＭの間である。一実施形態では、がん抗原ＮＹ－ＥＳＯ－１に対する改変ＴＣＲの解離定数（ＫＤ）は、約０．３～約２μＭの間である。一実施形態では、がん抗原ＮＹ－ＥＳＯ－１に対する改変ＴＣＲの解離定数（ＫＤ）は、約２～約３μＭの間である。一実施形態では、がん抗原ＮＹ－ＥＳＯ－１に対する改変ＴＣＲの解離定数（ＫＤ）は、約３～約４μＭの間である。一実施形態では、がん抗原ＮＹ－ＥＳＯ－１に対する改変ＴＣＲの解離定数（ＫＤ）は約０．４μＭである。一実施形態では、がん抗原ＮＹ－ＥＳＯ－１に対する改変ＴＣＲの解離定数（ＫＤ）は約０．４１μＭである。一実施形態では、がん抗原ＮＹ－ＥＳＯ－１に対する改変ＴＣＲは約３．９μＭである。一実施形態では、がん抗原ＮＹ－ＥＳＯ－１に対する改変ＴＣＲの解離定数（ＫＤ）は約３．８９μＭである。様々な実施形態において、エピトープはＮＹ－ＥＳＯ－１１５７－１６５である。
特定の実施形態において、改変ＴＣＲは、ＴＣＲのβ鎖のＣＤＲ２の残基５３に位置する単一アミノ酸置換を含む。単一アミノ酸置換には、Ｉ５３Ｅ、Ｉ５３ＦおよびＩ５３Ｗが含まれ得るが、これらに限定されない。
特定の実施形態において、改変ＴＣＲは、ＴＣＲのβ鎖のＣＤＲ２の残基５５に位置する単一アミノ酸置換を含む。単一アミノ酸置換には、Ｄ５５Ｅが含まれ得るが、これに限定されない。
特定の実施形態において、改変ＴＣＲは、ＴＣＲのβ鎖のＣＤＲ２の残基５０、５１、または５２に位置する単一アミノ酸置換を含む。単一アミノ酸置換には、Ｇ５０Ｖ、Ｇ５０Ａ、Ａ５１Ｄ、Ａ５１Ｅ、またはＧ５２Ｑが含まれ得るが、これらに限定されない。
特定の実施形態では、改変ＴＣＲのβ鎖配列は、改変ＴＣＲのβ鎖またはその機能的断片のＣＤＲ２領域の外側で、非置換ＷＴ ＴＣＲのβ鎖またはその機能的断片と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、改変ＴＣＲのβ鎖またはその機能的断片は、非置換ＷＴ ＴＣＲのβ鎖またはその機能的断片のアミノ酸配列においてＣＤＲ２領域に単一アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、非置換ＷＴ ＴＣＲのβ鎖は、配列番号１のアミノ酸配列を含む。
特定の実施形態において、改変ＴＣＲは、配列番号２～５のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、改変ＴＣＲは、配列番号２のアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、改変ＴＣＲは、配列番号３のアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、改変ＴＣＲは、配列番号４のアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、改変ＴＣＲは、配列番号５のアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。上記の実施形態のいずれかにおいて、改変ＴＣＲは、非置換ＷＴ ＴＣＲのβ鎖（例えば、配列番号１に記載される）と比較して、β鎖のＣＤＲ２内に単一アミノ酸置換を含む。
特定の実施形態において、改変ＴＣＲは、配列番号２～５のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、改変ＴＣＲは、配列番号２のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、改変ＴＣＲは、配列番号３のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、改変ＴＣＲは、配列番号４のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、改変ＴＣＲは、配列番号５のアミノ酸配列を含む。
特定の実施形態において、改変ＴＣＲは、配列番号１１～１４のいずれか１つから選択されたヌクレオチド配列に対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、改変ＴＣＲは、配列番号１１のヌクレオチド配列に対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、改変ＴＣＲは、配列番号１２のヌクレオチド配列に対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、改変ＴＣＲは、配列番号１３のヌクレオチド配列に対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、改変ＴＣＲは、配列番号１４のヌクレオチド配列に対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含む。上記の実施形態のいずれかにおいて、改変ＴＣＲは、非置換ＷＴ ＴＣＲのβ鎖（例えば、配列番号１に記載される）と比較して、β鎖のＣＤＲ２内に単一アミノ酸置換を含む。
特定の実施形態において、改変ＴＣＲは、配列番号１１～１４のいずれか１つから選択されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、改変ＴＣＲは、配列番号１１のヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、改変ＴＣＲは、配列番号１２のヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、改変ＴＣＲは、配列番号１３のヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、改変ＴＣＲは、配列番号１４のヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含む。
一態様では、本発明は、配列番号７のアミノ酸配列を含むα鎖、および配列番号２～５のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むβ鎖を含む、改変Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を提供する。一実施形態では、改変Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）は、配列番号７のアミノ酸配列を含むα鎖、および配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むβ鎖を含む。一実施形態では、改変Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）は、配列番号７のアミノ酸配列を含むα鎖、および配列番号３のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むβ鎖を含む。一実施形態では、改変Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）は、配列番号７のアミノ酸配列を含むα鎖、および配列番号４のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むβ鎖を含む。一実施形態では、改変Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）は、配列番号７のアミノ酸配列を含むα鎖、および配列番号５のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性７５％を有するアミノ酸配列を含むβ鎖を含む。上記の実施形態のいずれかにおいて、改変ＴＣＲは、非置換ＷＴ ＴＣＲのβ鎖（例えば、配列番号１に記載される）と比較して、β鎖のＣＤＲ２内に単一アミノ酸置換を含む。
一態様では、本発明は、配列番号７のアミノ酸配列を含むα鎖、および配列番号２～５のいずれか１つのアミノ酸配列を含むβ鎖を含む改変Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を提供する。一実施形態では、改変Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）は、配列番号７のアミノ酸配列を含むα鎖、および配列番号２のアミノ酸配列を含むβ鎖を含む。一実施形態では、改変Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）は、配列番号７のアミノ酸配列を含むα鎖、および配列番号３のアミノ酸配列を含むβ鎖を含む。一実施形態では、改変Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）は、配列番号７のアミノ酸配列を含むα鎖、および配列番号４のアミノ酸配列を含むβ鎖を含む。一実施形態では、改変Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）は、配列番号７のアミノ酸配列を含むα鎖、および配列番号５のアミノ酸配列を含むβ鎖を含む。
一態様では、本発明は、配列番号９のヌクレオチド配列によってコードされるα鎖、および配列番号１１～１４のいずれか１つから選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされるβ鎖を含む改変Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を提供する。一実施形態では、改変Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）は、配列番号９のヌクレオチド配列によってコードされるα鎖、および配列配列番号１１のヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するヌクレオチドによってコードされるβ鎖を含む。一実施形態では、改変Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）は、配列番号９のヌクレオチド配列によってコードされるα鎖、および配列番号１２のヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされるβ鎖を含む。一実施形態では、改変Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）は、配列番号９のヌクレオチド配列によってコードされるα鎖、および配列番号１３のヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされるβ鎖を含む。一実施形態では、改変Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）は、配列番号９のヌクレオチド配列によってコードされるα鎖、および配列番号１４のヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされるβ鎖を含む。上記の実施形態のいずれかにおいて、改変ＴＣＲは、非置換ＷＴ ＴＣＲのβ鎖（例えば、配列番号１に記載される）と比較して、β鎖のＣＤＲ２内に単一アミノ酸置換を含む。
一態様では、本発明は、配列番号９のヌクレオチド配列によってコードされるα鎖、および配列番号１１～１４のいずれかのヌクレオチド配列によってコードされるβ鎖を含む改変Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を提供する。一実施形態では、改変Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）は、配列番号９のヌクレオチド配列によってコードされるα鎖、および配列番号１１のヌクレオチド配列によってコードされるβ鎖を含む。一実施形態では、改変Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）は、配列番号９のヌクレオチド配列によってコードされるα鎖、および配列番号１２のヌクレオチド配列によってコードされるβ鎖を含む。一実施形態では、改変Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）は、配列番号９のヌクレオチド配列によってコードされるα鎖、および配列番号１３のヌクレオチド配列によってコードされるβ鎖を含む。一実施形態では、改変Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）は、配列番号９のヌクレオチド配列によってコードされるα鎖、および配列番号１４のヌクレオチド配列によってコードされるβ鎖を含む。
本発明はまた、関連するポリペプチドおよびタンパク質、ならびに関連する核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞、および遺伝子操作された細胞を含むがこれらに限定されない細胞の集団を提供する。
一態様では、本発明は、本明細書に記載の改変ＴＣＲの機能的部分を含む単離ポリペプチドを提供し、機能的部分は、ＴＣＲのα鎖およびβ鎖の可変領域を含み、機能的部分はアミノ酸置換を含む。特定の実施形態において、単離ポリペプチドは、配列番号２～５から選択されるアミノ酸配列を含む。
一態様では、本発明は、本明細書に記載の改変ＴＣＲの機能的部分を含む単離ポリペプチドを提供し、機能的部分は、ＴＣＲのα鎖およびβ鎖の定常領域をさらに含む。特定の実施形態では、定常領域はヒト起源のものである。他の実施形態では、定常領域はマウス起源である。
一態様では、本発明は、本明細書に記載の改変ＴＣＲのアミノ酸配列のいずれかをコードする核酸配列を提供する。
保存的アミノ酸置換が本明細書に記載されるもののいずれかのポリペプチドに導入され、例えば、参照配列に対して７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の配列同一性を有し、好ましくはその配列の活性を保持するポリペプチドを達成し得ることが理解されるであろう。当技術分野で公知であり本明細書で言及される保存的アミノ酸置換は、タンパク質中のアミノ酸を、例えば、構造、サイズ、および／または化学的特性に関して類似の側鎖を有するアミノ酸で置換することを含む。例えば、以下の各グループ内のアミノ酸は、同じグループ内の他のアミノ酸と交換することができる：グリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシンを含む、脂肪族側鎖を有するアミノ酸；セリンおよびスレオニンなどの、非芳香族のヒドロキシル含有側鎖を有するアミノ酸；アスパラギン酸およびグルタミン酸などの、酸性側鎖を有するアミノ酸；グルタミンおよびアスパラギンを含む、アミド側鎖を有するアミノ酸；リシン、アルギニンおよびヒスチジンを含む、塩基性アミノ酸；フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンを含む、芳香族環側鎖を有するアミノ酸；システインおよびメチオニンを含む、硫黄含有側鎖を有するアミノ酸。さらには、アスパラギン酸およびグルタミン酸などの酸性側鎖を有するアミノ酸は、本明細書では、アスパラギンおよびグルタミンなどのアミド側鎖を有するアミノ酸と交換可能であると考えられる。
本発明の様々な実施形態において有用な配列の例を以下に提供する。
ＢＣ１ ＷＴ β鎖
ＭＡＰＲＬＬＣＣＡＡＬＳＬＬＷＡＧＰＶＮＡＧＶＴＱＴＰＫＦＱＶＬＫＴＧＱＳＭＴＬＱＣＡＱＤＭＮＨＥＹＭＳＷＹＲＱＤＰＧＭＧＬＲＬＩＨＹＳＶＧＡＧＩＴＤＱＧＥＶＰＮＧＹＮＶＳＲＳＴＴＥＤＦＰＬＲＬＬＳＡＡＰＳＱＴＳＶＹＦＣＡＳＳＹＶＧＡＡＧＥＬＦＦＧＥＧＳＲＬＴＶＬＥＤＬＮＫＶＦＰＰＥＶＡＶＦＥＰＳＥＡＥＩＳＨＴＱＫＡＴＬＶＣＬＡＴＧＦＦＰＤＨＶＥＬＳＷＷＶＮＧＫＥＶＨＳＧＶＳＴＤＰＱＰＬＫＥＱＰＡＬＮＤＳＲＹＣＬＳＳＲＬＲＶＳＡＴＦＷＱＮＰＲＮＨＦＲＣＱＶＱＦＹＧＬＳＥＮＤＥＷＴＱＤＲＡＫＰＶＴＱＩＶＳＡＥＡＷＧＲＡＤＣＧＦＴＳＶＳＹＱＱＧＶＬＳＡＴＩＬＹＥＩＬＬＧＫＡＴＬＹＡＶＬＶＳＡＬＶＬＭＡＭＶＫＲＫＤＳＲＧ＊（配列番号１）
Ｉ５３Ｅ β鎖
ＭＡＰＲＬＬＣＣＡＡＬＳＬＬＷＡＧＰＶＮＡＧＶＴＱＴＰＫＦＱＶＬＫＴＧＱＳＭＴＬＱＣＡＱＤＭＮＨＥＹＭＳＷＹＲＱＤＰＧＭＧＬＲＬＩＨＹＳＶＧＡＧＥＴＤＱＧＥＶＰＮＧＹＮＶＳＲＳＴＴＥＤＦＰＬＲＬＬＳＡＡＰＳＱＴＳＶＹＦＣＡＳＳＹＶＧＡＡＧＥＬＦＦＧＥＧＳＲＬＴＶＬＥＤＬＮＫＶＦＰＰＥＶＡＶＦＥＰＳＥＡＥＩＳＨＴＱＫＡＴＬＶＣＬＡＴＧＦＦＰＤＨＶＥＬＳＷＷＶＮＧＫＥＶＨＳＧＶＳＴＤＰＱＰＬＫＥＱＰＡＬＮＤＳＲＹＣＬＳＳＲＬＲＶＳＡＴＦＷＱＮＰＲＮＨＦＲＣＱＶＱＦＹＧＬＳＥＮＤＥＷＴＱＤＲＡＫＰＶＴＱＩＶＳＡＥＡＷＧＲＡＤＣＧＦＴＳＶＳＹＱＱＧＶＬＳＡＴＩＬＹＥＩＬＬＧＫＡＴＬＹＡＶＬＶＳＡＬＶＬＭＡＭＶＫＲＫＤＳＲＧ＊（配列番号２）
Ｉ５３Ｆ β鎖
ＭＡＰＲＬＬＣＣＡＡＬＳＬＬＷＡＧＰＶＮＡＧＶＴＱＴＰＫＦＱＶＬＫＴＧＱＳＭＴＬＱＣＡＱＤＭＮＨＥＹＭＳＷＹＲＱＤＰＧＭＧＬＲＬＩＨＹＳＶＧＡＧＦＴＤＱＧＥＶＰＮＧＹＮＶＳＲＳＴＴＥＤＦＰＬＲＬＬＳＡＡＰＳＱＴＳＶＹＦＣＡＳＳＹＶＧＡＡＧＥＬＦＦＧＥＧＳＲＬＴＶＬＥＤＬＮＫＶＦＰＰＥＶＡＶＦＥＰＳＥＡＥＩＳＨＴＱＫＡＴＬＶＣＬＡＴＧＦＦＰＤＨＶＥＬＳＷＷＶＮＧＫＥＶＨＳＧＶＳＴＤＰＱＰＬＫＥＱＰＡＬＮＤＳＲＹＣＬＳＳＲＬＲＶＳＡＴＦＷＱＮＰＲＮＨＦＲＣＱＶＱＦＹＧＬＳＥＮＤＥＷＴＱＤＲＡＫＰＶＴＱＩＶＳＡＥＡＷＧＲＡＤＣＧＦＴＳＶＳＹＱＱＧＶＬＳＡＴＩＬＹＥＩＬＬＧＫＡＴＬＹＡＶＬＶＳＡＬＶＬＭＡＭＶＫＲＫＤＳＲＧ＊（配列番号３）
Ｉ５３Ｗ β鎖
ＭＡＰＲＬＬＣＣＡＡＬＳＬＬＷＡＧＰＶＮＡＧＶＴＱＴＰＫＦＱＶＬＫＴＧＱＳＭＴＬＱＣＡＱＤＭＮＨＥＹＭＳＷＹＲＱＤＰＧＭＧＬＲＬＩＨＹＳＶＧＡＧＷＴＤＱＧＥＶＰＮＧＹＮＶＳＲＳＴＴＥＤＦＰＬＲＬＬＳＡＡＰＳＱＴＳＶＹＦＣＡＳＳＹＶＧＡＡＧＥＬＦＦＧＥＧＳＲＬＴＶＬＥＤＬＮＫＶＦＰＰＥＶＡＶＦＥＰＳＥＡＥＩＳＨＴＱＫＡＴＬＶＣＬＡＴＧＦＦＰＤＨＶＥＬＳＷＷＶＮＧＫＥＶＨＳＧＶＳＴＤＰＱＰＬＫＥＱＰＡＬＮＤＳＲＹＣＬＳＳＲＬＲＶＳＡＴＦＷＱＮＰＲＮＨＦＲＣＱＶＱＦＹＧＬＳＥＮＤＥＷＴＱＤＲＡＫＰＶＴＱＩＶＳＡＥＡＷＧＲＡＤＣＧＦＴＳＶＳＹＱＱＧＶＬＳＡＴＩＬＹＥＩＬＬＧＫＡＴＬＹＡＶＬＶＳＡＬＶＬＭＡＭＶＫＲＫＤＳＲＧ＊（配列番号４）
Ｄ５５Ｅ β鎖
ＭＡＰＲＬＬＣＣＡＡＬＳＬＬＷＡＧＰＶＮＡＧＶＴＱＴＰＫＦＱＶＬＫＴＧＱＳＭＴＬＱＣＡＱＤＭＮＨＥＹＭＳＷＹＲＱＤＰＧＭＧＬＲＬＩＨＹＳＶＧＡＧＩＴＥＱＧＥＶＰＮＧＹＮＶＳＲＳＴＴＥＤＦＰＬＲＬＬＳＡＡＰＳＱＴＳＶＹＦＣＡＳＳＹＶＧＡＡＧＥＬＦＦＧＥＧＳＲＬＴＶＬＥＤＬＮＫＶＦＰＰＥＶＡＶＦＥＰＳＥＡＥＩＳＨＴＱＫＡＴＬＶＣＬＡＴＧＦＦＰＤＨＶＥＬＳＷＷＶＮＧＫＥＶＨＳＧＶＳＴＤＰＱＰＬＫＥＱＰＡＬＮＤＳＲＹＣＬＳＳＲＬＲＶＳＡＴＦＷＱＮＰＲＮＨＦＲＣＱＶＱＦＹＧＬＳＥＮＤＥＷＴＱＤＲＡＫＰＶＴＱＩＶＳＡＥＡＷＧＲＡＤＣＧＦＴＳＶＳＹＱＱＧＶＬＳＡＴＩＬＹＥＩＬＬＧＫＡＴＬＹＡＶＬＶＳＡＬＶＬＭＡＭＶＫＲＫＤＳＲＧ＊（配列番号５）
Ａ９７Ｌ β鎖
ＭＡＰＲＬＬＣＣＡＡＬＳＬＬＷＡＧＰＶＮＡＧＶＴＱＴＰＫＦＱＶＬＫＴＧＱＳＭＴＬＱＣＡＱＤＭＮＨＥＹＭＳＷＹＲＱＤＰＧＭＧＬＲＬＩＨＹＳＶＧＡＧＩＴＤＱＧＥＶＰＮＧＹＮＶＳＲＳＴＴＥＤＦＰＬＲＬＬＳＡＡＰＳＱＴＳＶＹＦＣＡＳＳＹＶＧＬＡＧＥＬＦＦＧＥＧＳＲＬＴＶＬＥＤＬＮＫＶＦＰＰＥＶＡＶＦＥＰＳＥＡＥＩＳＨＴＱＫＡＴＬＶＣＬＡＴＧＦＦＰＤＨＶＥＬＳＷＷＶＮＧＫＥＶＨＳＧＶＳＴＤＰＱＰＬＫＥＱＰＡＬＮＤＳＲＹＣＬＳＳＲＬＲＶＳＡＴＦＷＱＮＰＲＮＨＦＲＣＱＶＱＦＹＧＬＳＥＮＤＥＷＴＱＤＲＡＫＰＶＴＱＩＶＳＡＥＡＷＧＲＡＤＣＧＦＴＳＶＳＹＱＱＧＶＬＳＡＴＩＬＹＥＩＬＬＧＫＡＴＬＹＡＶＬＶＳＡＬＶＬＭＡＭＶＫＲＫＤＳＲＧ＊（配列番号６）
ＢＣ１ ＷＴ α鎖
ＭＥＴＬＬＧＬＬＩＬＷＬＱＬＱＷＶＳＳＫＱＥＶＴＱＩＰＡＡＬＳＶＰＥＧＥＮＬＶＬＮＣＳＦＴＤＳＡＩＹＮＬＱＷＦＲＱＤＰＧＫＧＬＴＳＬＬＬＩＱＳＳＱＲＥＱＴＳＧＲＬＮＡＳＬＤＫＳＳＧＲＳＴＬＹＩＡＡＳＱＰＧＤＳＡＴＹＬＣＡＶＲＰＱＴＧＧＳＹＩＰＴＦＧＲＧＴＳＬＩＶＨＰＹＩＱＮＰＤＰＡＶＹＱＬＲＤＳＫＳＳＤＫＳＶＣＬＦＴＤＦＤＳＱＴＮＶＳＱＳＫＤＳＤＶＹＩＴＤＫＴＶＬＤＭＲＳＭＤＦＫＳＮＳＡＶＡＷＳＮＫＳＤＦＡＣＡＮＡＦＮＮＳＩＩＰＥＤＴＦＦＰＳＰＥＳＳＣＤＶＫＬＶＥＫＳＦＥＴＤＴＮＬＮＦＱＮＬＳＶＩＧＦＲＩＬＬＬＫＶＡＧＦＮＬＬＭＴＬＲＬＷＳＳ＊（配列番号７）
ＮＹ－ＥＳＯ－１ １５７－１６５ ペプチド
ＳＬＬＭＷＩＴＱＣ（配列番号８）
ＢＣ１ ＷＴ α鎖
ＡＴＧＧＡＡＡＣＣＣＴＧＣＴＧＧＧＣＣＴＧＣＴＧＡＴＣＣＴＧＴＧＧＣＴＧＣＡＧＣＴＧＣＡＧＴＧＧＧＴＧＴＣＣＡＧＣＡＡＧＣＡＧＧＡＡＧＴＧＡＣＣＣＡＧＡＴＣＣＣＴＧＣＣＧＣＣＣＴＧＡＧＣＧＴＧＣＣＣＧＡＧＧＧＣＧＡＧＡＡＣＣＴＧＧＴＧＣＴＧＡＡＣＴＧＣＡＧＣＴＴＣＡＣＣＧＡＣＡＧＣＧＣＣＡＴＣＴＡＣＡＡＣＣＴＧＣＡＧＴＧＧＴＴＣＣＧＧＣＡＧＧＡＣＣＣＣＧＧＣＡＡＧＧＧＣＣＴＧＡＣＣＡＧＣＣＴＧＣＴＧＣＴＧＡＴＣＣＡＧＡＧＣＡＧＣＣＡＧＣＧＧＧＡＧＣＡＧＡＣＣＡＧＣＧＧＣＡＧＧＣＴＧＡＡＣＧＣＣＡＧＣＣＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＣＧＧＣＡＧＡＡＧＣＡＣＣＣＴＧＴＡＣＡＴＣＧＣＣＧＣＣＡＧＣＣＡＧＣＣＣＧＧＣＧＡＣＴＣＣＧＣＣＡＣＣＴＡＣＣＴＧＴＧＣＧＣＣＧＴＧＣＧＧＣＣＴＣＡＧＡＣＣＧＧＣＧＧＣＡＧＣＴＡＣＡＴＣＣＣＣＡＣＣＴＴＣＧＧＣＡＧＧＧＧＣＡＣＣＡＧＣＣＴＧＡＴＣＧＴＧＣＡＣＣＣＣＴＡＣＡＴＣＣＡＧＡＡＣＣＣＣＧＡＣＣＣＣＧＣＣＧＴＧＴＡＣＣＡＧＣＴＧＣＧＧＧＡＣＡＧＣＡＡＧＴＣＣＡＧＣＧＡＣＡＡＧＡＧＣＧＴＧＴＧＣＣＴＧＴＴＣＡＣＣＧＡＣＴＴＣＧＡＣＡＧＣＣＡＧＡＣＣＡＡＣＧＴＧＡＧＣＣＡＧＡＧＣＡＡＧＧＡＣＡＧＣＧＡＣＧＴＧＴＡＣＡＴＣＡＣＣＧＡＣＡＡＧＡＣＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＡＴＧＣＧＧＡＧＣＡＴＧＧＡＣＴＴＣＡＡＧＡＧＣＡＡＣＡＧＣＧＣＣＧＴＧＧＣＣＴＧＧＴＣＣＡＡＣＡＡＧＡＧＣＧＡＣＴＴＣＧＣＣＴＧＣＧＣＣＡＡＣＧＣＣＴＴＣＡＡＣＡＡＣＡＧＣＡＴＣＡＴＣＣＣＣＧＡＧＧＡＣＡＣＣＴＴＴＴＴＣＣＣＣＡＧＣＣＣＣＧＡＧＡＧＣＡＧＣＴＧＣＧＡＣＧＴＧＡＡＡＣＴＧＧＴＧＧＡＧＡＡＧＡＧＣＴＴＣＧＡＧＡＣＣＧＡＣＡＣＣＡＡＣＣＴＧＡＡＣＴＴＣＣＡＧＡＡＣＣＴＧＡＧＣＧＴＧＡＴＣＧＧＣＴＴＣＡＧＡＡＴＴＣＴＧＣＴＧＣＴＧＡＡＧＧＴＧＧＣＣＧＧＣＴＴＣＡＡＣＣＴＧＣＴＧＡＴＧＡＣＣＣＴＧＣＧＧＣＴＧＴＧＧＡＧＣＡＧＴ（配列番号９）
ＢＣ１ ＷＴ β鎖
ＡＴＧＧＣＣＣＣＧＣＧＧＣＴＧＣＴＧＴＧＴＴＧＴＧＣＣＧＣＣＣＴＧＡＧＣＣＴＧＣＴＧＴＧＧＧＣＣＧＧＡＣＣＴＧＴＧＡＡＣＧＣＣＧＧＣＧＴＧＡＣＣＣＡＧＡＣＣＣＣＣＡＡＧＴＴＣＣＡＧＧＴＧＣＴＧＡＡＡＡＣＣＧＧＣＣＡＧＡＧＣＡＴＧＡＣＣＣＴＧＣＡＧＴＧＣＧＣＣＣＡＧＧＡＣＡＴＧＡＡＣＣＡＣＧＡＧＴＡＣＡＴＧＡＧＣＴＧＧＴＡＣＡＧＧＣＡＧＧＡＣＣＣＣＧＧＣＡＴＧＧＧＣＣＴＧＣＧＧＣＴＧＡＴＣＣＡＣＴＡＣＡＧＣＧＴＧＧＧＡＧＣＣＧＧＣＡＴＣＡＣＣＧＡＣＣＡＧＧＧＣＧＡＧＧＴＧＣＣＣＡＡＣＧＧＣＴＡＣＡＡＣＧＴＧＡＧＣＡＧＡＡＧＣＡＣＣＡＣＣＧＡＧＧＡＣＴＴＣＣＣＣＣＴＧＡＧＧＣＴＧＣＴＧＴＣＴＧＣＣＧＣＣＣＣＴＡＧＣＣＡＧＡＣＣＡＧＣＧＴＧＴＡＣＴＴＣＴＧＣＧＣＣＡＧＣＡＧＣＴＡＴＧＴＧＧＧＡＧＣＣＧＣＣＧＧＡＧＡＧＣＴＧＴＴＣＴＴＣＧＧＣＧＡＧＧＧＣＡＧＣＣＧＧＣＴＧＡＣＣＧＴＧＣＴＧＧＡＡＧＡＴＣＴＧＡＡＣＡＡＡＧＴＧＴＴＣＣＣＣＣＣＣＧＡＡＧＴＧＧＣＣＧＴＧＴＴＣＧＡＧＣＣＣＡＧＣＧＡＧＧＣＣＧＡＧＡＴＣＡＧＣＣＡＣＡＣＣＣＡＧＡＡＧＧＣＣＡＣＣＣＴＧＧＴＧＴＧＴＣＴＧＧＣＣＡＣＣＧＧＣＴＴＣＴＴＣＣＣＣＧＡＣＣＡＣＧＴＧＧＡＧＣＴＧＴＣＣＴＧＧＴＧＧＧＴＧＡＡＣＧＧＣＡＡＧＧＡＡＧＴＧＣＡＣＡＧＣＧＧＣＧＴＧＴＣＣＡＣＣＧＡＣＣＣＣＣＡＧＣＣＣＣＴＧＡＡＧＧＡＧＣＡＧＣＣＣＧＣＣＣＴＧＡＡＣＧＡＴＡＧＣＡＧＡＴＡＣＴＧＣＣＴＧＡＧＣＡＧＣＣＧＧＣＴＧＡＧＡＧＴＧＡＧＣＧＣＣＡＣＣＴＴＣＴＧＧＣＡＧＡＡＣＣＣＣＣＧＧＡＡＣＣＡＣＴＴＣＡＧＡＴＧＣＣＡＧＧＴＧＣＡＧＴＴＣＴＡＣＧＧＣＣＴＧＡＧＣＧＡＧＡＡＣＧＡＣＧＡＧＴＧＧＡＣＣＣＡＧＧＡＴＡＧＡＧＣＣＡＡＧＣＣＣＧＴＧＡＣＣＣＡＧＡＴＣＧＴＧＴＣＣＧＣＣＧＡＧＧＣＣＴＧＧＧＧＣＡＧＡＧＣＣＧＡＣＴＧＣＧＧＣＴＴＣＡＣＣＡＧＣＧＴＧＴＣＣＴＡＣＣＡＧＣＡＧＧＧＣＧＴＧＣＴＧＡＧＣＧＣＣＡＣＡＡＴＣＣＴＧＴＡＣＧＡＧＡＴＣＣＴＧＣＴＧＧＧＣＡＡＧＧＣＣＡＣＡＣＴＧＴＡＣＧＣＣＧＴＧＣＴＧＧＴＧＴＣＣＧＣＣＣＴＧＧＴＧＣＴＧＡＴＧＧＣＴＡＴＧＧＴＧＡＡＧＣＧＧＡＡＧＧＡＣＡＧＣＡＧＧＧＧＣＴＧＡ（配列番号１０）
Ｉ５３Ｅ β鎖
ＡＴＧＧＣＣＣＣＧＣＧＧＣＴＧＣＴＧＴＧＴＴＧＴＧＣＣＧＣＣＣＴＧＡＧＣＣＴＧＣＴＧＴＧＧＧＣＣＧＧＡＣＣＴＧＴＧＡＡＣＧＣＣＧＧＣＧＴＧＡＣＣＣＡＧＡＣＣＣＣＣＡＡＧＴＴＣＣＡＧＧＴＧＣＴＧＡＡＡＡＣＣＧＧＣＣＡＧＡＧＣＡＴＧＡＣＣＣＴＧＣＡＧＴＧＣＧＣＣＣＡＧＧＡＣＡＴＧＡＡＣＣＡＣＧＡＧＴＡＣＡＴＧＡＧＣＴＧＧＴＡＣＡＧＧＣＡＧＧＡＣＣＣＣＧＧＣＡＴＧＧＧＣＣＴＧＣＧＧＣＴＧＡＴＣＣＡＣＴＡＣＡＧＣＧＴＧＧＧＡＧＣＣＧＧＣＧＡＧＡＣＣＧＡＣＣＡＧＧＧＣＧＡＧＧＴＧＣＣＣＡＡＣＧＧＣＴＡＣＡＡＣＧＴＧＡＧＣＡＧＡＡＧＣＡＣＣＡＣＣＧＡＧＧＡＣＴＴＣＣＣＣＣＴＧＡＧＧＣＴＧＣＴＧＴＣＴＧＣＣＧＣＣＣＣＴＡＧＣＣＡＧＡＣＣＡＧＣＧＴＧＴＡＣＴＴＣＴＧＣＧＣＣＡＧＣＡＧＣＴＡＴＧＴＧＧＧＡＧＣＣＧＣＣＧＧＡＧＡＧＣＴＧＴＴＣＴＴＣＧＧＣＧＡＧＧＧＣＡＧＣＣＧＧＣＴＧＡＣＣＧＴＧＣＴＧＧＡＡＧＡＴＣＴＧＡＡＣＡＡＡＧＴＧＴＴＣＣＣＣＣＣＣＧＡＡＧＴＧＧＣＣＧＴＧＴＴＣＧＡＧＣＣＣＡＧＣＧＡＧＧＣＣＧＡＧＡＴＣＡＧＣＣＡＣＡＣＣＣＡＧＡＡＧＧＣＣＡＣＣＣＴＧＧＴＧＴＧＴＣＴＧＧＣＣＡＣＣＧＧＣＴＴＣＴＴＣＣＣＣＧＡＣＣＡＣＧＴＧＧＡＧＣＴＧＴＣＣＴＧＧＴＧＧＧＴＧＡＡＣＧＧＣＡＡＧＧＡＡＧＴＧＣＡＣＡＧＣＧＧＣＧＴＧＴＣＣＡＣＣＧＡＣＣＣＣＣＡＧＣＣＣＣＴＧＡＡＧＧＡＧＣＡＧＣＣＣＧＣＣＣＴＧＡＡＣＧＡＴＡＧＣＡＧＡＴＡＣＴＧＣＣＴＧＡＧＣＡＧＣＣＧＧＣＴＧＡＧＡＧＴＧＡＧＣＧＣＣＡＣＣＴＴＣＴＧＧＣＡＧＡＡＣＣＣＣＣＧＧＡＡＣＣＡＣＴＴＣＡＧＡＴＧＣＣＡＧＧＴＧＣＡＧＴＴＣＴＡＣＧＧＣＣＴＧＡＧＣＧＡＧＡＡＣＧＡＣＧＡＧＴＧＧＡＣＣＣＡＧＧＡＴＡＧＡＧＣＣＡＡＧＣＣＣＧＴＧＡＣＣＣＡＧＡＴＣＧＴＧＴＣＣＧＣＣＧＡＧＧＣＣＴＧＧＧＧＣＡＧＡＧＣＣＧＡＣＴＧＣＧＧＣＴＴＣＡＣＣＡＧＣＧＴＧＴＣＣＴＡＣＣＡＧＣＡＧＧＧＣＧＴＧＣＴＧＡＧＣＧＣＣＡＣＡＡＴＣＣＴＧＴＡＣＧＡＧＡＴＣＣＴＧＣＴＧＧＧＣＡＡＧＧＣＣＡＣＡＣＴＧＴＡＣＧＣＣＧＴＧＣＴＧＧＴＧＴＣＣＧＣＣＣＴＧＧＴＧＣＴＧＡＴＧＧＣＴＡＴＧＧＴＧＡＡＧＣＧＧＡＡＧＧＡＣＡＧＣＡＧＧＧＧＣＴＧＡ（配列番号１１）
