CN114181967A - 一种能同时表达cd19 car和敲除t细胞表面pd-1表达的质粒结构及构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种能同时表达CD19CAR和敲除T细胞表面PD‑1表达的质粒结构及构建方法，在PD‑1的基因序列中选取23个碱基序列作为靶点，构建pGL3‑gRNA‑cas9‑U6‑PD‑1质粒，所述碱基序列为SEQ ID：agccg aagac cttag agcag tag。本发明利用Crispr/Cas9系统，敲除T细胞中的PD‑1基因，使其不表达PD‑1蛋白，打开免疫系统的刹车闸，增强免疫系统的功能。
Description
技术领域
本发明属于生物细胞技术领域，特别是涉及一种能同时表达CD19 CAR 和敲除T细胞表面PD-1表达的质粒结构。
背景技术
CAR-T(Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy，嵌合抗原受体 T细胞免疫疗法)是近年来发展起来的新的过继免疫细胞治疗手段，通过基因工程手段修饰T细胞，使其表达嵌合抗原受体，嵌合抗原受体可以特异性识别肿瘤相关抗原靶点，识别结合后将激活增殖T细胞的信号传递至胞内，引起T细胞激活和增殖，从而有效杀伤肿瘤细胞。
与普通的免疫细胞治疗相比，CAR-T技术具有许多独特的优势，如CAR 能非MHC依赖性识别肿瘤抗原，不需要经过APC。肿瘤表面蛋白类和脂类抗原都可以作为靶点；有共刺激分子，能有效增强T细胞增殖。因此该技术被认为是有望彻底攻克人类癌症的独特方法。
目前，CAR-T免疫治疗已在许多临床实验上取得巨大进展。其中，针对 B相关抗原CD19阳性的B细胞恶性肿瘤，如急性B-淋巴细胞白血病，慢性 B-淋巴细胞白血病，B细胞霍奇金氏淋巴瘤和非霍奇金氏淋巴瘤， CAR-T-CD19T细胞免疫治疗疗效显著，已有报告显示CAR-T-CD19治疗在成人和儿童复发和难治性B-ALL中可以获得高达90％的完全缓解率。研究报告也显示，几种用不同结构设计的CAR-CD19的临床试验治疗都显示了相似的良好疗效。有些患者经CAR-T治疗后还获得了持久性缓解，不需要额外的其他治疗。
发明内容
本发明主要解决的技术问题是提供一种能同时表达CD19 CAR和敲除T 细胞表面PD-1表达的质粒结构及构建方法，利用Crispr/Cas9系统，敲除T 细胞中的PD-1基因，使其不表达PD-1蛋白，打开免疫系统的刹车闸，增强免疫系统的功能。
为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是：一种能同时表达 CD19 CAR和敲除T细胞表面PD-1表达的质粒结构，在PD-1的基因序列中选取23个碱基序列作为靶点，构建pGL3-gRNA-cas9-U6-PD-1质粒。
进一步地说，所述碱基序列为SEQ ID：agccg aagac cttag agcag tag。
一种能同时表达CD19 CAR和敲除T细胞表面PD-1表达的质粒结构的构建方法，包括以下步骤：
S1、取患者自身的外周血，分离单个核细胞，用培养基诱导培养16-18 小时后，加入重组白细胞介素-2和RPMI1640诱导继续培养1-2天；每隔三天倍比加含有重组白细胞介素-2的培养基，培养至第14天，收获患者自体单核细胞诱导的T细胞，用于慢病毒感染；
S2、利用慢病毒包装体系将PD-1基因包装到慢病毒中，将携带PD-1基因的慢病毒感染单核细胞诱导的T细胞，即可。
进一步地说，所述步骤S2的具体操作为：所述pGL3-gRNA-cas9-U6-PD-1 质粒和慢病毒共同转染细胞，所述转染细胞内PD-1基因被包装成慢病毒颗粒，释放到细胞外，收集含有慢病毒的上清，并用收集到的上清感染诱导的T细胞。
进一步地说，所述步骤S1中，培养基含有氨苄霉素。
进一步地说，所述步骤S1中，用流式细胞术检测CIK细胞的分子标记 CD3+、CD56+的阳性表达率。