Ｉ５３Ｆ β鎖
ＡＴＧＧＣＣＣＣＧＣＧＧＣＴＧＣＴＧＴＧＴＴＧＴＧＣＣＧＣＣＣＴＧＡＧＣＣＴＧＣＴＧＴＧＧＧＣＣＧＧＡＣＣＴＧＴＧＡＡＣＧＣＣＧＧＣＧＴＧＡＣＣＣＡＧＡＣＣＣＣＣＡＡＧＴＴＣＣＡＧＧＴＧＣＴＧＡＡＡＡＣＣＧＧＣＣＡＧＡＧＣＡＴＧＡＣＣＣＴＧＣＡＧＴＧＣＧＣＣＣＡＧＧＡＣＡＴＧＡＡＣＣＡＣＧＡＧＴＡＣＡＴＧＡＧＣＴＧＧＴＡＣＡＧＧＣＡＧＧＡＣＣＣＣＧＧＣＡＴＧＧＧＣＣＴＧＣＧＧＣＴＧＡＴＣＣＡＣＴＡＣＡＧＣＧＴＧＧＧＡＧＣＣＧＧＣＴＴＣＡＣＣＧＡＣＣＡＧＧＧＣＧＡＧＧＴＧＣＣＣＡＡＣＧＧＣＴＡＣＡＡＣＧＴＧＡＧＣＡＧＡＡＧＣＡＣＣＡＣＣＧＡＧＧＡＣＴＴＣＣＣＣＣＴＧＡＧＧＣＴＧＣＴＧＴＣＴＧＣＣＧＣＣＣＣＴＡＧＣＣＡＧＡＣＣＡＧＣＧＴＧＴＡＣＴＴＣＴＧＣＧＣＣＡＧＣＡＧＣＴＡＴＧＴＧＧＧＡＧＣＣＧＣＣＧＧＡＧＡＧＣＴＧＴＴＣＴＴＣＧＧＣＧＡＧＧＧＣＡＧＣＣＧＧＣＴＧＡＣＣＧＴＧＣＴＧＧＡＡＧＡＴＣＴＧＡＡＣＡＡＡＧＴＧＴＴＣＣＣＣＣＣＣＧＡＡＧＴＧＧＣＣＧＴＧＴＴＣＧＡＧＣＣＣＡＧＣＧＡＧＧＣＣＧＡＧＡＴＣＡＧＣＣＡＣＡＣＣＣＡＧＡＡＧＧＣＣＡＣＣＣＴＧＧＴＧＴＧＴＣＴＧＧＣＣＡＣＣＧＧＣＴＴＣＴＴＣＣＣＣＧＡＣＣＡＣＧＴＧＧＡＧＣＴＧＴＣＣＴＧＧＴＧＧＧＴＧＡＡＣＧＧＣＡＡＧＧＡＡＧＴＧＣＡＣＡＧＣＧＧＣＧＴＧＴＣＣＡＣＣＧＡＣＣＣＣＣＡＧＣＣＣＣＴＧＡＡＧＧＡＧＣＡＧＣＣＣＧＣＣＣＴＧＡＡＣＧＡＴＡＧＣＡＧＡＴＡＣＴＧＣＣＴＧＡＧＣＡＧＣＣＧＧＣＴＧＡＧＡＧＴＧＡＧＣＧＣＣＡＣＣＴＴＣＴＧＧＣＡＧＡＡＣＣＣＣＣＧＧＡＡＣＣＡＣＴＴＣＡＧＡＴＧＣＣＡＧＧＴＧＣＡＧＴＴＣＴＡＣＧＧＣＣＴＧＡＧＣＧＡＧＡＡＣＧＡＣＧＡＧＴＧＧＡＣＣＣＡＧＧＡＴＡＧＡＧＣＣＡＡＧＣＣＣＧＴＧＡＣＣＣＡＧＡＴＣＧＴＧＴＣＣＧＣＣＧＡＧＧＣＣＴＧＧＧＧＣＡＧＡＧＣＣＧＡＣＴＧＣＧＧＣＴＴＣＡＣＣＡＧＣＧＴＧＴＣＣＴＡＣＣＡＧＣＡＧＧＧＣＧＴＧＣＴＧＡＧＣＧＣＣＡＣＡＡＴＣＣＴＧＴＡＣＧＡＧＡＴＣＣＴＧＣＴＧＧＧＣＡＡＧＧＣＣＡＣＡＣＴＧＴＡＣＧＣＣＧＴＧＣＴＧＧＴＧＴＣＣＧＣＣＣＴＧＧＴＧＣＴＧＡＴＧＧＣＴＡＴＧＧＴＧＡＡＧＣＧＧＡＡＧＧＡＣＡＧＣＡＧＧＧＧＣＴＧＡ（配列番号１２）
Ｉ５３Ｗ β鎖
ＡＴＧＧＣＣＣＣＧＣＧＧＣＴＧＣＴＧＴＧＴＴＧＴＧＣＣＧＣＣＣＴＧＡＧＣＣＴＧＣＴＧＴＧＧＧＣＣＧＧＡＣＣＴＧＴＧＡＡＣＧＣＣＧＧＣＧＴＧＡＣＣＣＡＧＡＣＣＣＣＣＡＡＧＴＴＣＣＡＧＧＴＧＣＴＧＡＡＡＡＣＣＧＧＣＣＡＧＡＧＣＡＴＧＡＣＣＣＴＧＣＡＧＴＧＣＧＣＣＣＡＧＧＡＣＡＴＧＡＡＣＣＡＣＧＡＧＴＡＣＡＴＧＡＧＣＴＧＧＴＡＣＡＧＧＣＡＧＧＡＣＣＣＣＧＧＣＡＴＧＧＧＣＣＴＧＣＧＧＣＴＧＡＴＣＣＡＣＴＡＣＡＧＣＧＴＧＧＧＡＧＣＣＧＧＣＴＧＧＡＣＣＧＡＣＣＡＧＧＧＣＧＡＧＧＴＧＣＣＣＡＡＣＧＧＣＴＡＣＡＡＣＧＴＧＡＧＣＡＧＡＡＧＣＡＣＣＡＣＣＧＡＧＧＡＣＴＴＣＣＣＣＣＴＧＡＧＧＣＴＧＣＴＧＴＣＴＧＣＣＧＣＣＣＣＴＡＧＣＣＡＧＡＣＣＡＧＣＧＴＧＴＡＣＴＴＣＴＧＣＧＣＣＡＧＣＡＧＣＴＡＴＧＴＧＧＧＡＧＣＣＧＣＣＧＧＡＧＡＧＣＴＧＴＴＣＴＴＣＧＧＣＧＡＧＧＧＣＡＧＣＣＧＧＣＴＧＡＣＣＧＴＧＣＴＧＧＡＡＧＡＴＣＴＧＡＡＣＡＡＡＧＴＧＴＴＣＣＣＣＣＣＣＧＡＡＧＴＧＧＣＣＧＴＧＴＴＣＧＡＧＣＣＣＡＧＣＧＡＧＧＣＣＧＡＧＡＴＣＡＧＣＣＡＣＡＣＣＣＡＧＡＡＧＧＣＣＡＣＣＣＴＧＧＴＧＴＧＴＣＴＧＧＣＣＡＣＣＧＧＣＴＴＣＴＴＣＣＣＣＧＡＣＣＡＣＧＴＧＧＡＧＣＴＧＴＣＣＴＧＧＴＧＧＧＴＧＡＡＣＧＧＣＡＡＧＧＡＡＧＴＧＣＡＣＡＧＣＧＧＣＧＴＧＴＣＣＡＣＣＧＡＣＣＣＣＣＡＧＣＣＣＣＴＧＡＡＧＧＡＧＣＡＧＣＣＣＧＣＣＣＴＧＡＡＣＧＡＴＡＧＣＡＧＡＴＡＣＴＧＣＣＴＧＡＧＣＡＧＣＣＧＧＣＴＧＡＧＡＧＴＧＡＧＣＧＣＣＡＣＣＴＴＣＴＧＧＣＡＧＡＡＣＣＣＣＣＧＧＡＡＣＣＡＣＴＴＣＡＧＡＴＧＣＣＡＧＧＴＧＣＡＧＴＴＣＴＡＣＧＧＣＣＴＧＡＧＣＧＡＧＡＡＣＧＡＣＧＡＧＴＧＧＡＣＣＣＡＧＧＡＴＡＧＡＧＣＣＡＡＧＣＣＣＧＴＧＡＣＣＣＡＧＡＴＣＧＴＧＴＣＣＧＣＣＧＡＧＧＣＣＴＧＧＧＧＣＡＧＡＧＣＣＧＡＣＴＧＣＧＧＣＴＴＣＡＣＣＡＧＣＧＴＧＴＣＣＴＡＣＣＡＧＣＡＧＧＧＣＧＴＧＣＴＧＡＧＣＧＣＣＡＣＡＡＴＣＣＴＧＴＡＣＧＡＧＡＴＣＣＴＧＣＴＧＧＧＣＡＡＧＧＣＣＡＣＡＣＴＧＴＡＣＧＣＣＧＴＧＣＴＧＧＴＧＴＣＣＧＣＣＣＴＧＧＴＧＣＴＧＡＴＧＧＣＴＡＴＧＧＴＧＡＡＧＣＧＧＡＡＧＧＡＣＡＧＣＡＧＧＧＧＣＴＧＡ（配列番号１３）
Ｄ５５Ｅ β鎖
ＡＴＧＧＣＣＣＣＧＣＧＧＣＴＧＣＴＧＴＧＴＴＧＴＧＣＣＧＣＣＣＴＧＡＧＣＣＴＧＣＴＧＴＧＧＧＣＣＧＧＡＣＣＴＧＴＧＡＡＣＧＣＣＧＧＣＧＴＧＡＣＣＣＡＧＡＣＣＣＣＣＡＡＧＴＴＣＣＡＧＧＴＧＣＴＧＡＡＡＡＣＣＧＧＣＣＡＧＡＧＣＡＴＧＡＣＣＣＴＧＣＡＧＴＧＣＧＣＣＣＡＧＧＡＣＡＴＧＡＡＣＣＡＣＧＡＧＴＡＣＡＴＧＡＧＣＴＧＧＴＡＣＡＧＧＣＡＧＧＡＣＣＣＣＧＧＣＡＴＧＧＧＣＣＴＧＣＧＧＣＴＧＡＴＣＣＡＣＴＡＣＡＧＣＧＴＧＧＧＡＧＣＣＧＧＣＡＴＣＡＣＣＧＡＧＣＡＧＧＧＣＧＡＧＧＴＧＣＣＣＡＡＣＧＧＣＴＡＣＡＡＣＧＴＧＡＧＣＡＧＡＡＧＣＡＣＣＡＣＣＧＡＧＧＡＣＴＴＣＣＣＣＣＴＧＡＧＧＣＴＧＣＴＧＴＣＴＧＣＣＧＣＣＣＣＴＡＧＣＣＡＧＡＣＣＡＧＣＧＴＧＴＡＣＴＴＣＴＧＣＧＣＣＡＧＣＡＧＣＴＡＴＧＴＧＧＧＡＧＣＣＧＣＣＧＧＡＧＡＧＣＴＧＴＴＣＴＴＣＧＧＣＧＡＧＧＧＣＡＧＣＣＧＧＣＴＧＡＣＣＧＴＧＣＴＧＧＡＡＧＡＴＣＴＧＡＡＣＡＡＡＧＴＧＴＴＣＣＣＣＣＣＣＧＡＡＧＴＧＧＣＣＧＴＧＴＴＣＧＡＧＣＣＣＡＧＣＧＡＧＧＣＣＧＡＧＡＴＣＡＧＣＣＡＣＡＣＣＣＡＧＡＡＧＧＣＣＡＣＣＣＴＧＧＴＧＴＧＴＣＴＧＧＣＣＡＣＣＧＧＣＴＴＣＴＴＣＣＣＣＧＡＣＣＡＣＧＴＧＧＡＧＣＴＧＴＣＣＴＧＧＴＧＧＧＴＧＡＡＣＧＧＣＡＡＧＧＡＡＧＴＧＣＡＣＡＧＣＧＧＣＧＴＧＴＣＣＡＣＣＧＡＣＣＣＣＣＡＧＣＣＣＣＴＧＡＡＧＧＡＧＣＡＧＣＣＣＧＣＣＣＴＧＡＡＣＧＡＴＡＧＣＡＧＡＴＡＣＴＧＣＣＴＧＡＧＣＡＧＣＣＧＧＣＴＧＡＧＡＧＴＧＡＧＣＧＣＣＡＣＣＴＴＣＴＧＧＣＡＧＡＡＣＣＣＣＣＧＧＡＡＣＣＡＣＴＴＣＡＧＡＴＧＣＣＡＧＧＴＧＣＡＧＴＴＣＴＡＣＧＧＣＣＴＧＡＧＣＧＡＧＡＡＣＧＡＣＧＡＧＴＧＧＡＣＣＣＡＧＧＡＴＡＧＡＧＣＣＡＡＧＣＣＣＧＴＧＡＣＣＣＡＧＡＴＣＧＴＧＴＣＣＧＣＣＧＡＧＧＣＣＴＧＧＧＧＣＡＧＡＧＣＣＧＡＣＴＧＣＧＧＣＴＴＣＡＣＣＡＧＣＧＴＧＴＣＣＴＡＣＣＡＧＣＡＧＧＧＣＧＴＧＣＴＧＡＧＣＧＣＣＡＣＡＡＴＣＣＴＧＴＡＣＧＡＧＡＴＣＣＴＧＣＴＧＧＧＣＡＡＧＧＣＣＡＣＡＣＴＧＴＡＣＧＣＣＧＴＧＣＴＧＧＴＧＴＣＣＧＣＣＣＴＧＧＴＧＣＴＧＡＴＧＧＣＴＡＴＧＧＴＧＡＡＧＣＧＧＡＡＧＧＡＣＡＧＣＡＧＧＧＧＣＴＧＡ（配列番号１４）
細胞の遺伝子操作
一態様では、本発明は、本明細書に記載の改変ＴＣＲを発現するリンパ球系細胞の遺伝子操作の方法を提供する。一実施形態では、リンパ球系細胞は、配列番号２のアミノ酸配列、あるいは配列番号２に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む改変ＴＣＲを発現するように遺伝子操作される。一実施形態では、リンパ球系細胞は、配列番号３のアミノ酸配列、あるいは配列番号３に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む改変ＴＣＲを発現するように遺伝子操作される。一実施形態では、リンパ球系細胞は、配列番号４のアミノ酸配列、あるいは配列番号４に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む改変ＴＣＲを発現するように遺伝子操作される。一実施形態では、リンパ球系細胞は、配列番号５のアミノ酸配列、あるいは配列番号５に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む改変ＴＣＲを発現するように遺伝子操作される。リンパ球系細胞は、ＰＢＭＣ、腫瘍流入領域リンパ節、または腫瘍浸潤物から得られる。特定の実施形態において、遺伝子操作されたリンパ球系細胞は、１つまたは複数の外因性分子を発現するようにさらに操作される。特定の実施形態において、遺伝子操作されたリンパ球系細胞は、１つまたは複数の細胞表面受容体を発現するようにさらに操作される。細胞表面受容体の例には、キメラ抗原受容体、およびがん抗原ＮＹ－ＥＳＯ－１１５７－１６５エピトープ（配列番号８）に対してではないＴ細胞受容体が含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、遺伝子操作されたリンパ球系細胞は、１つまたは複数の可溶性タンパク質を発現するようにさらに操作される。可溶性タンパク質の例には、サイトカイン、ケモカイン、成長因子、可溶性受容体、リガンド、抗体、抗体フラグメント、および抗原結合ドメインが含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、遺伝子操作されたリンパ球系細胞は、１つまたは複数の追加の受容体および可溶性タンパク質を発現するようにさらに操作される。
一態様では、本発明は、本明細書に記載の改変ＴＣＲを発現する遺伝子操作されたリンパ球系細胞を提供する。一実施形態では、遺伝子操作されたリンパ球系細胞は、配列番号２のアミノ酸配列、あるいは配列番号２に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む改変ＴＣＲを発現する。一実施形態では、遺伝子操作されたリンパ球系細胞は、配列番号３のアミノ酸配列、あるいは配列番号３に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む改変ＴＣＲを発現する。一実施形態では、遺伝子操作されたリンパ球系細胞は、配列番号４のアミノ酸配列、あるいは配列番号４に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む改変ＴＣＲを発現する。一実施形態では、遺伝子操作されたリンパ球系細胞は、配列番号５のアミノ酸配列、あるいは配列番号５に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む改変ＴＣＲを発現する。上記の実施形態のいずれかにおいて、改変ＴＣＲは、非置換ＷＴ ＴＣＲのβ鎖（例えば、配列番号１に記載される）と比較して、β鎖のＣＤＲ２内に単一アミノ酸置換を含む。
リンパ球系細胞は、ＰＢＭＣ、腫瘍流入領域リンパ節、または腫瘍浸潤物から得られる。特定の実施形態において、遺伝子操作されたリンパ球系細胞は、追加の受容体を発現するようにさらに操作される。追加の受容体には、キメラ抗原受容体、およびがん抗原ＮＹ－ＥＳＯ－１１５７－１６５エピトープ（配列番号８）に対してではないＴ細胞受容体が含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、遺伝子操作されたリンパ球系細胞は、可溶性タンパク質を発現するようにさらに操作される。可溶性タンパク質には、サイトカイン、ケモカイン、成長因子、可溶性受容体、リガンド、抗体、抗体フラグメント、および抗原結合ドメインが含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、遺伝子操作されたリンパ球系細胞は、追加の受容体および可溶性タンパク質を発現するようにさらに操作される。
一実施形態では、本明細書で提供されるのは、配列番号２のアミノ酸配列あるいは配列番号２に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む改変ＴＣＲを発現する遺伝子操作されたリンパ球系細胞である。
一実施形態では、本明細書で提供されるのは、配列番号３のアミノ酸配列あるいは配列番号３に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む改変ＴＣＲを発現する遺伝子操作されたリンパ球系細胞である。
一実施形態では、本明細書で提供されるのは、配列番号４のアミノ酸配列あるいは配列番号４に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む改変ＴＣＲを発現する遺伝子操作されたリンパ球系細胞である。
一実施形態では、本明細書で提供されるのは、配列番号５のアミノ酸配列あるいは配列番号５に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む改変ＴＣＲを発現する遺伝子操作されたリンパ球系細胞である。
様々な実施形態において、遺伝子操作されたリンパ球系細胞は、非置換ＷＴ ＴＣＲのβ鎖（例えば、配列番号１に記載される）と比較してβ鎖のＣＤＲ２内に単一アミノ酸置換を含む改変ＴＣＲを発現する。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される遺伝子操作されたリンパ球系細胞は、１つまたは複数の外因性分子をさらに発現するように遺伝子操作され得る。
リンパ球系細胞は、抗原と特異的に反応して特定の細胞産物を作り上げる免疫系の細胞である。リンパ球系細胞を含むサンプルは、対象の多数の供給源から得ることができ、そのような供給源には、組織（腫瘍組織、ウイルス感染組織、炎症部位、リンパ球浸潤部位および白血球浸潤部位の組織を含む）、胸腺、腫瘍組織（例えば、サンプル、断片）、または酵素的に消化された組織、解離／懸濁細胞、リンパ節サンプル、または体液サンプル（例えば、血液、腹水、リンパ液）が含まれるが、それらに限定されない。例示的な組織には、皮膚、脂肪組織、心臓血管組織（静脈、動脈、毛細血管、弁など）、神経組織、骨髄、乳房、胃腸、肺組織、眼組織（角膜および水晶体など）、軟骨、骨、および粘膜組織が含まれる。
サンプルは、未処理であっても、酵素処理されても、および／または解離／懸濁されて細胞懸濁液を形成してもよい。サンプルが酵素処理される場合、使用され得る酵素の非限定的な例には、コラゲナーゼ、ジスパーゼ、ヒアルロニダーゼ、リベラーゼ、およびデオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）が含まれる。
特定の実施形態において、本発明で使用するためのリンパ球系細胞は、腫瘍浸潤免疫細胞を含む。腫瘍浸潤免疫細胞は、可変比率で単核免疫細胞と多形核免疫細胞の両方（すなわち、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、好中球、樹状細胞、肥満細胞、好酸球、好塩基球など）で構成される。特定の実施形態において、本発明で使用するためのリンパ球は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を含む。ＴＩＬは、血流を離れて腫瘍に向かって遊走した白血球である。ＴＩＬは、多くの場合、腫瘍間質および腫瘍自体の内部に見られる。
特定の実施形態において、本発明で使用するためのリンパ球系細胞は、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を含む。特定の実施形態において、本発明で使用するためのリンパ球系細胞は、Ｔリンパ球（Ｔ細胞）および／またはナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）を含む。
特定の実施形態において、本発明で使用するためのリンパ球系細胞はＴ細胞である。特定の実施形態において、Ｔ細胞はＣＤ８＋Ｔ細胞である。特定の実施形態において、Ｔ細胞はＣＤ４＋細胞である。特定の実施形態では、Ｔ細胞は制御性Ｔ細胞である。
特定の実施形態において、本発明で使用するためのリンパ球はＮＫ細胞である。特定の実施形態では、ＮＫ細胞は、ＣＤ１６＋ＣＤ５６＋および／またはＣＤ５７＋ＮＫ細胞である。ＮＫは、特定の細胞溶解性酵素の活性化によって「自己」ＭＨＣ／ＨＬＡ抗原を発現しない細胞に結合して殺す能力、ＮＫ活性化受容体のリガンドを発現する腫瘍細胞または他の罹患細胞を殺す能力、および免疫応答を刺激または阻害するサイトカインと呼ばれるタンパク質分子を放出する能力を特徴とする。
リンパ球培養に適した条件には、適切な培地（例えば、アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、およびビタミンが添加され、無血清であるかまたは適切な量の血清（または血漿）もしくは規定されたホルモンのセット、および／または成長と拡大に十分な量のサイトカインが補足された、最小必須培地（ＭＥＭ）、ＲＰＭＩ培地１６４０、Ｌｏｎｚａ ＲＰＭＩ１６４０、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＲＰＭＩ、Ｃｌｉｃｋｓ、ＡＩＭ－Ｖ、ＤＭＥＭ、ａ－ＭＥＭ、Ｆ－１２、ＴｅｘＭＡＣＳ、Ｘ－Ｖｉｖｏ １５、およびＸ－Ｖｉｖｏ ２０、Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒ）が含まれる。
リンパ球の拡大のための他の添加剤の例には、界面活性剤、プラスマネート（ｐｉａｓｍａｎａｔｅ）、ＨＥＰＥＳなどのｐＨ緩衝液、ならびにＮ－アセチル－システインおよび２－メルカプトエタノールなどの還元剤が含まれるが、これらに限定されない。抗生物質（例えば、ペニシリンおよびストレプトマイシン）は、実験培養にのみ含まれ、対象に注入される細胞の培養には含まれない。標的細胞は、成長を支持するために必要な条件下、例えば、適切な温度（例えば、３７℃）および雰囲気（例えば、空気＋５％ＣＯ２）の下で維持される。
リンパ球系細胞の拡大は、当技術分野で知られている方法および条件を使用して実施することができる。特定の実施形態では、リンパ球系細胞の拡大は、ＰＣＴ／ＥＰ２０１８／０８０３４３に記載されている方法に従って実施される。
リンパ球系細胞の遺伝子操作は、トランスフェクション、形質導入、または一時的な細胞膜破壊（すなわち、セルスクイーズ（cell squeeze））のうちの少なくとも１つによって達成され、改変ＴＣＲをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドをリンパ球系細胞に導入する。特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、実質的に均質な細胞集団に組換え発現ベクターで形質導入することによってリンパ球系細胞に導入される。そのようなベクターは、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターであり得る。本発明で使用するための例示的なウイルスベクターには、レトロウイルスベクター（レンチウイルスベクターを含む）、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、ヘルペスウイルスベクター、またはバキュロウイルスベクターが含まれるが、これらに限定されない。一実施形態では、本発明で使用するためのウイルスベクターはレンチウイルスベクターである。
改変ＴＣＲを発現する遺伝子操作されたリンパ球系細胞に追加の受容体を導入してもよい。遺伝子操作されたリンパ球系細胞に追加の受容体があると、リンパ球系細胞の機能（例えば、抗腫瘍機能）が強化され得る。
特定の実施形態において、追加の受容体は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である。キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は通常、免疫細胞を活性化または刺激することができる細胞内シグナル伝達ドメインに融合した抗原結合ドメインを有する。ＣＡＲの細胞外結合ドメインは、マウスまたはヒト化モノクローナル抗体の可変領域の重鎖および軽鎖を融合することにより生じる単鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦｖ）で構成され得る。あるいは、（例えば、Ｆａｂライブラリーから得られた抗体からではなく）Ｆａｂ’ｓに由来するｓｃＦｖを使用してもよい。ｓｃＦｖは、膜貫通ドメインに融合され、次に細胞内シグナル伝達ドメインに融合され得る。ＣＡＲは、第１世代、第２世代、または第３世代のＣＡＲであり得る。「第１世代」ＣＡＲには、抗原結合時にＣＤ３ζ（ゼータ）シグナルのみを提供するものが含まれる。「第２世代」のＣＡＲには、共刺激（例えば、ＣＤ２８またはＣＤ１３７）および活性化（ＣＤ３ζ）を提供するものが含まれる。「第３世代」のＣＡＲには、複数の共刺激（例えば、ＣＤ２８およびＣＤ１３７）ならびに活性化（ＣＤ３ζ）を提供するものが含まれる。ＣＡＲはがん抗原を特異的に認識し得る。
特定の実施形態において、追加の受容体は、がん抗原ＮＹ－ＥＳＯ－１１５７－１６５エピトープに特異的ではないＴＣＲである。このようなＴＣＲは、ＮＹ－ＥＳＯ－１１５７－１６５エピトープ以外のがん抗原を特異的に認識し得る。
特定の実施形態において、がん抗原は、ＣＤ７、ＣＤ７４、ＣＤＳ、ＣＥＡ、ＥＧＰ－２、ＥＧＰ－４０、ＥｐＣＡＭ、ｅｒｂ－Ｂ２，３，４、ＦＢＰ、胎児型アセチルコリン受容体、葉酸受容体α、ＧＤ２、ＧＤ３、ＨＥＲ２、ｈＴＥＲＴ、ＩＬ－１３Ｒ－ａ２、ＫＤＲ、Ｋ－軽鎖、ＬｅＹ、Ｌｌ細胞、ＭＡＧＥ－Ａｌ、メソテリン（Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ）、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ－ＥＳＯ－１、がん胎児性抗原（ｈ５Ｔ４）、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＴＡＧ－７２、ＶＥＧＦ－Ｒ２、およびＷＴ－１から選択され得る。
改変ＴＣＲを発現する遺伝子操作されたリンパ球系細胞は、可溶性タンパク質または複数の可溶性タンパク質を発現および分泌するように操作され得る。本発明で使用するための可溶性タンパク質には、サイトカイン、ケモカイン、成長因子、可溶性受容体、リガンド、抗体、抗体フラグメント、ならびにそれらの抗原結合ドメインおよび機能的バリアントが含まれるが、これらに限定されない。
本明細書に記載の遺伝子操作されたリンパ球系細胞によって発現および／または分泌され得るサイトカインには、インターロイキン－２（ＩＬ－２）、インターロイキン－３（ＩＬ－３）、インターロイキン－６（ＩＬ－６）、インターロイキン－７（ＩＬ－７）、インターロイキン－９（ＩＬ－９）、インターロイキン－１１（ＩＬ－１１）、インターロイキン－１２（ＩＬ－１２）、インターロイキン－１５（ＩＬ－１５）、インターロイキン－１７（ＩＬ－１７）、インターロイキン－１８（ＩＬ－１８）、インターロイキン－２１（ＩＬ－２１）、インターロイキン－３３（ＩＬ－３３）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、インターフェロンアルファ（ＩＦＮ－アルファまたはＩＦＮ－α）、インターフェロンベータ（ＩＦＮ－ベータまたはＩＦＮ－β）、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ－ガンマまたはＩＦＮ－γ）、トランスフォーミング成長因子－ベータ（ＴＧＦ－β）、ＣＣＬ１９およびエリスロポエチンが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、遺伝子操作されたリンパ球系細胞によって発現されるサイトカインはＩＬ－２である。いくつかの実施形態において、遺伝子操作されたリンパ球系細胞によって発現されるサイトカインはＩＦＮ－γである。いくつかの実施形態において、遺伝子操作されたリンパ球系細胞によって発現されるサイトカインはＧＭ－ＣＳＦである。
本明細書に記載の遺伝子操作されたリンパ球系細胞によって発現および／または分泌され得るケモカインには、インターロイキン－８（ＩＬ－８）、好中球活性化タンパク質－１（ＮＡＰ－１）、好中球活性化タンパク質－２（ＮＡＰ－２）、ＧＲＯ、ＧＲＯβ、ＧＲＯγ、ＥＮＡ－７８、ＧＣＰ－２、ＩＰ－１０、ＭＩＧ、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１６、ＣＸＣＬ１９、およびＰＦ４などのＣＸＣ－ケモカイン；ならびにＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ－１α、ＭＩＰ－２β、単球走化性タンパク質－１（ＭＣＰ－１）、ＭＣＰ－２、ＭＣＰ－３、ＣＣＬ５、およびエオタキシンなどのＣＣケモカインが含まれるが、これらに限定されない。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる国際公開第Ｗ０２００００７８３３４号（例えば、表１）に記載される適切なケモカインもまた、本発明によって企図される。
本明細書に記載の遺伝子操作されたリンパ球系細胞によって発現および／または分泌され得る成長因子には、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子、マクロファージコロニー刺激因子、腫瘍壊死因子、トランスフォーミング成長因子、表皮成長因子、幹細胞因子、血小板由来成長因子、神経成長因子、線維芽細胞成長因子、インスリン様成長因子、成長ホルモン、インターロイキン－１（ＩＬ－１）、インターロイキン－２（ＩＬ－２）、ケラチノサイト成長因子、毛様体神経栄養因子、シュワン（Ｓｃｈｗａｎｎ）細胞由来成長因子、ワクシニアウイルス成長因子、ボンビキシン、ｎｅｕ分化因子、ｖ－Ｓｉｓおよびグリア成長因子（glial growth factor）が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書に記載の遺伝子操作されたリンパ球系細胞によって発現および／または分泌され得る可溶性受容体には、ＩＬ－１ＲＩ、ＩＬ－１ＲＩＩ、ＴＮＦＲＩ、ＴＮＦＲＩＩ、ＩＦＮ－α／βＲ、ＩＬ－４受容体、ＩＬ－６受容体、ＩＬ－１０受容体、ＩＬ－１１受容体、ＩＬ－１３受容体、ＩＬ－１８結合タンパク質、およびＴＧＦ－β受容体などの可溶性サイトカイン受容体；ならびに可溶性上皮成長因子受容体（ｓＥＧＦＲ）、可溶性血管内皮成長因子受容体およびＰＤ－１細胞外ドメイン（ectodomain）などの可溶性成長因子受容体、可溶性ＶＥＧＦＲ－１およびＳＩＲＰ－α分子が含まれるが、これらに限定されない。本明細書に記載の遺伝子操作されたリンパ球系細胞によって発現および／または分泌され得る可溶性受容体は、ＣＤ２８細胞内ドメイン(endodomain)または４１ＢＢ細胞内ドメイン、あるいは当技術分野で知られている他の任意の共刺激細胞内ドメイン（co-stimulatory endodomain）にさらに融合され得る。
本明細書に記載の遺伝子操作されたリンパ球系細胞によって発現および／または分泌され得るリガンドには、神経成長因子（ＮＧＦ）、ＣＤ４０Ｌ（ＣＤ１５４）、ＣＤ１３７Ｌ／４－１ＢＢＬ、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）、ＣＤ１３４Ｌ／ＯＸ４０Ｌ／ＣＤ２５２、ＣＤ２７Ｌ／ＣＤ７０、Ｆａｓリガンド（ＦａｓＬ）、Ｆａｓリガンドアゴニスト（ＦａｓＬアゴニスト）、ＬＡＧ３リガンド、ＶＥＧＦＲ１リガンド、ＴＩＭ３リガンド、ＴＩＧＩＴリガンド、ＳＩＲＰ－アルファリガンド、ＣＤ３０Ｌ／ＣＤ１５３、腫瘍壊死因子ベータ（ＴＮＦβ）／リンホトキシン－アルファ（ＬＴα）、リンホトキシン－ベータ（ＬＴβ）、ＣＤ２５７／Ｂ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ）／Ｂｌｙｓ／ＴＨＡＮＫ／Ｔａ１１－１、グルココルチコイド誘発性ＴＮＦ受容体リガンド（ＧＩＴＲＬ）、およびＴＮＦ関連アポトーシス誘発性リガンド（ＴＲＡＩＬ）、およびＬＩＧＨＴ（ＴＮＦＳＦ１４）；などの腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）リガンド；ＣＤ８０およびＣＤ８６などの免疫グロブリンスーパーファミリーリガンド；トール様受容体（ＴＬＲ）に対するリガンド、４－１ＢＢリガンド、アゴニスト、ＯＸ４０リガンドアゴニスト、ＩＣＯＳリガンドアゴニスト、Ｆｌｔ３リガンド、ホスホジエステラーゼ４Ｂ２（ＰＤＥ４Ｂ２）、ホスホジエステラーゼ４Ａ（ＰＤＥ４Ａ）、ホスホジエステラーゼ７Ａ（ＰＤＥ７Ａ）、ホスホジエステラーゼ４Ｃ（ＰＤＥ４Ｃ）、およびプログラムされた細胞死タンパク質－１（ＰＤ－１）リガンドが含まれるが、これらに限定されない。
本明細書に記載の遺伝子操作されたリンパ球系細胞によって発現および／または分泌され得る抗体には、がん抗原に特異的に結合するものが含まれる。このようながん抗原は、ＣＤ７、ＣＤ１９、ＣＤ７４、ＣＤＳ、ＣＥＡ、ＥＧＰ－２、ＥＧＰ－４０、ＥｐＣＡＭ、ｅｒｂ－Ｂ２、３、４、ＦＢＰ、胎児型アセチルコリン受容体、葉酸受容体α、ＧＤ２、ＧＤ３、ＨＥＲ２、ｈＴＥＲＴ、ＩＬ－１３Ｒ－ａ２、ＫＤＲ、Ｋ－軽鎖、ＬｅＹ、Ｌｌ細胞、ＭＡＧＥ－Ａｌ、メソテリン、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ－ＥＳＯ－１、がん胎児性抗原（ｈ５Ｔ４）、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＴＡＧ－７２、ＶＥＧＦ－Ｒ２、およびＷＴ－１から選択され得る。前記抗原に特異的に結合するアミノ酸配列は、当技術分野で知られているか、あるいは当技術分野で知られている方法を使用して調製することができる。
特定の実施形態において、抗体は、二重特異性抗体（例えば、二重特異性Ｔ細胞抗体（ＢｉＴＥ））である。二重特異性抗体は、２つの異なる抗原結合ドメインを含む組換え合成抗体である。例えば、抗原結合ドメインの一方はがん抗原を標的とし、他方はリンパ球活性化分子に結合し得る。
がん抗原に対して親和性を有する抗体フラグメントまたは抗原結合ドメインは、本明細書に記載の遺伝子操作されたリンパ球系細胞によって発現され得る。抗体フラグメントには、一本鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆｖフラグメント、単鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）、（Ｆａｂ）２’フラグメントなどの二価抗体フラグメント、Ｆ（ａｂ’）フラグメント、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、イントラボディ、ミニボディ、ジアボディ、トリアボディ、およびデカボディが含まれるが、これらに限定されない。
改変ＴＣＲを発現する遺伝子操作されたリンパ球系細胞は、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ－３、ＴＩＧＩＴ、ＶＩＳＴＡ、ＴＩＭ－３、およびＣｂｌ－ｂを含むがこれらに限定されない阻害／チェックポイント分子の遺伝子ノックダウンをさらに発現するように操作され得る。いくつかの実施形態において、遺伝子ノックダウンを発現するように操作され得る改変ＴＣＲを発現する遺伝子操作されたリンパ球は、限定されないが、ＩＬ－２、ＩＬ－３３、ＧＭ－ＣＳＦ、ＣＤ４０アゴニストなどの追加の可溶性タンパク質を発現および分泌するようにさらに操作され得る。
そのような遺伝子操作されたリンパ球系細胞を養子細胞移入療法において使用する方法も提供される。特定の実施形態において、リンパ球系細胞は、対象に対して自己由来（または自家）（autologous）、同種異系（allogeneic）、同系（syngeneic）、または異種（xenogeneic）であり得る。特定の実施形態において、リンパ球系細胞は、免疫療法処置のために対象に再導入されたときにリンパ球に対する免疫反応性応答を低減するために自己由来である。
一実施形態では、本明細書で提供されるのは、ＴＣＲを発現し、かつ１つまたは複数のタンパク質をさらに発現する遺伝子操作されたリンパ球系細胞である。特定の実施形態において、タンパク質の少なくとも１つは可溶性タンパク質である。可溶性タンパク質は、例えば、成長因子（例えば、ＧＭ－ＣＳＦ）であり得る。特定の実施形態では、タンパク質の少なくとも１つは細胞間タンパク質である。細胞間タンパク質は、例えば、ホスホジエステラーゼ（例えば、ＰＤＥ４Ｂ２）であり得る。遺伝子操作されたリンパ球系細胞は、１つまたは複数の細胞表面受容体をさらに発現し得る。特定の実施形態において、ＴＣＲは、外因性の野生型ＴＣＲである。特定の実施形態において、ＴＣＲは、改変ＴＣＲである。
一実施形態では、本明細書で提供されるのは、配列番号１のアミノ酸配列、あるいは配列番号１に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＴＣＲを発現し、さらに１つまたは複数の可溶性タンパク質を発現する、遺伝子操作されたリンパ球系細胞である。可溶性タンパク質は成長因子であり得る。成長因子はＧＭ－ＣＳＦであり得る。遺伝子操作されたリンパ球系細胞は、１つまたは複数の細胞表面受容体をさらに発現し得る。
一実施形態では、本明細書で提供されるのは、配列番号２のアミノ酸配列またはその機能的断片、あるいは配列番号２に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む改変ＴＣＲを発現し、さらに１つまたは複数の可溶性タンパク質を発現する、遺伝子操作されたリンパ球系細胞である。可溶性タンパク質は成長因子であり得る。成長因子はＧＭ－ＣＳＦであり得る。遺伝子操作されたリンパ球系細胞は、１つまたは複数の細胞表面受容体をさらに発現し得る。
一実施形態では、本明細書で提供されるのは、配列番号３のアミノ酸配列またはその機能的断片、あるいは配列番号３に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む改変ＴＣＲを発現し、さらに１つまたは複数の可溶性タンパク質を発現する、遺伝子操作されたリンパ球系細胞である。可溶性タンパク質は成長因子であり得る。成長因子はＧＭ－ＣＳＦであり得る。遺伝子操作されたリンパ球系細胞は、１つまたは複数の細胞表面受容体をさらに発現し得る。
一実施形態では、本明細書で提供されるのは、配列番号４のアミノ酸配列またはその機能的断片、あるいは配列番号４に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む改変ＴＣＲを発現し、さらに１つまたは複数の可溶性タンパク質を発現する、遺伝子操作されたリンパ球系細胞である。可溶性タンパク質は成長因子であり得る。成長因子はＧＭ－ＣＳＦであり得る。遺伝子操作されたリンパ球系細胞は、１つまたは複数の細胞表面受容体をさらに発現し得る。
一実施形態では、本明細書で提供されるのは、配列番号５のアミノ酸配列またはその機能的断片、あるいは配列番号５に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む改変ＴＣＲを発現し、さらに１つまたは複数の可溶性タンパク質を発現する、遺伝子操作されたリンパ球系細胞である。可溶性タンパク質は成長因子であり得る。成長因子はＧＭ－ＣＳＦであり得る。遺伝子操作されたリンパ球系細胞は、１つまたは複数の細胞表面受容体をさらに発現し得る。
いくつかの実施形態において、ＧＭ－ＣＳＦは、マウスＧＭ－ＣＳＦまたはその機能的断片である。マウスＧＭ－ＣＳＦのＵｎｉＰｒｏｔ識別子はＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ０１５８７である。
いくつかの実施形態において、ＧＭ－ＣＳＦは、配列番号１５のアミノ酸配列、あるいは配列番号１５に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ＧＭ－ＣＳＦは、配列番号１５のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＧＭ－ＣＳＦをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１６のヌクレオチド配列、あるいは配列番号１６に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、ＧＭ－ＣＳＦをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１６のヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態において、ＧＭ－ＣＳＦの機能的断片は、配列番号１９のアミノ酸配列、あるいは配列番号１９に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ＧＭ－ＣＳＦの機能的断片は、配列番号１９のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＧＭ－ＣＳＦの機能的断片をコードするヌクレオチド配列は、配列番号２０のヌクレオチド配列、あるいは配列番号２０に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、ＧＭ－ＣＳＦの機能的断片をコードするヌクレオチド配列は、配列番号２０のヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態において、ＧＭ－ＣＳＦは、ヒトＧＭ－ＣＳＦまたはその機能的断片である。ヒトＧＭ－ＣＳＦのＵｎｉＰｒｏｔ識別子はＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ０４１４１である。
いくつかの実施形態において、ＧＭ－ＣＳＦは、配列番号２１または３４のアミノ酸配列、あるいは配列番号２１または３４に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ＧＭ－ＣＳＦは、配列番号２１または３４のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＧＭ－ＣＳＦをコードするヌクレオチド配列は、配列番号２２または３５のヌクレオチド配列、あるいは配列番号２２または３５に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、ＧＭ－ＣＳＦをコードするヌクレオチド配列は、配列番号２２または３５のヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態において、ＧＭ－ＣＳＦの機能的断片は、配列番号２５または３６のアミノ酸配列、あるいは配列番号２５または３６に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ＧＭ－ＣＳＦの機能的断片は、配列番号２５または３６のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＧＭ－ＣＳＦの機能的断片をコードするヌクレオチド配列は、配列番号２６または３７のヌクレオチド配列、あるいは配列番号２６または３７に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、ＧＭ－ＣＳＦの機能的断片をコードするヌクレオチド配列は、配列番号２６または３７のヌクレオチド配列を含む。
ＧＭ－ＣＳＦまたはその機能的断片を発現するのに有用な配列の例を以下に提供する。
マウスＧＭ－ＣＳＦ（全長タンパク質配列）
ＭＷＬＱＮＬＬＦＬＧＩＶＶＹＳＬＳＡＰＴＲＳＰＩＴＶＴＲＰＷＫＨＶＥＡＩＫＥＡＬＮＬＬＤＤＭＰＶＴＬＮＥＥＶＥＶＶＳＮＥＦＳＦＫＫＬＴＣＶＱＴＲＬＫＩＦＥＱＧＬＲＧＮＦＴＫＬＫＧＡＬＮＭＴＡＳＹＹＱＴＹＣＰＰＴＰＥＴＤＣＥＴＱＶＴＴＹＡＤＦＩＤＳＬＫＴＦＬＴＤＩＰＦＥＣＫＫＰＧＱＫ（配列番号１５）
マウスＧＭ－ＣＳＦ（全長ＤＮＡ配列）
ＡＴＧＴＧＧＣＴＧＣＡＧＡＡＴＴＴＡＣＴＴＴＴＣＣＴＧＧＧＣＡＴＴＧＴＧＧＴＣＴＡＣＡＧＣＣＴＣＴＣＡＧＣＡＣＣＣＡＣＣＣＧＣＴＣＡＣＣＣＡＴＣＡＣＴＧＴＣＡＣＣＣＧＧＣＣＴＴＧＧＡＡＧＣＡＴＧＴＡＧＡＧＧＣＣＡＴＣＡＡＡＧＡＡＧＣＣＣＴＧＡＡＣＣＴＣＣＴＧＧＡＴＧＡＣＡＴＧＣＣＴＧＴＣＡＣＡＴＴＧＡＡＴＧＡＡＧＡＧＧＴＡＧＡＡＧＴＣＧＴＣＴＣＴＡＡＣＧＡＧＴＴＣＴＣＣＴＴＣＡＡＧＡＡＧＣＴＡＡＣＡＴＧＴＧＴＧＣＡＧＡＣＣＣＧＣＣＴＧＡＡＧＡＴＡＴＴＣＧＡＧＣＡＧＧＧＴＣＴＡＣＧＧＧＧＣＡＡＴＴＴＣＡＣＣＡＡＡＣＴＣＡＡＧＧＧＣＧＣＣＴＴＧＡＡＣＡＴＧＡＣＡＧＣＣＡＧＣＴＡＣＴＡＣＣＡＧＡＣＡＴＡＣＴＧＣＣＣＣＣＣＡＡＣＴＣＣＧＧＡＡＡＣＧＧＡＣＴＧＴＧＡＡＡＣＡＣＡＡＧＴＴＡＣＣＡＣＣＴＡＴＧＣＧＧＡＴＴＴＣＡＴＡＧＡＣＡＧＣＣＴＴＡＡＡＡＣＣＴＴＴＣＴＧＡＣＴＧＡＴＡＴＣＣＣＣＴＴＴＧＡＡＴＧＣＡＡＡＡＡＡＣＣＡＧＧＣＣＡＡＡＡＡ（配列番号１６）
マウスＧＭ－ＣＳＦ（シグナルペプチドのタンパク質配列）
ＭＷＬＱＮＬＬＦＬＧＩＶＶＹＳＬＳ（配列番号１７）
マウスＧＭ－ＣＳＦ（シグナルペプチドのＤＮＡ配列）
ＡＴＧＴＧＧＣＴＧＣＡＧＡＡＴＴＴＡＣＴＴＴＴＣＣＴＧＧＧＣＡＴＴＧＴＧＧＴＣＴＡＣＡＧＣＣＴＣＴＣＡ（配列番号１８）
マウスＧＭ－ＣＳＦ（活性可溶性ＧＭ－ＣＳＦのタンパク質配列）
ＡＰＴＲＳＰＩＴＶＴＲＰＷＫＨＶＥＡＩＫＥＡＬＮＬＬＤＤＭＰＶＴＬＮＥＥＶＥＶＶＳＮＥＦＳＦＫＫＬＴＣＶＱＴＲＬＫＩＦＥＱＧＬＲＧＮＦＴＫＬＫＧＡＬＮＭＴＡＳＹＹＱＴＹＣＰＰＴＰＥＴＤＣＥＴＱＶＴＴＹＡＤＦＩＤＳＬＫＴＦＬＴＤＩＰＦＥＣＫＫＰＧＱＫ（配列番号１９）
マウスＧＭ－ＣＳＦ（活性可溶性ＧＭ－ＣＳＦのＤＮＡ配列）
ＧＣＡＣＣＣＡＣＣＣＧＣＴＣＡＣＣＣＡＴＣＡＣＴＧＴＣＡＣＣＣＧＧＣＣＴＴＧＧＡＡＧＣＡＴＧＴＡＧＡＧＧＣＣＡＴＣＡＡＡＧＡＡＧＣＣＣＴＧＡＡＣＣＴＣＣＴＧＧＡＴＧＡＣＡＴＧＣＣＴＧＴＣＡＣＡＴＴＧＡＡＴＧＡＡＧＡＧＧＴＡＧＡＡＧＴＣＧＴＣＴＣＴＡＡＣＧＡＧＴＴＣＴＣＣＴＴＣＡＡＧＡＡＧＣＴＡＡＣＡＴＧＴＧＴＧＣＡＧＡＣＣＣＧＣＣＴＧＡＡＧＡＴＡＴＴＣＧＡＧＣＡＧＧＧＴＣＴＡＣＧＧＧＧＣＡＡＴＴＴＣＡＣＣＡＡＡＣＴＣＡＡＧＧＧＣＧＣＣＴＴＧＡＡＣＡＴＧＡＣＡＧＣＣＡＧＣＴＡＣＴＡＣＣＡＧＡＣＡＴＡＣＴＧＣＣＣＣＣＣＡＡＣＴＣＣＧＧＡＡＡＣＧＧＡＣＴＧＴＧＡＡＡＣＡＣＡＡＧＴＴＡＣＣＡＣＣＴＡＴＧＣＧＧＡＴＴＴＣＡＴＡＧＡＣＡＧＣＣＴＴＡＡＡＡＣＣＴＴＴＣＴＧＡＣＴＧＡＴＡＴＣＣＣＣＴＴＴＧＡＡＴＧＣＡＡＡＡＡＡＣＣＡＧＧＣＣＡＡＡＡＡ（配列番号２０）
ヒトＧＭ－ＣＳＦ（全長タンパク質１）
ＭＷＬＱＳＬＬＬＬＧＴＶＡＣＳＩＳＡＰＡＲＳＰＳＰＳＴＱＰＷＥＨＶＮＡＩＱＥＡＲＲＬＬＮＬＳＲＤＴＡＡＥＭＮＥＴＶＥＶＩＳＥＭＦＤＬＱＥＰＴＣＬＱＴＲＬＥＬＹＫＱＧＬＲＧＳＬＴＫＬＫＧＰＬＴＭＭＡＳＨＹＫＱＨＣＰＰＴＰＥＴＳＣＡＴＱＴＩＴＦＥＳＦＫＥＮＬＫＤＦＬＬＶＩＰＦＤＣＷＥＰＶＱＥ（配列番号２１）
ヒトＧＭ－ＣＳＦ（全長ＤＮＡ１）
ＡＴＧＴＧＧＣＴＧＣＡＡＴＣＴＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＧＧＣＡＣＡＧＴＧＧＣＣＴＧＴＴＣＴＡＴＴＡＧＣＧＣＣＣＣＴＧＣＣＡＧＡＴＣＴＣＣＡＴＣＴＣＣＴＡＧＣＡＣＡＣＡＧＣＣＴＴＧＧＧＡＧＣＡＣＧＴＧＡＡＣＧＣＣＡＴＣＣＡＡＧＡＡＧＣＣＡＧＡＣＧＧＣＴＧＣＴＧＡＡＣＣＴＧＡＧＣＡＧＡＧＡＴＡＣＡＧＣＣＧＣＣＧＡＧＡＴＧＡＡＣＧＡＧＡＣＡＧＴＧＧＡＡＧＴＧＡＴＣＡＧＣＧＡＧＡＴＧＴＴＣＧＡＣＣＴＧＣＡＡＧＡＧＣＣＴＡＣＣＴＧＣＣＴＧＣＡＧＡＣＣＡＧＡＣＴＧＧＡＡＣＴＧＴＡＣＡＡＧＣＡＧＧＧＣＣＴＧＡＧＡＧＧＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＡＡＧＣＴＧＡＡＡＧＧＣＣＣＴＣＴＧＡＣＡＡＴＧＡＴＧＧＣＣＡＧＣＣＡＣＴＡＣＡＡＧＣＡＧＣＡＣＴＧＣＣＣＴＣＣＡＡＣＡＣＣＴＧＡＧＡＣＡＡＧＣＴＧＴＧＣＣＡＣＡＣＡＧＡＣＣＡＴＣＡＣＣＴＴＣＧＡＧＡＧＣＴＴＣＡＡＡＧＡＧＡＡＣＣＴＧＡＡＧＧＡＣＴＴＣＣＴＧＣＴＧＧＴＣＡＴＣＣＣＣＴＴＣＧＡＣＴＧＣＴＧＧＧＡＧＣＣＣＧＴＧＣＡＡＧＡＡ（配列番号２２）
ヒトＧＭ－ＣＳＦ（シグナルペプチドのタンパク質配列）
ＭＷＬＱＳＬＬＬＬＧＴＶＡＣＳＩＳ（配列番号２３）
ヒトＧＭ－ＣＳＦ（シグナルペプチドのＤＮＡ配列）
ＡＴＧＴＧＧＣＴＧＣＡＡＴＣＴＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＧＧＣＡＣＡＧＴＧＧＣＣＴＧＴＴＣＴＡＴＴＡＧＣ（配列番号２４）
ヒトＧＭ－ＣＳＦ（活性可溶性ＧＭ－ＣＳＦ１のタンパク質配列）
ＡＰＡＲＳＰＳＰＳＴＱＰＷＥＨＶＮＡＩＱＥＡＲＲＬＬＮＬＳＲＤＴＡＡＥＭＮＥＴＶＥＶＩＳＥＭＦＤＬＱＥＰＴＣＬＱＴＲＬＥＬＹＫＱＧＬＲＧＳＬＴＫＬＫＧＰＬＴＭＭＡＳＨＹＫＱＨＣＰＰＴＰＥＴＳＣＡＴＱＴＩＴＦＥＳＦＫＥＮＬＫＤＦＬＬＶＩＰＦＤＣＷＥＰＶＱＥ（配列番号２５）
（配列番号２５）
ヒトＧＭ－ＣＳＦ（活性可溶性ＧＭ－ＣＳＦ１のＤＮＡ配列）
ＧＣＣＣＣＴＧＣＣＡＧＡＴＣＴＣＣＡＴＣＴＣＣＴＡＧＣＡＣＡＣＡＧＣＣＴＴＧＧＧＡＧＣＡＣＧＴＧＡＡＣＧＣＣＡＴＣＣＡＡＧＡＡＧＣＣＡＧＡＣＧＧＣＴＧＣＴＧＡＡＣＣＴＧＡＧＣＡＧＡＧＡＴＡＣＡＧＣＣＧＣＣＧＡＧＡＴＧＡＡＣＧＡＧＡＣＡＧＴＧＧＡＡＧＴＧＡＴＣＡＧＣＧＡＧＡＴＧＴＴＣＧＡＣＣＴＧＣＡＡＧＡＧＣＣＴＡＣＣＴＧＣＣＴＧＣＡＧＡＣＣＡＧＡＣＴＧＧＡＡＣＴＧＴＡＣＡＡＧＣＡＧＧＧＣＣＴＧＡＧＡＧＧＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＡＡＧＣＴＧＡＡＡＧＧＣＣＣＴＣＴＧＡＣＡＡＴＧＡＴＧＧＣＣＡＧＣＣＡＣＴＡＣＡＡＧＣＡＧＣＡＣＴＧＣＣＣＴＣＣＡＡＣＡＣＣＴＧＡＧＡＣＡＡＧＣＴＧＴＧＣＣＡＣＡＣＡＧＡＣＣＡＴＣＡＣＣＴＴＣＧＡＧＡＧＣＴＴＣＡＡＡＧＡＧＡＡＣＣＴＧＡＡＧＧＡＣＴＴＣＣＴＧＣＴＧＧＴＣＡＴＣＣＣＣＴＴＣＧＡＣＴＧＣＴＧＧＧＡＧＣＣＣＧＴＧＣＡＡＧＡＡ（配列番号２６）
ヒトＧＭ－ＣＳＦ（全長タンパク質２）
ＭＷＬＱＳＬＬＬＬＧＴＶＡＣＳＩＳＡＰＡＲＳＰＳＰＳＴＱＰＷＥＨＶＮＡＩＱＥＡＲＲＬＬＮＬＳＲＤＴＡＡＥＭＮＥＴＶＥＶＩＳＥＭＦＤＬＱＥＰＴＣＬＱＴＲＬＥＬＹＫＱＧＬＲＧＳＬＴＫＬＫＧＰＬＴＭＭＡＳＨＹＫＱＨＣＰＰＴＰＥＴＳＣＡＴＱＩＩＴＦＥＳＦＫＥＮＬＫＤＦＬＬＶＩＰＦＤＣＷＥＰＶＱＥ（配列番号３４）
ヒトＧＭ－ＣＳＦ（全長ＤＮＡ２）
ＡＴＧＴＧＧＣＴＧＣＡＡＴＣＴＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＧＧＣＡＣＡＧＴＧＧＣＣＴＧＴＴＣＴＡＴＴＡＧＣＧＣＣＣＣＴＧＣＣＡＧＡＴＣＴＣＣＡＴＣＴＣＣＴＡＧＣＡＣＡＣＡＧＣＣＴＴＧＧＧＡＧＣＡＣＧＴＧＡＡＣＧＣＣＡＴＣＣＡＡＧＡＡＧＣＣＡＧＡＣＧＧＣＴＧＣＴＧＡＡＣＣＴＧＡＧＣＡＧＡＧＡＴＡＣＡＧＣＣＧＣＣＧＡＧＡＴＧＡＡＣＧＡＧＡＣＡＧＴＧＧＡＡＧＴＧＡＴＣＡＧＣＧＡＧＡＴＧＴＴＣＧＡＣＣＴＧＣＡＡＧＡＧＣＣＴＡＣＣＴＧＣＣＴＧＣＡＧＡＣＣＡＧＡＣＴＧＧＡＡＣＴＧＴＡＣＡＡＧＣＡＧＧＧＣＣＴＧＡＧＡＧＧＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＡＡＧＣＴＧＡＡＡＧＧＣＣＣＴＣＴＧＡＣＡＡＴＧＡＴＧＧＣＣＡＧＣＣＡＣＴＡＣＡＡＧＣＡＧＣＡＣＴＧＣＣＣＴＣＣＡＡＣＡＣＣＴＧＡＧＡＣＡＡＧＣＴＧＴＧＣＣＡＣＡＣＡＧＡＴＣＡＴＣＡＣＣＴＴＣＧＡＧＡＧＣＴＴＣＡＡＡＧＡＧＡＡＣＣＴＧＡＡＧＧＡＣＴＴＣＣＴＧＣＴＧＧＴＣＡＴＣＣＣＣＴＴＣＧＡＣＴＧＣＴＧＧＧＡＧＣＣＣＧＴＧＣＡＡＧＡＡ（配列番号３５）
ヒトＧＭ－ＣＳＦ（活性可溶性ＧＭ－ＣＳＦ２のタンパク質配列）
ＡＰＡＲＳＰＳＰＳＴＱＰＷＥＨＶＮＡＩＱＥＡＲＲＬＬＮＬＳＲＤＴＡＡＥＭＮＥＴＶＥＶＩＳＥＭＦＤＬＱＥＰＴＣＬＱＴＲＬＥＬＹＫＱＧＬＲＧＳＬＴＫＬＫＧＰＬＴＭＭＡＳＨＹＫＱＨＣＰＰＴＰＥＴＳＣＡＴＱＩＩＴＦＥＳＦＫＥＮＬＫＤＦＬＬＶＩＰＦＤＣＷＥＰＶＱＥ（配列番号３６）
ヒトＧＭ－ＣＳＦ（活性可溶性ＧＭ－ＣＳＦ２のＤＮＡ配列）
ＧＣＣＣＣＴＧＣＣＡＧＡＴＣＴＣＣＡＴＣＴＣＣＴＡＧＣＡＣＡＣＡＧＣＣＴＴＧＧＧＡＧＣＡＣＧＴＧＡＡＣＧＣＣＡＴＣＣＡＡＧＡＡＧＣＣＡＧＡＣＧＧＣＴＧＣＴＧＡＡＣＣＴＧＡＧＣＡＧＡＧＡＴＡＣＡＧＣＣＧＣＣＧＡＧＡＴＧＡＡＣＧＡＧＡＣＡＧＴＧＧＡＡＧＴＧＡＴＣＡＧＣＧＡＧＡＴＧＴＴＣＧＡＣＣＴＧＣＡＡＧＡＧＣＣＴＡＣＣＴＧＣＣＴＧＣＡＧＡＣＣＡＧＡＣＴＧＧＡＡＣＴＧＴＡＣＡＡＧＣＡＧＧＧＣＣＴＧＡＧＡＧＧＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＡＡＧＣＴＧＡＡＡＧＧＣＣＣＴＣＴＧＡＣＡＡＴＧＡＴＧＧＣＣＡＧＣＣＡＣＴＡＣＡＡＧＣＡＧＣＡＣＴＧＣＣＣＴＣＣＡＡＣＡＣＣＴＧＡＧＡＣＡＡＧＣＴＧＴＧＣＣＡＣＡＣＡＧＡＴＣＡＴＣＡＣＣＴＴＣＧＡＧＡＧＣＴＴＣＡＡＡＧＡＧＡＡＣＣＴＧＡＡＧＧＡＣＴＴＣＣＴＧＣＴＧＧＴＣＡＴＣＣＣＣＴＴＣＧＡＣＴＧＣＴＧＧＧＡＧＣＣＣＧＴＧＣＡＡＧＡＡ（配列番号３７）
一実施形態では、本明細書で提供されるのは、配列番号１のアミノ酸配列、あるいは配列番号１に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＴＣＲを発現し、さらに１つまたは複数の細胞内タンパク質を発現する、遺伝子操作されたリンパ球系細胞である。細胞内タンパク質は、ホスホジエステラーゼ（例えば、ＰＤＥ４Ｂ２）であり得る。遺伝子操作されたリンパ球系細胞は、１つまたは複数の細胞表面受容体をさらに発現し得る。
一実施形態では、本明細書で提供されるのは、配列番号２のアミノ酸配列またはその機能的断片、あるいは配列番号２に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む改変ＴＣＲを発現し、さらに１つまたは複数の細胞内タンパク質を発現する、遺伝子操作されたリンパ球系細胞である。細胞内タンパク質は、ホスホジエステラーゼ（例えば、ＰＤＥ４Ｂ２）であり得る。遺伝子操作されたリンパ球系細胞は、１つまたは複数の細胞表面受容体をさらに発現し得る。
一実施形態では、本明細書で提供されるのは、配列番号３のアミノ酸配列またはその機能的断片、あるいは配列番号３に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む改変ＴＣＲを発現し、さらに１つまたは複数の細胞内タンパク質を発現する、遺伝子操作されたリンパ球系細胞である。細胞内タンパク質は、ホスホジエステラーゼ（例えば、ＰＤＥ４Ｂ２）であり得る。遺伝子操作されたリンパ球系細胞は、１つまたは複数の細胞表面受容体をさらに発現し得る。
一実施形態では、本明細書で提供されるのは、配列番号４のアミノ酸配列またはその機能的断片、あるいは配列番号４に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む改変ＴＣＲを発現し、さらに１つまたは複数の細胞内タンパク質を発現する、遺伝子操作されたリンパ球系細胞である。細胞内タンパク質は、ホスホジエステラーゼ（例えば、ＰＤＥ４Ｂ２）であり得る。遺伝子操作されたリンパ球系細胞は、１つまたは複数の細胞表面受容体をさらに発現し得る。
一実施形態では、本明細書で提供されるのは、配列番号５のアミノ酸配列またはその機能的断片、あるいは配列番号５に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む改変ＴＣＲを発現し、さらに１つまたは複数の細胞内タンパク質を発現する、遺伝子操作されたリンパ球系細胞である。細胞内タンパク質は、ホスホジエステラーゼ（例えば、ＰＤＥ４Ｂ２）であり得る。遺伝子操作されたリンパ球系細胞は、１つまたは複数の細胞表面受容体をさらに発現し得る。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される遺伝子操作されたリンパ球は、本発明の改変ＴＣＲに加えて、ホスホジエステラーゼを発現する。いくつかの実施形態において、ホスホジエステラーゼは、ホスホジエステラーゼ４Ｂ２（ＰＤＥ４Ｂ２）、ホスホジエステラーゼ４Ａ（ＰＤＥ４Ａ）、ホスホジエステラーゼ７Ａ（ＰＤＥ７Ａ）、またはホスホジエステラーゼ４Ｃ（ＰＤＥ４Ｃ）である。一実施形態では、ホスホジエステラーゼは、ホスホジエステラーゼ４Ｂ２（ＰＤＥ４Ｂ２）である。