进一步地说，所述步骤S1中，当CD3+阳性率＞80％，CD3+CD56+双阳性率＞20％，视为CIK诱导成功。
进一步地说，所述步骤S1中，每隔三天需在培养基中同时加入3％的患者自体血浆。
进一步地说，所述步骤S2中，所述转染细胞为PBMC细胞。
本发明的有益效果：本发明利用Crispr/Cas9系统来敲除PD-1基因，还利用Crispr/Cas9技术修饰的T细胞，所述T细胞表面含有PD-1蛋白，可与癌细胞表面的PD-L1蛋白结合，阻碍活化T细胞攻击癌细胞；敲除T细胞中的 PD-1基因，打开了免疫系统的刹车闸，增强免疫系统的功能。
具体实施方式
下面对本发明的较佳实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。
实施例1：将基因片段PD-1插入慢病毒表达载体pGL3-gRNA-cas9-U6
上述PD-1的核酸人工序列(碱基序列为SEQ ID：agccg aagac cttag agcag tag)，委托汉恒生物科技有限公司合成，插入pGL3-gRNA-cas9-U6载体，转化到E.coli，经测序正确后，使用OMEGA公司的质粒纯化试剂盒提取并纯化质粒，获得重组表达载体的高品质质粒。
实施例2：pGL3-gRNA-cas9-U6敲除PD-1的T细胞的制备
(一)异质性T细胞——CIK的制备
取75ml患者外周血，用TBD样本密度分离液，分离出单核细胞。用含有800IU/mL的氨苄霉素的培养基诱导培养16-18小时后，加入1200IU/mL的重组白细胞介素2和50ng/mL的RPMI1640继续培养1-2天。每隔三天倍比加液，同时加入3％的自体血浆，培养至第14天，流式细胞术检测CIK细胞中的CD3和CD56的阳性表达率，当CD3+阳性率﹥80％，CD3+CD56+双阳性率﹥20％，视为CIK诱导成功，并留取该CIK待病毒感染。
(二)慢病毒包装质粒脂质体转染PBMC细胞
从液氮罐中取出冻存的PBMC细胞，迅速丢入37℃水浴锅中并快速晃动，尽量在1～2min内使细胞溶液完全溶解。将细胞溶液转移到15mL离心管中，并在其中加上1mL新鲜的完全培养基，混匀后离心，156g，5min。去掉上清，加入1mL新鲜的完全培养基重悬细胞沉淀后，转入100mm培养皿，每个培养皿补足到10mL培养基。将培养皿平稳放入培养箱中培养。第二天观察细胞存活率，并更换培养基。以后每天观察细胞生长情况。
将状态良好的PBMC细胞铺在100mm的培养皿中，置于培养箱中培养2 天。观察细胞密度，达到70～80％的汇合率即可进行转染。转染后更换含10％胎牛血清FBS的新鲜完全培养基，转染后6h进行换液。
转染后48h和72h分别两次收集病毒上清。在48h收毒时，将100mm dish 中的培养基倒入50mL离心管中，注意培养皿壁不要接触离心管口，以防出现细菌污染，随后补入10mL含10％FBS的新鲜完全培养基，平稳置于恒温培养箱中继续培养。在72h收毒时，直接将100mm dish中的培养基倒入50mL 离心管中，同样注意培养皿壁不要接触离心管口，以防出现细菌污染。收完 72h的病毒原液后，该dish便可以舍弃。将50mL离心管中的病毒上清，4℃， 2000g，10min，去除细胞碎片；然后收集病毒原液上清置于超速离心机中，4℃，82700g，离心120min，最后将慢病毒超离液分装到灭菌处理的病毒管中。按照要求分装病毒，-80℃冰箱保存。
(三)慢病毒感染CIK细胞及感染后CIK细胞的扩增培养
从-80℃拿出2ml病毒液解冻后加入培养基，将聚凝胺加入上述培养基稀释，使其终浓度为10μg/ml。用该病毒液重悬1×106个上述诱导的CIK细胞。将细胞悬液加入到6孔板中，使病毒颗粒数与CIK细胞数比例约为2:1，400g， 120min。37℃，5％的CO2培养箱中培养16小时后，用新鲜培养基稀释一倍，继续培养1天后收集细胞去除剩余的病毒颗粒进行正常培养。为了提高CIK 细胞的感染效率，可重复此感染步骤1-2次。根据细胞生长状态及时加入新鲜的完全培养基，培养15-17天使细胞扩增至足够的用量。