一実施形態では、ＰＤＥ４Ｂ２は、ヒトＰＤＥ４Ｂ２またはその機能的断片である。ヒトＰＤＥ４Ｂ２のＧｅｎｌｎｆｏ識別子は８２７９９４８２であり、ＮＣＢＩアクセッション番号はＮＰ＿００１０３２４１６である。
いくつかの実施形態において、ＰＤＥ４Ｂ２は、配列番号２７のアミノ酸配列、あるいは配列番号２７に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ＰＤＥ４Ｂ２は、配列番号２７のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＰＤＥ４Ｂ２をコードするヌクレオチド配列は、配列番号２８のヌクレオチド配列、あるいは配列番号２８に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、ＰＤＥ４Ｂ２をコードするヌクレオチド配列は、配列番号２８のヌクレオチド配列を含む。
一実施形態では、ＰＤＥ４Ｂ２は、マウスＰＤＥ４Ｂ２またはその機能的断片である。マウスＰＤＥ４Ｂ２のＧｅｎｌｎｆｏ識別子は２９５７８９１２９であり、ＮＣＢＩアクセッション番号はＮＰ＿００１１７１４５１である。
いくつかの実施形態では、ＰＤＥ４Ｂ２は、配列番号２９のアミノ酸配列、あるいは配列番号２９に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ＰＤＥ４Ｂ２は、配列番号２９のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＰＤＥ４Ｂ２をコードするヌクレオチド配列は、配列番号３０のヌクレオチド配列、あるいは配列番号３０に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、ＰＤＥ４Ｂ２をコードするヌクレオチド配列は、配列番号３０のヌクレオチド配列を含む。
ＰＤＥ４Ｂ２またはその機能的断片を発現するのに有用な配列の例を以下に提供する。
ヒトＰＤＥ４Ｂ２アミノ酸配列
ＭＫＥＨＧＧＴＦＳＳＴＧＩＳＧＧＳＧＤＳＡＭＤＳＬＱＰＬＱＰＮＹＭＰＶＣＬＦＡＥＥＳＹＱＫＬＡＭＥＴＬＥＥＬＤＷＣＬＤＱＬＥＴＩＱＴＹＲＳＶＳＥＭＡＳＮＫＦＫＲＭＬＮＲＥＬＴＨＬＳＥＭＳＲＳＧＮＱＶＳＥＹＩＳＮＴＦＬＤＫＱＮＤＶＥＩＰＳＰＴＱＫＤＲＥＫＫＫＫＱＱＬＭＴＱＩＳＧＶＫＫＬＭＨＳＳＳＬＮＮＴＳＩＳＲＦＧＶＮＴＥＮＥＤＨＬＡＫＥＬＥＤＬＮＫＷＧＬＮＩＦＮＶＡＧＹＳＨＮＲＰＬＴＣＩＭＹＡＩＦＱＥＲＤＬＬＫＴＦＲＩＳＳＤＴＦＩＴＹＭＭＴＬＥＤＨＹＨＳＤＶＡＹＨＮＳＬＨＡＡＤＶＡＱＳＴＨＶＬＬＳＴＰＡＬＤＡＶＦＴＤＬＥＩＬＡＡＩＦＡＡＡＩＨＤＶＤＨＰＧＶＳＮＱＦＬＩＮＴＮＳＥＬＡＬＭＹＮＤＥＳＶＬＥＮＨＨＬＡＶＧＦＫＬＬＱＥＥＨＣＤＩＦＭＮＬＴＫＫＱＲＱＴＬＲＫＭＶＩＤＭＶＬＡＴＤＭＳＫＨＭＳＬＬＡＤＬＫＴＭＶＥＴＫＫＶＴＳＳＧＶＬＬＬＤＮＹＴＤＲＩＱＶＬＲＮＭＶＨＣＡＤＬＳＮＰＴＫＳＬＥＬＹＲＱＷＴＤＲＩＭＥＥＦＦＱＱＧＤＫＥＲＥＲＧＭＥＩＳＰＭＣＤＫＨＴＡＳＶＥＫＳＱＶＧＦＩＤＹＩＶＨＰＬＷＥＴＷＡＤＬＶＱＰＤＡＱＤＩＬＤＴＬＥＤＮＲＮＷＹＱＳＭＩＰＱＳＰＳＰＰＬＤＥＱＮＲＤＣＱＧＬＭＥＫＦＱＦＥＬＴＬＤＥＥＤＳＥＧＰＥＫＥＧＥＧＨＳＹＦＳＳＴＫＴＬＣＶＩＤＰＥＮＲＤＳＬＧＥＴＤＩＤＩＡＴＥＤＫＳＰＶＤＴ（配列番号２７）
ヒトＰＤＥ４Ｂ２のヌクレオチド配列
ＡＴＧＡＡＧＧＡＡＣＡＣＧＧＣＧＧＣＡＣＣＴＴＴＡＧＣＡＧＣＡＣＡＧＧＣＡＴＣＴＣＴＧＧＴＧＧＣＡＧＣＧＧＣＧＡＴＡＧＣＧＣＣＡＴＧＧＡＴＴＣＴＣＴＧＣＡＡＣＣＣＣＴＧＣＡＧＣＣＴＡＡＣＴＡＣＡＴＧＣＣＣＧＴＧＴＧＣＣＴＧＴＴＣＧＣＣＧＡＧＧＡＡＡＧＣＴＡＣＣＡＧＡＡＡＣＴＧＧＣＣＡＴＧＧＡＡＡＣＣＣＴＧＧＡＡＧＡＡＣＴＧＧＡＣＴＧＧＴＧＣＣＴＧＧＡＣＣＡＧＣＴＧＧＡＡＡＣＣＡＴＣＣＡＧＡＣＣＴＡＣＡＧＡＴＣＣＧＴＧＴＣＣＧＡＧＡＴＧＧＣＣＡＧＣＡＡＣＡＡＧＴＴＣＡＡＧＣＧＧＡＴＧＣＴＧＡＡＣＡＧＡＧＡＧＣＴＧＡＣＣＣＡＣＣＴＧＡＧＣＧＡＧＡＴＧＡＧＣＣＧＣＴＣＴＧＧＡＡＡＴＣＡＧＧＴＧＴＣＣＧＡＧＴＡＴＡＴＣＡＧＣＡＡＣＡＣＣＴＴＣＣＴＧＧＡＣＡＡＧＣＡＧＡＡＣＧＡＣＧＴＧＧＡＡＡＴＣＣＣＡＴＣＴＣＣＴＡＣＡＣＡＧＡＡＧＧＡＣＣＧＣＧＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＡＡＡＧＣＡＧＣＡＧＣＴＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＡＴＣＡＧＣＧＧＣＧＴＧＡＡＧＡＡＡＣＴＧＡＴＧＣＡＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＡＡＣＡＡＣＡＣＣＡＧＣＡＴＣＡＧＣＡＧＡＴＴＣＧＧＣＧＴＧＡＡＣＡＣＣＧＡＧＡＡＣＧＡＧＧＡＣＣＡＣＣＴＧＧＣＣＡＡＡＧＡＧＣＴＧＧＡＡＧＡＴＣＴＧＡＡＣＡＡＡＴＧＧＧＧＣＣＴＧＡＡＣＡＴＣＴＴＣＡＡＣＧＴＧＧＣＣＧＧＣＴＡＣＡＧＣＣＡＣＡＡＣＡＧＡＣＣＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＡＴＴＡＴＧＴＡＣＧＣＣＡＴＣＴＴＣＣＡＡＧＡＧＣＧＧＧＡＣＣＴＧＣＴＧＡＡＡＡＣＣＴＴＣＣＧＧＡＴＣＡＧＣＡＧＣＧＡＣＡＣＣＴＴＣＡＴＣＡＣＣＴＡＣＡＴＧＡＴＧＡＣＣＣＴＴＧＡＧＧＡＣＣＡＣＴＡＣＣＡＣＡＧＣＧＡＣＧＴＧＧＣＣＴＡＣＣＡＣＡＡＴＡＧＣＣＴＧＣＡＴＧＣＣＧＣＴＧＡＴＧＴＧＧＣＣＣＡＧＡＧＣＡＣＡＣＡＣＧＴＧＣＴＧＣＴＧＴＣＴＡＣＡＣＣＡＧＣＴＣＴＧＧＡＴＧＣＣＧＴＧＴＴＣＡＣＣＧＡＣＣＴＧＧＡＡＡＴＴＣＴＧＧＣＣＧＣＣＡＴＣＴＴＴＧＣＣＧＣＣＧＣＴＡＴＣＣＡＣＧＡＴＧＴＴＧＡＴＣＡＣＣＣＣＧＧＣＧＴＧＴＣＣＡＡＣＣＡＧＴＴＣＣＴＧＡＴＣＡＡＴＡＣＣＡＡＣＡＧＣＧＡＧＣＴＧＧＣＣＣＴＧＡＴＧＴＡＣＡＡＣＧＡＣＧＡＧＡＧＣＧＴＧＣＴＧＧＡＡＡＡＣＣＡＣＣＡＴＣＴＧＧＣＣＧＴＧＧＧＣＴＴＣＡＡＧＣＴＧＣＴＧＣＡＡＧＡＧＧＡＡＣＡＣＴＧＣＧＡＣＡＴＣＴＴＣＡＴＧＡＡＣＣＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＧＣＡＧＣＧＧＣＡＧＡＣＣＣＴＧＣＧＧＡＡＧＡＴＧＧＴＣＡＴＣＧＡＴＡＴＧＧＴＧＣＴＧＧＣＣＡＣＣＧＡＣＡＴＧＡＧＣＡＡＧＣＡＣＡＴＧＴＣＴＣＴＧＣＴＧＧＣＣＧＡＣＣＴＧＡＡＡＡＣＣＡＴＧＧＴＣＧＡＧＡＣＡＡＡＧＡＡＡＧＴＧＡＣＣＡＧＣＡＧＣＧＧＣＧＴＴＣＴＧＣＴＧＣＴＧＧＡＣＡＡＣＴＡＣＡＣＣＧＡＣＡＧＡＡＴＣＣＡＧＧＴＧＣＴＧＡＧＡＡＡＣＡＴＧＧＴＧＣＡＣＴＧＣＧＣＣＧＡＴＣＴＧＡＧＣＡＡＣＣＣＣＡＣＣＡＡＧＡＧＣＣＴＧＧＡＡＣＴＧＴＡＣＡＧＡＣＡＧＴＧＧＡＣＣＧＡＣＣＧＧＡＴＣＡＴＧＧＡＡＧＡＧＴＴＣＴＴＴＣＡＧＣＡＡＧＧＣＧＡＣＡＡＡＧＡＡＣＧＣＧＡＧＣＧＣＧＧＣＡＴＧＧＡＡＡＴＣＴＣＣＣＣＡＡＴＧＴＧＣＧＡＴＡＡＧＣＡＣＡＣＣＧＣＣＡＧＣＧＴＧＧＡＡＡＡＧＴＣＣＣＡＡＧＴＧＧＧＣＴＴＴＡＴＣＧＡＣＴＡＣＡＴＣＧＴＧＣＡＣＣＣＴＣＴＧＴＧＧＧＡＧＡＣＡＴＧＧＧＣＣＧＡＴＣＴＧＧＴＴＣＡＧＣＣＴＧＡＣＧＣＴＣＡＧＧＡＣＡＴＣＣＴＧＧＡＣＡＣＡＣＴＧＧＡＡＧＡＴＡＡＣＣＧＧＡＡＣＴＧＧＴＡＴＣＡＧＡＧＣＡＴＧＡＴＣＣＣＴＣＡＧＡＧＣＣＣＣＴＣＴＣＣＡＣＣＴＣＴＧＧＡＴＧＡＧＣＡＧＡＡＣＡＧＡＧＡＴＴＧＣＣＡＧＧＧＣＣＴＧＡＴＧＧＡＡＡＡＧＴＴＣＣＡＧＴＴＣＧＡＧＣＴＧＡＣＡＣＴＧＧＡＣＧＡＡＧＡＧＧＡＣＴＣＴＧＡＧＧＧＣＣＣＣＧＡＧＡＡＡＧＡＡＧＧＣＧＡＧＧＧＣＣＡＣＡＧＣＴＡＣＴＴＣＡＧＣＡＧＣＡＣＡＡＡＧＡＣＣＣＴＧＴＧＣＧＴＧＡＴＣＧＡＣＣＣＣＧＡＧＡＡＣＡＧＧＧＡＴＡＧＣＣＴＧＧＧＣＧＡＧＡＣＡＧＡＣＡＴＣＧＡＣＡＴＴＧＣＣＡＣＣＧＡＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＣＣＣＧＴＧＧＡＴＡＣＡ（配列番号２８）
マウスＰＤＥ４Ｂ２のアミノ酸配列
ＭＫＥＱＧＧＴＶＳＧＡＡＳＳＲＧＧＧＤＳＡＭＡＳＬＱＰＬＱＰＮＹＬＳＶＣＬＦＰＥＥＳＹＱＫＬＡＭＥＴＬＥＥＬＤＷＣＬＤＱＬＥＴＩＱＴＹＲＳＶＳＥＭＡＳＮＫＦＫＲＭＬＮＲＥＬＴＨＬＳＥＭＳＲＳＧＮＱＶＳＥＹＩＳＮＴＦＬＤＫＱＮＤＶＥＩＰＳＰＴＱＫＤＲＥＫＫＫＫＱＱＬＭＴＱＩＳＧＶＫＫＬＭＨＳＳＳＬＮＮＴＳＩＳＲＦＧＶＮＴＥＮＥＤＨＬＡＫＥＬＥＤＬＮＫＷＧＬＮＩＦＮＶＡＧＹＳＨＮＲＰＬＴＣＩＭＹＡＩＦＱＥＲＤＬＬＫＴＦＫＩＳＳＤＴＦＶＴＹＭＭＴＬＥＤＨＹＨＳＤＶＡＹＨＮＳＬＨＡＡＤＶＡＱＳＴＨＶＬＬＳＴＰＡＬＤＡＶＦＴＤＬＥＩＬＡＡＩＦＡＡＡＩＨＤＶＤＨＰＧＶＳＮＱＦＬＩＮＴＮＳＥＬＡＬＭＹＮＤＥＳＶＬＥＮＨＨＬＡＶＧＦＫＬＬＱＥＥＨＣＤＩＦＱＮＬＴＫＫＱＲＱＴＬＲＫＭＶＩＤＭＶＬＡＴＤＭＳＫＨＭＳＬＬＡＤＬＫＴＭＶＥＴＫＫＶＴＳＳＧＶＬＬＬＤＮＹＴＤＲＩＱＶＬＲＮＭＶＨＣＡＤＬＳＮＰＴＫＳＬＥＬＹＲＱＷＴＤＲＩＭＥＥＦＦＱＱＧＤＫＥＲＥＲＧＭＥＩＳＰＭＣＤＫＨＴＡＳＶＥＫＳＱＶＧＦＩＤＹＩＶＨＰＬＷＥＴＷＡＤＬＶＱＰＤＡＱＤＩＬＤＴＬＥＤＮＲＮＷＹＱＳＭＩＰＱＳＰＳＰＰＬＤＥＲＳＲＤＣＱＧＬＭＥＫＦＱＦＥＬＴＬＥＥＥＤＳＥＧＰＥＫＥＧＥＧＨＳＹＦＳＳＴＫＴＬＣＶＩＤＰＥＮＲＤＳＬＥＥＴＤＩＤＩＡＴＥＤＫＳＰＩＤＴ（配列番号２９）
マウスＰＤＥ４Ｂ２のヌクレオチド配列
ＡＴＧＡＡＧＧＡＡＣＡＧＧＧＣＧＧＣＡＣＣＧＴＧＴＣＴＧＧＣＧＣＣＧＣＴＴＣＴＡＧＴＡＧＡＧＧＣＧＧＡＧＧＣＧＡＴＡＧＣＧＣＣＡＴＧＧＣＣＡＧＴＣＴＧＣＡＧＣＣＡＣＴＧＣＡＧＣＣＣＡＡＣＴＡＣＣＴＧＡＧＣＧＴＧＴＧＣＣＴＧＴＴＣＣＣＣＧＡＧＧＡＡＡＧＣＴＡＣＣＡＧＡＡＡＣＴＧＧＣＴＡＴＧＧＡＡＡＣＣＣＴＧＧＡＡＧＡＡＣＴＧＧＡＣＴＧＧＴＧＣＣＴＧＧＡＣＣＡＧＣＴＧＧＡＡＡＣＣＡＴＣＣＡＧＡＣＣＴＡＣＡＧＡＴＣＣＧＴＧＴＣＣＧＡＧＡＴＧＧＣＣＡＧＣＡＡＣＡＡＧＴＴＣＡＡＧＡＧＧＡＴＧＣＴＧＡＡＣＡＧＡＧＡＧＣＴＧＡＣＣＣＡＣＣＴＧＡＧＣＧＡＧＡＴＧＡＧＣＡＧＡＴＣＣＧＧＣＡＡＣＣＡＧＧＴＧＴＣＣＧＡＧＴＡＴＡＴＣＡＧＣＡＡＣＡＣＣＴＴＣＣＴＧＧＡＣＡＡＧＣＡＧＡＡＣＧＡＣＧＴＧＧＡＡＡＴＣＣＣＣＡＧＣＣＣＣＡＣＣＣＡＧＡＡＧＧＡＣＣＧＣＧＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＡＡＡＧＣＡＧＣＡＧＣＴＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＡＴＣＡＧＣＧＧＣＧＴＧＡＡＧＡＡＡＣＴＧＡＴＧＣＡＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＡＡＣＡＡＣＡＣＣＡＧＣＡＴＣＡＧＣＡＧＡＴＴＣＧＧＣＧＴＧＡＡＣＡＣＣＧＡＧＡＡＣＧＡＧＧＡＣＣＡＣＣＴＧＧＣＣＡＡＡＧＡＧＣＴＧＧＡＡＧＡＴＣＴＧＡＡＣＡＡＡＴＧＧＧＧＣＣＴＧＡＡＣＡＴＣＴＴＣＡＡＣＧＴＧＧＣＣＧＧＣＴＡＣＡＧＣＣＡＣＡＡＣＡＧＡＣＣＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＡＴＴＡＴＧＴＡＣＧＣＣＡＴＣＴＴＣＣＡＧＧＡＡＣＧＧＧＡＣＣＴＧＣＴＧＡＡＡＡＣＣＴＴＣＡＡＧＡＴＣＡＧＣＡＧＣＧＡＣＡＣＣＴＴＣＧＴＧＡＣＣＴＡＣＡＴＧＡＴＧＡＣＡＣＴＧＧＡＡＧＡＴＣＡＣＴＡＣＣＡＣＡＧＣＧＡＣＧＴＧＧＣＣＴＡＣＣＡＣＡＡＣＴＣＴＣＴＧＣＡＣＧＣＣＧＣＣＧＡＴＧＴＧＧＣＣＣＡＧＡＧＣＡＣＴＣＡＴＧＴＧＣＴＧＣＴＧＡＧＣＡＣＣＣＣＴＧＣＣＣＴＧＧＡＣＧＣＣＧＴＧＴＴＣＡＣＣＧＡＴＣＴＧＧＡＡＡＴＣＣＴＧＧＣＣＧＣＴＡＴＣＴＴＣＧＣＣＧＣＴＧＣＣＡＴＣＣＡＣＧＡＴＧＴＧＧＡＣＣＡＣＣＣＴＧＧＣＧＴＧＴＣＣＡＡＣＣＡＧＴＴＣＣＴＧＡＴＣＡＡＣＡＣＡＡＡＣＡＧＣＧＡＧＣＴＧＧＣＣＣＴＧＡＴＧＴＡＣＡＡＣＧＡＣＧＡＧＡＧＣＧＴＧＣＴＧＧＡＡＡＡＣＣＡＣＣＡＴＣＴＧＧＣＣＧＴＧＧＧＣＴＴＣＡＡＧＣＴＧＣＴＧＣＡＧＧＡＡＧＡＡＣＡＣＴＧＣＧＡＣＡＴＣＴＴＴＣＡＧＡＡＣＣＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＧＣＡＧＡＧＧＣＡＧＡＣＣＣＴＧＡＧＡＡＡＧＡＴＧＧＴＣＡＴＣＧＡＣＡＴＧＧＴＧＣＴＧＧＣＣＡＣＣＧＡＣＡＴＧＡＧＣＡＡＧＣＡＣＡＴＧＴＣＣＣＴＧＣＴＧＧＣＣＧＡＣＣＴＧＡＡＡＡＣＣＡＴＧＧＴＧＧＡＡＡＣＡＡＡＧＡＡＡＧＴＧＡＣＣＡＧＣＴＣＣＧＧＣＧＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＧＡＣＡＡＣＴＡＣＡＣＣＧＡＣＡＧＡＡＴＣＣＡＧＧＴＧＣＴＧＡＧＧＡＡＣＡＴＧＧＴＧＣＡＣＴＧＣＧＣＣＧＡＣＣＴＧＴＣＣＡＡＣＣＣＣＡＣＣＡＡＧＡＧＣＣＴＧＧＡＡＣＴＧＴＡＣＡＧＡＣＡＧＴＧＧＡＣＣＧＡＣＡＧＧＡＴＣＡＴＧＧＡＡＧＡＧＴＴＣＴＴＴＣＡＧＣＡＡＧＧＣＧＡＣＡＡＡＧＡＡＣＧＣＧＡＧＡＧＧＧＧＣＡＴＧＧＡＡＡＴＣＡＧＣＣＣＣＡＴＧＴＧＣＧＡＣＡＡＧＣＡＣＡＣＣＧＣＣＡＧＣＧＴＧＧＡＡＡＡＧＴＣＣＣＡＡＧＴＧＧＧＣＴＴＴＡＴＣＧＡＣＴＡＣＡＴＣＧＴＧＣＡＣＣＣＣＣＴＧＴＧＧＧＡＧＡＣＡＴＧＧＧＣＣＧＡＴＣＴＧＧＴＧＣＡＧＣＣＴＧＡＣＧＣＣＣＡＧＧＡＣＡＴＣＣＴＧＧＡＣＡＣＴＣＴＧＧＡＡＧＡＴＡＡＣＣＧＧＡＡＣＴＧＧＴＡＴＣＡＧＡＧＣＡＴＧＡＴＣＣＣＣＣＡＧＡＧＣＣＣＣＡＧＣＣＣＴＣＣＡＣＴＧＧＡＣＧＡＧＡＧＡＴＣＣＡＧＡＧＡＣＴＧＣＣＡＧＧＧＣＣＴＧＡＴＧＧＡＡＡＡＧＴＴＣＣＡＧＴＴＣＧＡＧＣＴＧＡＣＴＣＴＧＧＡＡＧＡＡＧＡＧＧＡＣＡＧＣＧＡＧＧＧＣＣＣＣＧＡＧＡＡＡＧＡＡＧＧＣＧＡＧＧＧＣＣＡＣＴＣＴＴＡＣＴＴＣＡＧＣＡＧＣＡＣＣＡＡＧＡＣＡＣＴＧＴＧＣＧＴＧＡＴＣＧＡＣＣＣＣＧＡＧＡＡＣＡＧＧＧＡＣＡＧＣＣＴＣＧＡＡＧＡＧＡＣＴＧＡＣＡＴＣＧＡＣＡＴＴＧＣＣＡＣＣＧＡＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＣＣＣＡＴＣＧＡＴＡＣＡ（配列番号３０）
二機能性分子
強力な抗腫瘍Ｔ細胞免疫の欠如を克服するための１つのアプローチは、上記のＴ細胞受容体または抗体由来受容体のいずれかから作製される親和性増強受容体の使用による、腫瘍を標的とするＴ細胞のｅｘ ｖｉｖｏ遺伝子改変である。Ｔ細胞のｅｘ ｖｉｖｏ操作を必要としない補完的なアプローチは、腫瘍認識とＴ細胞誘導（T cell engaging）ドメインを組み合わせてＴ細胞を標的腫瘍に向けなおす（redirect）融合タンパク質の使用を含む。そのような融合タンパク質の特異性および抗腫瘍活性は、例えば、Cancer Immunol Immunother (2013) 62:773-785, Nat Med. 2012 Jun;18(6):980-7、および米国特許第７，７６３，７１８号に記載され、これらのそれぞれは、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
一態様では、本明細書に提供されるのは、本明細書に開示される改変ＴＣＲまたはその機能的断片と、Ｔ細胞上の細胞表面タンパク質に特異的に結合するポリペプチドとを含む二機能性分子である。Ｔ細胞上の細胞表面タンパク質の例には、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４４、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＢ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ４９ａ、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ１６、ＣＤ２８、およびＩＬ－２Ｒが含まれるが、これらに限定されない。
特定の実施形態において、ポリペプチドは、免疫エフェクターポリペプチドである。
本明細書で使用される場合、「免疫エフェクターポリペプチド」という用語は、一般に、Ｔ細胞の活性化などによる、免疫系の液性または細胞性アームの直接的または間接的活性化を通して、免疫応答を誘導または刺激する任意の分子を指す。免疫エフェクターポリペプチドの例には、ＩＬ－１、ＩＬ－１α、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＩＬ－２３、ＴＧＦ－β、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦα、抗ＣＤ２抗体、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ８抗体、抗ＣＤ４４抗体、抗ＣＤ４５ＲＡ抗体、抗ＣＤ４５ＲＢ抗体、抗ＣＤ４５ＲＯ抗体、抗ＣＤ４９ａ抗体、抗ＣＤ４９ｂ抗体、抗ＣＤ４９ｃ抗体、抗ＣＤ４９ｄ抗体、抗ＣＤ４９ｅ抗体、抗ＣＤ４９ｆ抗体、抗ＣＤ１６抗体、抗ＣＤ２８抗体、抗ＩＬ－２Ｒ抗体、ウイルスタンパク質およびペプチド、および細菌タンパク質またはペプチドが含まれるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、抗体または抗体フラグメントを含む。抗体フラグメントには、一本鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆｖフラグメント、単鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）、（Ｆａｂ）２’フラグメントなどの二価抗体フラグメント、Ｆ（ａｂ’）フラグメント、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、イントラボディ、ミニボディ、ジアボディ、トリアボディ、およびデカボディが含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、ポリペプチドはｓｃＦｖを含む。特定の実施形態において、ポリペプチドは免疫エフェクターポリペプチドである。
いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、ＣＤ３に特異的に結合する。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、抗ＣＤ３抗体を含む。抗ＣＤ３抗体の例には、ＯＫＴ３、ＵＣＨＴ－１、ＢＭＡ０３１、および１２Ｆ６が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、抗ＣＤ３抗体に由来するｓｃＦｖを含む。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、ＯＫＴ３、ＵＣＨＴ－１、ＢＭＡ０３１または１２Ｆ６に由来するｓｃＦｖを含む。特定の実施形態において、ＣＤ３に特異的に結合するポリペプチドは、免疫エフェクターポリペプチドである。
特定の実施形態において、ＴＣＲのＮ末端は、Ｔ細胞上の細胞表面タンパク質に特異的に結合するポリペプチドのＣ末端に連結される。特定の実施形態において、ＴＣＲのＣ末端は、Ｔ細胞上の細胞表面タンパク質に特異的に結合するポリペプチドのＮ末端に連結される。特定の実施形態において、ＴＣＲは、ヘテロ二量体αβＴＣＲポリペプチド対、または一本鎖αβＴＣＲ（ｓｃＴＣＲ）ポリペプチドであり、ヘテロ二量体ＴＣＲポリペプチド対のα鎖もしくはβ鎖のＮ末端、またはｓｃＴＣＲポリペプチドのＮ末端は、Ｔ細胞の細胞表面タンパク質に特異的に結合するポリペプチドのＣ末端アミノ酸に連結される。特定の実施形態において、ＴＣＲは、ヘテロ二量体αβＴＣＲポリペプチド対、または一本鎖αβＴＣＲポリペプチドであり、ヘテロ二量体ＴＣＲポリペプチド対のα鎖もしくはβ鎖のＣ末端、またはｓｃＴＣＲポリペプチドのＣ末端は、Ｔ細胞の細胞表面タンパク質に特異的に結合するポリペプチドのＮ末端アミノ酸に連結される。
ＴＣＲと、Ｔ細胞の細胞表面タンパク質に特異的に結合するポリペプチドとの連結は、直接的であっても、またはリンカー配列を介して間接的であってもよい。リンカー配列は通常柔軟性があり、それら配列は、柔軟性を制限する可能性のある嵩高い側鎖を持たないグリシン、アラニン、セリンなどのアミノ酸で構成される。リンカー配列の使用可能なまたは最適な長さは、任意の所与のＴＣＲ二機能性分子の場合において簡単に決定される。一部の例では、リンカーは、約１２未満、例えば、約１０未満、または５～１０のアミノ酸長である。
本明細書に記載の二機能性分子のいくつかの実施形態において、改変ＴＣＲまたはその機能的断片は、配列番号２～５のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むβ鎖を含む。一実施形態では、改変ＴＣＲまたはその機能的断片は、配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むβ鎖を含む。一実施形態では、改変ＴＣＲまたはその機能的断片は、配列番号３のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むβ鎖を含む。一実施形態では、改変ＴＣＲまたはその機能的断片は、配列番号４のアミノ酸に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むβ鎖を含む。一実施形態では、改変ＴＣＲまたはその機能的断片は、配列番号５のアミノ酸に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むβ鎖を含む。上記の実施形態のいずれかにおいて、改変ＴＣＲまたはその機能的断片は、非置換ＷＴ ＴＣＲのβ鎖（例えば、配列番号１に記載される）と比較して、β鎖のＣＤＲ２内に単一アミノ酸置換を含む。
本明細書に記載の二機能性分子の特定の実施形態において、改変ＴＣＲまたはその機能的断片は、配列番号２～５のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列を含むβ鎖を含む。一実施形態では、改変ＴＣＲまたはその機能的断片は、配列番号２のアミノ酸配列を含むβ鎖を含む。一実施形態では、改変ＴＣＲまたはその機能的断片は、配列番号３のアミノ酸配列を含むβ鎖を含む。一実施形態では、改変ＴＣＲまたはその機能的断片は、配列番号４のアミノ酸配列を含むβ鎖を含む。一実施形態では、改変ＴＣＲまたはその機能的断片は、配列番号５のアミノ酸配列を含むβ鎖を含む。
本明細書に記載の二機能性分子の特定の実施形態において、改変ＴＣＲまたはその機能的断片は、配列番号７のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むα鎖をさらに含む。一実施形態では、改変ＴＣＲまたはその機能的断片は、配列番号７のアミノ酸配列を含むα鎖をさらに含む。
様々な実施形態において、本明細書に記載の二機能性分子は、本明細書に記載の宿主細胞または医薬組成物と組み合わせて使用され得る。
治療方法
一態様では、本明細書で提供されるのは、対象におけるがんを治療する方法である。この方法は、そのようながんを患っている対象に、有効量の本発明の改変ＴＣＲを提示するリンパ球系細胞、またはそのような細胞を含む医薬組成物を投与することを含む。本明細書に記載の方法によって治療可能ながんの非限定的な例には、例えば、神経芽細胞腫、骨髄腫、転移性メラノーマ（黒色腫）、滑膜肉腫、膀胱がん、食道がん、肝細胞がん、頭頸部がん、非小細胞肺がん、卵巣がん、前立腺がん、および乳がんが含まれる。
一態様では、本明細書で提供されるのは、哺乳動物における免疫応答を刺激または増強する方法であり、有効量の本発明の遺伝子操作されたリンパ球系細胞、またはそのような細胞を含む医薬組成物を哺乳動物に投与することを含む。
がんの追加の例には、がん腫、リンパ腫、芽細胞腫（blastoma）、肉腫（例えば、骨肉腫または横紋筋肉腫）、および白血病またはリンパ性悪性腫瘍が含まれるが、これらに限定されない。そのようながんのより具体的な例には、扁平上皮がん（例えば、上皮性扁平上皮がん）、腺扁平上皮がん、肺がん（例えば、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、肺の腺がん、肺の扁平上皮がんを含む）、腹膜がん、肝細胞がん、胃がんまたは腹部がん（gastric or stomach cancer）（例えば、消化器がん、膵臓がんを含む）、子宮頸がん、卵巣がん、肝臓がん、膀胱がん、尿路がん、肝細胞がん（hepatoma）、乳がん、結腸がん、直腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜がんまたは子宮がん、唾液腺がん、腎臓がんまたは腎がん、前立腺がん、外陰がん、甲状腺がん、肝がん、肛門がん、陰茎がん、原発性または転移性メラノーマ（黒色腫）、多発性骨髄腫およびＢ細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、脳（例えば、高悪性度神経膠腫（グリオーマ）、びまん性橋膠腫（diffuse pontine glioma）、上衣腫、神経芽細胞腫（もしくは神経膠腫）（neuroblastoma）、または膠芽腫（glioblastoma））、および頭頸部がん、ならびに関連する転移が含まれる。腫瘍の追加の例は、The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 19th Edition, § on Hematology and Oncology, published by Merck Sharp & Dohme Corp., 2011 (ISBN 978-0-911910-19-3); The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 20th Edition, § on Hematology and Oncology, published by Merck Sharp & Dohme Corp., 2018 (ISBN 978-0-911-91042-1) (2018 digital online edition at internet website of Merck Manuals);およびSEER Program Coding and Staging Manual 2016に記載され、これらはそれぞれ、すべての目的のために参照により完全に組み込まれる。
様々な実施形態において、本明細書に記載の方法によって治療可能ながんは、その細胞の表面にがん抗原ＮＹ－ＥＳＯ－１１５７－１６５エピトープ（配列番号８）を提示する。
上記の治療方法のいずれかのいくつかの実施形態では、組成物は治療有効量で投与される。本発明の方法で投与される組成物の投与量は、対象の身体パラメータ、投与頻度、投与方法、クリアランス速度などに応じて大きく変化するであろう。初期用量はより多くなる可能性があり、その後により少ない維持用量が続く可能性がある。有効な投与量レベルを維持するために、用量は、毎週または隔週のように少ない頻度で投与されるか、あるいはより少ない用量に分割されて、毎日、半週ごとなどに投与され得る。様々な用量が改変宿主細胞のｉｎ ｖｉｖｏ持続性を達成するのに有効となり得ることが企図される。また、様々な用量が改変宿主細胞のｉｎ ｖｉｖｏエフェクター機能を改善するのに有効となり得ることも企図される。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法によって作製された改変宿主細胞を含む組成物は、１０２～１０１０細胞／ｋｇ体重、１０５～１０９細胞／ｋｇ体重、１０５～１０８細胞／ｋｇ体重、１０５～１０７細胞／ｋｇ体重、１０７～１０９細胞／ｋｇ体重、または１０７～１０８細胞／ｋｇ体重（これらの範囲内のすべての整数値を含む）の投与量で投与され得る。改変宿主細胞の数は、組成物が意図される治療用途に依存するであろう。
改変宿主細胞は、上記の投与量で複数回投与されてもよい。改変宿主細胞は、治療を受けている患者に対して、同種異系、同系、異種、または自己由来（自家）であり得る。
本開示に記載される組成物および方法は、化学療法、外科手術、放射線療法、遺伝子治療などの他のタイプの腫瘍治療と組み合わせて利用することができる。
様々な疾患／障害を治療するために使用される場合、本開示の組成物および方法は、同じまたは類似の疾患／障害に適した他の治療方法／薬剤と共に利用され得ることも企図される。そのような他の治療方法／薬剤を共投与（同時にまたは逐次的に）して、相加的または相乗的効果を生み出すことができる。各薬剤の適切な治療上有効な投与量は、相加作用または相乗効果のために低減され得る。
上記の治療方法のいずれかのいくつかの実施形態において、この方法は、免疫抑制剤、生物学的製剤、プロバイオティクス、プレバイオティクス、およびサイトカイン（例えば、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＦＮまたはＩＬ－２）からなる群より選択される１つまたは複数の追加の化合物を対象に投与することをさらに含む。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法は、本開示のキメラサイトカイン受容体を発現する免疫細胞の機能を増強するために、免疫細胞によって産生されるＧＭ－ＣＳＦに加えて、外因性ＧＭ－ＣＳＦを提供することをさらに含む。外因性ＧＭ－ＣＳＦは、例えば、ｉ）ＦＤＡ承認のＧＭ－ＣＳＦ薬サルグラモスチム（Ｌｅｕｋｉｎｅ（商標））の注射、またはｉｉ）ＧＭ－ＣＳＦを発現する非ウイルスまたはウイルスベクター（例えば、ＦＤＡ承認のＧＭ－ＣＳＦを発現する腫瘍溶解性ウイルス タリモジェンラヘルパレプベック［ＴＶＥＣ、Ｉｍｌｙｇｉｃ（商標）］）の使用によって提供され得る。これらの薬物は、本開示のキメラサイトカイン受容体を発現する免疫細胞の患者への投与（例えば、注入）の前に、投与と一緒に、または投与後に与えることができる。
非限定的な例として、本発明は、（例えば、ＩＬ１、ＩＮＦα／β、ＩＬ６、ＴＮＦ、ＩＬ２３などの遮断を介して）炎症を遮断する他の治療法と組み合わせることができる。
本発明の方法および組成物は、例えば、治療用ワクチン（ＧＶＡＸ、ＤＣベースのワクチンなどを含むがこれらに限定されない）、チェックポイント阻害剤（ＣＴＬＡ４、ＰＤ１、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３などを遮断する薬剤を含むがこれらに限定されない）、または活性化剤（４－１ＢＢ、ＯＸ４０などを増強する薬剤を含むがこれらに限定されない）などの他の免疫調節治療と組み合わせることができる。本発明の方法はまた、ＮＫＴ機能または安定性を調節する能力を有する他の治療と組み合わせることができ、これには、抗原をロードされていないまたはロードされた、ＣＤ１ｄ、ＣＤ１ｄ融合タンパク質、ＣＤ１ｄ二量体またはＣＤ１ｄのより大きなポリマー；ＣＤ１ｄ－キメラ抗原受容体（ＣＤ１ｄ－ＣＡＲ）；またはヒトに存在する５つの既知のＣＤ１異性体（ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ、ＣＤ１ｃ、ＣＤ１ｅ）のいずれかが含まれるが、これらに限定されない。本発明の方法はまた、ミドスタウリン（midostaurin）、エナシデニブ（enasidenib）、またはそれらの組み合わせなどの他の治療と組み合わせることもできる。
本発明の治療方法は、追加の免疫療法および治療法と組み合わせることができる。例えば、腫瘍を治療するために使用される場合、本発明の組成物は、腫瘍のタイプ、患者の状態、他の健康問題および様々な因子に応じて、例えば、外科手術、放射線療法、化学療法またはそれらの組み合わせなどの従来の治療法と組み合わせて使用することができる。特定の態様において、本発明の阻害剤との組み合わせ腫瘍治療に有用な他の治療薬には、抗血管新生剤が含まれる。多くの抗血管新生剤が同定され、当技術分野で知られており、それには、例えば、ＴＮＰ－４７０、血小板第４因子、トロンボスポンジン－１、組織メタロプロテアーゼ阻害物質（ＴＥＭＰ１およびＴＥＭＰ２）、プロラクチン（１６－Ｋｄ断片）、アンギオスタチン（プラスミノーゲンの３８－Ｋｄ断片）、エンドスタチン、ｂＦＧＦ可溶性受容体、トランスフォーミング成長因子ベータ、インターフェロンアルファ、可溶性ＫＤＲおよびＦＬＴ－１受容体、胎盤プロリフェリン関連タンパク質、ならびにＣａｒｍｅｌｉｅｔ ａｎｄ Ｊａｉｎ（２０００）に列挙されたものが含まれる。一実施形態では、本発明の改変宿主細胞は、抗ＶＥＧＦ抗体、ＶＥＧＦバリアント、可溶性ＶＥＧＦ受容体断片、ＶＥＧＦまたはＶＥＧＦＲを遮断することができるアプタマー、抗ＶＥＧＦＲ中和抗体、ＶＥＧＦＲチロシンキナーゼの阻害剤、およびそれらの任意の組み合わせ（例えば、抗ｈＶＥＧＦ抗体Ａ４．６．１、ベバシズマブまたはラニビズマブ）などの、ＶＥＧＦアンタゴニストまたはＶＥＧＦ受容体アンタゴニストと組み合わせて使用することができる。
本開示の併用療法（combination treatment）で使用することができる化学療法化合物の非限定的な例には、例えば、アミノグルテチミド、アムサクリン、アナストロゾール、アスパラギナーゼ、アザシチジン、ｂｃｇ、ビカルタミド、ブレオマイシン、ブセレリン、ブスルファン、カンプトテシン（campothecin）、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、クロドロネート、コルヒチン、シクロホスファミド、シプロテロン、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デシタビン、ジエネストロール、ジエチルスチルベストロール、ドセタキセル、ドキソルビシン、エピルビシン、エストラジオール、エストラムスチン、エトポシド、エキセメスタン、フィルグラスチム、フルダラビン、フルドロコルチゾン、フルオロウラシル、フルオキシメステロン、フルタミド、ゲムシタビン、ゲニステイン、ゴセレリン、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イホスファミド、イマチニブ、インターフェロン、イリノテカン、イロノテカン(ironotecan)、レトロゾール、ロイコボリン、ロイプロリド、レバミソール、ロムスチン、メクロレタミン、メドロキシプロゲステロン、メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、メスナ、メトトレキサート、マイトマイシン、ミトタン、ミトキサントロン、ニルタミド、ノコダゾール、オクトレオチド、オキサリプラチン、パクリタキセル、パミドロネート、ペントスタチン、プリカマイシン、ポルフィマー、プロカルバジン、ラルチトレキセド、リツキシマブ、ストレプトゾシン、スラミン、タモキシフェン、テモゾロミド、テニポシド、テストステロン、チオグアニン、チオテパ、チタノセンジクロリド、トポテカン、トラスツズマブ、トレチノイン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシンおよびビノレルビンが含まれる。
これらの化学療法化合物は、それらの作用機序によって、例えば、以下のグループに分類され得る：代謝拮抗剤／抗がん剤、例えば、ピリミジン類似体（５－フルオロウラシル、フロクスウリジン、カペシタビン、ゲムシタビンおよびシタラビン）およびプリン類似体、葉酸拮抗剤および関連阻害剤（メルカプトプリン、チオグアニン、ペントスタチン、および２－クロロデオキシアデノシン（クラドリビン））；抗増殖／抗有糸分裂剤、例えば、ビンカアルカロイド（ビンブラスチン、ビンクリスチン、およびビノレルビン）などの天然物、タキサン（パクリタキセル、ドセタキセル）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ノコダゾール、エポチロン、およびナベルビンなどの微小管崩壊剤（microtubule disruptor）、エピジポドフィロシトキシン（epidipodophyllotoxin）（エトポシド、テニポシド）、ＤＮＡ損傷剤（アクチノマイシン、アムサクリン、アントラサイクリン、ブレオマイシン、ブスルファン、カンプトテシン、カルボプラチン、クロラムブシル、シスプラチン、シクロホスファミド、シトキサン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、ヘキサメチルメラミン、オキサリプラチン、イホスファミド、メルファラン、メクロレタミン、マイトマイシン、ミトキサントロン、ニトロソウレア、プリカマイシン、プロカルバジン、タキソール、タキソテール（texotere）、テニポシド、トリエチレンチオホスホラミドおよびエトポシド（ＶＰ１６））；抗生物質、例えば、ダクチノマイシン（アクチノマイシンＤ）、ダウノルビシン、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、イダルビシン、アントラサイクリン、ミトキサントロン、ブレオマイシン、プリカマイシン（ミスラマイシン）およびマイトマイシン；酵素（Ｌ－アスパラギンを体系的に代謝し、自身でアスパラギンを合成する能力を持たない細胞を取り除くＬ－アスパラギナーゼ）；抗血小板剤；抗増殖／抗有糸分裂アルキル化剤、例えばナイトロジェンマスタード（メクロレタミン、シクロホスファミドおよび類似体、メルファラン、クロラムブシル）、エチレンイミンおよびメチルメラミン（ヘキサメチルメラミンおよびチオテパ）、アルキルスルホネート－ブスルファン、ニトロソウレア（カルムスチン（ＢＣＮＵ）および類似体、ストレプトゾシン）、トラゼン－ダカルバジニン（trazenes-dacarbazinine）（ＤＴＩＣ）；抗増殖／抗有糸分裂抗代謝剤、例えば葉酸類似体（メトトレキサート）；プラチナ配位錯体（シスプラチン、カルボプラチン）、プロカルバジン、ヒドロキシウレア、ミトタン、アミノグルテチミド；ホルモン、ホルモン類似体（エストロゲン、タモキシフェン、ゴセレリン、ビカルタミド、ニルタミド）、およびアロマターゼ阻害剤（レトロゾール、アナストロゾール）；抗凝固剤（ヘパリン、合成ヘパリン塩、および他のトロンビン阻害剤）；血栓溶解剤（組織プラスミノーゲン活性化因子、ストレプトキナーゼおよびウロキナーゼなど）、アスピリン、ジピリダモール、チクロピジン、クロピドグレル、アブシキシマブ；抗遊走剤（antimigratory agent）；抗分泌剤（ブレフェルジン（breveldin））；免疫抑制剤（シクロスポリン、タクロリムス（ＦＫ－５０６）、シロリムス（ラパマイシン）、アザチオプリン、ミコフェノール酸モフェチル）；抗血管新生化合物（例えば、ＴＮＰ－４７０、ゲニステイン、ベバシズマブ）および成長因子阻害剤（例えば、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）阻害剤）；アンジオテンシン受容体遮断薬；一酸化窒素ドナー；アンチセンスオリゴヌクレオチド；抗体（トラスツズマブ）；細胞周期阻害剤および分化誘導因子（トレチノイン）；ｍＴＯＲ阻害剤、トポイソメラーゼ阻害剤（ドキソルビシン（アドリアマイシン）、アムサクリン、カンプトテシン、ダウノルビシン、ダクチノマイシン、エニポシド、エピルビシン、エトポシド、イダルビシンおよびミトキサントロン、トポテカン、イリノテカン）、コルチコステロイド（コルチゾン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾンおよびプレニゾロン）；成長因子シグナル伝達キナーゼ阻害剤；ミトコンドリア機能不全誘導因子およびカスパーゼ活性化因子；およびクロマチン崩壊剤。
本明細書に記載の方法の様々な実施形態において、対象はヒトである。対象は、年齢や性別を問わず、若年者であっても成人であってもよい。
医薬組成物、剤形および投与
一態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書に記載の改変ＴＣＲを有するリンパ球系細胞、および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物である。
担体は、例えば、水、生理食塩水、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、それらの適切な混合物、および植物油を含む、溶媒または分散媒体であり得る。微生物の作用の防止は、当技術分野で知られている様々な抗菌剤および抗真菌剤によってもたらすことができる。多くの場合、等張剤、例えば、糖または塩化ナトリウムを含めることが好ましいであろう。
本明細書に記載の改変ＴＣＲを有する遺伝子操作されたリンパ球系細胞の集団に基づく医薬組成物は、１つまたは複数の生理学的に許容される担体および／または賦形剤を使用して任意の従来の方法で処方することができる。リンパ球系細胞は、例えば、注射、非経口、膣、直腸投与による、または腫瘍への直接投与による投与のために処方され得る。
医薬組成物は、注射による（例えば、ボーラス注射または持続注入による）非経口投与用に処方することができる。注射用製剤は、任意選択で防腐剤を含む、例えばアンプルまたは複数回投与容器中の単位剤形で提示することができる。医薬組成物はさらに、油性または水性ビヒクル中の懸濁液、溶液または乳濁液として処方することができ、懸濁剤、安定剤および／または分散剤などの他の薬剤を含み得る。
注射用途に適した剤形には、滅菌水溶液または分散液；ごま油、ピーナッツ油または水性プロピレングリコールを含む製剤；および無菌注射溶液または分散液の即時調製用の滅菌粉末が含まれ得る。すべての場合において、製剤は無菌でなければならず、また流動性でなければならない。製造条件および特定の保管パラメータ（例えば、冷蔵および凍結など）の下で安定でなければならず、細菌および真菌などの微生物の汚染作用から保護されなければならない。
調合すると、溶液は、剤形と適合性のある方法で、治療上有効であるような量で投与され得る。用量範囲および投与頻度は、本明細書に記載の改変ＴＣＲを有する遺伝子操作されたリンパ球系細胞の集団の性質、および病状、ならびに特定の患者のパラメータおよび使用される投与経路に応じて変化し得る。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の改変ＴＣＲを有する遺伝子操作されたリンパ球系細胞の集団は、約１０７～約１０１２の範囲の用量で対象に投与され得る。より正確な用量は、それが投与されている対象に依存し得る。例えば、対象が若年である場合、より低い用量が必要とされ、対象が成人ヒト対象である場合、より高い用量が必要とされ得る。特定の実施形態において、より正確な用量は、対象の体重に依存し得る。
本発明をさらに以下の実施例によって説明および実証する。しかしながら、明細書におけるこれらおよび他の実施例の使用はいずれも、単なる例示であり、決して本発明のまたは任意の例示された用語の範囲および意味を限定するものではない。同様に、本発明は、ここに記載された特定の好ましい実施形態に限定されない。実際に、本明細書を読むと、本発明の多くの修正および変更が当業者に明らかであり、そのような変更は、本発明の精神または範囲から逸脱することなく行うことができる。したがって、本発明は、添付の特許請求の範囲およびそれら特許請求の範囲が権利を有する等価物の全範囲によってのみ限定されるべきである。
実施例１．可溶性の合理的に操作されたＢＣ１ ＴＣＲバリアントの結合親和性
材料および方法
ＴＣＲのアミノ酸置換を、構造ベースのコンピューター支援タンパク質工学によって設計した。野生型ＴＣＲ－ｐ－ＭＨＣ複合体（ＰＤＢ ＩＤ ２ｂｎｒ）の実験構造から始めて、結合自由エネルギーへの各ＴＣＲおよびｐＭＨＣ残基の寄与を、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｃｈａｎｉｃｓ－Ｇｅｎｅｒａｌｉｚｅｄ Ｂｏｒｎ Ｓｕｒｆａｃｅ Ａｒｅａ（ＭＭ－ＧＢＳＡ）を使用して推定した。これらの結果を使用して、ｐＭＨＣに対するＴＣＲの親和性を高める可能性のある配列修飾を決定した。後者をコンピューター上でＴＣＲ構造に導入し、結果として生じる結合自由エネルギーの変化を、ＭＭ－ＧＢＳＡを使用して再度推定した。ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ（インシリコ）で結合自由エネルギーが有利に増加すると予測された配列修飾が、実験的検証のために保持された。可溶性ＴＣＲは、哺乳動物細胞培養システムと細菌封入体からの両方で生成された。可溶性ｐＭＨＣに対する直接滴定ＥＬＩＳＡを使用して、野生型ＴＣＲと比較した結合強度を比較した。目的のＴＣＲを、α鎖およびβ鎖の細菌封入体のリフォールディングから作製し、親和性および速度論（kinetics）を測定するために表面プラズモン共鳴によって特徴付けした。
ＢＣ１と名付けられた野生型ＴＣＲは、よく特徴付けられたＴＣＲ １Ｇ４からわずか４アミノ酸（α鎖に２つ、β鎖に２つ）だけ異なる（Chen, J. L., et al., J Exp Med 2005. 201, 1243-1255、これはすべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる）。ＢＣ１ ＴＣＲは、長期生存しているがん患者の免疫優勢クローンに由来するため、臨床的に興味深いものである。
ＨＥＫ－２９３細胞での可溶性ＴＣＲの製造および精製
ＴＣＲ ＢＣ１のα鎖およびβ鎖を、ＣＭＶプロモーターの制御下で発現ベクターｐＨＹＫ８に別々にクローン化した。ヘテロ二量体鎖のペアリングを、Ｃｈａｎｇらの戦略に従って酸性－塩基性ジッパーで促進した（Chang, H. C., et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 1994. 91, 11408-11412）。ＴＣＲβ鎖はＣｙｓ２４２の位置の後ろで切り捨て、柔軟なリンカー領域、トロンビン部位、酸性ジッパー、およびＨＩＳタグに置き換え、α鎖はＣｙｓ２０９の後ろで切り捨て、リンカー領域、トロンビン部位、および塩基性ジッパーで置き換えた。可溶性ＴＣＲは、線形２５ｋＤａポリエチレンイミンを用いてプラスミドをＨＥＫ－２９３細胞にコトランスフェクションすることにより製造した。トランスフェクトされた細胞を、（酸性化を最小限に抑えるため）４ｍＭのバルプロ酸を添加したＰｒｏ２９３ ＣＤＭ培地（Ｌｏｎｚａ）で最大７日間懸濁培養した。培養上清を遠心分離によって収集し、製造元の提案に従ってＮｉ－ＮＴＡアガロース（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してＴＣＲを精製した。
細菌封入体からの可溶性ＴＣＲおよびｐＭＨＣの製造
ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓ細菌細胞を使用して、封入体としてＴＣＲα鎖およびβ鎖（ｐＧＭＴ７にクローニング）を作製し、以前記載したように透析によって可溶化およびリフォールディングした（Boulter, J. M., et al., Protein Eng 2003. 16, 707-711）。次に、ＴＣＲを濃縮およびろ過した後、Ｎｉ２＋固定化金属キレートセファロース（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）およびイミダゾール溶出を用いて高速タンパク質液体クロマトグラフィーＨＩＳタグ精製を行った。ＳＰＲ分析の前に、サンプルを１０ｋＤａ ＭＷＣＯスピンフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で濃縮し、Ｓ２００カラムを用いてＨＢＳ－ＥＰバッファー（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．００５％（ｖ／ｖ）Ｐ２０界面活性剤）中にゲルろ過し、凝集体を除去した。ビオチン化Ａ２／ＮＹ－ＥＳＯ１５７－１６５は、以前に説明されたように調製した（Altman, J. D., et al., Science, 1996. 274, 94-96）。
合理的に開発されたＴＣＲの滴定ＥＬＩＳＡ
ビオチン化ｐＭＨＣ（Ａ２／ＮＹ－ＥＳＯ１５７－１６５複合体）を、トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ、ｐＨ７．４）中の２％ＢＳＡでブロッキングしたＳＡコーティングプレート（９６ウェル、高結合プレート、Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）で捕捉した。各ステップ間にＴＢＳ（０．１％ Ｔｗｅｅｎ）でプレートを完全に洗浄した。ＴＢＳ（１％ＢＳＡ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ）中の可溶性ＴＣＲと室温で１．５時間インキュベートした後、ＳＡの遊離部位をビオチンでブロックした。結合したＴＣＲを、ＴＢＳ（１％ＢＳＡ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ）で１／１５００に希釈した抗β鎖ＴＣＲ ｍＡｂ（ＴＣＲ １１５１、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ロックフォード、イリノイ州、米国）、続いてＴＢＳ（０．１％ Ｔｗｅｅｎ）で１／１５００に希釈したＨＲＰ結合ヤギ抗抗マウスＩｇＧ－Ａｂ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、およびＨ２Ｏ２を含有するクエン酸－リン酸緩衝液中の２，２’－アジノ－ビス（３－エチルベンズチアゾリン－６－スルホン酸）でのＨＲＰ検出を用いて検出した。３０分後にＯＤ４０５－４９０でプレートの読み取りを行った。各ＴＣＲについてＥＬＩＳＡを少なくとも３回繰り返した。
表１において、ＷＴ ＢＣ１ ＴＣＲの結合は「＋＋＋」として定義され、ＷＴ ＢＣ１ ＴＣＲより大きい結合は「＋＋＋＋」として示され、ＷＴより小さい結合は「＋＋」として示され、非常に弱い結合は「＋」として示され、結合無しは「－」として示された。
Figure 2022525925000001
合理的に開発されたＴＣＲの表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）
ＳＰＲは、ＢＩＡｃｏｒｅ ３０００およびＳＡコーティングされたＣＭ５センサーチップ（ＢＩＡＣｏｒｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上において２５℃で実施した。フローセルに、均一に分布させるために１０μｌ／分の速度で２００反応単位（response unit）のビオチン化ｐＭＨＣをロードした。ストレプトアビジン（ＳＡ）の遊離部位をビオチンでブロックし、参照セルをサンプル溶液の注入時のバルク屈折率の変化に対する対照として使用した。速度論的分析のために、ロードされたチップ上にＴＣＲの６～８段階希釈液を５０～１００μｌ／分で注入した。データは、２重または３重で行われた少なくとも２つの独立した実験のうちの１つの実験からの代表であり、最善のＣｈｉ２値を与える。各ＴＣＲのｋｏｎ値およびｋＯｆｆ値は、１：１のラングミュア結合を想定して計算し、データはＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ４．１およびグローバルフィットアルゴリズムを使用して解析した。ＫＤはｋＯｆｆ／ｋ０ｎによって計算した。
表２において、「＊」は、Ａ９７ＬおよびＤＭｂが、以前に公開されたＴ細胞に最適な機能的活性を付与するＴＣＲであることを示す（Irving, M., et al., JBC 2012. 287, 23068-23078、これは参照によりすべての目的のためにその全体が本明細書に組み込まれる）。「＊＊」は、１Ｇ４が、ＮＹ－ＥＳＯ－１１５７－１６５に結合する特性を有する患者から分離された野生型ＴＣＲであることを示す（Dunn, S. M., et al., Protein Sci 2006. 15, 710-721; Robbins, P. F., et al., J Clin Oncol 2011. 29, 917-924; Rapoport, A. P., et al., Nat Med 2015. 21, 914-921; Chen, J. L., J Exp Med 2005. 201, 1243-1255、これらのそれぞれは、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる）。「＊＊＊」は、１Ｇ４ＬＹが、臨床試験で使用されている１Ｇ４の高親和性バリアントであることを示す（Dunn, S. M., et al., Protein Sci 2006. 15, 710-721; Robbins, P. F., et al., J Clin Oncol 2011. 29, 917-924; Rapoport, A. P., et al., Nat Med 2015. 21, 914-921; Chen, J. L., J Exp Med 2005. 201, 1243-1255、これらのそれぞれは、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる）。ＢＣ１ ＴＣＲバリアントにおける変異は太字で強調表示されている。