(四)利用流式细胞技术检测pGL3-gRNA-cas9-U6在CIK中的表达效率；
将105个扩增得到的细胞重悬于100μl FACS缓冲液(含2mmol/l EDTA 和0.5％BSA的PBS)中，与Goat anti-Human IgG Antibody，FITC conjugate室温孵育30分钟，生理盐水清洗两次后，通过流式细胞仪检测FITC荧光信号，测量FITC阳性细胞比率，反映CAR-T细胞在总细胞中的比率。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
序列表
<110> 东莞市麦亘生物科技有限公司
<120> 一种能同时表达CD19 CAR和敲低T细胞表面PD-1表达的质粒结构及构建方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
agccgaagac cttagagcag tag 23
Claims (9)
1.一种能同时表达CD19 CAR和敲除T细胞表面PD-1表达的质粒结构，其特征在于：在PD-1的基因序列中选取23个碱基序列作为靶点，构建pGL3-gRNA-cas9-U6-PD-1质粒。
2.根据权利要求1所述的一种能同时表达CD19 CAR和敲除T细胞表面PD-1表达的质粒结构，其特征在于：所述碱基序列为SEQ ID：agccg aagac cttag agcag tag。
3.根据权利要求1所述的一种能同时表达CD19 CAR和敲除T细胞表面PD-1表达的质粒结构的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1、取患者自身的外周血，分离单个核细胞，用培养基诱导培养16-18小时后，加入重组白细胞介素-2和RPMI1640诱导继续培养1-2天；每隔三天倍比加含有重组白细胞介素-2的培养基，培养至第14天，收获患者自体单核细胞诱导的T细胞，用于慢病毒感染；
S2、利用慢病毒包装体系将PD-1基因包装到慢病毒中，将携带PD-1基因的慢病毒感染单核细胞诱导的T细胞，即可。
4.根据权利要求1所述的一种能同时表达CD19 CAR和敲除T细胞表面PD-1表达的质粒结构的构建方法，其特征在于：所述步骤S2的具体操作为：所述pGL3-gRNA-cas9-U6-PD-1质粒和慢病毒共同转染细胞，所述转染细胞内PD-1基因被包装成慢病毒颗粒，释放到细胞外，收集含有慢病毒的上清，并用收集到的上清感染诱导的T细胞。
5.根据权利要求1所述的一种能同时表达CD19 CAR和敲除T细胞表面PD-1表达的质粒结构的构建方法，其特征在于：所述步骤S1中，培养基含有氨苄霉素。
6.根据权利要求1所述的一种能同时表达CD19 CAR和敲除T细胞表面PD-1表达的质粒结构的构建方法，其特征在于：所述步骤S1中，用流式细胞术检测CIK细胞的分子标记CD3+、CD56+的阳性表达率。
7.根据权利要求1所述的一种能同时表达CD19 CAR和敲除T细胞表面PD-1表达的质粒结构的构建方法，其特征在于：所述步骤S1中，当CD3+阳性率＞80％，CD3+CD56+双阳性率＞20％，视为CIK诱导成功。
8.根据权利要求1所述的一种能同时表达CD19 CAR和敲除T细胞表面PD-1表达的质粒结构的构建方法，其特征在于：所述步骤S1中，每隔三天需在培养基中同时加入3％的患者自体血浆。
9.根据权利要求4所述的一种能同时表达CD19 CAR和敲除T细胞表面PD-1表达的质粒结构的构建方法，其特征在于：所述步骤S2中，所述转染细胞为PBMC细胞。
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2021
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