Figure 2022525925000002
結果および考察
上記のように、合理的設計（ＭＭ－ＧＢＳＡ計算）（Zoete, V. et al., JMR 2010. 23, 142-152; Zoete, V., and Michielin, O. Proteins 2007. 67, 1026-1047; Zoete, V., et al., Proteins 2005. 61, 79-93）により、初代ヒトＴ細胞と比較して、増大する親和性および高められた機能を有するＨＬＡ－Ａ２－ＮＹ－ＥＳＯ１５７－１６５ ＴＣＲのパネルを開発した（Zoete, V. et al., JMR 2010. 23, 142-152; Schmid, D. A., et al., Journal of immunology 2010. 184, 4936-4946; Irving, M., et al., JBC 2012. 287, 23068-23078）。
表１および２に示すように、ＴＣＲのパネルは、ＨＬＡ－Ａ２－ＮＹ－ＥＳＯ１５７－１６５に対する親和性の増大を示す。表１は、滴定ＥＬＩＳＡによるＴＣＲのｐＭＨＣへの直接結合を示し、表２は、これらＴＣＲのサブセットについて決定された親和性および速度論を示す。表１において太字で強調表示されているように、結合について「＋＋＋＋」で示される、ＷＴ ＴＣＲよりも高い親和性でｐＭＨＣに結合する単一アミノ酸置換ＴＣＲがいくつかある。表２に示すように、ＷＴ ＢＣ１ ＴＣＲの残基５３での少なくとも２つの異なる単一アミノ酸置換（Ｉ５３Ｅ、およびＩ５３Ｆ）が、ＷＴ ＢＣ１ ＴＣＲと比較した場合に、より高い結合親和性（ＫＤ ＷＴ＞Ｉ５３Ｅ＞Ｉ５３Ｆ）をもたらし、Ｉ５３ＦがＨＬＡ－Ａ２－ＮＹ－ＥＳＯ－１１５７－１６５に対して最も高い親和性を有する。
抗ＴＣＲ ＢＶ１３．１ Ａｂおよび蛍光標識テトラマーで染色されたいくつかの異なるＢＣ１ ＴＣＲバリアントで操作されたＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞のフローサイトメトリー分析（２Ａ～２Ｂおよび図３Ａ～３Ｂ）は、試験したすべてのバリアント（Ｉ５３Ｅ、Ｉ５３Ｆ、Ｉ５３Ｗ、Ｄ５５Ｅ、およびＤＭｂ）が、野生型（ＢＣ１ ＴＣＲ形質導入細胞）および陽性対照Ａ９７Ｌおよび１Ｇ４ＬＹに匹敵する発現を示すことを表す。
実施例２．ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲバリアントを発現するＴ細胞によるサイトカイン産生
材料および方法
細胞株培養
２９３ＴおよびＪｕｒｋａｔ細胞株はＡＴＣＣから購入した。すべての細胞株を、１０％熱不活化ＦＢＳ、２ｍｍｏｌ／ｌのＬ－グルタミン、１００μｇ／ｍｌのペニシリン、および１００Ｕ／ｍｌのストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ－１６４０で培養した。２９３Ｔ細胞株は、レンチウイルスのパッケージングおよび調製に使用した。
ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖のクローニングおよびレンチウイルスの作製
ＴＣＲａ２３およびＴＣＲｂ１３．１の両方のＯＲＦをレンチウイルスベクターｐＲＲＬに組み込み、その際に３’の長い末端反復のＵ３領域のほとんどが欠失され、自己不活性化３’長末端反復（self-inactivating 3′ long terminal repeat）（ＳＩＮ）が生じた。ＴＣＲａ鎖とＴＣＲｂ鎖は、ピコルナウイルス由来の２Ａ配列によって分離された。
レンチウイルスは、ＴｕｒｂｏＦｅｃｔを使用した２９３Ｔ細胞の一過性トランスフェクションによって産生された。簡単に説明すると、２９３Ｔ細胞に、ＮＹ－ＥＳＯ ＴＣＲａおよびＴＣＲｂ鎖をコードするレンチウイルスベクターｐＲＲＬとレンチウイルスヘルパープラスミドと（Ｒ８．７４およびｐＭＤ２Ｇ）をコトランスフェクションした。トランスフェクションの４８時間後にレンチウイルス上清を回収し、ろ過し、超遠心分離によって濃縮した。ペレットを適切な量のＲＰＭＩ １０％ＦＢＳに再懸濁し、－８０℃で保存するかまたは直接使用した。
レンチウイルス形質導入の前に、合計０．５ｘ１０６のＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞を、５０ＩＵ／ｍｌのインターロイキン２の存在下で１ｘ１０６のαＣＤ３／αＣＤ２８ビーズで１８～２０時間刺激した。５日目にビーズを除去し、Ｔ細胞を１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－７および１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－１５の存在下で培養した。ＴＣＲの発現は、フローサイトメトリー分析により、形質導入後６日目およびそれ以降の時点に決定した。使用した抗体は、ＰＥ標識ヒトＴＣＲＶｂ１３．１、ならびにＡＰＣ標識抗ヒトＣＤ４および抗ヒトＣＤ８抗体であった。ＮＹ－ＥＳＯ１５７－１６５を提示するＰＥ標識ＨＬＡ－Ａ２テトラマーを使用して、導入されたＴＣＲの正しいフォールディングを検出した。ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して染色細胞を解析した。
細胞株
ＨＬＡ－Ａ２．１＋／ＮＹ－ＥＳＯ＋メラノーマ細胞株Ｍｗ２７５およびＡ３７５、ならびにＮＹ－ＥＳＯ陰性細胞株ＮＡ８は、１０％ＦＢＳおよび抗生物質（１００ＩＥ／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン）を添加したＩＭＤＭで培養した。Ｓａｏｓ－２（骨肉腫）およびＵ２６６（Ｂ細胞）、両方ともＨＬＡ－Ａ２．１／ＮＹ－ＥＳＯ＋、ならびにＯＶＣＡｒ３（卵巣）およびＳＫＯ＃（卵巣）、両方ともＮＹ－ＥＳＯ陰性は、１０％ＦＢＳおよび抗生物質を添加したＲＰＭＩで培養した。
ＮＹ－ＥＳＯ陰性細胞株、Ｕ８７ＭＧ（脳）、Ａ４３１（皮膚）、Ａ６７３（肉腫）、ＲＤ－ＥＳ（肉腫）、ＨＴ－２９（肺）、およびＳＫ－Ｎ－ＡＳ（神経芽細胞腫）は、１０％のＦＢＳと抗生物質を添加したＤＭＥＭ添加で培養した。
初代Ｔ細胞の精製および形質導入
初代ヒトＴ細胞は、健康ドナーに由来するバフィーコートの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から分離した。すべての血液サンプルは、ドナーのインフォームドコンセントを得て収集し、ヴォー州（スイス）の倫理承認を受けて遺伝子操作した。遠心分離の標準プロトコルを使用して、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（Ａｘｏｎｌａｂ）分離溶液を介して全ＰＢＭＣを取得し、磁気ビーズ分離（ｅａｓｙＳＥＰ、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）と組み合わせたネガティブセレクションキットを使用してＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を分離した。Ｔ細胞を完全培地（１０％熱不活化ウシ胎児血清、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌの硫酸ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を添加した、Ｇｌｕｔａｍａｘを含むＲＰＭＩ１６４０）で培養し、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８モノクローナル抗体（ｍＡＢ）コーティングビーズ（Ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、１：２のＴ細胞：ビーズの比で刺激した。活性化の１２～２４時間後、約５～１０の感染多重度（ＭＯＩ）で、レンチウイルス粒子でＴ細胞に形質導入した。ヒト組換えインターロイキン－２（ｈ－ＩＬ２；Ｇｌａｘｏ）を１日おきに添加して、刺激の５日後（＋５日）までに５０ＩＵ／ｍｌの最終濃度を得た。この時点で、磁気ビーズを除去し、ＩＬ２をさらに添加しないで、ｈ－ＩＬ１５を１０ｎｇ／ｍＬ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ ＧｍｂＨ）で添加した。拡大のために０．５～１ｘ１０６細胞／ｍｌの細胞密度を維持した。導入されたＴＣＲを、形質導入の５日後に蛍光マルチマー染色によって測定した。すべての機能アッセイの前に、休止状態の操作されたＴ細胞を、同一の導入遺伝子発現となるように調整した。
サイトカイン産生
サイトカイン放出アッセイは、最終体積２００μｌのＲＰＭＩ培地中、９６ウェル丸底プレートにおいて、二重で、ウェルあたり５ｘ１０４の標的細胞と５ｘ１０４のＴ細胞を共培養することにより実施した。２４時間後、共培養上清を回収し、製造元のプロトコル（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）に従って、ＥＬＩＳＡキットを使用してＩＦＮ－γおよびＩＬ－２の存在について調べた。報告値は、４人の健康ドナー（ＨＤ）に由来する形質導入されたＴ細胞の平均を表す。
結果および考察
サイトカイン産生に対するＴＣＲ結合パラメータの影響を評価するために、形質導入されていない、ならびに様々なＴＣＲバリアントおよびＷＴ ＢＣ１ ＴＣＲで形質導入されたＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞を、ＮＹ－ＥＳＯ１５７－１６５ペプチドの連続１０倍希釈液をロードしたＴ２細胞とインキュベートした。ＴＣＲを介した活性化に応答して産生されたＩＬ－２について、分泌は、ＴＣＲ Ｉ５３Ｆ、Ｉ５３Ｗ、Ｄ５５Ｅ、ＤＭｂ、および１Ｇ４ＬＹを発現する操作されたＣＤ４＋細胞で最大に達した。ＴＣＲ Ｉ５３Ｆ、Ｉ５３Ｗ、Ｄ５５Ｅ、およびＤＭｂを発現する操作されたＣＤ４＋細胞は、ＷＴ ＴＣＲと比較した場合に、ＩＬ２産生に関してより良好に機能するように思われ、それらの機能は１Ｇ４ＬＹ ＴＣＲと同様である（図４Ａ）。操作されたＴＣＲバリアントであるＩ５３Ｅは、このアッセイでＷＴ ＴＣＲと同様の機能を示した。同じ条件下で、非形質導入ＣＤ４＋細胞によってＩＬ－２は産生されなかった（図４Ａ）。
ＩＬ－２は、ＨＬＡ／Ａ２－ＮＹ－ＥＳＯ－１を自然に発現する腫瘍Ｔ細胞株（Ｍｅ２７５）、またはＨＬＡ／Ａ２－ＮＹ－Ｅｓｏ－１を発現するように遺伝子操作された腫瘍Ｔ細胞株（ＯＶＣＡＲ５ ＮＬＭおよびＡ２００８－Ａ２－ＮＬＭ）において、非形質導入（ＮＴ）細胞（ネガティブコントロール）、野生型ＢＣ１ ＴＣＲ形質導入細胞、およびＴＣＲ Ｉ５３Ｅを発現するように形質導入された細胞、およびＡ９７Ｌを発現するように形質導入された細胞と比較して、ＴＣＲ Ｉ５３Ｆを発現するように操作された健康ドナー（ＨＤ）のＴ細胞によって最も効率的に産生される。ＨＬＡ／Ａ２－ＮＹ－ＥＳＯ－１を発現していない腫瘍細胞株（ＯＶＣＡＲ５およびＡ２００８－Ａ２およびＮＡ８）との交差反応性はない（図５）。
ＩＬ－２は、非形質導入（ＮＴ）細胞（ネガティブコントロール）と比較して、Ｍｅ２７５、Ｓａｏｓ－２、およびＵ２６６細胞において、ＴＣＲ Ｉ５３Ｆ、およびＩ５３Ｗを発現するように操作されたＣＤ４＋Ｔ細胞によって最も効率的に産生される。ＴＣＲ ＤＭｂおよび１Ｇ４ＬＹを発現するように操作されたＣＤ４＋Ｔ細胞によるＩＬ－２産生が顕著ではない他のＮＹ－ＥＳＯ陽性細胞株と比較して、Ｓａｏｓ－２およびＵ２６６細胞において、ＴＣＲ ＤＭｂおよび１Ｇ４ＬＹを発現するように操作されたＣＤ４＋Ｔ細胞によるＩＬ－２産生がある。ＩＬ－２は、ＮＹ－ＥＳＯ陽性細胞株のいずれにおいても、ＴＣＲ Ｉ５３Ｅ、Ｄ５５Ｅを発現するように操作されたＣＤ４＋細胞、野生型ＢＣ１ ＴＣＲ形質導入細胞、およびＴＣＲ Ａ９７Ｌを発現するように形質導入された細胞によって産生されなかった（図６）。ＷＴ ＢＣ１ ＴＣＲで形質導入されたＣＤ４＋Ｔ細胞では、Ａ２／ＮＹ－ＥＳＯ－ＮＹ－１１５７－１６５の認識はＣＤ８受容体に依存する。この場合、ＷＴ ＢＣ１ ＴＣＲで形質導入されたＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＭＨＣクラスＩに結合したＮＹ－ＥＳＯエピトープに反応するようには見えない。しかしながら、ＣＤ４＋Ｔ細胞が、ＭＨＣクラスＩに結合したＮＹ－ＥＳＯエピトープへの結合親和性が高い（ＷＴ ＢＣ１ ＴＣＲと比較して）ＴＣＲバリアント（すなわち、Ｉ５３Ｆおよび１５３Ｗ ＴＣＲ）で形質導入された場合、これら操作されたＴ細胞によるＩＬ－２産生がより高くなることが観察され、Ｉ５３Ｆ ＴＣＲ形質導入細胞のＣＤ８共受容体（co-receptor）依存性が低いことを示す。
図９では、ＩＬ－２は、野生型ＢＣ１ ＴＣＲおよびＩ５３Ｅ ＴＣＲを発現するように操作された細胞と比較して、ＴＣＲ Ｉ５３Ｆを発現するように操作されたＣＤ４＋Ｔ細胞によって最も効率的に産生される。野生型ＢＣ１ ＴＣＲ操作細胞およびＩ５３Ｅを発現するように操作された細胞と比較した場合に、ＴＣＲ Ｉ５３Ｆで操作されたＣＤ４＋Ｔ細胞はＣＤ８共受容体依存性が低い傾向があり（図９）、また図５で比較すると、Ｉ５３Ｆ ＴＣＲ発現細胞によるＩＬ－２産生を、野生型ＢＣ１ ＴＣＲ操作細胞、Ｉ５３Ｅを発現するように操作された細胞、およびＡ９７ＬＴ ＣＲを発現する細胞と比較した場合にも、同じ傾向が見られる。
ＴＣＲを介した活性化に応答して産生されたＩＦＮ－γについて、ＴＣＲ Ａ９７Ｌ、Ｉ５３Ｅ、Ｉ５３Ｆ、Ｉ５３Ｗ、Ｄ５５Ｅ、ＤＭｂ、および１Ｇ４ＬＹを発現する操作されたＣＤ８＋細胞は、このアッセイでＷＴ ＢＣ１ ＴＣＲと同様の機能を示した。同じ条件下で、非形質導入ＣＤ８＋細胞によってＩＦＮ－γは産生されなかった（図４Ｂ）。
ＩＦＮ－γは、ＨＬＡ／Ａ２－ＮＹ－ＥＳＯ－１を自然に発現する腫瘍Ｔ細胞株（Ｍｅ２７５）、またはＨＬＡ／Ａ２－ＮＹ－ＥＳＯ－１を発現するように遺伝子操作された腫瘍Ｔ細胞株（ＯＶＣＡＲ５ ＮＬＭおよびＡ２００８－Ａ２－ＮＬＭ）において、非形質導入（ＮＴ）細胞（ネガティブコントロール）と比較して、ＴＣＲ Ａ９７Ｌ、Ｉ５３Ｅ、およびＩ５３Ｆを発現するように操作された健康ドナー（ＨＤ）Ｔ細胞によって効率的に産生される。ＨＬＡ／Ａ２－ＮＹ－ＥＳＯ－１を発現していない腫瘍細胞株（ＯＶＣＡＲ５およびＡ２００８－Ａ２およびＮＡ８）との交差反応性はない。親和性が増強されたＢＣ１ ＴＣＲバリアントのパネルによるＩＦＮ－γ産生は、野生型ＢＣ１ ＴＣＲを発現するように操作されたＴ細胞と類似していた（図７）。図１０において、ＩＦＮ－γは、野生型ＢＣ１ ＴＣＲおよびＩ５３Ｅ ＴＣＲを発現する細胞と比較して、Ｉ５３Ｆ ＴＣＲを発現するように操作されたＣＤ８＋細胞によって最も効率的に産生される。
ＩＦＮ－γは、Ｍｅ２７５細胞では、ＴＣＲ Ｉ５３Ｆ、Ｄ５５Ｅ、およびＤＭｂ；Ａ３７５細胞では、Ｉ５３ＦおよびＤＭｂ；Ｓａｏｓ－２細胞では、Ｉ５３Ｆ、Ｉ５３Ｗ、Ｄ５５ＥおよびＤＭｂ；Ｕ２６６細胞では、Ｉ５３Ｆ、Ｉ５３Ｗ、Ｄ５５Ｅ、ＤＭｂ；を発現するように操作されたＣＤ８＋Ｔ細胞によって最も効率的に産生される。ＩＦＮ－γは、すべてのＮＹ－ＥＳＯ陽性細胞株において、Ａ９７Ｌ（野生型ＢＣ１ ＴＣＲの陽性対照変異体）および１Ｇ４ＬＹ（野生型１Ｇ４ ＴＣＲの陽性対照変異体）を発現するように操作されたＣＤ８＋Ｔ細胞によって効率的に産生される。ＩＦＮ－γは、Ａ３７５を除くすべてのＮＹ－ＥＳＯ陽性細胞株において、野生型ＢＣ１ ＴＣＲを発現するように操作されたＣＤ８＋Ｔ細胞によって適度なレベルで産生された（図８）。
ＮＹ－ＥＳＯ陽性細胞株Ａ３７５を使用した場合に、Ｉ５３Ｆ ＴＣＲを発現するように操作されたＣＤ８＋Ｔ細胞は、１Ｇ４ＬＹと同様のレベルのＩＦＮ－γ産生を示したが、１５３Ｗは、Ｉ５３Ｆおよび１Ｇ４（ＬＹ）の両方と比較して、より少ないＩＦＮ－γを産生した。ＮＹ－ＥＳＯ陰性細胞株を使用した場合、ＩＦＮ－γの産生はなかった（図１１）。
実施例３．ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲバリアントを発現するＴ細胞の細胞傷害活性
ＮＹ－ＥＳＯ ＴＣＲ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞傷害活性を、ＩｎｃｕＣｙｔｅを使用して測定した。簡単に説明すると、１ｘ１０４のＴ２標的細胞を、細胞傷害性赤色試薬（Ｅｓｓｅｎ Ｂｉｏｓｃｅｉｎｃｅ、Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ、Ｍｉｃｈｉｇａｎ、ＵＳＡ）の存在下で、ウェルあたり２．５／１０４のＮＹ－ＥＳＯテトラマー陽性ＣＤ８＋Ｔ細胞と共培養した。ＩｎｃｕＣｙｔｅ ｚｏｏｍソフトウェアを使用して、２時間ごとに画像を撮影した。
Ｉ５３ＦおよびＩ５３Ｅで形質導入されたＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞傷害活性は、野生型ＢＣ１ ＴＣＲを発現するＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞傷害活性と類似していた（図１２）。
実施例４．ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲバリアントを発現するＴ細胞の抗腫瘍活性
ＮＯＤ ＳＣＩＤγＫＯマウス（ＮＳＧ）に皮下注射する直前に、３ｘ１０６のＭｅ２７５細胞を６／１０６のＮＹ－ＥＳＯ特異的Ｔ細胞と混合するＷｉｎｎアッセイを実施した。Ｔ細胞は３０％のＣＤ４＋Ｔ細胞と７０％のＣＤ８＋Ｔ細胞で構成されていた。腫瘍サイズを週に２回測定した。腫瘍体積が１０００ｍｍ３に達するとマウスを屠殺した。
図１３Ｂに見られるように、Ａ９７ＬおよびＩ５３Ｆで形質導入されたＴ細胞の両方が、４３日間腫瘍サイズを約０ｍｍ３に維持するのに効果的であった。Ｉ５３Ｅ形質導入Ｔ細胞は、このアッセイで野生型ＢＣ１ ＴＣＲ形質導入Ｔ細胞と同様に機能した。非形質導入Ｔ細胞では、腫瘍サイズは４３日目に約７００ｍｍ３のサイズに達した。
実施例５．ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲバリアントを発現するＴ細胞の抗腫瘍活性
ＮＳＧマウスに５ｘ１０６のＭｅ２７５細胞を注射した。腫瘍サイズが５０～１００ｍｍ３に達したら、１０ｘ１０６のＮＹ－ＥＳＯ特異的Ｔ細胞を腫瘍周囲または静脈内に２回注射した（１０日目と１３日目）。Ｔ細胞は３０％のＣＤ４＋Ｔ細胞と７０％のＣＤ８＋Ｔ細胞で構成されていた。腫瘍サイズを週に２回ノギスで測定した。腫瘍が１０００ｍｍ３に達するとマウスを屠殺した。
Ａ９７ＬおよびＩ５３Ｆで形質導入されたＴ細胞は、腫瘍周囲に投与した場合、３０日間腫瘍サイズを１００ｍｍ３未満に維持するのに効果的であった。Ｉ５３Ｅ形質導入Ｔ細胞は、このアッセイで野生型ＢＣ１ ＴＣＲ形質導入Ｔ細胞と同様に機能した。非形質導入Ｔ細胞では、腫瘍は３０日目に約２７５ｍｍ３のサイズに達した（図１４Ｂ）。
静脈内投与した場合、Ｉ５３Ｆ ＴＣＲで形質導入されたＴ細胞（健康ドナー１から得られた）は、５０日間にわたって腫瘍を無視できるサイズに保つのに効果的であった（図１５Ｂ、左）。別の健康ドナー（健康ドナー２）からのＴ細胞を使用してＩ５３Ｆ ＴＣＲで形質導入した場合、そのような形質導入された細胞は、６５日間にわたって腫瘍を約３５０ｍｍ３未満に保つのに効率的であった（図１５Ｂ、右）。
静脈内投与した場合、Ｉ５３Ｆと１Ｇ４ＬＹで別々に形質導入されたＴ細胞（健康ドナー３から得られた）は両方とも効果的であり、漸増する滴定で、非形質導入Ｔ細胞と比較して腫瘍体積サイズを小さく維持するという点で同様のプロファイルを示した（図１６Ｂ）。
実施例６．ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲおよびＧＭ－ＣＳＦを発現する改変Ｔ細胞
材料および方法
マウス
ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（ＮＳＧ）マウスは、特定病原微生物排除（ＳＯＰＦ）条件下において施設内で飼育し、すべての動物実験は、ローザンヌ大学の動物施設で特定病原微生物排除（ＳＰＦ）条件下において実施した。すべての実験は、ヴォー州の獣医当局によって承認され、スイス連邦法に従って実施した。
細胞株
野生型親Ａ３７５（ＨＬＡ－Ａ２＋、ＮＹ－ＥＳＯ－１＋）、ＭｅｌＡｖｌ３（ＨＬＡ－Ａ２＋、ＮＹ－ＥＳＯ－１－）およびＮＡ８（ＨＬＡ－Ａ２＋、ＮＹ－ＥＳＯ－１－）メラノーマ、Ｈ１６５０（ＨＬＡ－Ａ２＋、ＮＹ－ＥＳＯ－１－）非小細胞肺がん、およびＬＮ－１８（ＨＬＡ－Ａ２＋、ＮＹ－ＥＳＯ－１＋）膠芽腫細胞株は、ＡＴＣＣにより購入した。Ｍｅ２７５（ＨＬＡ－Ａ２＋、ＮＹ－ＥＳＯ－１＋）メラノーマ細胞株はＤ．Ｓｐｅｉｓｅｒ教授（ローザンヌ大学、Ｌｕｄｗｉｇ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈのローザンヌ支部）から提供され、ｉｎ ｖｉｖｏでその活性を追跡するためにルシフェラーゼを安定発現するように操作された。ＯＶＣＡＲ５（ＨＬＡ－Ａ２＋、ＮＹ－ＥＳＯ－１－）およびＡ２００８－Ａ２（ＨＬＡ－Ａ２＋、ＮＹ－ＥＳＯ－１－）卵巣がん細胞株は、ペンシルベニア大学から入手され、全長ＮＹ－ＥＳＯ－１がん／精巣ファミリー腫瘍抗原配列、ならびにそれぞれｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでそれらの活性を追跡するためにｍＣｈｅｒｒｙおよびルシフェラーゼを安定発現するように操作された。すべてのメラノーマ細胞株は、１０％ＦＣＳおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシンを添加したＩＭＤＭ＋Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｔｈｅｒｍｏ）で維持し、残りの細胞株は、１０％ＦＣＳおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ（Ｔｈｅｒｍｏ）で維持した。
分子クローニング
マウスＣＳＦ２（ＧＭ－ＣＳＦ）ｃＤＮＡ（Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ０１５８７）の全配列はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎによって合成された。続いて、ＰＣＲおよび標準的な分子クローニング技術を使用して、Ｔｈｙ１．１－Ｔ２Ａ（ＣＤ９０．１）レポーター遺伝子カセットに続いて、配列をｐＭＳＧＶレトロウイルスベクター（Hughes, Human Gene Therapy, 2005;16:457-472）にクローン化し、ｐＭＳＧＶ－Ｔｈｙ１．１－Ｔ２Ａ－ｍＧＭ－ＣＳＦレトロウイルスプラスミドを作製した。ｐＭＳＧＶ－Ｔｈｙ１．１－Ｔ２Ａを対照ベクターとして使用した。
フローサイトメトリー
ＡＰＣ抗ヒトＣＤ８、ＡＰＣ抗ヒトＣＤ４、およびＡＰＣ抗マウスＴｈｙ１．１（ＣＤ９０．１）はＢｉｏＬｅｇｅｎｄから購入した。ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲテトラマーは、ローザンヌ大学のペプチドおよびテトラマー施設（Peptide and Tetramer facility）によって施設内で製造された。ＦＩＴＣ抗ヒトＭＣＳＰはＭｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃで購入した。ＡＰＣ抗マウスＣＤ４５、ＡＰＣＣｙ７抗マウスＦ４／８０、およびＰＥＣｙ７抗マウスＣＤ１１ｂは、フローサイトメトリー施設、ＦＢＭ、ＬＩＣＲ／ＵＮＩＬにより提供されおよび／または施設内で製造された。データ取得はＬＳＲＩＩフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で実施し、ＦｌｏｗＪｏ（ＴｒｅｅＳｔａｒ）でデータを解析した。
レトロウイルス／レンチウイルスの作製
レトロウイルス粒子を作製するために、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、ｐＭＳＧＶトランスファープラスミドと、レトロウイルスパッケージングプラスミドｐＭＤ－Ｇａｇ／ＰｏｌおよびｐＭＤ ＲＤ１１４（Milone et al, 2018 Leukemia 32, 1529-1541）ネコ内在性ウイルスエンベロープ糖タンパク質をコトランスフェクションした。トランスフェクションの２４時間後、４８時間後、および７２時間後に培養上清を回収し、２４，０００ｘｇで２時間超遠心分離して濃縮した。濃縮ウイルスは使用するまで－８０℃で保存した。ウイルス力価およびＭＯＩは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＴｈｙ１．１レポーター遺伝子の発現によって決定した。
ヒトＴ細胞刺激およびレンチウイルス／レトロウイルス形質導入
健康ドナーのアフェレーシス製品は、承認された大学の倫理委員会のプロトコルに基づく書面による同意を得て、スイスのエパランジュにあるＴｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ Ｉｎｔｅｒｒｅｇｉｏｎａｌｅ ＣＲＳ ＳＡ，Ｅｐａｌｉｎｇｅｓから購入した。Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）密度勾配遠心分離を使用してＰＢＭＣを調製し、ＣＤ８またはＣＤ４磁気マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用して、製造元のプロトコルに従って、ＣＤ８またはＣＤ４ Ｔ細胞をネガティブ分離した。分離されたＣＤ８およびＣＤ４ Ｔ細胞を、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により、ヒトＩＬ－２（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）の存在下において２：１のビーズ：Ｔ細胞比で刺激した。
ヒトＴ細胞のレンチウイルス／レトロウイルス形質導入
Ｔ細胞のレンチウイルス形質導入は、培地にウイルス粒子を直接添加することにより、活性化の２４時間後に実施し（ＭＯＩ ２０）、Ｌｅｎｔｉｂｏｏｓｔ（ＳｉｒｉｏｎＢｉｏｔｅｃｈ）を同時に添加することにより増強した。Ｔ細胞のレトロウイルス形質導入は、活性化の４８時間後に実施した。簡単に説明すると、事前にレトロウイルス粒子を２０００ｘｇで１．５時間スピノキュレートしたレトロネクチンコーティングプレートにＴ細胞を移した。翌日、レトロネクチンコーティングプレートからＴ細胞を取り出した。ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズは活性化の５日後に除去し、Ｔ細胞はその後、下流で使用するまで、０．５～１ｘ１０６Ｔ細胞／ｍｌで、１０％熱不活化ウシ胎児血清（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、１０ｎｇ／ｍｌ ヒトＩＬ－７（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）、および１０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－１５（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を添加したＲＰＭＩ １６４０－Ｇｌｕｔａｍａｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で維持した。
ＩＦＮγ産生／Ｔ細胞細胞傷害性アッセイ
１０５の休止Ｔ細胞（４：１のＣＤ８＋：ＣＤ４＋）を完全培地中において１０５の腫瘍細胞と４８時間共培養した。形質導入効率に基づいてＴ細胞数を正規化し、条件間で同様のＴ細胞頻度を達成するために必要な場合は、非形質導入Ｔ細胞を添加した。４８時間後、収集した無細胞培養上清中のＩＦＮγレベルを、メーカーのプロトコルに従ってＥＬＩＳＡ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で測定した。Ｔ細胞の細胞傷害性は、細胞のフローサイトメトリー分析によって決定し、培養物中のアネキシンＶ＋／ＤＡＰＩ＋腫瘍細胞のパーセンテージとして定義した。結果を、腫瘍細胞のみを含む培養物中のアネキシンＶ＋／ＤＡＰＥ＋のパーセンテージに対して正規化した。
ヒトＴ細胞によるトランスジェニックマウスＧＭ－ＣＳＦ産生
Ｔ細胞（ＣＤ８またはＣＤ４）を１０６Ｔ細胞／ｍｌの濃度で、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－７／ＩＬ－１５を添加した無血清培地中において２４時間培養した。生存率および細胞数を、血球計算盤を使用して事前に決定した。形質導入効率に基づいてＴ細胞数を正規化し、条件間で同様のＴ細胞頻度を達成するために必要に応じて非形質導入Ｔ細胞を添加した。２４時間後、収集した無細胞上清中のマウスＧＭ－ＣＳＦレベルを、メーカーのプロトコルに従ってＥＬＩＳＡ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で測定した。
骨髄由来マクロファージ（ＢＭＤＭ）の作製
ＮＳＧマウスの大腿骨と脛骨をフラッシングすることにより、全骨髄細胞を単離した。１０％ＦＣＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、５０μＭ β－メルカプトエタノールおよび５０ｎｇ／ｍＬのマウスＭ－ＣＳＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を添加したＤＭＥＭ＋Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｔｈｅｒｍｏ）培地中において全骨髄細胞を７日間インキュベートし、付着画分を採取することによってマクロファージを作製した。３日目と６日目に培地をリフレッシュした。
ウィンアッセイ（Ｗｉｎｎ ａｓｓａｙ）
６～１２週齢の雄ＮＳＧマウスの脇腹に、５ｘ１０６（または指定される数）のＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲ発現マウスＧＭ－ＣＳＦ分泌ヒトＴ細胞（４：１のＣＤ８＋：ＣＤ４＋）または同等数のモック（ｍｏｃｋ）形質導入マウスＧＭ－ＣＳＦ分泌ヒトＴ細胞と事前に混合した５ｘ１０６のＭｅ２７５メラノーマ細胞を皮下接種した。腫瘍の成長を週に２回のノギス測定によって監視し、式Ｖ＝１／２（ＬｘＷ２）（ここで、Ｌは最大の縦方向の直径、Ｗ（幅）は最大の横方向の直径である）を使用して腫瘍体積を計算した。腫瘍が１０００ｍｍ３に達したとき、元の体重の＞２０％を失ったとき、または弱まって瀕死になったときに、マウスを屠殺した。各群は５匹以上のマウスで構成された。
異種移植モデル
６～１２週齢の雄ＮＳＧマウスの横腹に、５ｘ１０６のＭｅ２７５メラノーマ細胞を皮下接種した。同時に、上記のようにヒトＴ細胞を活性化、形質導入、および拡大した。接種の約２週間後に腫瘍が５０～１００ｍｍ３に達したときに、Ｔ細胞をマウスに養子移入した。Ｔ細胞は、注射ごとに、１ｘ１０７のＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲ発現マウスＧＭ－ＣＳＦ分泌ヒトＴ細胞（４：１のＣＤ８＋：ＣＤ４＋）または同等数のモック形質導入マウスＧＭ－ＣＳＦ分泌ヒトＴ細胞で、１３日目と１５日目に２回投与した。上記のように、腫瘍の成長をノギス測定によって監視した。
結果および考察
この研究で使用されたレトロウイルスマウスＧＭ－ＣＳＦおよびレンチウイルスＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲ構築物の概略図を図１７Ａに示す。ウイルス形質導入後７日目に、ヒトＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞によるＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲおよびマウスＧＭ－ＣＳＦの発現がフローサイトメトリーによって確認された（図１７Ｂ）。形質導入されたＣＤ８＋Ｔ細胞の培養物の上清において、分泌されたマウスＧＭ－ＣＳＦをＥＬＩＳＡによって検出することができる（図１７Ｃ）。これは、ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲを安定発現しかつマウスＧＭ－ＣＳＦを分泌するようにヒトＴ細胞を効率的に共操作（co-engineer）できることを示す。
ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲで操作されたＴ細胞によるＩＦＮγ分泌は、ＨＬＡ－Ａ２＋ＮＹ－ＥＳＯ－１＋腫瘍細胞の認識に基づき検出され得る（図１８Ａ）。ＩＦＮγレベルに対するマウスＧＭ－ＣＳＦの影響はない。ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲで操作されたＴ細胞は、ＨＬＡ－Ａ２＋ＮＹ－ＥＳＯ－１＋腫瘍細胞を容易に殺すことができ、その細胞傷害活性はマウスＧＭ－ＣＳＦによる影響を受けない（図１８Ｂ）。これは、分泌されたマウスＧＭ－ＣＳＦがヒトＴ細胞の活性に影響を及ぼさないことを示す。
マウスＧＭ－ＣＳＦを分泌するように共操作されたヒトＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲ発現Ｔ細胞は、ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲのみを発現する対照Ｔ細胞と比較して、Ｍｅ２７５メラノーマ細胞の生着および確立を効果的に遅らせることができる（図１９Ａ）。これは、マウスの生存に大きく反映しており、ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲ発現マウスＧＭ－ＣＳＦ分泌Ｔ細胞で処置されたマウスの４０％で腫瘍がなかった（図１９Ｂ）。２ｘ１０７のＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲ発現マウスＧＭ－ＣＳＦ分泌Ｔ細胞の養子移入は、ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲ単独と比較して、確立されたＭｅ２７５腫瘍のより優れた腫瘍制御を示した（図１９Ｃ）。これは、ＮＳＧヒトメラノーマ異種移植マウスモデルにおいて、腫瘍微小環境で分泌されたＴ細胞由来マウスＧＭ－ＣＳＦが、ＮＹ－ＥＳＯ－１特異的Ｔ細胞による腫瘍成長の制御を有意に増強できることを示す。
実施例７．ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲ「Ｉ５３Ｆ」バリアントおよびＰＤＥ４Ｂ２を発現する改変Ｔ細胞
材料および方法
分子クローニング
ヒトＴ細胞においてヒトＰＤＥ４Ｂ２ホモログを過剰発現させるために、Bobisse, S. et al. Cancer Res. 69, 9385-9394 (2009)で使用されているレンチウイルスベクターｐＲＲＬを使用した。特に、ヒトＰＧＫプロモーターおよびコザック（Ｋｏｚａｋ）エレメント（ＧＣＣＡＣＣ（配列番号３１）の下流にクローン化された配列は、ヒトＷＴ ＰＤＥ４Ｂ２（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿００１０３２４１６．１；図２６の配列番号２７）をコードし、ＤＧＧＧ（配列番号３２）リンカーを介して以下のアミノ酸配列に融合される：ＧＫＰＩＰＮＰＬＬＧＬＤＳＴＧＧＳＧＧＧＫＰＩＰＮＰＬＬＧＬＤＳＴＧＳＧＳＧＳＧＫＰＩＰＮＰＬＬＧＬＤＳＴ（配列番号３３）。この配列は、Ｖ５タグエピトープの３つの繰り返しと、Reddy Chichili et al., Protein Sci. 22, 153-167 (2013)で使用されている２つのリンカーを含む。対照Ｔ細胞の操作には、同じｐＲＲＬベクターバックボーンが用いられ、ヒトＰＧＫプロモーターおよびコザックエレメントの下流にｅＧＦＰコード配列が導入された。Ｔ細胞にＮＹ－ＥＳＯ－１抗原特異性を与えるために、Lamers, C. H. J. et al. Cancer Gene Ther. 15, 268-274 (2008)で用いられているＳＦＧレトロウイルスベクターが使用され、それはＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲバリアンβ－Ｉ５３Ｆのα鎖ならびにβ鎖をコードする。導入されたすべてのＤＮＡ配列は、ヒト細胞でのタンパク質発現のためにコドン最適化された。
濃縮レンチウイルスまたはレトロウイルスの作製
ウイルス粒子を作製する目的で、ＨＥＫ－２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。簡単に説明すると、レンチウイルス粒子の作製のために、１８μｇのｇａｇ／ｐｏｌコードＲ８．７４プラスミド、７μｇのエンベロープタンパク質コードＶＳＶＧプラスミド、ならびに１５μｇの導入遺伝子コードｐＲＲＬベクターを、３ｍＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭ（１１０５８－０２１、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と事前に混合したＴｕｒｂｏＦｅｃｔ（Ｒ０５３２、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）１２０μｌで希釈した。同様に、レトロウイルス粒子の作製のために、１８μｇのｇａｇ／ｐｏｌコードＰｅｇＰａｍ、７μｇのエンベロープタンパク質コードＲＤ１１４プラスミド、ならびに２２μｇのＳＦＧレトロウイルスベクターを、３ｍＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭと事前に混合したＴｕｒｂｏＦｅｃｔ（Ｒ０５３２、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）１２０μｌで希釈した。注目すべきことに、ＴｕｒｂｏＦｅｃｔ／Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ溶液を、パッケージング／導入遺伝子プラスミドの希釈に使用する前に、室温で５分間インキュベートした。続いて、トランスフェクションミックスを、室温で３０分間インキュベートした後、９０～９５％コンフルエントのＨＥＫ－２９３Ｔ細胞を含むＴ１５０組織培養フラスコにおいて、１０％ウシ胎児血清およびペニシリン／ストレプトマイシン（４－０１Ｆ００－Ｈ、Ｂｉｏｃｏｎｃｅｐｔ）を添加したＲＰＭＩ １６４０（１１８７５０８５、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）から構成される新鮮なＲ１０培地の上に添加した。２４時間後、培養上清を新鮮なＲ１０に交換し、さらに２４時間経過した後にそれを回収し、ろ過（４５μｍ）および２４０００ｇで２時間の遠心分離にかけた。最後に、ウイルス粒子を４００μｌのＲ１０に再懸濁した後、ドライアイスで急速凍結し、－８０℃に置いた。
Ｔ細胞の分離、形質導入および培養
健康ドナーからのＰＢＭＣを、標準的なＦｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ遠心分離によって０日目に分離し、メーカーの指示に従ってそれぞれのネガティブ分離キット（１３０－０９６－５３３、１３０－０９６－４９５ Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用してＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞を精製した。分離直後に、５０Ｕ／ｍＬの組換えヒトＩＬ２（Ｇｌａｘｏ ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅから贈与）の存在下において、Ｔ細胞あたり２ビーズの比率で、Ｔ細胞をＲ１０中において抗ＣＤ３／ＣＤ２８コーティングマイクロビーズ（１１１３２Ｄ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で刺激した。４８ウェルプレートにおいて、０．５ｘ１０６Ｔ細胞／ウェル、１／１０６Ｔ細胞／ｍＬの濃度で、Ｔ細胞を活性化した。レンチウイルス形質導入のために、１：５００希釈で使用されたＬｅｎｔｉＢＯＯＳＴ（商標）（Ｓｉｒｉｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＧｍｂＨ）の存在下での刺激の１８～２２時間後に、０．５／１０６のＴ細胞を含むウェルあたり、１００μｌの濃縮レンチウイルスを加えた。レトロウイルスの形質導入は、未処理の４８ウェル細胞培養プレート内で生じた。具体的には、そのようなウェルを、ＰＢＳ中の２０ｎｇ／ｍＬのレトロネクチン（ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ）（Ｔ１００Ｂ、Ｔａｋａｒａ）溶液で４℃で一晩コーティングした後、ＰＢＳで洗浄し、続いて３７℃で３０分間Ｒ１０でブロッキングした。これらウェルをＰＢＳで洗浄した後、５０μｌの濃縮レトロウイルスを５０μｌのＲ１０とともに添加し、プレートを２５℃、２０００ｇで９０分間遠心した。レトロウイルスのコトランスダクション（co-transduction）を行うために、事前にレンチウイルスに曝露されたＴ細胞を、刺激後４０～４４時間以内に、レトロネクチン（ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ）／レトロウイルスコーティングウェルに移し、２６０ｇで１０分間スピンダウンした。このようなＴ細胞を、レトロウイルス形質導入の２４時間後に組織培養処理ウェルに移した。Ｔ細胞の拡大を支援するためにＩＬ２（５０Ｕ／ｍＬ）を加えたＲ１０を、Ｔ細胞活性化マイクロビーズが除去される５日目まで培養物に添加した。５日目以降、１０ｎｇ／ｍＬの組換えヒトＩＬ７およびＩＬ１５（１３０－０９５－７６４、１３０－０９５－３６２、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を加えたＲ１０をＴ細胞培養物に添加した。形質導入効率は７日目にＦＡＣＳで評価し、Ｔ細胞は８～２１日目の間に細胞内ｃＡＭＰの定量化または機能アッセイに使用した。
ｃＡＭＰの測定
休止Ｔ細胞を洗浄し、様々な濃度のフォルスコリンまたはＰＧＥ２に１時間曝露した。Ｔ細胞は１２ウェルプレートにおいて１ｘ１０６Ｔ細胞／ｍＬの濃度で処理したが、条件ごとに２．５ｘ１０６Ｔ細胞を使用した。続いて、Ｔ細胞を２５０μｌの０．１Ｍ ＨＣｌで溶解し、それらの細胞内ｃＡＭＰ含有量を、製造元の指示に従って直接ｃＡＭＰ ＥＬＩＳＡキット（ＡＤＩ－９００－０６６、Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）で評価した。
フローサイトメトリー
すべてのＦＡＣＳデータをＬＣＲＩＩフローサイトメーター（ＢＤ）で取得し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して解析した。死細胞除去のために、製造元の指示に従ってｆｉｘａｂｌｅ ａｑｕａ ｄｅａｄ ｄｙｅ Ｌ３４９６５またはＬ３４９７５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用し、一方、Ｔ細胞染色のためには以下の抗体を使用した：ＣＤ４５：Ｐａｃ Ｂｌｕｅ（３０４０２９、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、抗Ｖ５タグ：ＦＩＴＣ（Ｒ９６３２５、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、抗Ｖ５タグ：Ｄｙ６５０（ＮＢＰ２－５２６５３Ｃ、Ｎｏｖｕｓ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）、Ｖｂ１３．１：ＰＥ（ＩＭ２２９２、ＢＤ）、ＩＦＮγ：ＰｅＣｙ７（５０２５２７、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＴＮＦ－α：ＰＥ（５０２９０９、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、抗ＢｒＤＵ：ＡＰＣ（１２－５０７１－４２、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）。ＦＡＣＳにより細胞内サイトカイン産生を評価するために、ウェルあたり５０ｘ１０３の生きたＴ細胞を、丸底９６ウェルプレートにおいて、プレートコーティングａＣＤ３（５μｇ／ｍＬ）と可溶性ａＣＤ２８（２μｇ／ｍＬ）の組み合わせで７時間刺激した。サイトカイン分泌を防ぐために、アッセイ開始の１．５時間後に、１：４００の希釈率でゴルジストップ（Ｇｏｌｇｉ ｓｔｏｐ）（５５４７２４、ＢＤ）をウェルに添加した。形質導入効率またはサイトカインを産生する能力を評価する前に、標準の固定／透過処理キット（５５４７１４、ＢＤ）を製造元の指示に従って使用して、Ｔ細胞を固定および透過処理した。フローサイトメトリー用のＢｒｄＵ染色キット（８８１７－６６００－４２、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、Ｔ細胞の増殖を定量化した。簡単に説明すると、ウェルあたり１ｘ１０５の生きたＴ細胞を、平底９６ウェルプレート内においてプレートコーティングａＣＤ３（５μｇ／ｍＬ）で４８時間活性化し、アッセイ終了の７時間前にＢｒｄＵを１０μＭの作業濃度でウェルに添加した。
ＩＦＮγ分泌の定量化
ＧＦＰ、ＰＤＥ４Ｂ２、ｅＧＦＰ＆ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲ、またはＰＤＥ４Ｂ２＆ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲを形質導入した休止状態のＣＤ８Ｔ細胞を、様々な濃度のＰＧＥ２またはフォルスコリンの存在下で、ＮＹ－ＥＳＯ－１提示メラノーマ細胞Ａ３７５と４８時間共培養し、共培養上清中のＩＦＮγの存在を、製造業者の指示に従ってＥＬＩＳＡキット（８８－７３１６－８８、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により評価した。共培養は平底９６ウェルプレートで行い、１ｘ１０５のＡ３７５細胞と、１ｘ１０５のＴＣＲ＋の生きたＴ細胞または対応する数のｅＧＦＰ－／ＰＤＥ４Ｂ２－形質導入Ｔ細胞をウェルごとに添加した。
細胞傷害アッセイ
ｅＧＦＰ、ＰＤＥ４Ｂ２、ｅＧＦＰ＆ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲ、またはＰＤＥ４Ｂ２＆ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲを形質導入した休止状態のＣＤ４またはＣＤ８Ｔ細胞を、ＰＧＥ２の存在下または非存在下で、それぞれ４７時間または４４時間、Ａ３７５細胞と共培養した。共培養は、ＩｎｃｕＣｙｔｅ機器によってモニターされ、１ｘ１０４のＡ３７５腫瘍細胞、ならびに２５ｘ１０３のＴＣＲ＋の生きたＴ細胞または対応する数のｅＧＦＰ－／ＰＤＥ４Ｂ２－形質導入Ｔ細胞をウェルごとに添加した平底９６ウェルプレートで行った。使用したＡ３７５腫瘍細胞は、ウェル内での直接検出を可能にするために、核蛍光タンパク質ｍＣｈｅｒｒｙを発現するように操作された。
結果および考察
初代ヒトＴ細胞における外因性ＰＤＥ４Ｂ２の発現、または外因性ＰＤＥ４Ｂ２とＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲバリアントβ－Ｉ５３Ｆの共発現が、フローサイトメトリーによって確認された（図２１）。ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲは、ＴＣＲβ鎖のＶβ１３．１バリアントを含むため、前者の存在は、完全に正確ではないが、Ｖβ１３．１の検出によって推測できる。
ｅＧＦＰまたはＰＤＥ４Ｂ２を形質導入した休止状態のＣＤ４Ｔ細胞の細胞内ｃＡＭＰレベルを、ＦｓｋまたはＰＧＥ２に１時間曝露した時点で測定した。処理後、Ｔ細胞を溶解し、ｃＡＭＰレベルをＥＬＩＳＡで定量化した。結果は、ＰＤＥ４Ｂ２の過剰発現が細胞内ｃＡＭＰの蓄積を防ぐことを示す（図２２）。
ｅＧＦＰまたはＰＤＥ４Ｂ２を形質導入した休止状態のＣＤ４Ｔ細胞がＩＦＮγまたはＴＮＦ－αを産生する能力を、ＰＧＥ２またはフォルスコリンの存在下でプレート結合ａＣＤ３および可溶性ａＣＤ２８有りまたは無しで７時間刺激した時点で、細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）により決定した。ＰＧＥ２またはフォルスコリンの存在下でのＮＹ－ＥＳＯ－１提示メラノーマ細胞Ａ３７５との４８時間の共培養に応答した、ｅＧＦＰ、ＰＤＥ４Ｂ２、ｅＧＦＰ＆ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲ、またはＰＤＥ４Ｂ２＆ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲで形質導入した休止状態のＣＤ８Ｔ細胞によるＩＦＮγの分泌をＥＬＩＳＡで評価した。両方の結果は、ＰＤＥ４Ｂ２の過剰発現が、細胞内ｃＡＭＰ蓄積を誘導する条件下で、Ｔｈ－１サイトカイン産生を促進することを示す（図２３Ａ、２３Ｂ）。
ｅＧＦＰまたはＰＤＥ４Ｂ２で形質導入したＣＤ４Ｔ細胞が増殖する能力を、ＢｒＤＵ取り込みアッセイによって決定した。Ｔ細胞を、ＰＧＥ２またはフォルスコリンの存在下で、プレート結合ａＣＤ３有りまたは無しで４８時間再刺激した。結果は、ＰＤＥ４Ｂ２の過剰発現が細胞内ｃＡＭＰ蓄積を誘導する条件下で増殖を促進することを示す（図２４）。
ｅＧＦＰ、ＰＤＥ４Ｂ２、ｅＧＦＰ＆ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲ、またはＰＤＥ４Ｂ２＆ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲで形質導入した休止状態のＣＤ４またはＣＤ８Ｔ細胞が、ＰＧＥ２の存在下または不在下で、ＮＹ－ＥＳＯ－１提示メラノーマ細胞Ａ３７５の拡大を抑制する能力をＩｎｃｕＣｙｔｅによって評価した。図２５に示すように、ＰＤＥ４Ｂ２の過剰発現は、ＰＧＥ２の存在下でＴ細胞の細胞傷害性を促進する。
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本発明は、本明細書に記載の特定の実施形態によって範囲を限定されるべきではない。実際、本明細書に記載されたものに加えて、本発明の様々な修正が、前述の説明から当業者に明らかになるであろう。このような変更は、添付の特許請求の範囲内に含まれることが意図されている。
本明細書で引用されるすべての特許、出願、刊行物、試験方法、文献、および他の資料は、本明細書に物理的に存在するかのように、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

Claims (132)

  1. 改変Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）またはその機能的断片をコードするポリヌクレオチドであって、前記改変ＴＣＲは、非置換野生型（ＷＴ）ＴＣＲのβ鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）２と比較して、改変ＴＣＲのβ鎖のＣＤＲ２内に単一アミノ酸置換を含む、ポリヌクレオチド。
  2. 前記改変ＴＣＲのβ鎖配列が、該改変ＴＣＲのβ鎖またはその機能的断片のＣＤＲ２領域の外側で、非置換ＷＴ ＴＣＲのβ鎖またはその機能的断片と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
  3. 前記改変ＴＣＲのβ鎖またはその機能的断片が、非置換ＷＴ ＴＣＲのβ鎖またはその機能的断片のアミノ酸配列においてＣＤＲ２領域に単一アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む、請求項１または２に記載のポリヌクレオチド。
  4. 非置換ＷＴ ＴＣＲのβ鎖が、配列番号１のアミノ酸配列を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  5. 前記単一アミノ酸置換が、ＷＴ ＴＣＲに対して残基５０、５１、５３、または５５で生じる、請求項１～４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  6. 前記単一アミノ酸置換が、ＷＴ ＴＣＲに対して残基５３または５５で生じる、請求項１～５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  7. 前記単一アミノ酸置換が、Ｉ５３Ｅ、Ｉ５３Ｆ、Ｉ５３Ｗ、またはＤ５５Ｅである、請求項１～６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  8. 前記改変ＴＣＲが、ＷＴ ＴＣＲよりも高い結合親和性でがん抗原に結合する、請求項１～７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  9. 前記がん抗原がＮＹ－ＥＳＯ－１１５７－１６５エピトープ（配列番号８）である、請求項８に記載のポリヌクレオチド。
  10. 前記改変ＴＣＲのがん抗原への結合親和性が、ＷＴ ＴＣＲのがん抗原への結合親和性と比較して約５倍～約７５倍高い、請求項８または９に記載のポリヌクレオチド。
  11. 前記改変ＴＣＲのがん抗原への結合親和性が、ＷＴ ＴＣＲのがん抗原への結合親和性と比較して約１０倍～約７５倍高い、請求項１０に記載のポリヌクレオチド。
  12. 前記改変ＴＣＲのがん抗原への結合親和性が、ＷＴ ＴＣＲのがん抗原への結合親和性と比較して約２５倍～約７５倍高い、請求項１１に記載のポリヌクレオチド。
  13. 前記改変ＴＣＲのがん抗原への結合親和性が、ＷＴ ＴＣＲのがん抗原への結合親和性と比較して約４０倍～約７５倍高い、請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
  14. 前記改変ＴＣＲのがん抗原への結合親和性が、ＷＴ ＴＣＲのがん抗原への結合親和性と比較して約４０倍～約６０倍高い、請求項１３に記載のポリヌクレオチド。
  15. 前記改変ＴＣＲのがん抗原への結合親和性が、ＷＴ ＴＣＲのがん抗原への結合親和性と比較して約４０倍～約５０倍高い、請求項１４に記載のポリヌクレオチド。
  16. 前記改変ＴＣＲのがん抗原への結合親和性が、ＷＴ ＴＣＲのがん抗原への結合親和性と比較して約５０倍高い、請求項８または９に記載のポリヌクレオチド。
  17. 前記改変ＴＣＲのがん抗原に対する解離定数（ＫＤ）が約０．３０μＭ～約４．５μＭの間である、請求項８または９に記載のポリヌクレオチド。
  18. 前記改変ＴＣＲのがん抗原に対する解離定数（ＫＤ）が約０．３０μＭ～約２μＭの間である、請求項１７に記載のポリヌクレオチド。
  19. 前記改変ＴＣＲのがん抗原に対する解離定数（ＫＤ）が約２μＭ～約３μＭの間である、請求項１７に記載のポリヌクレオチド。
  20. 前記改変ＴＣＲのがん抗原に対する解離定数（ＫＤ）が約３μＭ～約４μＭの間である、請求項１７に記載のポリヌクレオチド。
  21. 前記改変ＴＣＲのがん抗原に対する解離定数（ＫＤ）が約０．４１μＭである、請求項１７に記載のポリヌクレオチド。
  22. 前記改変ＴＣＲのがん抗原に対する解離定数（ＫＤ）が約３．８９μＭである、請求項１７に記載のポリヌクレオチド。
  23. 前記改変ＴＣＲが、配列番号２～５のいずれか１つのアミノ酸配列またはその機能的断片、あるいは配列番号２～５のいずれか１つに対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１～２２のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  24. 前記改変ＴＣＲが、配列番号１１～１４のいずれか１つのヌクレオチド配列、または配列番号１１～１４のいずれか１つに対して少なくとも８０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる、請求項１～２３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  25. 改変ＴＣＲの発現のための少なくとも１つの調節エレメントに作動可能に連結されている、請求項１～２４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  26. 前記少なくとも１つの調節エレメントがプロモーターである、請求項２５に記載のポリヌクレオチド。
  27. ＤＮＡ分子である、請求項１～２６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  28. ＲＮＡ分子またはその誘導体である、請求項１～２６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  29. 請求項１～２８のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む組換えベクターであって、前記ポリヌクレオチドが、改変Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の発現のための少なくとも１つの調節エレメントに作動可能に連結されている、組換えベクター。
  30. ウイルスベクターである、請求項２９に記載のベクター。
  31. 前記ウイルスベクターが、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、アルファウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、またはワクシニアウイルスベクターである、請求項３０に記載のベクター。
  32. 非ウイルスベクターである、請求項２９に記載のベクター。
  33. 請求項１～２８のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドによってコードされる改変ＴＣＲのβ鎖またはその機能的断片を含む、改変Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）。
  34. ａ）請求項１～２９のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドによってコードされる改変ＴＣＲのβ鎖またはその機能的断片、および
    ｂ）α鎖またはその機能的断片
    を含む、改変Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）。
  35. 請求項１～２８のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドによってコードされる改変ＴＣＲのβ鎖のＣＤＲを含む、改変Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）。
  36. ａ）改変ＴＣＲのβ鎖の機能的断片であって、請求項１～２８のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドによってコードされるβ鎖のＣＤＲを含む機能的断片、および
    ｂ）α鎖の機能的断片であって、α鎖のＣＤＲを含む機能的断片
    を含む、改変Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）。
  37. ａ）の機能的断片がＴＣＲβ鎖の定常領域をさらに含む、および／またはｂ）の機能的断片がＴＣＲα鎖の定常領域をさらに含む、請求項３６に記載の改変ＴＣＲ。
  38. 前記定常領域のいずれかがヒト起源である、請求項３７に記載の改変ＴＣＲ。
  39. 前記定常領域のいずれかがマウス起源である、請求項３７に記載の改変ＴＣＲ。
  40. 前記α鎖が、ＷＴ ＴＣＲのα鎖またはその機能的断片を含む、請求項３４～３９のいずれか一項に記載の改変ＴＣＲ。
  41. ＷＴ ＴＣＲのα鎖が、配列番号７のアミノ酸配列を含む、請求項４０に記載の改変ＴＣＲ。
  42. 配列番号２～５のいずれか１つのアミノ酸配列またはその断片、あるいは配列番号２～５のいずれか１つに対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項３３～４１のいずれか一項に記載の改変ＴＣＲ。
  43. 配列番号７のアミノ酸配列を含むα鎖、および配列番号２～５のいずれか１つのアミノ酸配列を含むβ鎖を含む、改変Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）。
  44. 請求項３３～４３のいずれか一項に記載の改変Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む単離宿主細胞。
  45. 請求項１～２８のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む単離宿主細胞。
  46. 前記ポリヌクレオチドが、宿主細胞における改変Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の発現を媒介することができる少なくとも１つの調節エレメントに作動可能に連結されている、請求項４５に記載の単離宿主細胞。
  47. 請求項２９～３２のいずれか一項に記載のベクターを含む単離宿主細胞。
  48. 哺乳動物細胞である、請求項４４～４７のいずれか一項に記載の単離宿主細胞。
  49. リンパ球系細胞である、請求項４４～４８のいずれか一項に記載の単離宿主細胞。
  50. 前記リンパ球系細胞がＴ細胞である、請求項４９に記載の単離宿主細胞。
  51. 前記リンパ球系細胞がナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である、請求項４９に記載の単離宿主細胞。
  52. 末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、腫瘍流入領域リンパ節、または腫瘍浸潤物から得られたものである、請求項４８～５１のいずれか一項に記載の単離宿主細胞。
  53. ｅｘ ｖｉｖｏで活性化および／または拡大されている、請求項４４～５２のいずれか一項に記載の単離宿主細胞。
  54. 同種異系細胞である、請求項４４～５３のいずれか一項に記載の単離宿主細胞。
  55. 自己細胞である、請求項４４～５３のいずれか一項に記載の単離宿主細胞。
  56. 疾患を有する対象から単離されたものである、請求項５５に記載の単離自己宿主細胞。
  57. 前記疾患ががんである、請求項５６に記載の単離自己宿主細胞。
  58. 前記がんが、その細胞の表面にがん抗原ＮＹ－ＥＳＯ－１１５７－１６５エピトープ（配列番号８）を提示する、請求項５７に記載の単離自己宿主細胞。
  59. 前記がんが、骨髄腫、メラノーマ、肉腫、膀胱がん（bladder cancer）、食道がん、肝細胞がん、頭頸部がん、乳がん、前立腺がん、膀胱がん（urinary bladder cancer）、皮膚がん、肺がん、卵巣がん、または脳腫瘍である、請求項５７または５８に記載の単離自己宿主細胞。
  60. １つまたは複数の外因性分子を発現するようにさらに操作された、請求項４４～５９のいずれか一項に記載の単離宿主細胞。
  61. 前記１つまたは複数の外因性分子が免疫シグナル伝達分子である、請求項６０に記載の単離宿主細胞。
  62. 前記免疫シグナル伝達分子がサイトカインである、請求項６１に記載の単離宿主細胞。
  63. 前記免疫シグナル伝達分子がケモカインである、請求項６１に記載の単離宿主細胞。
  64. 前記免疫シグナル伝達分子が成長因子である、請求項６１に記載の単離宿主細胞。
  65. 前記成長因子が顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）である、請求項６４に記載の単離宿主細胞。
  66. がん抗原に結合するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）またはその機能的断片を含む単離宿主細胞であって、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）を発現するようにさらに操作されている、単離宿主細胞。
  67. 前記がん抗原がＮＹ－ＥＳＯ－１１５７－１６５エピトープ（配列番号８）である、請求項６６に記載の単離宿主細胞。
  68. Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）がＷＴ ＴＣＲである、請求項６６または６７に記載の単離宿主細胞。
  69. ＷＴ ＴＣＲのβ鎖が、配列番号１のアミノ酸配列、または配列番号１に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項６６～６８のいずれか一項に記載の単離宿主細胞。
  70. ＷＴ ＴＣＲのα鎖が、配列番号７のアミノ酸配列を含む、請求項６６～６９のいずれか一項に記載の単離宿主細胞。
  71. ＧＭ－ＣＳＦのアミノ酸配列が、配列番号２１、３４または１５、あるいは配列番号２１、３４または１５に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項６５～７０のいずれか一項に記載の単離宿主細胞。
  72. ＧＭ－ＣＳＦをコードするヌクレオチド配列が、配列番号２２、３５または１６、あるいは配列番号２２、３５または１６に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項６５～７１のいずれか一項に記載の単離宿主細胞。
  73. 前記１つまたは複数の外因性分子が可溶性受容体である、請求項６０または６１に記載の単離宿主細胞。
  74. 前記１つまたは複数の外因性分子がリガンドである、請求項６０または６１に記載の単離宿主細胞。
  75. 前記１つまたは複数の外因性分子が抗原結合タンパク質である、請求項６０または６１に記載の単離宿主細胞。
  76. 前記抗原結合タンパク質が抗体または抗体フラグメントである、請求項７５に記載の単離宿主細胞。
  77. 前記１つまたは複数の外因性分子がホスホジエステラーゼである、請求項６０に記載の単離宿主細胞。
  78. 前記ホスホジエステラーゼがＰＤＥ４Ｂ２である、請求項７７に記載の単離宿主細胞。
  79. がん抗原に結合するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）またはその機能的断片を含む単離宿主細胞であって、ＰＤＥ４Ｂ２を発現するようにさらに操作されている、単離宿主細胞。
  80. 前記がん抗原がＮＹ－ＥＳＯ－１１５７－１６５エピトープ（配列番号８）である、請求項７９に記載の単離宿主細胞。
  81. Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）がＷＴ ＴＣＲである、請求項７９または８０に記載の単離宿主細胞。
  82. ＷＴ ＴＣＲのβ鎖が、配列番号１のアミノ酸配列、または配列番号１に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項７９～８１のいずれか一項に記載の単離宿主細胞。
  83. ＷＴ ＴＣＲのα鎖が、配列番号７のアミノ酸配列を含む、請求項７９～８２のいずれか一項に記載の単離宿主細胞。
  84. ＰＤＥ４Ｂ２のアミノ酸配列が、配列番号２７または２９、あるいは配列番号２７または２９に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項７８～８３のいずれか一項に記載の単離宿主細胞。
  85. ＰＤＥ４Ｂ２をコードするヌクレオチド配列が、配列番号２８または３０、あるいは配列番号２８または３０に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項７８～８４のいずれか一項に記載の単離宿主細胞。
  86. 前記１つまたは複数の外因性分子が細胞表面受容体である、請求項６０に記載の単離宿主細胞。
  87. 前記細胞表面受容体がキメラ抗原受容体である、請求項８６に記載の単離宿主細胞。
  88. 前記細胞表面受容体が、がん抗原ＮＹ－ＥＳＯ－１１５７－１６５エピトープ（配列番号８）に結合しないＴ細胞受容体である、請求項８６に記載の単離宿主細胞。
  89. 請求項３３～４３に記載の改変Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）またはその機能的断片、ならびにＴ細胞上の細胞表面タンパク質に特異的に結合する免疫エフェクターポリペプチドを含む、二機能性分子。
  90. 前記免疫エフェクターポリペプチドが抗体または抗体フラグメントを含む、請求項８９に記載の二機能性分子。
  91. 前記免疫エフェクターポリペプチドが単鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦｖ）を含む、請求項８９または９０に記載の二機能性分子。
  92. 前記免疫エフェクターポリペプチドがＣＤ３に特異的に結合する、請求項８９～９１のいずれか一項に記載の二機能性分子。
  93. 前記免疫エフェクターポリペプチドが、ＯＫＴ３、ＵＣＨＴ－１、ＢＭＡ０３１、または１２Ｆ６に由来する抗体または抗体フラグメントを含む、請求項９２に記載の二機能性分子。
  94. 請求項４４～８８のいずれか一項に記載の宿主細胞、または請求項８９～９３のいずれか一項に記載の二機能性分子、ならびに薬学的に許容される担体および／または賦形剤を含む、医薬組成物。
  95. 養子細胞移入療法で使用される、請求項９４に記載の医薬組成物。
  96. 請求項１～２８のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドまたは請求項２９～３２のいずれか一項に記載のベクターを用いて宿主細胞を遺伝子操作することを含む、請求項４４～８８のいずれか一項に記載の宿主細胞を作製する方法。
  97. 請求項３３～４３のいずれか一項に記載の改変Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）またはその機能的断片を発現するように宿主細胞を遺伝子操作する方法。
  98. 請求項１～２８のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドまたは請求項２９～３２のいずれか一項に記載のベクターを用いて宿主細胞を遺伝子操作することを含む、請求項９７に記載の方法。
  99. 遺伝子操作ステップがウイルス遺伝子送達を介して行われる、請求項９６～９８のいずれか一項に記載の方法。
  100. 遺伝子操作ステップが非ウイルス遺伝子送達を介して行われる、請求項９９に記載の方法。
  101. ｅｘ ｖｉｖｏで行われる、請求項９６～１００のいずれか一項に記載の方法。
  102. ｅｘ ｖｉｖｏで宿主細胞を活性化および／または拡大することをさらに含む、請求項９６～１０１のいずれか一項に記載の方法。
  103. 前記改変ＴＣＲが、配列番号２～５のいずれか１つのアミノ酸配列またはその断片、あるいは配列番号２～５のいずれか１つに対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項９６～１０２のいずれか一項に記載の方法。
  104. １つまたは複数の外因性分子をさらに発現するように前記宿主細胞を遺伝子操作することをさらに含む、請求項９６～１０３のいずれか一項に記載の方法。
  105. 前記１つまたは複数の外因性分子が免疫シグナル伝達分子である、請求項１０４に記載の方法。
  106. 前記外因性分子が、サイトカイン、ケモカイン、成長因子、可溶性受容体、リガンド、ホスホジエステラーゼ、抗原結合タンパク質、または細胞表面受容体である、請求項１０４または１０５に記載の方法。
  107. 前記成長因子が顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）である、請求項１０６に記載の方法。
  108. ＧＭ－ＣＳＦのアミノ酸配列が、配列番号２１、３４または１５、あるいは配列番号２１、３４または１５に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１０７に記載の方法。
  109. ＧＭ－ＣＳＦをコードするヌクレオチド配列が、配列番号２２、３５または１６、あるいは配列番号２２、３５または１６に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項１０７または１０８に記載の方法。
  110. ホスホジエステラーゼがＰＤＥ４Ｂ２である、請求項１０６に記載の方法。
  111. ＰＤＥ４Ｂ２のアミノ酸配列が、配列番号２７または２９、あるいは配列番号２７または２９に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１１０に記載の方法。
  112. ＰＤＥ４Ｂ２をコードするヌクレオチド配列が、配列番号２８または３０、あるいは配列番号２８または３０に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項１１０または１１１に記載の方法。
  113. 前記抗原結合タンパク質が抗体または抗体フラグメントである、請求項１０６に記載の方法。
  114. 前記細胞表面受容体が、キメラ抗原受容体、またはがん抗原ＮＹ－ＥＳＯ－１１５７－１６５エピトープ（配列番号８）に結合しないＴ細胞受容体である、請求項１０６に記載の方法。
  115. 前記宿主細胞が哺乳動物細胞である、請求項９６～１１４のいずれか一項に記載の方法。
  116. 前記宿主細胞がリンパ球系細胞である、請求項９６～１１５のいずれか一項に記載の方法。
  117. 前記リンパ球系細胞がＴ細胞である、請求項１１６に記載の方法。
  118. 前記リンパ球系細胞がナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である、請求項１１６に記載の方法。
  119. 前記宿主細胞が、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、腫瘍流入領域リンパ節、または腫瘍浸潤物から得られる、請求項１１５～１１８のいずれか一項に記載の方法。
  120. 前記宿主細胞がｅｘ ｖｉｖｏで活性化および／または拡大されている、請求項９６～１１９のいずれか一項に記載の方法。
  121. 前記宿主細胞が同種異系細胞である、請求項９６～１２０のいずれか一項に記載の方法。
  122. 前記宿主細胞が自己細胞である、請求項９６～１２０のいずれか一項に記載の方法。
  123. 前記宿主細胞が、疾患を有する対象から単離される、請求項９６～１２２のいずれか一項に記載の方法。
  124. 前記疾患ががんである、請求項１２３記載の方法。
  125. 前記がんの細胞が、その表面にがん抗原ＮＹ－ＥＳＯ－１１５７－１６５エピトープ（配列番号８）を提示する、請求項１２４に記載の方法。
  126. 前記がんが、骨髄腫、メラノーマ、肉腫、膀胱がん（bladder cancer）、食道がん、肝細胞がん、頭頸部がん、乳がん、前立腺がん、膀胱がん（urinary bladder cancer）、皮膚がん、肺がん、卵巣がん、または脳腫瘍である、請求項１２４または１２５に記載の方法。
  127. 必要とする哺乳動物において免疫応答を刺激または増強する方法であって、有効量の、請求項３３～４３のいずれか一項に記載の改変Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を含むリンパ球系細胞、請求項４４～８８のいずれか一項に記載の宿主細胞、請求項８９～９３のいずれか一項に記載の二機能性分子、請求項９４または９５に記載の組成物、あるいは請求項９６～１２６のいずれか一項に記載の方法によって作製された宿主細胞を哺乳動物に投与することを含む、方法。
  128. 必要とする対象におけるがんの治療方法であって、有効量の、請求項３３～４３のいずれか一項に記載の改変Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を含むリンパ球系細胞、請求項４４～８８のいずれか一項に記載の宿主細胞、請求項８９～９３のいずれか一項に記載の二機能性分子、請求項９４または９５に記載の組成物、あるいは請求項９６～１２６のいずれか一項に記載の方法によって作製された宿主細胞を対象に投与することを含む、方法。
  129. 前記がんの細胞が、その表面にがん抗原ＮＹ－ＥＳＯ－１１５７－１６５エピトープ（配列番号８）を提示する、請求項１２８に記載の方法。
  130. 前記がんが、骨髄腫、メラノーマ、肉腫、膀胱がん（bladder cancer）、食道がん、肝細胞がん、頭頸部がん、乳がん、前立腺がん、膀胱がん（urinary bladder cancer）、皮膚がん、肺がん、卵巣がん、または脳腫瘍である、請求項１２８または１２９に記載の方法。
  131. ａ）対象または哺乳動物のＴ細胞を分離すること；
    ｂ）請求項１～２８のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドまたは請求項２９～３２のいずれか一項に記載のベクターを用いてｅｘ ｖｉｖｏで前記Ｔ細胞を遺伝子改変すること；
    ｃ）任意選択で、ステップｂ）の前、後、または最中に、前記Ｔ細胞を拡大および／または活性化すること；
    ｄ）遺伝子改変されたＴ細胞を前記対象または哺乳動物に導入すること；
    を含む、請求項１２８～１３０のいずれか一項に記載の方法。
  132. 前記対象または哺乳動物がヒトである、請求項１２８～１３１のいずれか一項に記載の方法。
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